DE3788397T2 - Synthetische htlv-iii-peptid-zusammensetzungen und ihre verwendung. - Google Patents
Synthetische htlv-iii-peptid-zusammensetzungen und ihre verwendung.Info
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-
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Description
- Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf synthetische Peptide, und insbesondere auf synthetische Peptide, die einen Teil von einem Protein oder Proteinen nachahmen, welche durch das HTLV-III oder HTLV-III-ähnliche Viren produziert werden, welche ätiologisch mit den Krankheitssyndromen verbunden sind, die als AIDS und ARC bekannt sind.
- Das erworbene Immundefizienzsyndrom (AIDS) wurde erstmals in den Vereinigten Staaten im Jahr 1981 erkannt, und die Anzahl der Fälle in den Vereinigten Staaten hat sich seitdem annähernd alle zehn Monate verdoppelt. Seit 1981 gab es etwa 16.000 gemeldete Fälle von AIDS in den Vereinigten Staaten, von denen annähernd die Hälfte bereits verstorben sind. Die zu erwartende Folge der Erkrankung ist unabänderlich der Tod, da es gegenwärtig keine bekannte Behandlung gibt, die wirksam die verheerenden Auswirkungen der Erkrankung verzögern oder verhindern kann. Obwohl die Erkrankung zuerst bei homosexuellen oder bisexuellen Männern und Personen mit intravenösem Drogenmißbrauch in Erscheinung trat, hat sie sich nun durch gemeinsamen Gebrauch von verunreinigten Nadeln oder durch sexuellen Intimkontakt mit oder Empfang von Blutprodukten von einem Träger des Virus ausgebreitet.
- Das ätiologische Agens, welches mit AIDS verbunden ist, ist als Gruppe von verwandten Retroviren identifiziert worden, die bekannt sind als humane T-Zell-lymphotrope Viren-Typ III (Human T-cell Lymphotropic Viruses, HTLV-III), humanes Immundefizienzvirus (Human Immunodeficiency Virus, HIV), Lymphadenopathieviren (LAV) oder AIDS-verwandte Viren (AIDS- Related Viruses, ARV). Diese Viren werden insgesamt hier aus Gründen der Bequemlichkeit als "HTLV-III-Viren" bezeichnet.
- Da Aids durch Blutprodukte übertragen werden kann, gab es vom Beginn der Erkennung der Erkrankung an einen starken Anreiz zur Entwicklung von diagnostischen Tests zur Untersuchung von Blut auf Antikörper oder Antigene, die für das infizierende Virus spezifisch sind. Die Anstrengungen auf diesem Gebiet haben sich als fruchtbar erwiesen, und am Ende des Jahres 1985 wurde fünf Unternehmen die Zulassung erteilt, Tests zum Nachweis von gegen das Virus HTVL-III gerichteten Antikörpern auf den Markt zu bringen. Diese Tests beruhen für den Nachweis der Antikörper alle auf der Verwendung von Virusproteinen, die aus kultivierten, mit HTLV-III infizierten T-Lymphozyten gewonnen werden. Das aus den kultivierten Zellen gewonnene Virus wird aufgebrochen (z. B. mit Detergens) und eine Flüssigkeit (genannt "Viruslysat") wird erhalten. Dieses Lysat (welches eine Vielzahl von Virusproteinfragmenten enthält) wird dann typischerweise als Festphasenkomponente eines Immunassays verwendet.
- Die gegenwärtigen im Handel befindlichen Immunassays haben das herkömmliche Sandwich-ELISA-Format, in welchem die Festphasenkomponente (mit dem daraufabgeschiedenen Viruslysat) mit Blut oder Serum in Berührung gebracht wird, das vermutlich HTLV-III-Antikörper enthält. Falls die Antikörper vorhanden sind, wird erwartet, daß sie an das Viruslysat binden und, nachdem ungebundenes Material weggewaschen worden ist, werden sie mit enzymmarkiertem anti-Human-Immunglobulin zusammengebracht. Die markierten Antikörper werden an alle menschlichen Antikörper binden, die an die Festphase angeheftet sind; die Spezifität des Tests für HTLV-III-Antikörper wird deshalb durch das Viruslysat bereitgestellt.
- Obgleich die vorhandenen Tests die Übertragung des Virus HTLV-III durch Blutprodukte signifikant verringert zu haben scheinen, weisen diese Tests, die auf Viruslysat basieren, einige bedeutende Nachteile auf.
- Erstens besteht die Möglichkeit, daß die Hersteller des Tests während der Herstellung infiziert werden könnten, da das Viruslysat aus Zellen erzeugt wird, welche mit lebendem Virus HTLV-III infiziert sind. Auch besteht zumindest die theoretische Möglichkeit, daß das lebende Virus das Aufbrechverfahren überleben könnte und in den diagnostischen Test gelangen und somit den Verwender infizieren könnte.
- Ein zweiter Nachteil hängt mit der Schwierigkeit, das Lysat zu erhalten, und der wechselnden Beschaffenheit des sich ergebenden Lysats in Abhängigkeit von Änderungen des Verarbeitungsverfahrens oder der Eigenschaften der infizierten Zellen, die verwendet werden, um das Viruslysat zu erhalten, zusammen.
- Ein dritter und bei weitem ernsterer praktischer Nachteil ist die erhebliche Anzahl von falsch positiven und in geringerem Maße falsch negativen Ergebnissen, die bei Verwendung der gegenwärtigen Tests auftreten. Es ist mittlerweile anerkannt, daß die gegenwärtigen Viruslysat-ELISA-Tests zu einer erheblichen Anzahl von falsch positiven Ergebnissen führen. Wie im Hastings Center Report, Special Supplement, August 1985 mit dem Titel "AIDS; The Emerging Ethical Dilemmas" festgestellt wurde:
- "Jedoch ist der ELISA-Test nicht so spezifisch wie empfindlich; d. h., in einer Population von gesunden Blutspendern wird nicht weniger als eins von hundert Testergebnissen positiv sein; und von diesen werden nicht weniger als 90 von 100 falsch positiv sein. In-nationalem Maßstab werden von den 8 Millionen Blutspenden jedes Jahr 40.000 falsch positiv sein." (Seite 9)
- Man nimmt an, daß die falsch Positiven zum Teil auf die Anwesenheit von nicht-viralen Proteinen in den Viruslysatpräparationen, die in der Festphasenkomponente der gegenwärtigen Assays verwendet werden, zurückzuführen sind.
- Der Bericht gibt ferner an, daß ein Western Blot-Test zur Bestätigung (welcher teurer und technisch schwieriger als der ELISA-Test ist) durchgeführt werden muß, um die falsch positiven Ergebnisse auszuschließen. Da Western Blot-Assays ihrerseits Fehler aufweisen und von einer subjektiven Interpretation abhängen, ist ein einfacher, schneller und objektiver Test auf HTLV-III-Antikörper zur Bestätigung immer noch wünschenswert.
- Falsch negative Ergebnisse sind ebenfalls von Belang, obwohl solche falsch negativen Ergebnisse zum Teil von den Eigenschaften des Assays, von der immunsuppressiven Natur der Erkrankung oder von der Latenzperiode zwischen dem Kontakt mit dem Virus HTLV-III und der Entwicklung von Antikörpern herrühren können.
- Ein weiterer Nachteil der gegenwärtig verfügbaren Tests ist, daß sie nur Antikörper gegen das Virus HTLV-III, und nicht das Virus oder das virale Antigen selbst nachweisen. Ein positives Ergebnis zeigt deshalb nur an, daß die getestete Person zu irgendeiner Zeit mit dem Virus HTLV-III in Berührung gekommen ist und Antikörper dagegen entwickelt hat; es kann nicht daraus geschlossen werden, ob die Person gegenwärtig infiziert ist oder infektiös ist oder Aids hat. Es sollte zur Kenntnis genommen werden, daß in der revidierten Definition von AIDS des Center for Disease Control (Juni 1985) Patienten als Aidsfälle ausgeschlossen werden, wenn sie im Hinblick auf gegen HTLV-III gerichtete Serum-Antikörper negativ sind und nicht eine niedrige Anzahl von T-Helfer-Lymphozyten oder ein niedriges Verhältnis von T-Helferzu T-Suppressor-Lymphozyten haben.
- Trotz ihres nicht schlüssigen diagnostischen Werts werden die gegenwärtigen Tests nicht nur zum Nachweisen von viruskontaminiertem Blut verwendet, sondern auch, um infizierte Personen zu erkennen (von denen angenommen wird, daß bei ihnen AIDS zum Ausbruch kommen und sie die Krankheit anderen übertragen könnten). Da eine wesentliche Anzahl von Menschen, die in den im Handel erhältlichen Antikörper-Tests positiv sind, weder klinische Symptome aufweisen noch (anscheinend) andere infizieren können, besteht bei den gegenwärtigen Tests ein erhebliches Risiko, eine Person fälschlich als Aidsträger mit den sich daraus ergebenden sozialen und psychologischen Folgen zu identifizieren.
- Viele der Nachteile der gegenwärtigen Tests auf Lysatbasis könnten umgangen werden, wenn das Viruslysat durch ein Material ersetzt würde, welches nicht von virusinfizierten Zellen gewonnen ist. Ein solches Material könnte z. B. ein virusspezifisches synthetisches Peptid oder ein virusspezifisches Peptid, das aus einem rekombinanten Organismus (typischerweise E. Coli) gewonnen ist, sein.
- Arbeiten auf dem letzteren Gebiet sind von Robert C. Gallo und Mitarbeitern in einer Vielzahl von neueren Artikeln berichtet worden, einschließlich von Biotechnology, Bd. 3, S. 905-909 (Oktober 1985), Science, Bd. 228, S. 93-96 (5. April 1985) und Nature, Bd. 315, S. 151-154 (9. Mai 1985). Diese Arbeitsgruppen haben ein aus 82 Aminosäuren bestehendes Peptid identifiziert, welches von einem Genabschnitt in der ENV-Region des Virus HTLV-III codiert wird, welches durch rekombinante E. Coli -Techniken erzeugt wurde. Dieses Peptid wird von gegen das Virus HTLV-III gerichteten Antikörpern erkannt. Noch später hat eine Genentech-Gruppe über Arbeiten an einem Peptid mit 102 Aminosäuren berichtet, welches darin das Peptid der Gallo-Gruppe mit 82 Aminosäuren enthält. Biotechnology, Bd. 4, S. 128-133 (Februar 1986).
- Obwohl die Methode mit dem synthetischen Peptid offensichtliche Vorteile bietet (z. B. Spezifität, Reinheit, Leichtigkeit der Herstellung, udgl.) scheint es wenig Arbeiten auf diesem Gebiet gegeben zu haben. Tatsächlich ist die einzige den Erfindern der vorliegenden Erfindung bekannte Veröffentlichung, welche der Öffentlichkeit vor dem Prioritätsdatum zugänglich gemacht wurde, welche sich auf solche Arbeiten bezieht, ein Vortrag von Dr. Dino Dina und Mitarbeitern beim Fifth Annual Congress for Recombinant DNA Research, 3-6 Februar 1985. Obwohl die Zusammenfassung des Vortrags angibt, daß verschiedene synthetische Peptide "verwendet werden (1), um Immunantworten bei Aids-Patienten zu bestimmen und (2) Antiseren in Tieren zu erzeugen", wurden die verwendeten spezifischen Peptide nicht offenbart. Darüber hinaus wurden in dem Vortrag selbst keine spezifischen Peptide angegeben, und es gab keinen Hinweis darauf, daß irgendein Peptid oder eine Kombination von Peptiden alle oder die meisten der bekannten positiven Seren erkennen konnte. Anschließend wurde im August 1986 eine Veröffentlichung von Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., (1986) 83 : 6159-6163 veröffentlicht.
- Synthetische Peptide, welche erfolgreich einen Teil des HTLV-III-Proteins nachahmen würden und folglich sowohl zum Nachweis von gegen HTLV-III gerichteten Antikörpern als auch zur Herstellung von Antikörpern, weiche das Virus HTLV-III oder virales Antigen erkennen würden, brauchbar wären, wären ein bedeutender Fortschritt auf dem Fachgebiet. Die vorliegende Erfindung stellt solche Peptide, Zusammensetzungen, welche solche Peptide enthalten, und Verfahren zum Verwenden dieser Peptide und Zusammensetzungen zur Therapie und Diagnose bereit. Die Erfindung stellt auch gegen Peptid gerichtete Antikörper, Zusammensetzungen, welche diese Antikörper enthalten, und Verfahren zum Verwenden der Antikörper und Zusammensetzungen bereit.
- Die vorliegende Erfindung stellt synthetische Peptide bereit, von denen jedes eine Sequenz von mindestens sieben Aminosäureresten hat, welche den Sequenzen der Reste im gp41-Hüllprotein (ENV) des Virus HTLV-III entsprechen. Es wurde gefunden, daß solche Peptide die immunologischen Eigenschaften des natürlichen Virus selbst nachahmen, und sie werden ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
- Diese Peptide werden von einer Mehrzahl von HTLV-III-Antikörper-positiven Seren von Patienten mit AIDS/ARC ebenso wie von antikörperpositiven Seren mit unbekannter Diagnose erkannt. Dazu kommt, daß die erfindungsgemäßen Peptide kaum zu falsch positiven Ergebnissen führen. Die bevorzugten Peptide, die von im wesentlichen allen HTLV-III-Antikörper-positiven Seren erkannt werden, sind diejenigen der Formeln (II) bis (VI) (VIII), (X) und (XII) bis (XIV).
- Diese Ergebnisse sind im Hinblick auf die Tatsache, daß andere Peptide, die Teilen der HTLV-III-Hüllproteine entsprechen, gegen das Virus HTLV-III gerichtete Antikörper nicht selektiv erkennen können, sehr überraschend.
- Die vorliegende Erfindung umfaßt ferner die Entdeckung, daß die Erkennung von gegen das Virus HTLV-III gerichteten Antikörpern erheblich verstärkt wird, wenn die obengenannten Peptide oder das Peptid RILAVERYLKDQQLLGIWGCS (XV) in Kombination unter Einhaltung einer speziellen Auswahlvorschrift verwendet werden. Speziell wurde entdeckt, daß eine verstärkte Erkennung erreicht wird durch Auswählen von 2 oder mehreren der oben beschriebenen Peptide oder des Peptids RILAVERYLKDQQLLGIWGCS (XV), worin ein erstes der Peptide die gp41-Proteinsequenz:
- CSGKLIC (I)
- enthält. Vorzugsweise enthält dieses erste Peptid mindestens diese sieben Aminosäurereste, und noch mehr bevorzugt mindestens eine aus zwölf Aminosäureresten bestehende Sequenz des gp41-Proteins, welche die Sequenz der Formel (I) einschließt.
- Die Kombination von Peptiden sollte auch mindestens ein zweites Peptid einschließen, worin das Peptid mindestens die Aminosäurerestesequenz von
- LLG(X)W (XVI)
- einschließt, worin X ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus I, L, M oder F. Es sollte beachtet werden, daß X der Position 602 des gp41-Proteins entspricht, und wenn X I ist, die Sequenz der Formel (XVI) der Position 599 bis 603 des gp41-Proteins entspricht. Andererseits wird angenommen, daß auf der Basis einer Untersuchung des Sequenzvergleichs von HIV-Isolaten im kritischen Bereich des gp41-Proteins die Ersetzung von I an dieser Position, 602, durch L, M oder F antigenisch äquivalent ist. Dieses zweite Peptid sollte zusätzlich zum Einschluß der Sequenz der Formel (XVI) auch eine Gesamtzahl von mindestens fünfzehn Aminosäureresten in einer Sequenz, die in dem gp41-Protein gefunden wird, einschließen. Mit anderen Worten umfaßt das zweite Peptid die Sequenz
- ZLLGXWZ';
- worin X ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus I, L, M oder F;
- worin Z ausgewählt ist aus der Aminosäurerestesequenz des gp41-Proteins des Virus HTLV-III, die sich unmittelbar benachbart zur Aminoseite des L-Leucinrests an der 599. Position des gp41-Proteins befindet;
- worin Z' ausgewählt ist aus der Aminosäurerestesequenz des gp41-Proteins des Virus HTLV-III, die sich unmittelbar benachbart zur Carboxyseite des L-Tryptophanrests an der 603. Position des gp41-Proteins befindet; und
- worin Z und/oder Z' 0 Reste lang sein kann, und worin Z und Z' zusammen wenigstens 10 Reste umfassen.
- Die Kombination der Peptide (IV) oder (XII) mit den Peptiden (III), (XIII) oder (X) ist besonders bevorzugt. Die Kombination von (III) und (IV) oder (XIII) und (IV) sind die Kombinationen der Wahl.
- In Anbetracht dieser Ergebnisse ist klar, daß eine signifikante antigene Determinante des Virus HTLV-III, welche mit HTLV-III-Antikörpern reagiert, in den Peptiden mit den sieben Aminosäureresten enthalten ist, welche die Sequenz der oben beschriebenen Formel (I) enthalten. Darüber hinaus ist beobachtet worden, daß, obwohl jedes der erfindungsgemäßen Peptide mit den meisten HTLV-III-positiven Seren reagiert, einzelne Seren von Patienten spezifisch mit einem der erfindungsgemäßen Peptide reagieren, aber mit anderen nicht. Diese Beobachtung zeigt an, daß zusätzliche antigene Determinanten in längeren Peptiden vorhanden sind, welche die Sequenz der Formel (I) enthalten, wie etwa in den Peptiden (II) bis (XI). Ein Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet der Peptidsynthese ist durchaus in der Lage, Fragmente der erfindungsgemäßen Peptide herzustellen, um antigene und immunogene Fragmente darin zu bestimmen. Dementsprechend werden solche antigenen und immunogenen Fragmente als Teil der vorliegenden Erfindung angesehen. Darüber hinaus würde ein Fachmann auch erkennen, daß längere Peptide, die einem Teil des HTLV-III-Hüllpeptids entsprechen und mit der Lehre hier übereinstimmen, bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung wirksam sein würden. Dementsprechend werden solche längeren Peptide ebenfalls als Teil der vorliegenden Erfindung angesehen.
- Die Peptide der Erfindung enthalten mindestens einen Cysteinrest, und in bestimmten Fällen zwei solcher Reste. Dementsprechend können die erfindungsgemäßen Peptide in verschiedenen oxidierten Formen vorkommen. Zusätzlich zu der monomeren Form, in welcher die Sulfhydrylgruppe des Cysteinrests (der Cysteinreste) reduziert ist, können auch dimere oder polymere Formen existieren, in denen Sulfhydrylgruppen an zwei oder mehreren Peptidmolekülen oxidiert werden und Disulfidbindungen bilden. Während erfindungsgemäße Peptide, die nur einen Cysteinrest besitzen, nur lineare Dimere bilden können, können diejenigen, die zwei Cysteinreste besitzen, cyclische Monomere oder lineare oder cyclische Dimere und lineare Polymere verschiedener Länge bilden. Diese verschiedenen oxidierten Formen werden als Teil der vorliegenden Erfindung angesehen und sind in dem Ausdruck "erfindungsgemäße Peptide" eingeschlossen.
- Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zum Nachweisen oder Bestimmen von gegen HTLV-III gerichteten Antikörpern und einen diagnostischen Kit zum Bestimmen oder Nachweisen von gegen HTLV-III gerichteten Antikörpern unter Verwendung von einem oder mehreren synthetischen Peptiden der Erfindung bereit. Das erfindungsgemäße Verfahren zum Nachweisen oder Bestimmen von gegen HTLV-III gerichteten Antikörpern in einer Flüssigkeit, die vermutlich diese Antikörper enthält, z. B. Blut, Serum, Plasma, Speichel oder Urin, umfaßt die Schritte:
- a) Bereitstellen wenigstens eines an eine feste Oberfläche angehefteten erfindungsgemäßen Peptids oder eines antigenischen Fragments davon;
- b) Inkontaktbringen dieser mit einem Peptid beschichteten festen Oberfläche mit der zu analysierenden Flüssigkeit für eine Zeitdauer, die ausreichend ist, daß eine immunologische Reaktion stattfinden kann; und
- c) Nachweisen oder Bestimmen des Vorhandenseins oder der Menge an Antikörpern, die an das Peptid oder an das antigenische Fragment gebunden sind.
- In Abhängigkeit von dem eingesetzten Nachweisverfahren kann es nützlich sein, die feste Oberfläche von der Flüssigkeit abzutrennen und ungebundenes Material von dem Material der festen Oberfläche nach Schritt b) abzuwaschen. Wenngleich die spezielle Nachweismethode nicht kritisch ist, wurde gefunden, daß enzymmarkiertes Anti-Human-Immunglobulin gute Ergebnisse bringt. Der erfindungsgemäße diagnostische Kit zum Durchführen dieses Verfahrens umfaßt eine feste Oberfläche mit wenigstens einem erfindungsgemäßen Peptid oder einem antigenischen Fragment davon, welches daran gebunden ist, und markiertes (vorzugsweise enzymmarkiertes) anti-Human- Immunglobulin. Andere herkömmliche Materialien zum Markieren von Antikörpern können ebenfalls verwendet werden, wie z. B. Biotin oder ein Radioisotop.
- Zusätzlich stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Herstellen von gegen Peptid gerichteten Antikörpern bereit, die zum Nachweis des Virus HTLV-III oder eines viralen Antigens geeignet ist, welches das Immunisieren eines Wirtstieres mit einem erfindungsgemäßen Peptid oder einem immunogenen Fragment davon in polymerisierter Form oder an einen geeigneten immunogenen Träger angeheftet umfaßt. Das Verfahren zum Herstellen von gegen HTLV-III gerichteten polyklonalen Antikörpern umfaßt das Immunisieren eines Wirtstiers mit wenigstens einem erfindungsgemäßen Peptid oder einem immunogenen Fragment davon in polymerisierter Form oder angeheftet an einen geeigneten immunogenen Träger und das Entnehmen von Blut von dem Wirt. Das Verfahren zum Herstellen von gegen HTLV-III gerichteten monoklonalen Antikörpern umfaßt das Immunisieren eines Wirtstiers mit wenigstens einem erfindungsgemäßen Peptid oder einem immunogenen Fragment davon in polymerisierter Form oder angeheftet an einen geeigneten immunogenen Träger, Isolieren der Splenocyten aus dem immunisierten Wirt, Fusionieren der Splenocyten mit einer geeigneten Myelomzellinie, Auswählen der fusionierten Zellen durch Reaktionsfähigkeit gegenüber dem immunisierenden Peptid oder Fragment, gegenüber HTLV- III, oder gegenüber mit HTLV-III infizierten Zellen, und entweder Kultivieren der ausgewählten Hybridomas in vitro oder Injizieren derselben in einen geeigneten Wirt. Der daraus hervorgehende gewünschte monoklonale Antikörper kann aus dem Überstand über dem kultivierten Hybridoma oder aus dem Serum oder Aszites des angeimpften Wirts gewonnen werden.
- Die gegen Peptid gerichteten Antikörper selbst, das Verfahren zum Nachweisen des Virus HTLV-III unter Verwendung der Antikörper und diagnostische Kits, die den Antikörper enthalten (brauchbar zum Nachweis des Virus HTLV-III) sind ebenfalls in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen.
- Ein Sandwich-Verfahren zum Nachweisen oder Bestimmen des Virus HTLV-III oder von virusspezifischen Antigenen in einer Flüssigkeit, die vermutlich das Virus oder Antigen enthält, umfaßt die Schritte:
- a) Bereitstellen eines gegen wenigstens ein erfindungsgemäßes Peptid oder immunogenes Fragment davon gerichteten Antikörpers, wobei der Antikörper an eine feste Oberfläche angeheftet ist;
- b) Inkontaktbringen der mit dem Antikörper beschichteten festen Oberfläche mit der zu analysierenden Flüssigkeit für eine Zeitdauer, die ausreichend ist, daß eine immunologische Reaktion stattfinden kann; und
- c) Nachweisen oder Bestimmen des Vorhandenseins oder der Menge an HTLV-III-Virus oder der virusspezifischen Antigene, die an die Antikörper auf der festen Oberfläche angeheftet sind.
- In Abhängigkeit von dem eingesetzten Nachweisverfahren kann es nützlich sein, die feste Oberfläche von der zu analysierenden Flüssigkeit abzutrennen und ungebundenes Material von der festen Oberfläche nach Schritt b wegzuwaschen.
- Ein Kompetitionsverfahren zum Nachweisen oder Bestimmen von HTLV-III-Virus oder virusspezifischem Antigen in einer Flüssigkeit, die vermutlich das Virus oder Antigen enthält, umfaßt die Schritte:
- a) Bereitstellen eines gegen wenigstens ein erfindungsgemäßes Peptid oder ein immunogenes Fragment davon gerichteten Antikörpers, wobei der Antikörper an eine feste Oberfläche angeheftet ist;
- b) Mischen eines Aliquots der zu analysierenden Flüssigkeit mit einer bekannten Menge des markierten erfindungsgemäßen Peptids, um ein Probengemisch herzustellen;
- c) Inkontaktbringen der mit dem Antikörper beschichteten festen Oberfläche mit dem Probengemisch für eine Zeitdauer, die ausreichend ist, daß eine immunologische Reaktion stattfinden kann;
- d) Trennen der festen Oberfläche vom Probengemisch;
- e) Nachweisen oder Bestimmen des Vorhandenseins oder der Menge an markiertem Peptid, das entweder an die feste Oberfläche gebunden ist oder im Probengemisch verbleibt; und
- f) Bestimmen des Vorhandenseins oder der Menge des Virus oder Antigens in der Flüssigkeit durch das Ergebnis in Stufe
- Der diagnostische Kit zum Nachweisen oder Bestimmen von Virus HTLV-III durch ein Sandwich- oder Kompetitionsverfahren umfaßt:
- a) eine feste Oberfläche, an die ein gegen wenigstens ein erfindungsgemäßes Peptid oder ein immunogenes Fragment davon gerichteter Antikörper gebunden ist; und
- b) eine bekannte Menge eines markierten gegen HTLV-III, gegen ein virusspezifisches Antigen, gegen ein erfindungsgemäßes Peptid oder ein immunogenes Fragment davon gerichteten Antikörpers (für einen Sandwichassay); oder eine bekannte Menge eines markierten erfindungsgemäßen Peptids (für einen Kompetitionsassay).
- Eine der prophylaktischen und therapeutischen Anwendungen der erfindungsgemäßen Peptide schließt das Immunisieren eines Tiers gegen das Virus HTLV-III ein, welches das parenterale Verabreichen einer immunogen wirksamen Menge von wenigstens einem erfindungsgemäßen Peptid oder einem immunogenen Fragment davon in polymerisierter Form oder an einen immunogen wirksamen Träger angeheftet an das Tier umfaßt. Ein zweiter Aspekt der therapeutischen Anwendung der erfindungsgemäßen Peptide schließt das Behandeln eines Tieres mit einer latenten oder tatsächlichen HTLV-III-Virus-Infektion ein, welches das parenterale Verabreichen einer Menge von wenigstens einem Peptid der Erfindung oder von einem immunogenen Fragment davon in polymerisierter Form oder angeheftet an einen immunogen wirksamen Träger umfaßt, wobei die Menge wirksam ist, um die HTLV-III-Virus-Infektion zu behandeln. In noch einer weiteren therapeutischen Anwendung können Antikörper, die gegen die erfindungsgemäßen Peptide hergestellt wurden, mit toxischen oder medizinischen Substanzen verbunden werden und gegen infizierte Zellen gerichtet werden. Ein letzter therapeutischer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine Zusammensetzung von Material, welches eine immunogene Menge von wenigstens einem Peptid der Erfindung oder einem immunogenen Fragment davon in polymerisierter Form oder angeheftet an einem immunogen wirksamen Träger umfaßt, welche zur Verwendung in jedem der obengenannten Verfahren geeignet ist.
- Ein erfindungsgemäßes Peptid oder ein antigenisches Fragment davon kann auch verwendet werden, um die Spezifität des erfindungsgemäßen Peptidtests zu verbessern und somit die Abhängigkeit vom schwierigeren Western-Blot-Bestätigungstest zu verringern. Die Genauigkeit eines positiven Ergebnisses in dem Test mit dem erfindungsgemäßen Peptid kann durch Wiederholen des Tests in Gegenwart einer wirksamen Blockierungsmenge eines erfindungsgemäßen Peptids oder eines antigenen Fragments davon bestätigt werden. Wenn das Binden der angenommenen HTLV-III-Antikörper an die Platte durch das zugegebene Peptid, Fragment oder Protein blockiert wird, ist das ursprüngliche positive Ergebnis bestätigt; wenn die Bindung nicht blockiert wird, war das ursprüngliche Ergebnis ein falsch (nicht-spezifisch) positives Ergebnis.
- Die vorliegende Erfindung schließt deshalb auch ein Verfahren zum Bestimmen der Genauigkeit eines positiven Ergebnisses, das in einem Test auf gegen HTLV-III gerichtete Antikörper in einer Flüssigkeitsprobe, die vermutlich diese Antikörper enthält, erhalten wird, ein, wobei der Test ein Sandwich-Assay ist, bei dem ein synthetisches HTLV-III-Peptid an die feste Oberfläche angeheftet ist, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt:
- a) Mischen eines Aliquots der Probe mit einer wirksamen Blockierungsmenge eines erfindungsgemäßen Peptids oder eines antigenischen Fragments davon, um ein Probengemisch herzustellen;
- b) Inkontaktbringen des Probengemischs mit der festen Phase des Tests für eine Zeitdauer, die ausreichend ist, daß eine immunologische Reaktion stattfinden kann;
- c) Bestimmen, ob das Binden der Antikörper im Probengemisch an die feste Phase gehemmt ist, im Vergleich zum Binden in der Abwesenheit des Peptids oder Fragments; und
- d) Bestimmen der Genauigkeit des positiven Ergebnisses auf der Grundlage des Vorhandenseins oder der Abwesenheit der Hemmung.
- Der Ausdruck "wirksame Blockierungsmenge" des erfindungsgemäßen Peptids oder Fragments bedeutet eine Menge, die im wesentlichen vollständig mit allen HTLV-III-Antikörpern reagiert, welche gegen die in dem Peptid oder Fragment enthaltene(n) antigenische(n) Determinante(n) gerichtet sind, welche in der untersuchten Probe vorhanden sind, und somit im wesentlichen die Reaktion dieser Antikörper mit dem Peptid auf der festen Oberfläche des Assays blockiert. Der Sandwichassay ist vorzugsweise ein ELISA-Assay.
- Die erfindungsgemäßen Peptide können durch jede herkömmliche Methode hergestellt werden (einschließlich von rDNA-Technologie und Flüssigphasensynthesemethoden), obwohl eine Festphasensynthese vom Merrifield-Typ ein bequemer Weg zur Herstellung und Isolierung des Peptids ist. Eine weitere Beschreibung dieser Methode und anderer im Fachgebiet bekannten Methoden kann in der Literatur gefunden werden, d. h. M. Bodanszky, et al., Peptide Synthesis, John Wiley & Sons, Second Edition, 1976, ebenso wie in anderen Literaturarbeiten, die Fachleuten bekannt sind. Synthesemethoden (im Gegensatz zu rDNA-Methoden) sind aus Gründen der Reinheit, der antigenischen Spezifität, der Freiheit von unerwünschten Nebenprodukten, der Leichtigkeit der Herstellung udgl. bevorzugt. Geeignete Schutzgruppen, die bei solchen Synthesen verwendet werden können und ihre Abkürzungen finden sich im obengenannten Text ebenso wie in J.F.W. McOmie, Protective Groups in Organic Chemistry, Plenum Press, New York, 1973. Diese beiden Bücher werden hierin per Bezugnahme mit aufgenommen.
- Typische Träger, an die die erfindungsgemäßen Peptide zur Erzeugung von gegen Peptid gerichteten Antikörpern oder zur Herstellung von therapeutischen Formen der erfindungsgemäßen Peptide angeheftet werden können, schließen z. B. Rinderserumalbumin; Tetanustoxoid; K.L.H.; Schweine-, Rinder- oder Pferdeimmunglobulin und die B-Untereinheit von Cholera- oder wärmelabilem E. Coli-Toxin ein.
- Um die therapeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung herzustellen, wird ein erfindungsgemäßes Peptid oder Fragment in polymerisierter Form oder an einen geeigneten immunogenen Träger angeheftet als aktiver Bestandteil in inniger Vermischung mit einem parenteral verträglichen pharmazeutischen Träger kombiniert. Dieser Träger umfaßt gewöhnlich steriles Wasser, obwohl andere Bestandteile zur Unterstützung der Löslichkeit oder für Konservierungszwecke (z. B. Thimerosal oder Methylparabene) eingeschlossen werden können. Es können auch injizierbare Suspensionen hergestellt werden, in diesem Fall können geeignete flüssige Träger, Suspendiermittel udgl. eingesetzt werden. Diese Zusammensetzungen können auch einen Immunstimulator wie Thymopentin oder Interleukin II oder andere Hilfsmittel wie Aluminiumhydroxid oder B.C.G. enthalten.
- Die Strukturen der erfindungsgemäßen Peptide sind in dem herkömmlichen ein-Buchstaben-Code für Aminosäuren angegeben und sind von links nach rechts zu lesen, was der Amino-nach- Carboxy-Richtung der Sequenz entspricht. Zur Erleichterung für den Leser werden die ein-Buchstaben-Codes für die in den erfindungsgemäßen Peptiden enthaltenen Aminosäuren angegeben:
- I = L-Isoleucin; W = L-Tryptophan; G = Glycin; C = L-Cystein; S = L-Serin; K = L-Lysin; L = L-Leucin; T = L-Threonin; A = L-Alanin; V = L-Valin; P = L-Prolin; D = L-Asparaginsäure; N = L-Asparagin; E = L-Glutaminsäure; R = L-Arginin; y = L-Tyrosin; Q = L-Glutamin; M = L-Methionin; und F = L-Phenylalanin.
- Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht.
- Chlormethyliertes Styrol-Divinylbenzol-Polymer, welches 1,3 meq Chlorid/g des Harzes enthielt, wurde mit Boc-Prolin in wasserfreiem N,N-Dimethylformamid (DMF) unter Verwendung von Kaliumiodid (KI) als katalytisch wirksames Mittel verestert. Die Reaktion wurde bei 55ºC 24 Std. lang durchgeführt (1).
- Die Substitution von Boc-Prolin betrug 0,92 mMol/g, was unter Verwendung eines Picrinsäureassays an einem Teil des entblockierten Harzes bestimmt wurde.
- Die Synthese des Peptids der Formel (II) wurde unter Verwendung der klassischen Merrifield-Methode (2) ausgeführt. Die Peptidsequenz "IWGCSGKLICTTAVP" wurde mit einem Peptidsyntheseautomat Vega 250C unter Verwendung eines Doppelkupplungsprogramms synthetisiert. 1,8326 g Boc-Prolin-Harz wurde im wesentlichen mit den folgenden Boc-L-Aminosäuren (3,8) in einem 12 meq-Überschuß zweifach gekuppelt:
- Aminosäure Lösungsmittel
- Das Peptid wurde von dem Harz mit 10% Anisol in Fluorwasserstoffsäure abgespalten und mit 20%iger wässeriger Essigsäure extrahiert. Diese Lösung wurde filtriert, um festes Harz zu entfernen und über eine Fractogel TSK HW-40F Entsalzungssäule unter Verwendung eines Elutionsmittels aus 20%iger wässeriger Essigsäure laufen gelassen. Die Fraktionen wurden in 10 ml-Aliquots gesammelt und der Säulenausfluß bei 280 nm beobachtet. Fraktionen, die eine positive Extinktion bei 280 nm aufwiesen, wurden mit 0,1%iger Trifluoressigsäure (TFA) in Wasser verdünnt und durch Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) untersucht (4). Es wurde festgestellt, daß der Hauptextinktionspeak bei 214 nm eine Retentionszeit von 12,42 min hatte. Die Fractogel-Fraktionen, die mehr als 70% dieses Peaks enthielten, wurden vereinigt und als Fr:1 bezeichnet. Die Fractogel-Fraktionen, die weniger als 70%, aber mehr als 50% dieses Peaks enthielten, wurden vereinigt und als Fr:2 bezeichnet.
- Die analytische HPLC (4) von Fr:1 zeigte, daß der 12,42 min- Peak 87% der gesamten Fläche ausmachte. Fr:1 wurde ferner durch Aminosäureanalyse (5), Sequenzbestimmung (6), und Bestimmung des prozentualen Peptidgehalts (7) charakterisiert. Die Peptidsequenzanalyse (6) wurde auch an dem Peptid-Harz durchgeführt, um die erwartete Sequenz des Peptids zu bestätigen.
- (1) Stewart & Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2. Ausgabe (1984), Pierce Chemical Co.
- (2) Merrifield, R.B. (1963), J. Amer. Chem. Soc. 85, S. 2149-2154.
- (3) Alle Boc-Aminosäuren wurden von Bachem Inc., Torrance, Calif., erhalten.
- (4) Bedingungen der analytischen HPLC:
- Puffer A: 0,1% TFA/destilliertes entionisiertes Wasser
- Puffer B: 0,1% TFA/Acetonitril in HPLC-Qualität Gradientenbedingungen: 10% "B" bis 50% "B" während 20 min
- Wellenlänge: 214 nm
- Fluß: 1,0 ml/min
- Säule: Vydac 214TP54 C-4 Proteinsäule, 250 · 4,5 mm
- (5) Die Aminosäureanalyse wurde mit einem LKB 4150 Alpha- Aminosäure-Analysegerät durchgeführt.
- (6) Die Peptidsequenzbestimmung wurde mit einem Proteinsequenziergerät 470A von Applied Biosystems durchgeführt.
- (7) Der Peptidgehalt wurde aus der Rückgewinnung bei der Aminosäureanalyse einer bekannten Menge an Peptid bestimmt.
- (8) Boc ist eine chemische Abkürzung für die Alpha-Aminoschutzgruppe tert-Butyloxycarbonyl. Die funktionelle Gruppe wird durch Hydrolyse in 50% Trifluoressigsäure (TFA)/50% Dichlormethan (CH&sub2;Cl&sub2;) entfernt, nachdem die Aminosäure an die wachsende Peptidkette angehängt worden ist. Dieser Vorgang legt das Aminoende der Kette frei, um eine wirksame Ankopplung der nächsten Aminosäure zu ermöglichen.
- Zusätzlich zu der Boc-Schutzgruppe an jeder Aminosäure werden die Seitenketten einiger Aminosäuren darüber hinaus vor dem Angriff durch die Reagentien der Peptidsynthese geschützt. Diese Schutzgruppen, die in Klammern in der Aufstellung aufgeführt sind, sind alle unter den Bedingungen der Peptidsynthese stabil, werden aber dennoch leicht von der Aminosäure während der Spaltung in Fluorwasserstoffsäure entfernt. Anisol (Methylphenylether) wirkt als nukleophiler Abfänger während des HF-Spaltungsschritts, um die Alkylierung des Peptids durch die Carboniumionen der freigesetzten Schutzgruppe zu verhindern. Die Schutzgruppen für die aufgeführten Aminosäuren sind unten definiert:
- O-Benzyl: Benzylester; gebunden an die Hydroxylseitenkette sowohl von Serin als auch Threonin, um die Acylierung oder Verzweigung der Peptidkette zu verhindern.
- MeObzl: 4-Methoxybenzyl; gebunden an die Sulfhydrylgruppe von Cystein, um seine Oxidation während der Peptidsynthese zu verhindern.
- Cl-Z: 2-Chlorbenzyloxycarbonyl; gebunden an die Alpha-Aminogruppe von Lysin, um das Seitenkettenwachstum von dieser Stelle des Peptids aus zu verhindern.
- Das in dem Fr:1-Pool von Teil B enthaltene Peptid wurde lyophilisiert, um Essigsäure zu entfernen, und auf 200 ug/ml in 0,1 M Natriumbicarbonat-Puffer von pH 9,0 solubilisiert. Aliquots dieses Peptids, die auf 20 ug/ml in Natriumbicarbonatpuffer verdünnt worden waren, wurden verwendet, um Mikrotiternäpfe für die in Tabelle IV gezeigten ELISAs zu beschichten. Für die unten in den Tabellen I-III gezeigten Tests wurde Peptid in Wasser auf 10 mg/ml solubilisiert und in Phosphatpuffer mit pH 7,3 bis auf 5 ug/ml zum Beschichten von Mikrotiternäpfen verdünnt. Das Peptid in Fr:1 liegt hauptsächlich in einer einzigen Form vor, von der angenommen wird, daß es das nicht oxidierte Monomer ist. Da das Peptid der Formel (II) zwei Cysteine enthält, polymerisiert es jedoch bei der Solubilisierung in neutralem oder basischem wässerigen Puffer. Das in den unten beschriebenen ELISAs verwendete Peptid ist ein Gemisch aus sehr kleinen Mengen von linearem Monomer und größeren Mengen von cyclischem Monomer (gebildet durch intramolekulare Disulfidbindung) und noch größeren Mengen von Polymeren (gebildet durch intermolekulare Disulfidbindung) mit verschiedenen Größen. Ohne dadurch festgelegt werden zu wollen, glauben die Anmelder, daß die Polymerformen für die hierin beschriebenen Reaktivitäten wichtig sind. Es wird angenommen, daß die cyclische Monomerform, wenngleich sie einen Teil der Antigenität der Polymerform beibehält, weniger wirksam an die Mikrotiternäpfe bindet und sich weniger als Festphasenkomponente des ELISAs eignet. Das mutmaßliche cyclische Monomer tritt als scharfer Peak bei einer Retentionszeit von etwa 12,7 min bei der HPLC-Analyse auf, während das Polymer als breiter Peak bei einer Retentionszeit von annähernd 15,9 min gekennzeichnet ist. Die Oxidationsbedingungen können im Hinblick auf die Temperatur, den pH-Wert, die Peptidkonzentration udgl. geändert werden, wie es Fachleuten bekannt ist, um den Anteil des Monomers, cyclischen Monomers und Polymers, das in dem Präparat verbleibt oder die Größe der gebildeten Polymere zu ändern. Kleine Mengen von sogenannten Deletionspeptiden (welchen eine oder mehrere Aminosäuren fehlen) und ihre Oxidationsformen können ebenfalls in den Peptidpräparaten, die in dem ELISA verwendet werden, gefunden werden, aber diese geringen Verunreinigungen beeinträchtigen die Verwendung des Peptids nicht.
- Die Synthese dieser Peptide wurde ausgeführt, wobei im wesentlichen die gleiche klassische Merrifield-Methode verwendet wurde, die zuvor für Peptid (II) beschrieben wurde. Für Peptid (III) wurde Boc-Serin-Harz mit einer Substitution von 0,92 mMol/g verwendet. Für Peptid (IV) wurde Boc-Isoleucin- Harz mit einer Substitution von 0,8 mMol/g verwendet. Die Synthese der Boc-Serin- und Boc-Isoleucin-Harze wurde durch das Gisin-Verfahren, das von Stewart & Young (1) beschrieben ist, ausgeführt.
- "IWGCSGKLICTTAVPWNAS" unter Verwendung der folgenden Boc-L- Aminosäuren in zwölf meq Überschuß synthetisiert:
- Aminosäure Lösungsmittel
- "AVERYLKDQQLLGIWGCSGKLI" unter Verwendung der folgenden Boc- Aminosäuren in 12 meq Überschuß synthetisiert:
- Aminosäure Lösungsmittel
- Wie beim Peptid (II) werden zusätzlich zu der Boc-Schutzgruppe an jeder Aminosäure die Seitenketten von einigen Aminosäuren zusätzlich vor dem Angriff durch die Reagentien der Peptidsynthese geschützt. Zusätzlich zu diesen Schutzgruppen, die bei den Aminosäuren bei der Synthese des Peptids(II) beschrieben sind, wurden die folgenden Schutzgruppen für die Aminosäuren verwendet, die ausschließlich in den Peptiden (III) und (IV) auftreten:
- Hobt: 1-Hydroxybenzotriazol; wird in äquimolaren Mengen zu Glutamin und Asparagin während der Kupplung verwendet, um die Dehydratisierung zu den Nitrilformen zu verhindern.
- Tosyl: p-Toluolsulfonyl; wird verwendet, um die Guanidingruppe in der Seitenkette von Arginin zu acylieren.
- Bzl: Beta-Benzylester; blockiert die Carboxylgruppen in der Seitenkette von Asparaginsäure und Glutaminsäure.
- BrZ: 2-Brombenzyloxycarbonyl; blockiert die Hydroxylgruppe in der Seitenkette von Tyrosin.
- Die Peptide wurden von dem Harz abgespalten, filtriert, mit Essigsäure extrahiert und über eine Fractogel- Entsalzungssäule wie in Beispiel I laufen gelassen. Für das Peptid (IV) wurden die Fractogel-Fraktionen durch analytische HPLC analysiert und Fraktionen, die mindestens 30% der gesamten Absorption bei 214 nm als Hauptpeak enthielten, welche bei einer Retentionszeit von annähernd 14 min auftraten, wurden vereinigt. Die vereinigten Fraktionen wurden auf Carboxymethylcellulose chromatographiert, die mit 0,01 M Ammoniumacetat, pH 4,4, äquilibriert worden war. Die Säule wurde mit einem Ammoniumsacetat-Stufengradienten eluiert, und die Fraktion, die bei 0,2 M Ammoniumacetat eluierte, wurde gesammelt, lyophilisiert und durch analytische HPLC analysiert. Der Hauptpeak, der bei einer Retentionszeit von 14 min auftrat, umfaßte zwischen 30 und 40% der gesamten Absorption bei 214 nm, und das Material hatte einen annehmbaren Aminosäuregehalt. Dieses Material wurde wieder aufgelöst und in einem ELISA wie für Peptid (II) beschrieben verwendet.
- Für Peptid (III) wurden Fractogel-Fraktionen ebenso durch analytische HPLC analysiert. Fraktionen, die mindestens 70% der gesamten Absorption bei 214 nm als Hauptpeak enthielten, der bei einer Retentionszeit von annähernd 12,99 min auftrat, wurden vereinigt, lyophilisiert und durch HPLC und auf den Aminosäuregehalt hin analysiert. Dieses Material wurde wieder in Lösung gebracht und in einem ELISA wie für Peptid (II) beschrieben verwendet.
- Wenn sie in Kombination als Festphasenkomponente in einem ELISA verwendet wurden, wurden jeweils 1 ug der Peptide (III) und 0,5 ug des Peptids (IV) pro Mikrotiternapf verwendet. Das Peptid wurde entweder auf dem Napf bei 37ºC getrocknet oder auf die Platte durch Inkubation über Nacht bei 4ºC "naß gepackt".
- C. Für Peptid (V) wurde Boc-Serin-Harz verwendet, wie für die Synthese von Peptid (III) beschrieben. Die Synthese von (V) verlief wie bei der Synthese von (III) beschrieben durch die Addition des C-terminalen Isoleucins von Peptid (III). Von diesem Punkt an wurde zur Vervollständigung der (V)-Sequenz das Verfahren zur Addition der Aminosäuren in der Sequenz AVERYLKDQQLLG in Peptid (IV) befolgt.
- Peptid (V) wurde von dem Harz abgespalten, filtriert, mit Essigsäure extrahiert und über eine Fractogel-Entsalzungssäule wie in Beispiel I beschrieben laufen gelassen. Fractogel-Fraktionen, die den Hauptabsorptionspeak bei 280 nm enthielten, wurden vereinigt und als Fr:1 bezeichnet. Fr:1 wurde auf seinen Aminosäuregehalt hin untersucht und erwies sich als annehmbar. Diese Fraktion wurde lyophilisiert und in einem ELISA wie bei Peptid (II) beschrieben verwendet.
- D. Unter Befolgung ähnlicher Verfahren wurden die Peptide der Formeln (I), (VI) bis (XVI) hergestellt.
- E. Polymerisierung der Peptide (III), (IV) und (V):
- Die Peptide (I) bis (III), (V) und (VII) bis (X) enthalten zwei Cysteine. Dementsprechend können diese Peptide durch oxidative Disulfidbindung polymerisieren und cyclisieren. Die Addition der vier Aminosäuren am C-terminalen Ende von (III) ermöglicht offensichtlich der cyclischen Form des Peptids, an den Kunststoff in dem ELISA-Assay zu binden. Infolgedessen ist die cyclische Form von (III) in einem Festphasen-ELISA wirksamer als das cyclische (II). Die Formen der Peptide (II), (III) und (V), die bisher in einem ELISA verwendet wurden, um auf die HTLV-III-Antikörpererkennung zu testen, waren typischerweise ein Gemisch aus linearem Monomer, cyclischem Monomer, Dimer und Polymer.
- Die Peptide (IV), (VI) und (XI) enthalten nur ein Cystein. Diese Peptide können eine Dimerstruktur über eine Disulfidbindung bilden.
- Unter den Bedingungen der Solubilisierung der Peptide bei der Herstellung für einen ELISA (z. B. 0,1 M Natriumbicarbonatpuffer mit pH 9,0) wurden die meisten der Sulfhydrylgruppen der Peptide (II), (III), (IV) und (V) in die Disulfidform umgewandelt.
- Unter Befolgung ähnlicher Verfahren wie dem der Beispiele II und III wurden für Vergleichszwecke Peptide mit den folgenden Formeln synthetisiert:
- QLQARILAVERY (C-I),
- AVERYLKDQQLLG (C-II),
- LKDQQLLGIWGCS (C-III),
- IWGCSGKLI (C-IV), und
- LICTTAVPWNASWSN (C-VIII).
- Diese Peptide haben jeweils Sequenzen, welche der Sequenz auf der HTLV-III-Hülle entsprechen, aber nicht mit der Lehre dieser Erfindung übereinstimmen. Im einzelnen sind die Peptide mit der Formel (C-I) und (C-II) Sequenzen stromaufwärts vom Aminoende der Sequenz der Formel (I), d. h., CSGKLIC. Peptide mit der Formel (C-III) enthalten nur den aminoterminalen Teil der Sequenz der Formel (I). Peptide mit der Formel (C-IV) enthalten die volle Sequenz von Formel (I), mit Ausnahme des carboxyterminalen L-Cystein-Rests. Peptide mit der Formel C-VIII sind Sequenzen stromabwärts vom Carboxyende der Sequenz der Formel (I), und wie hierin beschrieben wird, weist keines dieser Peptide die gewünschten immunreaktiven Eigenschaften auf.
- (1) ELISA-Platte mit Peptid beschichten - 1 ug/50 ul/Napf in 0,1 M NaHCO&sub3; pH 9.
- (2) Platten über Nacht unbedeckt bei 37ºC trocknen lassen; dann mit PBS waschen.
- (3) Platten mit 300 ul 5% NCS-PBS/Napf 2 Std. lang bei 37ºC blockieren.
- (4) Blockierungspuffer ausschütteln und gut abtropfen lassen.
- (5) 50 ul Testantiseren/Napf 30 bis 120 min lang bei 37ºC zugeben. (Wenn die Antiseren verdünnt werden sollen, T- Waschlösung verwenden.) Wir haben 1 : 2 bis 1 : 100-Verdünnungen verwendet.
- (6) Testantiseren ausschütteln und Platte sechs Mal mit PBS-Tween20 waschen (Tween ist ein eingetragenes Warenzeichen).
- (7) 100 ul zweiten Antikörper/Napf, der 1 : 4000 mit T-Waschlösung verdünnt ist, zugeben. 30 bis 120 min bei 37ºC.
- (8) Zweiten Antikörper ausschütteln und Platte sechs Mal mit PBS-Tween20 waschen.
- (9) 100 ul OPD-Substrat/Napf (oder 5 ul ABTS-Lösung) 20 min lang bei Raumtemperatur zugeben.
- (10) 50 ul 4 N H&sub2;SO&sub4;/Napf zugeben, um die OPD-Reaktion anzuhalten (oder 100 ul 1% SDS/Napf für die ABTS-Reaktion).
- (11) Platte mit einem MR 600 Microplate ELISA-Plattenlesegerät ablesen. (490 nm für OPD oder 405 nm für ABTS)
- (1) 0,1 M NaHCO&sub3; pH 9.
- (2) PBS + 5% normales Kälberserum.
- (3) T-Waschlösung: (780 ml TBS + 20 ml NCS + 1,6 g BSA + 0,4 ml Tween20)
- TBS 12,11 g Tris Base
- 17,5 g NaCl
- 1800 ml H&sub2;O
- pH auf 7,6 mit HCl (ca. 3 N)
- Endvolumen auf 2000 ml
- (4) Waschpuffer/PBS-Tween20 : 0,5 ml Tween10/1 l PBS.
- (5) OPD-Substrat: 1 OPD-Tablette/3 ml H&sub2;O/1,24 ul 30%iges H&sub2;O&sub2;.
- (6) 4 N H&sub2;SO&sub4;.
- (7) ABTS: H&sub2;O&sub2; in einem 1 : 1 Volumenverhältnis der Lösungen, die von Kirkegaard und Perry Laboratories, Inc., Gaithersbury, Md. geliefert werden)
- ABTS = 2,2'-Azino-di-[3-ethyl-benzthiazolinsulfonat]
- (8) 1% SDS.
- Das in Schritt 1 zum Beschichten der ELISA-Platte verwendete Material ist ein Peptid der Formel (II), (III), (IV), (V), oder ein Gemisch davon, wie oben beschrieben. Der zweite Antikörper ist entweder ein im Handel erhältlicher Peroxidasemarkierter polyklonaler Antikörper (Cappel Laboratories Katalognr. 3201-0231; Peroxidase-konjugierte IgG-Fraktion von Ziegen-anti-Human-Immunglobulinen) oder ein Peroxidasemarkierter monoklonaler Mäuse-anti-Human-IgG-Antikörper oder ein Gemisch aus Peroxidase-markierten monoklonalen Mäuseanti-Human-IgG, IgA- und IgM-Antikörpern.
- (1). ELISA-Platte mit Peptiden beschichten - ug Peptid (IV), 0,5 ug Peptid (III) 200 ul/Napf in 0,1 M Carbonatpuffer, pH 9,6.
- (2). Platten über Nacht bei 4ºC inkubieren.
- (3). Platten mit 300 ul 1,0% BSA-PBS plus Additiven/Napf 2 Std. lang bei 37ºC blockieren.
- (4). Blockierungspuffer ausschütteln.
- (5). Platten 1,5 Std. lang bei 37ºC trocknen.
- (6). 200 ul 1% Rindergammaglobulin - 5% BSA - 0,5% Tween- PBS/Napf zugeben, pH ,7,2.
- (7). 10 ul Testseren/Napf zugeben, 30 min lang bei 37ºC inkubieren.
- (8). Testseren ausschütteln, Platte 5mal mit PBS-0,5% Tween waschen.
- (9). 200 ul/Napf monoklonales anti-Human IgG, welches 1 : 3500 mit 50%igem fötalem Kälberserum - 1% Pferdeserum - 0,5% Tween-PBS verdünnt ist, zugeben.
- (10). 30 min lang bei 37ºC inkubieren.
- (11). Testseren ausschütteln, Platte 5mal mit PBS-0,05% Tween waschen.
- (12). 200 ul OPD-Substrat/Napf zugeben und 30 min lang bei Raumtemperatur inkubieren.
- (13). 50 ul 4 N H&sub2;SO&sub4;/Napf zugeben, um die Reaktion anzuhalten.
- (14). Platte bei 490 nm in einem MR 600 Mikroplattenlesegerät ablesen.
- (1). Phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) pH 7,3
- 8,0 g Natriumchlorid
- 0,2 g Kaliumphosphat, einbasisch
- 1,16 g Natriumphosphat, zweibasisch
- 0,2 g Kaliumchlorid
- 0,2 g Thiomersal Wasser auf 800 ml und vermischen pH, wenn nötig, einstellen, Wasser auf 1 l zugeben
- (2). Beschichtungspuffer, pH 9,6 0,01 M Carbonatpuffer
- (3). Blockierungspuffer (1% BSA-PBS plus Additive) 1% Rinderserumalbumin (Sigma #A7030)
- 10 Ku/ml Aprotinin
- 10 ug/ml Trypsininhibitor
- 10 nM EACA (E-Aminocapronsäure)
- 0,5 mM PMSF (Phenyl-methyl-sulfonylfluorid)
- 2,0 mM EDTA
- 10% Glycerin
- 10,0 g Rindergammaglobulin, Fraktion II, lyophilisiert
- 50,0 g Rinderalbumin, Fraktion V
- 0,5 ml Polysorbat 20 (Tween 20)
- Wasser zugeben auf 1 l und vermischen
- Durch 0,2 um-Filter filtrieren.
- 490 ml PBS
- 500 ml durch Wärme inaktiviertes fötales Rinderserum
- 10 ml durch Wärme inaktiviertes Pferdeserum
- 0,1 g Thiomersal
- 0,329 g Kaliumferricyanid
- Wasser auf 1 l, vermischen, durch 0,2 um-Filter filtrieren
- Die in Beispiel IV, Vorschrift 1 beschriebenen ELISA-Kits, die mit dem Peptid (II) gemacht sind, wurden gegen eine Gruppe von Seren getestet, welche Seren von normalen Personen, Patienten mit Störungen oder Krankheiten, die nicht mit Aids zusammenhingen, bekannten AIDS-Patienten, bekannten ARC-Patienten und Patienten- deren Diagnose unbekannt ist, aber die in handelsüblichen Tests oder im Western-Blot-Assay Antikörper-positiv sind, umfassen. Die Ergebnisse sind in den Tabellen I bis IV zusammengefaßt. Zum Vergleich wurden die gleichen Serenproben mit im Handel erhältlichen Kits und durch Western-Blot-Assay untersucht. Die für diese Studien ausgewählten handelsüblichen Kits waren von Abbott Laboratories, North Chicago, III. und Electro-Neucleonics, Inc. (ENI), Columbia, Md.
- A. Tabelle 1 zeigt Ergebnisse mit normalen Seren. TABELLE I Untersuchung normaler Seren durch ELISA unter Verwendung des Peptids (II) Anzahl der Proben Abbott Assay Diagnose/Proben-Identifikations# Normal
- Mittelwert der Normalen = 0,016 für E8-Assay Standardabweichung (S.D.) von dem Mittel = 0,017 Ausschlußwert bei Mittelwert + S.D. = 0,104 Falschpositivrate in 200 Proben mit einem Ausschlußwert von 0,104 = 0,5% (1/209)
- NT = nicht untersucht
- Wie in der obigen Tabelle gezeigt ist, reagieren Seren von Personen, die keine gegen HTLV-III gerichteten Antikörper enthalten, im allgemeinen nicht auf das Peptid (II) in einem standard-ELISA. Dies ermöglicht die Berechnung eines Absorptionsausschlußwerts, um zwischen Antikörper-negativen und Antikörper-positiven Seren zu unterscheiden. In dem obigen Assay von 200 normalen Seren wurde ein Ausschlußwert von 0,104 gewählt. Bei diesem Ausschlußwert wird erwartet, daß die falsch-positiv-Rate weniger als oder gleich 0,5% ist.
- B. Um die überlegene Wirksamkeit bei der Eliminierung von falsch Positiven durch Verwendung des Peptids der Formel (II) gegenüber den im Handel erhältlichen Kits, die ein Viruslysat verwenden, aufzuzeigen, wurde eine Anzahl von Seren von Patienten mit zwei Störungen, die nicht mit AIDS zusammenhängen, nämlich dem naso-pharyngealen Karzinom und rheumatischer Arthritis durch den erfindungsgemäßen Assay und handelsübliche Tests untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle II unten zusammengefaßt und zeigen die erhöhte Spezifität des erfindungsgemäßen Assays auf. Viele Proben, die mit handelsüblichen Tests falsch positive Ergebnisse ergaben, wurden durch den erfindungsgemäßen Assay korrekt als negativ identifiziert. TABELLE II Test von Patienten mit naso-pharyngalem Karzinom und rheumatischer Arthritis Anzahl der Proben erfindungsgemäßer Assay ENI Assay Abbott Assay Diagnose : Proben-Identifikations# NPC/Nicht-AIDS NPC/Nicht-Aids; 920 RA/Nicht-AIDS; 305 RA/Nicht-AIDS RA/Nicht-AIDS; 615
- (+) falsch Positive
- NT = nicht untersucht
- NPC = naso-pharyngeales Karzinom
- RA = rheumatische Arthritis
- C. Um die Wirksamkeit des erfindungsgemäßen Assays zum Nachweis von HTLV-III-Antikörpern in AIDS/ARC-Patientenseren im Vergleich zu handelsüblichen Kits aufzuzeigen, wurde der in Beispiel IV - Vorschrift 1 beschriebene ELISA-Kit gegen eine Reihe von Seren getestet, die von diagnostizierten AIDS- und ARC-Patienten gewonnen waren. Die Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengefaßt und zeigen, daß der Assay handelsüblichen Kits im Hinblick auf seine Fähigkeit, Seren zu identifizieren, welche gegen HTLV-III gerichtete Antikörper enthalten, äquivalent ist. TABELLE III Assay von AIDS/ARC-Seren Anzahl der Proben erfindungsgemäßer Assay ENI Assay Abbott Assay Diagnose/ProbenIdentifikations# AIDS
- (-) falsch Negative
- ARC = Aids Related Complex
- D. Die hohe Rate von falsch Positiven, die für gegenwärtig verfügbare Kits unter Verwendung von Viruslysat charakteristisch ist, ist z. T. auf die Anwesenheit von zellulären Antigenen in dem Lysat zurückzuführen, die mit Antikörpern reagieren, die sowohl in AIDS- als auch Nicht-AIDS-Patientenseren vorhanden sind. Dazu kommt, daß komplexe Antigene wie die, die von einem Virus wie HTLV-III abgeleitet sind, viele Epitope enthalten und eine größere Wahrscheinlichkeit besteht, daß sie nicht-spezifisch mit in menschlichen Seren vorhandenen Antikörpern reagieren. Das erfindungsgemäße Peptid (II) verringert die Komplexität des Antigens, welches verwendet wird, um mit den Patientenseren zu reagieren, auf ein oder vielleicht nur einige wenige Epitope. Es wird erwartet, daß die Wahrscheinlichkeit einer nicht-spezifischen Wechselwirkung mit nicht-HTLV-III-Antikörpern stark verringert ist. Nicht-spezifische Wechselwirkungen können jedoch immer noch auftreten, da einige Antikörper "klebrig" sind und an den Kunststoffträger, der in dem Assay verwendet wird, oder an andere Proteine wie Rinderserumalbumin oder Ziegenseren, die verwendet werden, um die Platte nach der Zugabe des Peptids zu blockieren, binden können. In Tabelle IV unten sind Daten angegeben, die sich auf den Assay von verschiedenen Patientenseren beziehen. Zusätzlich zu dem üblichen Assay mit Peptid (II), wie es in Beispiel IV - Vorschrift 1 beschrieben ist, haben wir jedes Serum gegen Peptid (II) getestet, nachdem die Serenproben mit einer wirksam blockierenden Menge des Peptids (II) vermischt worden war. In der Tabelle sind auch die Ergebnisse der Untersuchung jeder Probe mit im Handel erhältlichen Kits aufgenommen. TABELLE IV Kompetitionsassay, welcher positiven/negativen ELISA bestätigt Probenidentifikat.# ELISA-Wert und Bewertung mit Peptid Nichtblockiert blockiert (Bewertg.) Abbott Assay ENI Assay Western Assay Diagnose AIDS
- * = falsch positiv
- ** = falsch negativ
- UNK = unbekannt
- RA = rheumatische Arthritis, Nicht-AIDS
- DP = Dialysepatient, Nicht-AIDS
- NPC = Naso-pharyngeales Karzinom, Nicht-AIDS
- Es ist aus diesen Ergebnissen offensichtlich, daß nicht- AIDS-Serenproben, die durch einen oder beide der im Handel erhältlichen Kits unzutreffenderweise als positiv identifiziert wurden, bei Verwendung des Peptidkompetitionsassays korrekt als negativ identifiziert wurden. Darüber hinaus werden selbst Proben, die durch den Assay unzutreffenderweise als positiv identifiziert wurden, durch den Peptidkompetitionsassay korrekt als negativ identifiziert. Signifikanterweise dient der Blockierungs- oder Kompetitionsassay auch als Bestätigungsassay in Tests von Serenproben, die gegen HTLV-III gerichtete Antikörper enthalten. Die letzten sieben Proben, die wie in Tabelle IV gezeigt getestet wurden, sind auf Antikörper positiv sowohl im erfindungsgemäßen Test als auch in im Handel erhältlichen Assays (mit Ausnahme der beiden falsch negativen unter Verwendung des Abbott-Kits) und im Western-Blot-Assay. Die Reaktivität dieser Seren mit dem Peptid (II) wird wirksam durch Vermischen der Seren mit Peptid (II) blockiert, was anzeigt, daß die Reaktivität des Antikörpers mit dem Peptid peptidspezifisch ist und daß diese letzten sieben Beispiele echte Positive sind.
- ELISA-Kits, wie die in Beisppiel IV - Vorschrift 1 beschriebenen wurden mit den Peptidformeln (I) bis (XV) ebenso wie mit den Formeln (C-I) bis (C-VIII) hergestellt. Die ELISA- Kits wurden jeweils gegen eine aus zehn Proben bestehende Reihe von Seren getestet, welche klinisch positive Proben umfaßten, d. h., Proben, die bei der Bestimmung durch handelsübliche Assays und den Western-Blot-Assay für die HTLV- III-Infektion symptomatisch waren. Die Ergebnisse dieser Tests sind in Tabelle V unten gezeigt.
- Ein Peptidassay wird als positiv angesehen, wenn die Höhe der Absorption des ELISA-Tests mehr als das Doppelte der Höhe des Hintergrunds betrug, welche durch Mittelwertbildung aus der Absorption von zwei normalen Seren bestimmt wurde. Der erhaltene Mittelwert stellt den Mittelwert der optischen Dichte des ELISAs dar, der sich bei der Berechnung nach dem Abzug des Hintergrundwerts ergab. Der angegebene Index ist eine gewichtete Aktivität eines bestimmten Peptids relativ zu der Aktivität des Peptids der Formel (11). Der Index wird zugunsten der Fähigkeit eines bestimmten Peptidassays zur korrekten Angabe eines positiven Werts, der von der Höhe der normalen Hintergrundantwort unterschieden wird, gewichtet. Die Formel zur Ableitung des Index ist wie folgt:
- (% Positiv)³ · Mittelwert/(% Positiv)II)³· MittelwertII = Index
- worin: % Positiv ist % Positiv für den jeweiligen Peptidassay;
- Mittelwert ist Mittelwert für den jeweiligen Peptidassay;
- % PositivII ist % Positiv für den Peptidassay mit der Formel (II); und
- % MittelwertII ist Mittelwert für den Peptidassay mit der Formel (II). TABELLE V Peptid Formel Sequenz % Positiv Mittelwert Index
- Wie aus der obigen Tabelle ersichtlich ist, ergeben Assays, die aus Peptiden mit den Formeln (I) bis (XV) gemacht sind, alle positive Ergebnisse von wenigstens 50% oder mehr und weisen in jedem Fall einen Index von wenigstens 0,1 auf. Andererseits weist keines der Vergleichssegmente, obwohl diese nahe angrenzende oder überlappende oder teilweise überlappende Segmente von der HTLV-III-Hülle darstellen, solche positiven Ergebnisse oder einen solch hohen Index auf.
- Zusätzliche Seren von AIDS/ARC-Patienten wurden mit ELISA- Assays getestet, welche die zwei hochreaktiven Peptide der Formeln (III) und (IV) einsetzen (Beispiel IV - Vorschrift 1). Die Reaktivität von einigen dieser Seren wird in Tabelle VI gezeigt, wobei sie als Extinktionswerte angegeben wird. TABELLE VI Peptidformel Serumprobe
- Die meisten getesteten Seren reagierten sehr gut mit beiden Peptiden, so, wie es bei den Proben in Tabelle VI, Gruppe C der Fall ist. Gelegentlich jedoch waren einige Proben mit dem einen Peptid bei weitem reaktiver als mit dem anderen, wie es in Tabelle VI Gruppen A und B gezeigt ist. Diese Daten zeigen an, daß mehr als ein Epitop (z. B. ein lineares und ein Konformations-Epitop) in diesem Bereich aus zweiunddreißig Aminosäuren vorhanden sein kann, welches üblicherweise von Patienten erkannt wird, die mit dem AIDS-Virus in Berührung gekommen sind. Die Hochleistungsflüssigchromatographie-(HPLC)-Analyse von Peptiden der Formeln (III) und (IV) in Lösung zeigt an, daß Peptide der Formel (III) weitgehend als cyclische Monomeren vorliegen, wogegen Peptide der Formel (IV) hauptsächlich in Form von Dimeren vorliegen. Die strukturellen Eigenschaften, die diesen beiden Peptiden durch Disulfidbindungen verliehen werden, können sowohl mit der Antigen-Präsentation als auch der Schaffung eines Konformations-Epitops zusammenhängen.
- Weitere Beweise dafür, daß mehr als ein Epitop in den Peptiden der Formel (III) und (IV) vorhanden ist, können aus Kompetitionsuntersuchungen erhalten werden, wobei die Ergebnisse eines Beispiels dieser in Tabelle VIIA gezeigt sind. In dieser Untersuchung wurden Peptide der Formel (III) und (IV) beide auf eine Mikrotiterplatte als immobilisiertes Antigen aufgetragen, und ein ELISA-Assay wurde unter fünf verschiedenen Bedingungen durchgeführt: Ohne Kompetition, oder Kompetition mit einem Überschuß des Peptids der Formel (III), der Formel (IV), beiden Peptiden, oder einem heterologen Peptid. Die Kompetition wurde durch Zugabe des passenden Peptids (der passenden Peptide) zu dem verdünnten Serum unmittelbar vor der Zugabe der Serumprobe zu dem Mikrotiternapf durchgeführt. TABELLE VIIA Formel des konkurrierenden Peptids Probe Entblockiert Heterolog
- Unter diesen Bedingungen ist ganz klar, daß einige Proben sehr gut mit einem oder beiden der erfindungsgemäßen Peptide reagieren. Z.B. reagiert die Probe 3416 gut mit beiden Peptiden, da die Kompetition mit dem Peptid der Formel (III) eine optische Dichte (OD) von > 1,8 ergibt, die Kompetition mit dem Peptid der Formel IV eine OD von 1,055 ergibt und bei Anwesenheit beider konkurrierender Peptide die OD im wesentlichen auf Hintergrundwerte zurückgeht. Andere Serumproben, wie 3412, reagieren stärker mit dem einen Peptid als mit dem anderen; in diesem Fall wird die OD von > 1,4 bis herunter auf 0,113 verringert, wenn mit dem Peptid der Formel (III) blockiert wird, und bleibt > 1, wenn die Kompetition mit dem Peptid der Formel (IV) besteht. Jedoch besteht eindeutig eine gewisse Reaktivität mit dem Peptid der Formel (III), da in Gegenwart beider Peptide die Immunreaktivität vollständig erloschen ist (0,059).
- Eine andere Kompetitionsuntersuchung mit dem Peptid der Formel (I) auf der Platte zeigt, daß das Peptid der Formel (IV) nicht wirksam mit dem Peptid der Formel (I) konkurriert, obwohl das Peptid mit der Formel (III) sehr wirksam konkurriert. Siehe Tabelle VIIB unten. TABELLE VIIB Formel des konkurrierenden Peptids Probe Entblockiert Heterolog
- Somit geht aus diesen Analysen hervor, daß ein Epitop, das in dem Peptid der Formel (III) vorhanden ist, auch auf dem Peptid der Formel (I) vorhanden ist, und daß dieses Epitop wesentlich verschieden ist von demjenigen, das in dem Peptid der Formel (IV) vorhanden ist. Darüber hinaus reagieren auf der Grundlage dieser gleichen Probe praktisch alle Seren mit den Epitopen, die auf den Peptiden der Formel (III) und (IV) präsentiert werden, obwohl sie in vielen Fällen mit dem einen Peptid stärker reagieren als mit dem anderen.
- Unter Verwendung von 1 ug einer Kombination von Peptiden der Formel (III) und 0,5 ug von Peptiden der Formel (IV) als Festphasenantigen in einem ELISA-Assay (Beispiel IV - Vorschrift 2) war die Spezifität und Empfindlichkeit dieses Assays gleich oder besser als die von jedem untersuchten im Handel erhältlichen Viruslysat-Antikörper-Nachweiskit.
- Die Tabelle VIII gibt ELISA-Ergebnisse an, die unter Verwendung von Patientenseren, normalen Seren und Seren von verschiedenen Krankheitsgruppen, welche rheumatische Arthritis, naso-pharyngeales Karzinom (NPC), Epstein-Barr-Virusinfektion, Cytomegalievirusinfektion, gramnegative Sepsis, Toxoplasma Gondii, systemischen Lupus Erythematodes, und Herpesvirusinfektionen einschließen, erhalten wurden. TABELLE VIII Probengruppe Anzahl der Seren AIDS + ARC Symptomatisch PLS Asymptomatisch/ hohes Risiko Immunabnormalitäten Asymptomatisch/ hohes Risiko normal immun Normal/Nicht-AIDS Verschiedene Krankheitsgruppen/ Nicht-AIDS Gesamt Nicht-AIDS * Gibt die Anzahl der Patienten an.
- Wenn im guten Glauben für normal erachtete Seren auf Reaktivität in dem (III)/(IV)-Assay und in dem von Electronucleonics, Incorporated (ENI) auf den Markt gebrachten Assay getestet wurden, hat der (III)/(IV)-Peptid-Assay eine signifikant niedrigere falsch-positiv-Rate. Wie Tabelle VIII zeigt, war die falsch-positiv-Rate für ENI 1,65% (12/728, wogegen der (III)/(IV) -Peptid-Assay eine falsch-positiv-Rate von nur 0,55% (4/728) hat. Wenn die falsch-positiv-Rate in der Gruppe der verschiedenen Krankheiten untersucht wird, hat der Peptid-Assay eine leicht niedrigere falsch-positiv- Rate als der ENI-Assay, 1,81% gegenüber 2,58% (7/387 gegenüber 10/387).
- Die obigen Beispiele sind nur zum Zweck der Veranschaulichung angegeben worden, und nicht, um den Umfang der vorliegenden Erfindung zu beschränken, welcher ausschließlich in den Ansprüchen im Anhang definiert ist.
Claims (33)
1. Synthetisches Peptid, umfassend eine Sequenz, ausgewählt
aus der Gruppe, bestehend aus:
CSGKLIC,
IWGCSGKLICTTAVP,
IWGCSGKLICTTAVPWNAS,
AVERYLKDQQLLGIWGCSGKLI,
AVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNAS,
LKDQQLLGIWGCSGKLI,
LLGIWGCSGKLIC,
QQLLTGIWGCSGKLICTTAVPWNAS,
IWGCSGKLICTTAVPWN,
CSGKLICTTAVPWNAS,
SGKLICTTAVPWNAS,
AVERYLKDQQLLGIWGCSGKLIC,
GCSGKLICTTAVPWN,
LKDQQLLGIWGCSGK,
die antigenischen und immunologischen Fragmente davon, und
pharmazeutisch oder diagnostisch annehmbare Salze davon.
2. Synthetisches Peptid nach Anspruch 1 mit der Formel:
CSGKLIC
3. Synthetisches Pepitd nach Anspruch 1 mit der Formel:
IWGCSGKLICTTAVP
4. Synthetisches Peptid nach Anspruch 1 mit der Formel:
IWGCSGKLICTTAVPWNAS
5. Synthetisches Peptid nach Anspruch 1 mit der Formel:
AVERYLKDQQLLGIWGCSGKLI
6. Synthetisches Peptid nach Anspruch 1 mit der Formel:
AVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNAS
7. Synthetisches Peptid nach Anspruch 1 mit der Formel:
LKDQQLLGIWGCSGKLI
8. Synthetisches Peptid nach Anspruch 1 mit der Formel:
LLGIWGCSGKLIC
9. Synthetisches Peptid nach Anspruch 1 mit der Formel:
QQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNAS
10. Synthetisches Peptid nach Anspruch 1 mit der Formel:
IWGCSGKLICTTAVPWN
11. Synthetisches Peptid nach Anspruch 1 mit der Formel:
CSGKLICTTAVPWNAS
12. Synthetisches Peptid nach Anspruch 1 mit der Formel:
SGKLICTTAVPWNAS
13. Synthetisches Peptid nach Anspruch 1 mit der Formel:
AVERYLKDQQLLGIWGCSGKLIC
14. Synthetisches Peptid nach Anspruch 1 mit der Formel:
GCSGKLICTTAVPWN
15. Synthetisches Peptid nach Anspruch 1 mit der Formel:
LKDQQLLGIWGCSGK
16. Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 15 in zyklischer,
monomerer, dimerer oder polymerer Form.
17. In Kombination eine Mischung aus wenigstens zwei Peptiden,
die im Vergleich zu jedem einzeln verwendeten Peptid von gegen
HTLV-III gerichteten Antikörpern besser erkannt werden, wobei
die Mischung die Auswahl wenigstens zweier Peptide, welche
Aminosäurerestesequenzen umfassen, die homolog zu Teilen der
gp41-Proteinsequenz des Virus HTLV-III sind, umfaßt, worin:
ein erstes dieser Peptide den Teil der gp41-Proteinsequenz
CSGKLIC des Virus HTLV-III umfaßt; und
ein zweites dieser Peptide die Sequenz ZLLGXWZ' umfaßt; worin
x ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus I, L, M oder F;
Z ausgewählt ist aus der Aminosäureyrestesequenz des
gp41-Proteins des Virus HTLV-III, die sich unmittelbar
benachbart zur Aminoseite des L-Leucinrestes an der 599. Position
des gp41-Proteins befindet; Z' ausgewählt ist aus der
Aminosäurerestesequenz des gp41-Proteins des Virus HTLV-III, die
sich unmittelbar benachbart zur Carboxylseite des
L-Tryptophanrestes an der 603. Position des gp41-Proteins
befindet; worin Z und/oder z' 0 Reste lang sein kann; und worin
Z und Z' zusammen wenigstens 10 Reste umfassen.
18. Mischung der Peptide nach Anspruch 17, worin
das erste Peptid ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus
IWGCSGKLICTTAVPWNAS;
GCSGKLICTTAVPWN;
CSGKLICTTAVPWNAS; und
das zweite Peptid ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus
AVERYLKDQQLLGXWGCSGLI, und
AVERYLKDQQLLGXWGCSGKLIC.
19. Mischung der Peptide nach Anspruch 18, worin das erste
Peptid aus
IWGCSGKLICTTAVPWNAS besteht und
das zweite Peptid aus
AVERYLKDQQLLGXWGCSGKLI besteht.
20. Mischung nach Anspruch 19, worin I X ist.
21. Mischung der Peptide nach Anspruch 18, worin das erste
Peptid aus
GCSGKLICTTAVPWN besteht, und
das zweite Peptid aus
AVERYLKDQQLLGXWGCSGKLI besteht.
22. Mischung nach Anspruch, 1, worin 1 X ist.
23. Verfahren zum Nachweisen oder Bestimmen von gegen HTLV-III
gerichteten Antikörpern in einer Flüssigkeit, die vermutlich
diesen Antikörper enthält, welches umfaßt:
a) Bereitstellen wenigstens eines an eine feste Oberfläche
angehefteten Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 16;
b) Inkontaktbringen dieser mit einem Peptid beschichteten,
festen Oberfläche mit der zu analysierenden Flüssigkeit für
eine Zeitdauer, die ausreichend ist, daß eine
immunologische Reaktion stattfinden kann; und
c) Nachweisen oder Bestimmen des Vorhandenseins oder der
Menge an Antikörpern, die auf der Oberfläche des
Festkörpers an das Peptid oder an das antigenische Fragment
gebunden sind.
24. Verfahren nach Anspruch 23, worin das Nachweisen oder
Bestimmen den Schritt des Inkontaktbringens der Oberfläche mit
markiertem Anti-Human-Immunglobulin umfaßt.
25. Verfahren zum Herstellen von gegen das Virus HTLV-III
gerichteten Antikörpern, welches das Immunisieren eines Tieres
mit einer zum Erzeugen von Immunität wirksamen Menge
wenigstens eines Peptids nach Anspruch 1, welches
polymerisiert und/oder an einen geeigneten, immunogenen Träger
angeheftet ist und das Bluten dieses Tieres umfaßt.
26. Diagnostischer Kit zum Nachweisen oder Bestimmen von gegen
HTLV-III gerichteten Antikörpern, welcher umfaßt: (a) eine
feste Oberfläche, an die wenigstens ein Peptid nach einem der
Ansprüche 1 bis 16 gebunden ist und (b) markierte
Anti-Human-Immunglobuline.
27. Therapeutische oder prophylaktische Zusammensetzung,
umfassend eine zum Erzeugen von Immunität wirksame Menge
wenigstens eines Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 16,
das polymerisiert und/oder an einen zum Erzeugen
von Immunität wirksamen Träger angeheftet ist.
28. Sandwich-Verfahren zum Nachweisen oder Bestimmen des Virus
HTLV-III oder eines virus-spezifischen Antigens in einer
Flüssigkeit, die vermutlich das Virus oder Antigen enthält,
welches umfaßt:
a) Bereitstellen eines gegen wenigstens ein Peptid nach
einem der Ansprüche 1 bis 16 gerichteten Antikörpers, der an
eine feste Oberfläche angeheftet ist;
b) Inkontaktbringen der mit dem Antikörper beschichteten
festen Oberfläche mit der zu analysierenden Flüssigkeit für
eine Zeitdauer, die ausreichend ist, daß eine
immunologische Reaktion stattfinden kann; und
c) Nachweisen oder Bestimmen des Vorhandenseins oder der
Menge an HTLV-III-Virus oder des Virus-spezifischen
Antigens, das an die Antikörper auf der festen Oberfläche
angeheftet ist.
29. Kompetitionsverfahren zum Nachweisen oder Bestimmen von
HTLV-III-Virus oder virus-spezifischem Antigen in einer
Flüssigkeit, die vermutlich das Virus oder Antigen enthält,
umfassend die Schritte:
a) Bereitstellen eines gegen wenigstens ein Peptid nach
einem der Ansprüche 1 bis 16 gerichteten Antikörpers, wobei
der Antikörper an eine feste Oberfläche angeheftet ist;
b) Mischen eines Aliquots der zu analysierenden Flüssigkeit
mit einer bekannten Menge des markierten, erfindungsgemäßen
Peptids, um ein Probengemisch herzustellen;
c) Inkontaktbringen der mit dem Antikörper beschichteten
festen Oberfläche mit dem Probengemisch für eine Zeitdauer,
die ausreichend ist, daß eine immunologische Reaktion
stattfinden kann;
d) Trennen der festen Oberfläche vom Probengemisch;
e) Nachweisen oder Bestimmen des Vorhandenseins oder der
Menge an markiertem Peptid, das entweder an die feste
Oberfläche gebunden ist oder im Probengemisch verbleibt; und
f) Bestimmen des Vorhandenseins oder der Menge des Virus
oder Antigens in der Flüssigkeit durch das Ergebnis in
Stufe e).
30. Diagnostischer Kit zum Nachweisen oder Bestimmen von
HTLV-III-Virus oder Virus-spezifischem Antigen, welches
umfaßt:
a) eine feste Oberfläche, an die ein gegen wenigstens ein
Peptid nach Anspruch 1 gerichteter Antikörper gebunden ist;
und
b) eine bekannte Menge eines gegen HTLV-III, gegen ein
Virus-spezifisches Antigen oder gegen ein Peptid nach einem
der Ansprüche 1 bis 16 gerichteten Antikörpers.
31. Verfahren zum Bestimmen der Genauigkeit eines positiven
Ergebnisses, das in einem Test auf gegen HTLV-III gerichtete
Antikörper erhalten wird, ausgeführt mit einer flüssigen
Analysenprobe, die vermutlich die Antikörper enthält, wobei der
Test ein Sandwich-Assay ist, bei dem ein synthetisches
HTLV-III-Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 16 oder ein
antigenisches Fragment davon 'an die feste Oberfläche angeheftet
ist, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt
a) Mischen eines Aliquots der Analysenprobe mit einer
wirksamen Blockierungsmenge des synthetischen HTLV-III-Peptids
oder antigenischen Fragments davon, um ein Probengemisch
herzustellen;
b) Inkontaktbringen des Probengemisches mit der festen
Phase des Tests für eine Zeitdauer, die ausreichend ist, daß
eine immunologische Reaktion stattfinden kann;
c) Bestimmen, ob das Binden der Antikörper im Probengemisch
an die feste Phase gehemmt ist im Vergleich zum Binden in
der Abwesenheit des Peptids oder Fragments; und
d) Bestimmen der Genauigkeit des positiven Ergebnisses auf
der Grundlage des Vorhandenseins oder der Abwesenheit der
Hemmung.
32. Diagnostischer Kit zum Bestimmen oder Nachweisen von gegen
HTLV-III gerichtetem Antikörper und Bestätigen des positiven
Ergebnisses, welcher umfaßt
a) eine feste Oberfläche, an die ein Peptid nach einem der
Ansprüche 1 bis 16 gebunden ist;
b) eine wirksame Blockierungsmenge des Peptids nach einem
der Ansprüche 1 bis 16; und
c) markiertes Anti-Human-Immunglobulin.
33. Verfahren zum Herstellen von gegen HTLV-III gerichteten
monoclonalen Antikörpern, umfassend: a) Immunsieren eines
Wirtstieres mit einem Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 16
in polymerisierter Form oder gebunden an einen geeigneten,
immunogenen Träger; b) Isolieren der Splenozyten aus dem
immunisierten Wirt; c) Fusionieren der Splenozyten mit einer
geeigneten Myelom-Zellinie; d) Auswählen der fusionierten Zellen
durch Reaktionsfähigkeit gegenüber dem immunisierenden Peptid,
gegenüber HTLV-III, oder gegenüber mit HTLV-III infizierten
Zellen; e) entweder Kultivieren der ausgewählten Hybridomas in
vitro oder Injizieren derselben in einen geeigneten Wirt; und
f) Gewinnen des gewünschten monoclonalen Antikörpers aus dem
Überstand über den kultivierten Hybridomas oder aus dem Serum
oder Aszites des injizierten Wirts.
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