JPS63502341A - 血管形成促進活性を有する脂質含有組成物 - Google Patents
血管形成促進活性を有する脂質含有組成物Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
発明の名称
血管形成促進活性を有する脂質含有組成物見豆夏分互
本発明は、血管形成促進活性を有する脂質含有組成物に関する。
先立且翌
血管形成とは、新しく血管が形成されることによって、血液循環が高まる過程を
いう。血管形成の分野は、 100年以上も前から研究対象としてよく研究され
てきた0例えば、フィアシャウR,ディークランクハフテルンゲシュベルステ。
ヒルシュバルト、ベルリン(1863) ;チイニルシュ、C0,ディーハウト
ミットアトラス、ライプチヒ(1865)を参照されたい。(宿主の血管系と固
型腫瘍の生存、増殖との関連の重要性が観察されている)、正常な組織にごく微
量の血管形成因子が発見されるに及んで、興味が一段と高まった0例えば。
ダモー等、プロシーディングスオブザナショナルアカデミーオブサイエンシス
ユニ 3068−3072(1981) ;キスン等、2二 34 : 231
−243(1983) ; (活性化したリンパ球およびマクロファージ);フ
レデリック等、サイエンス 224 : 289−390(1984) : (
ヒト胞状液)ニブルゴス ヨーロピアンジャーナルオブクリニカルインベスティ
メント 13 289−296(1983) ; (羊膜顆粒及び胎盤)、キャ
テロット等、プロシープされたい、しかし、これらの組織に見い出されたごく微
量の血管形成因子は1組織や器官で発生する通常の増殖、発達と同程度の血管形
成活性しか示さない、血管形成因子は病理組織からもみつかっている0例えばワ
イス等、ブリティシュジャーナルオブキャンサー、並: 493−496(19
79) ;フエンセラウ等、ジャーナルオブバイオロジ力ルケミストリー壜咀:
9605−9611(1981)、マツクアスラウ等、エクスペリメンタルセ
ルリサーチ 月9 : 181−190(1979) ; (腫瘍細胞);クマ
ール等、ランジット ス: 364−367(1983) ;ブラウン等、ラン
ジット 1 : 682−685(1980)(関節炎患者の滑液);ヒル等、
エクスペリエンティア 担: 583−585(1983) (糖尿病のガラス
体物質):ゴールドスミス等、ジャーナルオブジアメiカンメディカルアソシエ
ーション 252 : 2034−2036が通常の増殖、発達を越える活性と
比較的多量の因子を示した最初の報告である。この因子はネコの網組織のクロロ
ホルム/メタノール画分(CMFr)に見い出された。キャッツィムプーラスと
ゴールドスミス名で″血管形成因子と血管を形成させる方法”というタイトルの
下に出願番号672.674号として1984年8月20日に出願されている。
この出願はここでの参照として編入されているゴールドスミス等の粗脂質抽出物
をCMFrに認められる活性よりはるかに高い血管形成活性をもつ種々の画分に
精製されることがわかった。
さらに脳由来のガングリオシドのような市販のガングリオシド他の脂質を含む成
分も血管形成の性質を有することもわかっている。また、既知の脂質を含む化合
物の組成物が血管形成の性質をもつこともわかっている。
血管形成活性を有する脂質を含む化合物の発見は新しい技術である。以前は蛋白
性の血管形成因子に注意が向けられていた0例えばクマール等、ランジット n
: 364−367(1983)(300から10’ダルトンの蛋白性因子)
:キスシ等、上記(70kd以上の蛋白性因子);パンダ等、上記(約2−14
kdの蛋白質);プルゴス等、上記(100−200kdの蛋白混合物)などで
ある。
今回、予期せぬことにガングリオシド、グリコリピド、セラミド、セレブロシド
、リン脂質、スフィンゴシトなどの脂質を含む分子の成分が血管形成活性を高め
る作用を有することがわかった。
見豆立!L
哺乳動物起源の血管形成活性を有する脂質を含む成分について述べる。加えて、
古くから知られている脂質含有化合物の混合物の血管形成を有する新しい組成に
ついても明らかにする。また、既知の脂質を含む成分が予期せぬことに血管形成
活性を有することも明らかにする。
凰夏凰l主腹豆
(図面中の写真は、いずれも生物の形態を示すためのものである)
図1は、ナンバー642.624でも明らかにしたCMFrを取得する方法を示
したものである。
図2と図3は、図1に示したCMFrをさらに分画する方法を示している。
図3は後述する方法で得た別の両分をさらに分画する方法を示している。
図4はCMFrで処理した後のウサギの角膜に形成された毛細血管を示している
。
図5は、間質に形成された多数の毛細血管を示している。
図6−17は発明のCAMアッセイに基き直線による分類をグラフで示したもの
である。
図18−24は生体内においてCMFrを用いて再形成された脈管の写真とその
グラフを示している。
成熟ネコ、メス、2.4−3.2kgの筋肉内に好ましくは7.0■/kgの濃
度でケタミンを注射して麻酔した。一旦麻酔したのち、既知の手術法で腹部の中
央を開腹した。網を除去し滅菌したプラスチックバックに入れ4℃に保った。同
時に、皮下脂肪も除去し、網組織と同様の方法で処理し、非網組織脂質のコント
ロールとして用いた。適当な無菌技術を用いて網の重量を測定し、プラスチック
の表面に広げ、手術用ハサミを用いて4d程度の大きさに切った。切った網の個
々の重量は7〜66gであった。これを滅菌したサーニングブレンダーに入れ予
め4℃に冷却したリン酸緩衝食塩水(以後PBSとする) 300+aQを加え
た。網の小片を20.500rpmで5分混ぜ、網のホモジネートを得るため滅
菌した250IIIQのプラスチックビンに移し1600Xg、 4℃、20分
間遠心分離した。遠心分離後、3つの明らかに分離できる両分が認められた。即
ち1種々の混合物であるベレット部分、すべての蛋白性の成分を含む濁ったホモ
ジネート、そして浮上するクリーム色の脂質ケーキである。これら3つの両分を
個々に分離した。
種々の成分からなるペレットを完全に除去した。濁ったホモジネート画分を硫酸
アンモニウムで完全に飽和しく100%飽和)、この画分の全蛋白成分を沈でん
させた。角膜アッセイにより、濁ったホモジネート画分にも、全蛋白性でん(P
BSに再懸濁)画分にも血管形成活性は認めら札なかった。
浮上する脂質ケーキとして単離された脂質画分は明らかに2つの層から構成され
ていた。上層の泡状の成分とより密度の高いぎっしり詰った層でこの層は上層よ
り色が濃かった。両層の活性を調べると両層にも血管形成活性成分が著量含まれ
ていることがわかった。この理由は、これらの脂質層の各々が個々におよび組合
さって1本発明の活性脂質画分を含んでいるからである0両層を含む脂質ケーキ
の重量は、もとの網の全重量の約93%であり、活性を有する血管形成因子成分
を含む濃縮有機溶媒抽出物を調製するのに用いるのはこの脂質ケーキである。
活性を有する脂質画分の抽出に用いた脂質ケーキの量と比率を表■に示した。
1 31.2 N R3,6
265,756,03,2
350、148,33,1
461、ONR7,1
538,037,03,5
639,9N R3,0
77,86,22,4
822,321,43,4
× 重量(g)
NR=測定せず
所定量の脂質ケーキにクロロホルム−メタノール(2:1゜v/v)約21mを
加えニーベルバッハ8575型ミクロブレンダーで2分間ホモゲナイズした。脂
質/有機溶媒ホモジネートを臨床用遠心分離で200 X g、10分間室温で
遠心分離し、透明で金色の上澄と粒状物質からなる沈でんとに分けた。上澄をと
り減圧下、37℃でロータリーエバポレータによりクロロホルム/メタノールを
完全に除去した。溶媒の除去法は他にも既知の方法がありロータリーエバポレー
ションにかえて行ってもよい、得られた粘性の液体を好ましくはPBS約4艷に
懸濁し、角膜およびカム・アッセイに供した。
■、晟!貫立夏取畏
上記のようにして得たCMFrをヘキサン(抽出物Logにつき約60m1lの
ヘキサン)に溶解後、0.66倍量に相当する95%エタノールを加えた。充分
混合後、分離させた。上層(ヘキサン)を95%エタノールで再抽出し、得られ
た下層と最初の抽出で得たエタノール層を合せた。エタノール層をヘキサンで再
抽出し、得られたヘキサン層を最初の抽出で得たヘキサン層と合せた。WJ層の
溶媒を乾燥除去し、゛′ヘキサン上層物質″と゛エタノール下層物質”を得た(
以後それぞれヘキサン−UP、エタノールLPと呼ぶ)。
エタノールLP画分をフオルヒ等、ジャーナルオブノ(イオロジカルケミストリ
ー2里: 497−509(1957)に従い分配した[即ち1両分をクロロホ
ルム/メタノール(2:1゜20倍容量、 v/vt)に溶解し、0.2倍容量
の水を加える0層を充分混和機分離させた]、フオルヒ分配の上層を除去し。
下層を0.4倍量のメタノール/水(1: 1)で洗浄した。ここで得られる上
層のメタノール層をフオルヒ分配で得られた上層と合せ溶媒を除去して得られた
両分を以後″フオルヒUP”と呼ぶ、下層も同様に溶媒除去し、以後゛′フオル
ヒLP”と呼ぶ。
フオルヒLPをクロロホルムに溶解し、バンス等、ジャーナル、オブリピドリサ
ーチ 見: 621−630(1967)に記載のケイ酸によるクロマトグラフ
ィ、ユニシルカラム、を行った。カラムを各々20倍量のクロロホルム、アセト
ン/メタノール(9: 1) 、メタノールで順次溶出した。この連続溶出によ
り、中性脂質(クロロホルム)、糖脂質(アセトン/メタノール)、リン脂質(
メタノール)が分離される。
フオルヒUPを1■当りメタノール/水(1: 1)約3−に溶解し、ウィリア
ムス等、ジャーナルオブニューロケミストリー 並(1) : 266−269
(1980)記載の方法でC18逆相カートリッジにかけ、4倍量のメタノール
/水(1: 1)で洗浄し、溶媒を除去し″非脂質UP物質″を得た。さらに4
倍量のクロロホルム/メタノール(2: 1)で“脂質UP物質″を得た。
脂質UP物質をメタノール/クロロホルム/水(60:30:8)に溶解し、ク
リスティ、リピドアナリシス、パーガモンプレス、2訂版、 p109−110
(1982)に従いDEAE−セファデックスアセテートカラムにかけた。この
カラムを10倍量のメタノール/クロロホルム/水で溶出し、″中性脂質上層画
分”即ち″中性脂質UP”と名づけた画分が得られた。
またメタノール/クロロホルム10.8酢酸ナトリウム(60:30:8)で抽
出することによりガングリオシド画分が得られた。両画分の溶媒をロータリーエ
バポレータで除去しC18逆相カートリジでグリコシド画分を脱塩した。
クロロホルム−メタノール画分に容量比で10倍量の1%酢酸を加えマグネチッ
クスターラーで10−12分間撹拌して抽出を行った。抽出物を200m1容の
びんに入れ2000rp+m、 5分遠心分離した。上層、即ち酢酸に不溶の両
分を除去した。
酢酸可溶画分に等量のクロロホルムを加え、上記のように遠心分離して2層に分
けた。各層をそれぞれ互いに反対の溶媒で洗浄後クロロホルム量すべてをプール
した。クロロホルムを揮散させることにより“酢酸可溶”画分を得た。
フオルヒUP及び“PBSホモジネート”画分のアフィニティクロマトグラフィ
(ヘパリン及びゼラチン結合)は次のようにして行った。
ヘパリン−セファロースCL −6Bビーズもしくはゼラチン−セファロースビ
ーズ(各々約3g)を焼結ガラスフィルター中、 450m1Lの水で洗浄した
。セファロースビーズを水に懸濁し、2.5X9aaのクロマトグラフィカラム
に充てんした。過剰量の水を流し、乾燥した試料(例えばフオルヒ−UP)を0
.01リン酸緩衝液PH7,0に懸濁し、このカラムにかけた。溶出は同緩衝液
で行った( 2 ml / winの流速でトータル100mfl) 、溶出は
、ますカラム内の塩を除去するため100m1の水で洗浄した。ヘパリンもしく
はゼラチンに結合する物質の溶出は、0.51酢酸50m1で行った。酢酸を蒸
発させたのち検定に供するためリン酸緩衝液に再懸濁した。
クロロホルム/メタノール(2: 1 、 v/v)脂質画分についてシリカゲ
ルクロマトグラフィを用いてさらにそれらの組成、亜両分を明らかにした。この
ようなりロマトグΣB(E、ホフマン編集)、エルスピア、ニューヨーク、19
83.記載の方法によった。我々の方法は、クロロホルム/メタノール脂質抽出
物5.0mlを予めクロロホルムで平衡化したシリカゲル(100−200メツ
シュシグマ化学会社)を充てんしたクロマトグラフィカラムにがけた。溶出は以
下の溶媒100m1iで順次行った。:クロロホルム;酢酸エチル:酢酸エチル
/メタノール(3: 1) ;メタノール/水(4:1)、最後にクロロホルム
/メタノール/酢酸/水(25: 15: 4 :2) 200m1!、各溶媒
による5つの溶出画分(1−V)が得られた。
ゲル浸透クロマトグラフィをセファデックスLH−20カラムで行った。クロロ
ホルム−メタノール抽出物またはエタノール−LPの100■をカラムにかけク
ロロホルム−メタノール(1: 1)で行った1両分を集め検定のために溶媒を
除去した。
■・貫分立分梶
下層の糖脂質を展開溶媒としてクロロホルム/メタノール/水(60:35:
8 )を用イルHPTLCを行なイスベンナーホルム、ジャーナルオブニューロ
ヶミスト!−1:42(1956)記載のオルシノールスプレー試薬で発色させ
た。
同時にウルマン等、ジャーナルオブリピドリサーチ。
19 : 910−913(1978)記載の方法でパーベンゾイル誘導体にし
てHPLCでも分析した。上層の複雑な中性糖脂質画分をHPTLC及びフォル
スマン及び5SEA−1抗体を用いるイムノブロッティングで調べた。上層の複
雑な中性糖脂質画分の主要成分を、調製用TLCまたはイアトロビーズカラム(
IX50ao、 60u)でカンテイ等、ジャーナルオブバイオロジカルケミス
トリー ηユ(24) 14865−14874(1982) :ハコモリ等、
ジャーナルオブバイオロジカルヶミストリー罎但(7) 4672−4680(
1984)記載のヘキサン/イソプロパツール/水による溶出法でさらに精製し
た。
ガングリオシド画分をメタノール中0.25N水酸化ナトリウムで37℃、2時
間処理し、氷酢酸で中和後C18逆相カートリッジで脱塩した。アルカリ処理し
たガングリオシド画分を次にDEAE−セファデックスカラムにがけ、 0.0
2M、 0.08M、 0.05M酢酸アンモニウム(メタノール中)で溶出す
ることにより各々モノ、ジ、ポリシアロガングリオシド画分を得た。レディーン
等、メソッドインエンザイモロジイ、■、83、パートD p139−191(
1982)参照。
ガングリオシド画分を、0.4 X 50CI11.10μm粒径のイアトロビ
ーズカラムでクロロホルム/メタノール/水(65: 35 :8)で溶出する
ことにより個々の成分に分離した。 1.2mQずつ画分を集め、一部をHPT
LCで分析し、単一成分を含む画分をプールした。非脂質画分をメタノールで抽
出し、遠心分離して上澄を除去した。不溶性の残渣を水にとがし。
水、メタノール可溶画分をいくっがの溶媒系を使ってHPTLCで調べた。
精製したガングリオシドを窒素ガスで乾燥し、0.025%CaCQ、を含む0
.05M酢酸緩衝液300μQを加えた。■コレラ玉のノイラミニダーゼ(10
0μQ、 0.1ユニツト)を加え、37℃、3時間インキュベートした。クロ
ロホルム/メタノール(2:1) 2m1lを加えて反応を停止し、逆相カート
リッジにかけ非脂質成分を水で溶出した。残存するガングリオシドと脂質反応産
物をメタノール及びクロロホルム/メタノールで溶出し、HPTLCで調べた。
遊離したシアル酸も上記レディーンに従って調製したトリメチルシリル誘導体と
してTLCで調べた。
糖、脂肪酸の分析は、まず糖脂質を上記レディーンの方法及びコツレック等、ア
ナリティ力ルバイオケミストリニ 94 : 36−39(1979)の方法に
従ってメタノール中無水0.75N HCQ中でメタツリシスした。脂肪酸のメ
チルエステルをTLCで分析した。またメチルグリコシドを上記のコッレック等
記載と同様の0v−1でカラムでトリメチルシリル誘導体として分析した。下層
の中性糖脂質をHPTLC分析するために、両分をピリジン中にベンゾイルクロ
リドでパーベンゾイル化し上記ウルマンの方法に基き非コーティングジバックス
力ラムを用いグラジェント溶出、230nmで検出するHPLCで分離定量した
。ダイレクトプローブマススペクトロメトリーのために糖脂質、またはガングリ
オシド試料(5−50Mg)を25μQピリジン/ヘキサメチルジシラン/トリ
メチルクロロシラン/N、0−ビストリメチルシリルトリフルオロアセタミド中
でトリメチルシリル化した。まず誘導体1〜5μgを試料カップに入れ、30℃
/winの速度で100℃から50℃に昇温した。マススペクトルは、テクニベ
ント、モデル56にデータシステム付のフィンニガンモデル4500クアドルポ
ールマススペクトロメータを用いて得た。
条件はイオン化電流0.5mA、イオン化電圧70eVで行った。
イオン化温度は150℃であった。 100+++/eから950m/eのマス
レンジの反復スキャンは5秒間隔で行った。
糖脂質をアルミニウム強化HPTLC上でクロロホルム−メタノール−水(60
: 35 : 8)で展開し、乾燥後、ブロックハウス等、ジャーナルオブバイ
オロジカルケミストリー〃狙: 13223−13225(1981)記載のヘ
キサン90.05%ポリイソブチルメタクリレート中に浸漬した。次にプレート
を1%ウシ血清アルブミンを含むPBSに2時間浸漬後、抗体溶液に40℃2時
間浸した。上層の中性糖脂質のプレートをアメリカンタイプカルチャーコレクシ
ョン(TIB121)から購入したフォルスマンモノクローナル抗体IgMで処
理した。
ジシアロガングリオシド画分のTLCプレートを発明者が調製したGD3モノク
ローナル抗体IgMで処理した。 PBSで洗浄後、プレートを西洋ワサビペル
オキシダーゼ結合ヤギ抗マウスIgMと40℃2時間反応させた。 PBSで洗
浄後、20%メタノール、0.025%H20□を含む0.02M )−リスー
HCQ緩衝液で調製した33mN 4−クロロ−ナフトールでプレートを発色さ
せた。
TV−1jB失拉1暖
ネコの網組織をホモゲナイズし、遠心分離し浮上するケーキをクロロホルム/メ
タノールで抽出しさらに図2に示すように分画した。ヘキサン層にはCMFr中
の物質の約98%を含んでおり、TLCで分析すると主にトリグリセリドからな
っていることがわかった。アルカリメタツリシス及び得られた脂肪酸のメチルエ
ステルのGC/MS分析から14:0,16:0゜16:1,17:0,18:
0,18:1,18:2がトリグリセリドの主要脂肪酸であった(ここで、最初
の数字は脂肪酸の炭素鎖長、後の数字は不飽和結合の数°を示す)。
エタノール層の物質をフオルヒ溶媒分配し、エタノール層脂質の80%を構成す
る下層脂質をユニシルカラムで分画した。ユニシルカラムから回収した中性脂質
画分もまた主にトリグリセリドから構成されており、TLC分析から少量のコレ
カテロールと遊離脂肪酸が検出された。アセトン溶出糖脂質をTLCで分析した
ところへキソシルセラミド、ラクトシルセラミド、グロボトリアロシルセラ゛ミ
ド、グロボシドの移動度に相当する成分が存在した。これらの糖脂質のHPTL
Cによる定量分析法は以下に述べる。メタノール溶出リン脂質画分をTLCで分
析したところ、ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、スフィンゴミエ
リンの移動度に相当する成分が存在した。
エタノール層の物質の重量で約20%がフオルヒーUP中に回収された。このフ
オルヒーUPの物質を逆相カートリッジにかけ、非脂質画分をメタノール−水で
溶出し、脂質をクロロホルム/メタノールで溶出した。脂質UPの物質をDEA
Eカラムにかけ、カラムに保持されない中性脂質画分を集めたところ脂質UPの
40%を構成していることがわかった。この両分をHPTLCで分析すると、ク
ロボシトより下に移動する糖脂質が主体でより複雑な微量の糖脂質を含んでいた
。
ガングリオシド画分をDEAEカラムで、酢酸アンモニウムのメタノール溶液で
溶出し逆相カートリッジで脱塩した。
)IPTLc分析の結果GM3.GMI、GD3といくつかの微量のポリシアロ
ガングリオシドの移動度に相当するレゾルシノール成分の存在が確認された。こ
れらのガングリオシドをさらに精製し同定する方法を以下に記載する。
非脂質上層画分(非脂質−UP)を乾燥しメタノールで抽出した。この物質の多
くはメタノール可溶性ではないので懸濁液を遠心分離し上澄を除去した。不溶性
の物質は容易に水に溶けた。これをTLCで分析すると、この水溶性画分には唯
一つのニンヒドリン陽性バンドが認められた。この水溶性物質のほとんどは塩で
あると考えられる。メタノール可溶性物質には少なくとも6つのオルシノール及
びニンヒドリン陽性成分が含まれており、トリメチルシリル化後GC/MS分析
した結果、糖、アミノ酸、ペプチド、糖ペプチドの複雑な混合物であった。絹繊
維の粗脂質抽出物から得た両分の重量分布を表■に示した。
糖脂質画分の一部をベンゾイルクロリドのピリジン溶液でベンゾイル化しバーベ
ンゾイル化誘導体をHPLCで分析し230nmで検出した。その結果を図3に
示す、この両分中の糖脂質組成を%で示すと、(JcCer (Nfa) 、
26%; Ga12Cer(Nfa)t9.6%; GQcCer ()lfa
) + GanCer (Hfa) + Gauss 2 Car (Nfa)
、 12%;LacCeryl1%: GbOse3Cer、10%; Gb
Ose4Cer、26%であった。
上層の中性脂質画分をHPTLCで調べると標準のグロブシトよりわずかにゆっ
くりと移動するオルシノール陽性物質が約90%で、同時により、極性の高い3
〜4コのオルシノール陽性成分を少量含んでいた。フォルラマン及び5SEA−
1抗体によるイムノブロッティングの結果からフォルラマン陽性成分が大部分を
占め、 5SEA −1陽性酸分は存在しなかった。主要成分をイアトロビーズ
カラムでさらに精製しメタツリシス後GC/MSで分析した。ヘキソ、−スの比
率は、CQc/GaQ/NAcGaQ= 1:2:2であった。存在する脂肪酸
は、主として 、インタクトな糖脂質もシリル化し、ダイレクトプローブマスス
ペクトロメトリーで分析した0図3に示したようにスペクトルから、末端にヘキ
ソサミン、内部にヘキソース残基、C−18スフインゴシン及び脂肪酸が存在す
ることがわかった0以上のデータから、糖脂質はフォルラマンペンタグリコシル
セラミドであることがわかった。結合の位置やコンフィギユレーションについて
は直接測定していないが、抗体との反応性、糖脂質分析の結果からこの構造に間
違いない。
(以下余白)
ガングリオシド画分を穏やかなアルカリ処理してエステル結合を切ってDEAE
−セファデックスクロマトグラフィを行なうとモノ、ジ、ポリシアロガングリオ
シド画分に分離できた。モノシアロガングリオシド画分をHPTLCで分析する
と主として、標準の0M3の移動度と同一のトリプレットなバンドの成分と量は
少ないがGMIに相当する成分を含んでいた。モノシアロガングリオシド画分を
イアトロビーズカラムでさらに精製して、0M3に相当する成分のみを含む両分
をプールした。これをノイラミニダーゼで処理し、得られた脂質を)IPTLC
とダイレクトプローグMSで調べるとラクトシルセラミドであることがわかった
。遊離したシアル酸をGC分析するとN−アセチルノイラミン酸のみからなって
いることがわかった。インタクトなガングリオシドをメタツリシスし、糖と脂肪
酸をGC分析した。 (JcIGaQ比は1:1であることがわかった。一方、
脂肪酸のGQclGaQ比は主に16:0,18:0,18:1,20:0,2
2:0,23:0,24:0,24:1からなっていることがわかった。この標
品をトリメチルシリルエーテル誘導体としてダイレクトプローブマススペクトロ
メトリーで調べた。マススペクトルは標準の0M3(シアリル[2−3]ガラク
トシル[1−4]グルコシ[1−11セラミド)のスペクトルに類似していた。
ジシアロガングリオシド画分をHPTLCで調べると主にGD3と同じ移動度に
移動する成分を含んでいた。これをイアトロビーズカラムでさらに精製し、GD
3のみを含む画分をプールした。この標品をメタツリシスし、メチルグリコシド
及び脂肪酸のメチルエステルをGC/MSで調べた。 GIΩ/GaD比は1:
1、脂肪酸は主として16:0,18:0,18:1,24:0,24:1であ
った。これをノイラミニダーゼで処理し、得られた脂質をHPTLC及びダイレ
クトプローブMS分析したところ、ラクトシルセラミドと同定された。遊離した
シアル酸は、GC分析の結果、N−アセチルノイラミン酸のみからなっていた。
TMS誘導体のダイレクトプローブMSからGD3に相当するスペクトルが得
られた。そこで我々の研究室で調製したGD3に反応するモノクローナル抗体を
用いてイムノブロッティグするとこの物質はこの抗体と反応することがわかった
。
またポリシアロガングリオシド画分をHPTLCで調べるとガングリオシドGD
1 a、GT 1 bに相当する成分が含まれていることがわかったが、量的
に不足だったのでそれ以上の分析はできなかった。
■、ムαUヨ腹
図1に示した脂質標品及びシリカゲルクロマトグラフィ分画画分1−Vの血管形
成活性を次のような方法でウサギの角膜で調べた:ニュージーランドホワイトラ
ビットの静脈内にベンドパルビタールを注射して(30■/kg)麻酔した1表
■に示した各標品から、脂質懸濁液50μnをウサギの目の角膜の基質内に25
Gの注射針を通して投与した。投与後、2,4,6,8.10日目上ウサギの角
膜を観察し、また手術用顕微鏡によっても観察した。血管の造成と角膜の浮腫お
よび/または炎症に注意した。視覚的に観察し、10日目上ウサギを殺し、ホル
マリン固定した摘出眼球から6μmの厚さの組織標本スライドをつくり、既知の
方法でヘマトキシリン及びエオシンで染色した。血管形成陽性の写真を記録した
。
血管形成活性の応答を次のようにランクづけした。:0゜血管形成を認めず、角
膜も透明;1+、縁に赤色をしだ量(きよう)膜血管の拡張を認める;2+、縁
から投与部位の2/3に至っていくつかの血管を認める;3+縁から投与部位に
いくつもの血管が認められそれが角膜の10−20%に相当する場合;4+、縁
から投与部位にかけて密集した血管形成を認め、角膜の少なくとも30−40%
に相当する場合。
比較のために、網組織の脂質ケーキの水懸濁液と皮下の非網組織の脂肪種晶も調
製して活性を調べた。皮下脂肪標品を調製するため、皮下脂肪組織3gとPB5
4mlとを混ぜエーベルバッハモクロブレンダーで4℃、2分間ホモゲイナイズ
した。同じように網組織の脂質ケーキの水懸濁液を調製するため脂質ケーキ4g
にPBS4mlを加え4℃、2分間ホモゲナイズした。遠心分離して蛋白画分と
脂質画分に分ける前の金網組織ホモジネートも評価した9表■以下に結果を記載
した。
(以下余白)
表 ■
24 No、1 0(炎症)
25 No、2 0(炎症)
26 No、3 0(炎症)
27 PBS単独 No、1 0
28 No、2 0
29 No、3 0
以上のデータはクロロホルム/メタノール脂質抽出物を角膜の1か所に50μΩ
投与した場合、もっともすぐれた血管形成活性が得られたことを示している。一
方、全網組織のPBSホモジネートと抽出前の脂質ケーキのPBSホモジネート
にわずかな活性が認められた。しかし、 CAMアッセイですぐれた血管形成活
性を示したPBSホモジネートからアフィニティクロマトグライでヘパリン結合
性成分が濃縮されたことは注目すべきである(表■参照)。
PBS単独や皮下の非網組織の脂肪ホモジネートには全く活性が認められなかっ
た。しかし、表■のデータを複雑化しているのは、ネコの腹壁から得た皮下脂肪
を角膜に投与した場合、2日以内に激しい炎症が現われたことである。
クロロホルム/メタノール脂質標品の水懸濁液を投与したときの角膜の応答は迅
速で、強い活性が認められた。抽出脂質画分の投与後24時間以内に、軽い炎症
がおこったが48時間以内にはおさまった。この投与直後の炎症は、しばしば目
かられずかに流出物を伴い、翠膜領域に小さな斑点が現われ、角膜が若干曇るの
が特徴である0間質の血管形成とともに、バンヌス、即ち角膜の縁周辺に幕状の
血管形成が投与後3〜4日に認められる。7日から10日上京でに。
血管は角膜内で密集し1組織化したネットワークを形成するようになる。これは
図3の写真に示しである。10日上京摘出した眼球の組織学的県究で角膜間質内
にたくさんの毛細血管が形成されているのがわかる0間質内の数多くの毛細血管
を示すため組織切片の写真を図4に示しである。
溶媒抽出脂質画分の水懸濁液がわずか50μQの単回投与で血管形成活性を有し
ていることはとくに注目すべきことである。この血管形成の過程や応答の機構は
不明であるが、組織化された血管ネットワークを形成するようになる新しい血管
を造成しているのは明らかである。
図3に示すようにCMFrをシリカゲルクロマトグラフィでさらに精製した。5
つの脂質並両分それぞれについて角膜アッセイしたところ亜画分■のみに血管形
成活性が認められた。しかし亜画分■全体の活性はクロロホルム/メタノール脂
質抽出標品の活性より小さかった。亜画分■〜■は単独では血管形成活性が認め
られないが、亜画分■といっしょにすると血管形成活性が高まった。
上記の実験からCMFrに血管形成活性が存在することが示された1次に図1に
示した方法で調製した別の両分を用いて実験を行った。これは以下に述べるCA
Mアッセイである。
CAMアッセイにおいては両分の効力を示すものとして“血管形成インデックス
″を算出した。さらに″識別ユニット”も算出した。この2つについては後に解
説する。
記載する実験は上記の実験で得た網組織由来の両分に限らない、より活性のある
両分の一般的分子組成を脂質を含む分子、ことにガングリオシドを含むこと一度
定めておけば既知の別の脂質含有分子が使える。予想外にも、このような物質の
多くが強い血管形成活性を有していた。さらに。
市販のガングリオシドを新しい組合せで使用する実験も行った。この場合も予期
せぬことに血管形成活性が認められた。いくつかの異ったガングリオシドを混ぜ
合せたものが相加的な血管形成効果以上の活性をもつことは興味大である。
Vl、CAMアーセイ
抽出物、分画画分等の血管形成効果をニワトリ肝葉尿膜アッセイ(”CAMアッ
セイ”)によって調べた。
CAMアッセイはニワトリ受精卵を用い、次のように行った。
方!l」1
ふ卵4目上の受精卵の殻にドリルで2dの穴をあける。
この穴を“窓”として使用する。この穴をセロファンテープでしっかりと封じる
0次にこの卵を37℃でさらに4日間インキュベートする。
デコ≦(久1日1A
ふ卵8目上にアガロース0.4gとPBSlOmlを混ぜ、小さなガラスバイア
ルびん中で100℃に加熱し50℃に冷えたら2%BSAのPBS溶液と混ぜる
。この混合物(2%アガロース+1%BSA、 PBS中)を湯浴で暖める。ピ
ペットで被験溶液(即ち抽出物、両分、組成物)20〜40−とアガロース混合
物1滴と撹拌しながら混ぜる。固化して大きなディスクができたらさらに4つの
小さなディスクに切る。
上ヘーイスクを く
ふ卵8目上に漿尿膜上にディスクを置く、つまり漿尿膜上の種々の度合で血管形
成がはじまっている場所を選んでディスクを置く、ディスクを置く場所はニワト
リ胎児から約1am離れたところにし、離れすぎて漿尿膜上の卵殻の内側にはり
つけたりしてはならない、このようにした卵をさらに4日間インキュベートする
。用いる器具はすべて予め98%エタノールにつけておく。
プラスチーターイスク
コルクポーラ−でプラスチックディスクをつくる。各ディスクに被験溶液を2.
5mlのせ、乾燥させた。さらに2.5mlの被験溶液をのせ、乾燥させた。デ
ィスクを調製後上記のように漿尿膜上においた。
羞果立■做
ふ卵12目上に“窓”をビンセットで広げた。
次に顕微鏡で卵を観察した。ディスク周辺の血管形成と他の領域の血管形成を比
較した。ディスク周辺の新生血管の度合を評価し他の卵のディスクの評価と比較
した。
各ディスクの効果を次のような基準で1〜5段階に分けた。
1=ディスク周辺に形成された血管分枝が1つか2つの小領域の場合:陰性
2=ディスク周辺に形成された血管分枝が3つか4つの小領域の場合:応答弱
3=パ車輸のスポーク状″ディスク周辺に血管の分枝が増加した場合:応答並
4=″車輪のスポーク状”ディスク周辺に“3”よりも強い血管分枝が認められ
た場合:応答強5=″車輸のスポーク状”ディスク周辺に著しい血管分枝が認め
られた場合:応答極めて強
プラス、マイナスの表示も使用した。 CAMアッセイの値の範囲を1−(全く
応答せず)から5(著しく強い応答)までとした。
前述の評価方式に基き、′血管形成インデックス” (以後の表で“A ltイ
ンデックスまたは単に“′A”と表示)もめた。Aインデックスは血管形成の比
較分析である。
″血管形成“インデックス”は
最大可能スコア
とした。
例えば12回のCAMアッセイ中″弱”が7回、″並″が1回、1強”が0で“
陰性”が4回とするとAインデックス表■に図x、n、mに示した方法で得た抽
出物の分析結果を示した。ここに示した用語は図に用いた用語と同じである。
ネコ、ウシ、ブタ、イヌの網組織から得た試料の結果を示した。
表 ■
ネコCMFr 41 28.98 46.34 17 4 1ウシ# 14 3
5.27 35.71 5 4 0ブタIt 18 24.9 61 7 0
0ヒツジ# 4 23.35 50.00 2 0 0イヌ II 4 45.
05 0 3 1 0ネコPBS上澄 15 19.12 73.33 4 0
01%酢酸可溶、上層 18 28.17 44.44 6 4 01%酢酸
可溶、下層 10 28.72 70.00 1 2 0ネコ皮下脂肪 6 2
0.03 83.33 0 1 0ブタ皮下脂肪 8 33.43 37.50
5 0 0ネコ脂質ケーキ 5 13.36 100 0 0 0化ΔL惣
因捌伊欧 Δ 窟匹」牡111轄琶Ω吐旦ΩUネコーヘキサン上層 24 16
.7 75 6 0 0ウシ−ヘキサン上層 4 15.05 75 3 1
0ブタ−ヘキサン上層 23 35.4 30 16 0 0ネコ−エタノール
下層 18 21.9 72 5 0 0ウシ−エタノール下層 5 13.3
6 100 0 0 0ブタ−エタノール下層 22 19.4 64 7 1
0ネコ一フオルヒ上層 44 28.8 50 13 9 0ブタ一フオルヒ
上層 10 18.7 80 1 1 0ヒツジ一フオルヒ上層 4 18.4
0 100 0 0 0イヌ一フオルヒ上層 4 23.40 100 0 0
0ネコ一フオルヒ下層 44 33.2 41 16 8 2ブタ一フオルヒ
下層 15 22.7 60 6 0 0ヒツジ一フオルヒ下層 4 10.0
0 100 0 0 0イヌ一フオルヒ下層 4 38.40 25 3 0
0CI8カラム゛
化ゴL惣 匹賂伊敗 Δ 窮匡傷mw農紅鼠Ωυ一旦Ωlネコ、C18脂質 4
35.05 50 1 1 1ブタ、C18脂質 14 25.8 64 5
0 0ネコC18・非脂質 8 15.88 75 1 1 0ネコ、全ガン
グリオシド 12 27.8 50 3 3 0DEAE カラム(つづき)
ブタ、中性ガングリオシド 14 33.4 50 0 0 0DEAE カラ
ム(つづき)
仁企1 晒刈胆 Δ 釧匣済■賜憬紅掴影鮒ブタ、モノ、ジオシア0 18 2
8.6 44 10 0 0ガングリオシド
ネコ、下層、クロロホルム/ム22 30.0 36 13 1 0ブタ、下層
、クロロホルム 9 34.1 22 7 0 0ネコ、下層、メタノ−/L/
26 33.1 23 20 0 0ブタ、下層、メタノール 11 34.
0 27 8 0 0イアトロビーズ
I 4450310
If 4 15 75 1 0 0
III 4 41.75 25 2 1 0IV 4 43.4 0 4 0
0
V 4 33.35 25 2 1 01 5 32.08 40 4 0 0
n 7 24.77 43 3 1 0m 6 33.40 33 2 2 0
IV 4 29.44 80 1 0 0V 5 25.36 60 2 0
0VI 5 29.40 40 3 0 0■ 5 22.72 60 2 0
0■ 6 32.27 33 3 1 01X 31フ、87 100 0
0 0X 3 33.40 33 1 1 0XI 4 40.05 25 1
2 0アフ ニーイ クロマトグラフィ
次に示す表■でも表1〜■と類似のデータを示す、ただし、試料はすべてガング
リオシドである。第一のグループはネコの網組織由来のガングリオシドである。
ガングリオシドをモノ、ジ、トリシアル化成分に分け、1:1または1:1:1
の比率で混合した。ブタの網組織由来のガングリオシドも同じ分析を行った。″
スペルコ”のグループも既知の市販のガングリオシドの分析を提供した(スペル
コのNil〜4)、しかし、&5〜8は新しいガングリオシド組成である。
この表では“DU”すなわち“識別ユニット”の値も示した。
“DU”値をめるためにAインデックス値をクラス■化合物S1と陰性平均%s
1、クラス■化合物SIIと陰性平均%S と陰性平均%8 を用いた。sI、
S!、sn、SIIはn 1
化合物の各クラスの配分の中心を定めている。これを用いてV□と%+2及びX
□Tt X2T ; ”重量係数”を次の式でめる。
Wz= 8 8 XI?=(SSII + 51 ) /2Wz= s s X
zy=(Ssn + S 1 ) /2■ !
DU値が小さくなればなるほどこの試料の血管形成活性が高い、DU値による化
合物をランク付し、よい方から順次並べて表Vに示す。
表 ■
化合物 シ訟笑」L工^−梼WM旦
吏」開園
酸七りジ旧ガングリオシド 12 39.17 27.8 50 3 3 0モ
ノシアロガングリオシド GM3 18 26.77 34.1 39 10
1 0ジシアロガングリオシド GD3 15 94.59 15.1 100
0 0 0トリジアロガングリオシド 17 75.63 21.6 82
3 0 0モノ、ジ、トリ(混合) 23 0.54 3111.9 13 1
9 1 0モノ、ジ(混合) 9 21.06 34.1 33 6 0 0モ
ノ、ト1バ混合) 16 6.66 37.5 14 13 0 0ジ、トリ(
混合”) 8 25.84 30.9 37 3 2 0中性ガングリオシドフ
オルツマン 49 37.85 29.0 49 25 0 0モノ、フォルラ
マン(混合) 16 80.67 20.9 87 2 0 0表 ■(つづき
)
二化−金一物一 主成分 甲羽 −囚一 」(−襲N丙 WM 互層GMI G
MI 823.5638.4 37 230脳i:;M3a31438.772
9.1 50 6 t 。
Zづ辺/ml力級り
精製混合ガングリオシド 12 21.45 32.8 33 7 1 0モノ
シアロガングリオシド 団1 12 47.28 26.2 58 5 0 0
ジシアロガングリオシド G)la 9 21.51 32.6 33 6 0
0七ノ/トiバ混合) 5 93.27 21.4 100 0 0 0ジ/
トiバ混合) 6 4.3638.9 17 500モノ/ジ/トリ(混合)
6 10.56 41.2 17 4 1 01り網相趣
モノシアロガングリオシド 29 52.0 23.2 62 11 2 2ジ
シアロガングリオシド 28 46.44 25.8 57 10 2 0トリ
ジアロガングリオシド 25 40.74 28.9 52 12 0 0モノ
、ジット1パ混合) 26 55.28 21.8 65 9 0 0モノ、ジ
(混合) 18 33.21 28.6 44 10 0 0モノ、トリ(混合
) 26 34.41 27.0 50 13 0 0ジ、トリ(混合) 27
45.13 27.0 56 12 0 0表 ■
ガングリオシド血管形成能
ランク DU 化−二合−−掬
1 −10.56 スベルコ、モノlジ/トリ混合物2 0.54 ネコ網、モ
ノフジlトリ混合物3 4.36 スペルコ、ジ/トリ混合物4 6.66 ネ
コ網、モノlトリ混合物5 19.90 スベルコ、モノ/ジ混合物6 21.
06 ネコ、モノlジ混合物7 21.45 スペルコ、精製混合ガングリオシ
ド8 21.51 スペルコ、ジシアロ
9 23.56 0M1
10 25.8 ネコ網、ジノトリ混合物11 26.77 ネコ網、モノシア
口(GM3)1233゜21 ブタ網、七ノ/ジ混合物13 33.67 スペ
ルコツトリジアロ14 37.85 ネコ網、中性ガングリオシド、フォルスマ
ン15 38.77 0M3
16 39.17 ネコ網、酸性DEAEガングリオシド17 40.74 ブ
タ網、トリジアロガングリオシド18 45.13 ブタ網、ジノトリ混合物1
9 46.44 ブタ網、ジシアロガングリオシド20 47.28 スペルコ
、モノシアロガングリオシド21 52.00 ブタ網、ジシアロガングリオシ
ド22 55.28 ブタ網、モノlジノトリ混合物23 75.63 ネコ網
、トリジアロガングリオシド24 80.67 ネコ網、モノlフォルスマン混
合物25 93.27 スペルコ、モノ/トリ混合物26 94.59 ネコ網
、ジシアロガングリオシド以上の結果は、CMFrはCAMアッセイに対し血管
形成活性もっているが、図■に示したようなステップで精製した画分はより強い
活性を示している0例えは表mでネコのCM?’r(表■の一番最初の欄)はA
値が28.98だが46.34%は陰性である。一方、 DEAEカラムで精製
したモノシアロガングリオシドはA値が34.1で陰性は39%しかない、逆に
、DEAEカラムから得られる脂質でない両分はこれらの値がそれぞれA=23
.6.陰性67%と精製しているにもかかわらず活性が低下した。また、ネコ網
由来のモノ、ジ、トリジアロガングリオシド混合物はA=38.9.陰性わずか
13%であった。
もうひとつの比較データが表■のデータから導き出せる。
表■、■に示したDU値はA値だけでなく陰性パーセントも考慮されることから
より実際的な効力を示すよい方法である。 DU値が低ければ低いほどその物質
の効力は高い、従って表■のように既知のガングリオシドの新しい混合物(スペ
ルコモノ、ジ、トリジアロガングリオシド)やネコのモノ。
ジ、トリジアロガングリオシドを含む両分が最も効力の高い組成である。
一方、以上の結果を図6〜16にグラフで示した。
この図は、種々の物質に対する直線分類グラフである。
直線分類グラフは、血管形成インデックスを陰性パーセントに対してプロットし
た。個々の物質グループの平均値と各々2つのグループ毎の比較からT値をめる
。このT値が他のものよりも効力があるか否かのインデックスになる。
図■に調べたすべての試料を用いT値についてのガイドラインを示した。以後図
7〜16では種々のグループについてたものは、血管形成活性の比較上有望であ
るものを意味する0図16に最も活性の強い組成を示す。
図17は、既知のジ及びトリジアロガングリオシドの新しい混合比率での血管形
成インデックスと、陰性パーセントを示したグラフである。このグラフからジ及
びトリジアロガングリオシドの混合比は1:2が最もよいことがわかる。
このグラフは、抗原−抗体結合をプロットしたときに得られるカーブと似ている
ことが注目される。これは、結合反応が沈でん形成や凝集反応をおこす抗原−抗
体型の反応がおこっていると思われる。
以後の実験は、上述のCMFrが生体内(in vivo)で血管形成能をもっ
ていることを示している。この実験は連続ナンバー672.624、ファイル1
984年8月20日で報告されている。
表■〜■に示したようにCMFは血管形成インデックスは低いがDU値はさらに
分画した両分や同様の調べた混合物より高い(CAMアッセイ)、従って、さら
に精製した両分ですぐれた結果が再現性よく得られるであろうことは経験豊かな
人なら考えるに違いない。
一方スベルコやシグマ薬品会社から購入した市販の脂質化合物や個々の研究者よ
り譲受した化合物についてもCAMアッセイしてしらべた0表■にその結果を示
す。
表 ■
びガング1オシド
−K」L潰−匹μs Δ 9匹 !琶互セレブロシド(スペルコ) 16 36
.3 38 910ガングリオシド(スペルコ’) 15 34.3 33 8
20グロボシド(スペルコ) 1フ 詞、6291020ステリルグルコシド(
スペルコ) 16 43.0 19 11 2 0セラミド(スベルコ) 17
32.2 41 820セラミドガラクトシド(スベルコ)20 27.0
60 710セラミド、タイプ■(シグマ) 18 31.9 44 1000
セレブロシド、タイプI(シグマ) 19 30.2 53 810セラミド、
タイプ■(シグマ) 16 30.5 37 1000セレブロシド、タイプ■
(シグマ) 13 30.3 38 800スルフアチド(シグマ) 7 28
.7 57 300スルフアチド(スベルコ) 6 30.0 50 300グ
ルコセレブロシド(シグマ) 7 26.7 43 400セラミドトリヘキソ
シト(シグマ) 4 38.4 25 300ステリルグルコシド(スペルコ)
6 46.8 0 510ガング1オシド
一止−合−物一 匹釜 Δ か可 叉琶旦GMI 8 38.4 37 230
精製GMI 15 32.5 27 11 0 0GM3 14 29.1 5
0 610精製GM3 17 29.1 47 8 1 0JLtJL 明星
Δ 心色!社旦
スフィンゴミエリン(脳)(シグマ) 8 20.9 100 000ホスフア
チジルコリン(シグマ’) 10 33.4 40 600ホスフオイノシチド
(シグマ) 3 31.1 33 200スフインゴミエリン(卵黄) 6 2
2.2 83 100兜−JLJIm−寛
!(資)ΔL潰−因堅 Δ ハ里!琶盈トリステアリン(シグマ) 21 36
.5 43 831トリオレイン(シグマ) 44525030モノステアリン
(シグマ) 4 50.0 0 220モノオレイン 4 50.0 0 22
0ジステアリン(シグマ) 3 26,7 67 010ジオレイン(シグマ)
3 13.3 100 000トリパルミチン(シグマ) 4 5 1000
00トリアラキドン(シグマ) 4 41.7 0400パラフインオイル(フ
ィッシャー)440 0400ステロイド
」ζΔL1− 印釜 Δ p亜W、琶旦エルゴステロール(スペルコ) 14
37.7 36630デスモスチロール(スペルコ) 4 26.7 50 2
00ラノステロール(スペルコ) 8 28.4 38 500ステイグマステ
ロール(スベルコ) 6 37.9 33 400経験ある人なら哺乳動物の肝
、脳、上皮組織などと同様植物ことに種子にも活性を有する画分がありそうだと
考えるに違いない、植物はレシチンを含んでおり、血管形成活性の高いレシチン
がみつかるかもしれない1合成して得られる脂質の中にも活性の高いものがある
かもしれない。
組織内で正常な血管形成を故意に破砕させた部位で水不溶性の脂質標品が血管を
新生させるかどうかの実験を行った。成熟した雌のネコの筋肉内に7mg/kg
の濃度でケタミンを注射して麻酔させた。ネコをあお向けにし雨後足のひざとそ
径部の間を切開する。大腿部の動脈をとり出して結紮し、そ径部と一番目の大腿
動脈の分枝(ハンター導管)の間を除去する。切開した部位を縫合し、ただちに
静脈内に塩化第一スズ/テクネチウム99を投与する。これは組織内で赤血球に
結合する放射活性物質である。この放射活性の部位と量をガンマカメラでスキャ
ンすることにより調べる。
このようにして、放射活性物質をラベルされた赤血球を運ぶ血管、毛細血管を見
ることができる。
塩化第一スズ/リン酸塩標品は、ピロリン酸ナトリウムlO■、トリメタリン酸
ナトリウム30■、塩化第−スズ0.95■を含んでいる。この標品にPBS2
.OmQを加えてとかしそのlrr&をネコの気管の静脈内に投与する。20分
後10ミリキュリーのテクネチウム−99+oを静脈内にする。イメージングス
キャン及び血流のデジタルインテグレーションは次のように観察した。
ネコを手術したのち1手術部位のバックグラウンドの放射活性の“ベースライン
”スキャンを行ない、続いて大腿動脈を除去した部位の右足の2か所にクロロホ
ルム/メタノール抽出物6〜7−と等量の蒸発させた粘性のPBS懸濁液を筋肉
内に投与する。擬薬として左足の同様の部位にPBSのみを投与した0通常の環
境下でこの種の手術による応答として、大腿動脈を除去した部位に新しい血管及
び毛細血管が形成され、血流がつながるかどうかをみた。術後各々の足に新しく
生じた血流の割合と度合を比較し、クロロホルム/メタノール抽出脂質標品の血
管形成能を直接評価した。
続いて客足の所定部位に塩化第−スズ/テクネチウム−99+aを静脈内投与し
、客足を術後3,6.9日目にスキャンした。
以上の結果を図18−20に示す、結果は(網組織の脂質画分を投与した)ネコ
の右足に新しい血管が形成され、次にコントロールの左足にも放射活性がカウン
トされた。術後72時間では放射活性の差は29.6%、6日目には左足に比べ
38.2%右足が高かった。9日目には、左足に比ベロ5.8%右足が高かった
0図18−20の写真は、クロロホルム/メタノール抽出脂質画分を用いての結
果である0図21に示すように、塩溶液のみを投与した場合に比べ脂質を投与し
たときの放射活性は直線的に増加した。左足に比べ右足の血管形成の増加は1時
間当り0.25%であった。このことは明らかに、脂質画分の血管形成効果によ
り右足に新しい血管が生じ、組織化されていることを示す、しかし、このデータ
は、次に示すコントロール実験により示されるように脂質標品を用いることによ
る共通の組織内効果の可能性を見のがしている。
もう1つのコントロールとして、別のネコを使って上記のように大腿動脈を除去
した。しかし、この実施例では。
何の注射も行なわなかった。術後3日及び6日にガンマカメラでスキャンし図2
2−24に示した。左右の足をスキャンしたところ図22に示すように3日後に
は新しい血管再生効果の差は認められなかった0図23は術後6日目の片方の動
脈を示し、図24は同じく6日目に背部からみたものである。
その結果調べた3日目、6日目とも左右の足の放射カウント数に差は認められず
、初めの実験と比べ血管形成の度合は極めて少なかった。実際、初めの実験での
左右(コントロール)の場合より今回の追加実験での血管形成は著しく劣った。
この点と左足(コントロール)の血管形成が比較的高かった(右足よりは低いが
)という初めの実験の結果から、初めの実験では、右足の脂質標品の一部がおそ
らく左足へ移行したと考える根拠がある。
CMFrを用いたin vivo (生体内の)実験を、ヘキサン/エタノール
で得た別の物質を用いて再度行った。この両分と、 CMFrの比較は表■−■
に示しているので、経験のある人は、これらの精製した抽出物は、迅速かつすぐ
れた血管形成活性を有していると結論づけるであろう。
血管形成活性を有する脂質分子を含む組成が哺乳動物組織から得られた。治療上
効果のある投与量での組成は、予め予期せぬ経路での血管形成活性に影響するこ
とを示している。jii乳動物組織や植物組織のような脂質を含む網に似た組織
が血管形成活性のある分子を含むものとして期待できる。血管形成活性のある分
子の構造に基いて合成された脂質も期待できる。
実際には、静脈内、筋肉内、経口、局所的など既知の方法で投与できる。投与量
は患者によって異なる。
ここで用いた用語や表現は、記述用語として用いたもので限定されたものではな
く、ここで示した性質と同等のものを排除する用語や表現として用いるつもりは
ない、従って発明の範囲内で種々の修正が行なわれることは認める。
飢11移八インデックス(A)
独管形城イシヂックス(A)
丘?を形式インチ”ツクス (A)
&管丹多滅インチ−7クス (A)
血V形成イ〉テ”・7クス (A)
29.6% 増力口
Fig、旧
6上京U打績)
38.2 % 増力口
ん泥、;対ハ右足り枚射冶柑カク訃の増加・76国際調査報告
l11+−46@1il−N4.f’、j/g%g必zc4(/ −A 61
K 37/22 8615−4C@発明 者 マクリュアー、ロバート ニス
アo発 明 者 シン、ロバート ニス アメリカ合衆国、 01720 マサ
チューセッツ、アクトン、ワシントーブ 27番地
□メリカ合衆国、 10024 ニュー ヨーク、ニュー ヨーク、ウニ″テイ
ーセブンス ストリート 24繻地合衆国、 01890 マサチューセッツ、
ウィンチェスタ−9l ストリート 暖地
Claims (44)
- 1.血管形成活性を示す量で少なくとも1つのタイプの血管形成活性を有する脂 質含有分子を含んだ血管形成活性を有する組成物。
- 2.組成物が、ガンダリオシドであることを特徴とする特許請求の範囲第1項記 載の組成物。
- 3.組成物が、モノジアロガングリオシドであることを特徴とする特許請求の範 囲第1項記載の組成物。
- 4.組成物が、ジシアロガングリオシドであることを特徴とする特許請求の範囲 第1項記載の組成物。
- 5.組成物が、トリジアロガングリオシドであることを特徴とする特許請求の範 囲第1項記載の組成物。
- 6.組成物が、モノ、ジ、トリジアロガングリオシド混合物であることを特徴と する特許請求の範囲第1項記載の組成物。
- 7.組成物が、モノ、ジシアロガングリオシドであることを特徴とする特許請求 の範囲第1項記載の組成物。
- 8.組成物が、モノ−、トリ−シアロガングリオシドを含むことを特徴とする特 許請求の範囲第1項記載の組成物。
- 9.組成物が、ジ−、トリ−シアロガングリオシドを含むことを特徴とする特許 請求の範囲第1項記載の組成物。
- 10.ジシアロガングリオシドとトリジアロガングリオシドの構成比率がそれぞ れおよそ0:3から3:0の範囲であることを特徴とする特許請求の範囲第9項 記載の組成物。
- 11.ジ−及びトリ−シアロガングリオシドの比が約1:2であることを特徴と する特許請求の範囲第9項記載の組成物。
- 12.組成物がリン脂質を含むことを特徴とする特許請求の範囲第1項記載の組 成物。
- 13.組成物がセラミドを含むことを特徴とする特許請求の範囲第1項記載の組 成物。
- 14.組成物がセレブロシドを含むことを特徴とする特許請求の範囲第1項記載 の組成物。
- 15.組成物が中性脂質であることを特徴とする特許請求の範囲第1項記載の組 成物。
- 16.組成物がレシチンであることを特徴とする特許請求の範囲第1項記載の組 成物。
- 17.組成物がスフインゴツドを含むことを特徴とする特許請求の範囲第1項記 載の組成物。
- 18.組成物が動物組織由来の脂質含有分を含むことを特徴とする特許請求の範 囲第1項記載の組成物。
- 19.脂質含有分子が網組織由来であることを特徴とする特許請求の範囲第18 項記載の組成物。
- 20.網組織がネコ、ウシ、ブタ,あるいはイヌの網組織から選ばれた網組織で あることを特徴とする特許請求の範囲第19項記載の組成物。
- 21.網組織がネコの網組織であることを特徴とする特許請求の範囲第20項記 載の組成物。
- 22.組成物が植物組織由来の脂質含有物質を含むことを特徴とする特許請求の 範囲第1項記載の組成物。
- 23.植物組織がレシチン含有組織であることを特徴とする特許請求の範囲第2 2項記載の組成物。
- 24.前記分子が合成によってつくられたものであることを特徴とする特許請求 の範囲第1項記載の組成物。
- 25.哺乳動物の組織を第1の溶媒と接触させて血管形成活性を有する脂質含有 分子を抽出する工程及びさらに前記血管形成活性を有する脂質含有分子を含む第 1の溶媒と第2の溶媒とを接触させて、血管形成を阻害する物質は抽出させない で、前記血管形成活性を有する脂質含有分子だけを第2の溶媒に抽出する工程か らなり、前記第1溶媒と前記第2溶媒とは互いに不溶性のものである血管形成活 性の高い組成物を得る方法。
- 26.第1の溶媒がクロロホルム−メタノール混液であることを特徴とする特許 請求の範囲第25項記載の方法。
- 27.第2の溶媒がヘキサン−エタノール混液であることを特徴とする特許請求 の範囲第25項記載の方法。
- 28.第1の溶媒がクロロホルム−メタノール混液であつ第2の溶媒がヘキサン −エタノール混液であることを特徴とする特許請求の範囲第25項記載の方法。
- 29.特許請求の範囲第28項記載の方法で得た抽出物。
- 30.血管形成活性を有する脂質含有第2溶媒をヘキサンとエタノールの層の成 分とに分離する特許請求の範囲第25項記載の方法。
- 31.エタノール層をクロロホルム−メタノール・水混合液と合せることにより 上層と下層に分配する特許請求の範囲第30項記載の方法。
- 32.特許請求の範囲第31項記載の方法で得られた抽出物。
- 33.上層をメタノールー水、続いてクロロホルム−水混液と混ぜ2層に分ける ことを特徴とする特許請求の範囲第31項記載の方法。
- 34.特許請求の範囲第33項記載の方法で得られた抽出物。
- 35.クロロホルム−メタノール部分をメタノール、クロロホルム、水混液と混 ぜ、続いてメタノール、クロロホルム、酢酸ナトリウム混液と混ぜ2層に分ける 特許請求の範囲第33項記載の方法。
- 36.特許請求の範囲第35項記載の方法で得られた抽出物。
- 37.下層をクロロホルム、アセトン、メタノールの順に混ぜ、3つの部分に分 ける特許請求の範囲第31項記載の方法。
- 38.特許請求の範囲第37項記載の方法で得られた抽出物。
- 39.酢酸ナトリウムを含む特許請求の範囲第35項の方法で得られた抽出物。
- 40.哺乳動物組織をヘキサン−エタノール混合溶媒と接触させて前記混合溶媒 に血管形成活性を有する脂質含有分子を抽出し;前記混合溶媒を除去し;前記得 られた抽出物を第2溶媒であるヘキサン−エタノール混合溶媒と接触させて血管 形成活性を有する脂質含有分子を前記第2溶媒に抽出し;ヘキサンを除去し;エ タノール抽出物をクロロホルム、メタノール及び水からなる溶媒と接触させ、そ の結果得られた混合物を上層と下層とに分離し;前記上層をメタノールー水混合 溶媒及びクロロホルム−メタノール混合溶媒と接触させ;このように処理した上 層をメタノールークロロホルム部分とメタノールー水部分とに分け;前記メタノ ールークロロホルム部分をクロロホルム−メタノール−水混合溶媒及びクロロホ ルム−メタノール−酢酸塩含有化合物の混合物と接触させ;このように処理した メタノールークロロホルム部分をクロロホルム−メタノール−水部分と酢酸塩を 含む部分とに分け;精製する工程からなる血管形成活性を有する脂質含有分子を 含む組成分の製造法。
- 41.該下層をクロロホルム、アセトン、メタノールと接触させ分離した面分を 得る特許請求の範囲第40項記載の方法。
- 42.特許請求の範囲第1項記載の組成物を使った患者の治療で、効果的な投与 量を定める患者の血管形成を高める方法。
- 43.特許請求の範囲第2項記載の組成物を使った患者の治療で、効果的な投与 量を定める患者の血管形成を高める方法。
- 44.組成物を経口、静脈内もしくは局所的に投与する特許請求の範囲第42項 記載の方法。
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