JPS62502464A - ステロイダル リポゾ−ム - Google Patents
ステロイダル リポゾ−ムInfo
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- JPS62502464A JPS62502464A JP60504547A JP50454785A JPS62502464A JP S62502464 A JPS62502464 A JP S62502464A JP 60504547 A JP60504547 A JP 60504547A JP 50454785 A JP50454785 A JP 50454785A JP S62502464 A JPS62502464 A JP S62502464A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
ステロイダル リボゾーム
1久
頁
1、発明の分野 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 52、発明の背景
・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 52.1 リボゾームズ ・・・
・・・・・・・・・・・・ 52.2 水溶性ステロール類 ・・・・・・・・
・・・・ 83、発明の要約 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・104
、図面の簡単な説明 ・・・・・・・・・・・・・・・・13、発明の詳細な説
明 ・・・・・・・・・・・・・・・・146、実施例: 水溶性化合物を取り
込むコレステロールヘミスクシネート リポゾームズ ・・・・・・・ 286
.1 コレステロールヘミスクシネートの種々の塩を用いて調製したりポゾーム
ズ ・・・・・・・・・・ 296.1.1コレステロールヘミスクシネート
トリス塩M L V s ・・・・・・・・・・・・・・ 296.1.22−
アミノ−2−メチル−1,3−プロパンジオールコレステロールヘミスクシネー
ト−M L V s −嘩・・・・・・・・・・・・ 296.1.32−アミ
ノエタノールコレステロールヘミスクシネート−M L V s・・・・・・・
・・ 306.1.4ビス−トリス−プロパンコレステロールヘミスクシネート
−M L V s・・・・・・・・ 306.1.5 トリエタノールアミンコ
レステロールヘミスクシネート−M T、 V s ・・・・・・・・ 316
.1.6 ミナコゾールコレステロールヘミスクシネート−M L V s ・
・・・・・・・ 316.1.7音波処理により調製されたコレステロールヘミ
スクシネート−5U V s ・・・・・・・ 326.1.8押出し技術によ
り調製されたコレステロールヘミスクシネート−8U V s・・・・・・・
326.1.9 ミナコゾールーCH3−トリスクリーム 326.1.10チ
ルコナゾール−CR2−)−リスクリーム 336.1.11 ミナコゾールー
CH3−トリス坐薬 346.1.12膣内カンジダ感染症に対するインビボ活
性346.2 コレステロールヘミスクシネートM L V s中へのイヌリン
の取り込み ・・・・・・・・・・・356.2.1 コレステロールへミスク
シネート−M L V s及・び卵ホスファチジルコリン−M L V s中へ
のイヌリンの取り込み効率 ・・・・・・・ 366.3 コレステロールへミ
スクシネート−3UVs中へのイヌリンの取り込み ・・・・・・・・・・39
6.4 コレステロールへミスクシネートMLVs中へのクロムの取り込み ・
・・・・・・・・・・・4Q6.4.1 コレステロールヘミスクシネート−M
L vs中へのクロムの取り込み効率 ・・・・・・ 416.4.2コレス
テロールヘミスクシネート−M L V s 中への取り込み体積ニクロム取り
込み及びコレステロールヘミスクシネート濃度 ・・・ 426.5 コレステ
ロールヘミスクシネート リボゾームの限外構造 ・・・・・・・・・・・・・
・ 426.6 コレステロールヘミスクシネート リボゾームのX線回折分析
・・・・・・・・・・・・・・・436.7 コレステロールヘミスクシネー
ト リボゾームの電子スピン共鳴分析 ・・・・・・・・・・・・466.8
コレステロールヘミスクシネート リボゾームの等張膨潤 ・・・・・・・・・
・・・477、かなり可溶性の化合物を取り込むコレステロールヘミスクシネー
ト リボゾーム ・・・・・・・・・・・・487.1 コレステロールヘミス
クシネート−8Uvs中に取り込まれた中成長ホルモン ・・・・・・・487
.2 コレステロールヘミスクシネート S U V s中に取り込まれたイン
シュリン ・・・・・・・497.3 コレステロールヘミスクシネート−3U
V s中に取り込まれたタイロシン(Tylosin) 508、実施例:脂
溶性化合物を取り込むためのコレステロールヘミスクシネート リボゾームの使
用 ・・・・ 508.1 コレステロールヘミスクシネート−M L V s
中に取り込まれたインドメサシン ・・・・ 518.1.2インドメサシン
を含有するコレステロールヘミスクシネート小球体の限外構造 ・・・・ 52
8.2 コレステロールヘミスクシネート−5U V s中に取り込まれたジア
ゼパム゛ ・・・・ 539、実施例:血清中のアミノグリコシド濃度を決定す
るためのコレステロールヘミスクシネート リボゾームの使用 5510、コレ
ステロールヘミスクシネート リボゾームのインビボ投与 ・・・・・・・・・
・・・・・・・ 5610.1 コレステロールヘミスクシネート−M L V
s中に取り込まれたインドメサシンを使用する関節炎の治療 ・・・・・・・
・・・・・・・・ 5610、2 コレステロールヘミスクシネート−8U V
s中に取り込まれたジアゼパムのインビボ投与 5710.2.1静脈内接種
後の器官分布 5710.3 コレステロールヘミスクシネート−M U V
s中に取り込まれたクロムのインビボ投与 ・・・ 591O94コレステロー
ルヘミスクシネート−M L V s中に取り込まれたヒト成長ホルモンのイン
ビボ投与 611・月浬IL医訪
本発明は、二重層(バイレイヤー、 bilayers)形成性ステロールの有
機酸誘導体の塩から成るリボゾーム中への化合物の取り込み(entrap)方
法及び組成物に関する。
コレステロール又は他の脂質などのステロール類は、有機酸塩などの親水性部を
取り付けて、マルチラメラ(multilamallar)又は小さいユニラメ
ラ(unilamellar)の小球体(vesicle)の@濁液を調製する
為に用いることができる0本発明のステロールリボゾームは、有機溶媒を用いて
又は用いずに調製することができる。
これらの小球体は、水溶性化合物1部分的に水溶性の化合物及び水不溶性化合物
を取り込むことができる。
ここに記載されるステロール小球体は、生物学的に活性な化合物又はインビボ(
in viν0)に投与されうる医薬化合物の取り込みに特に有用である。また
、本発明のステロールリポゾームはインビトロ(in vitro)にも用いら
れうる。例えば、ここに記載のコレステロールヘミスクシネート リボゾーム類
は、二価カチオン依存分析システムにおいてイン ビトロに使用できる。
2・叉肌立笈員
2.1.リボゾーム
リボゾームはカプセルに包まれた水相を含有する完全に閉鎖した二重層薄膜であ
る。リボゾームは種々のマルチラメラ小球体(水の層でそれぞれが分離された複
数の同心の薄膜二重層であることを特徴とする玉ねぎ様構造)又はユニラメラ小
球体(単一簿膜二重層を有する)であってもよい。
リボゾーム調製の二つのパラメーターは、小球体の大きさと脂質濃度の関数であ
る。すなわち、(1)一定量の脂質で閉じ込められた体積として定義される取り
込み量は、全脂質1モル当り(1mo Q −” )の取り込まれた脂質をリッ
トルで表わす、取り込み量は、小球体の脂質組成と媒体のイオン組成とにより順
次影響されるリボゾームの半径に依存する。(2)カプセル化効率は、二重層で
隔離された水の区画のフラクションとして定義され、百分率で表わされる。カプ
セル化効率は、脂質濃度に直接的に比例し。
より多くの脂質が存在するとより多くの溶質がリボゾームの中に隔離される〔デ
ィーマーとアスター、1983.リボゾームプレパレーション:メソッズアンド
メカニズム、リボゾーム中、エム・オストロ、マルセルデッカー社編、NY、2
7−57ページ (Deamerand Uster、1983. Lipos
ome Preparation : Methods and Mechan
isms、in 7. cd、 M 0stro、 Marcel Dekke
r、 Inc、、 NYt pρ、27−51)参照〕。
リボゾーム調製の最初の方法〔バングハム(Bangham)はが。
1965、ジャーナルオブモレキュラーバイオロジー(J、 Mol。
Biol、) 13.238−252)は次の通りである。すなわち、有機溶媒
にリン脂質を懸濁させ、次いで蒸発乾固させると反応容器にリン脂質のワックス
状沈殿物が残った1次に適量の水相を加え、この混合物を膨潤させ、その結果得
られるマルチラメラ小球体(以下、%lVsと称する)から成るリボゾームを機
械的手段で分散させた。
結果として得られる薄膜二重層の構造は、脂質の疎水性(無極性)゛′尾部′″
は二重層の中心に向いており、一方、親水性(極性)“頭部″は水相に向いてい
る。この技術はパパハドジャプロスとミラー(Papahadjopoulos
and Miller)、 1967、バイオヒミヵ・エト・バイレイヤー・
アクタ (Biochim、 Bioph、ys、 Acta、)、135,6
24−638)により記載された小さい音波処理されたユニラメラ小球体(以下
、 5UVsと称す)の開発の基礎を提供した。しかし、MLVs及び5uVs
は両方ともモデルシステムとしての限界を有している。
取り込みft (captured volume)又はカプセル化効率を増大
させる試みとしてリン脂質二重層からなるリボゾームの:A′!A法が数多く開
発されている。しかし、すべての方法で有機溶媒の使用が必要である。以下にこ
れらの方法のいくつかを簡単に記載する。
カプセル化効率を増大させるための努力は、リボゾームプレカーサー又はミセル
、例えば極性頭部が水相に向くように方向づけられた脂質分子のユニラメラにと
り囲まれた水相を含有する小球体を先ず形成することを包含した。リボゾームプ
レカーサーは極性脂質を有機溶媒に溶かした溶液にカプセル化されるべき水溶液
を加え音波処理することにより形成される。リボゾームプレカーサーは次に過剰
の脂質の存在下に第二の水相中で乳化され。
蒸発させる。その結果得られるリボゾームは脂質の二重層でカプセル化された水
相から成り、水相に分散されている(米国特許4゜224 、179号、198
0年9月23日付、M、 5ehreider参照)。
カプセル化効率を最大にする他の試みとして、パパハドジョプロス(Papah
adjopoulos、米国特許4,235,871号、 1980年11月2
′5日付)は逆相蒸発小球体(以下、REVsと称する)としても知られている
オリゴラメラ(Oligolamellar)脂質小球体を作る為の゛″逆相蒸
発法” (reverse−phase evaporation proce
ss)を記載している。この操作によれば、カプセル化すべき水性物質が有機溶
媒に極性脂質を溶かした混合物に加えられる。次に均質な油中水型乳液が形成さ
れ、そしてゲルが形成されるまで有機溶媒を蒸発する6次に、そのゲルは、その
ゲル状混合物を水性媒体中に分散させることにより5懸濁液に変えられる。製造
されたREVsは大部分はユニラメラ小球体(多くのユニラメラ小球体、又はL
UVs)と幾分かのオリゴラメラ−小球体から成っている。オリゴラメラ−小球
体は単に水性物質の入った大きな内部間隙を有するいくっがの同心二重層を特徴
としている。
薬品調合方式の為にリボゾームを使用する可能性に関して多くの記載がある。例
えば、米国特許3,993,754号、1976年11月23日付、イエーーエ
ア ラーマンとエリザベスエイ サーニー(YeuhErh Rahman a
nd Elizabeth A、 Cerny)及び米国特許4,145,41
0号、1979年3月20日付、バリイーディーシイアス(Barry D。
5ears)を参照、リボゾーム薬品調合方式において、薬剤はりボゾーム形成
中に取り込まれ1次いで治療すべき患者に投与される。
薬剤は水溶性でも無極性溶媒に可溶性でもよい。典型的開示は米国特許4,23
5,871号、1980年11月25日、パパハドジアプロスとスゾカ(Pap
ahadjopoulos and 5zoka)及び米国特許4,224,1
79号。
1980年9月23日付、エムシュナイダー(M、 5chneider)であ
る。
インビボに使用するりボゾームの調製に際して、(1)リボゾームの調製中に有
機溶媒を使用する必要性を除去すること及び(2)−服用量当りに調合されうる
取り込み物質の嵩と濃度をより多くするためカプセル化効率と取り込み量を最大
にすることは種々のステロール類及びその水溶性誘導体は化粧用、医薬用及び診
断上の目的に使用されている。水溶性ステロールの中で1例えば、分枝脂肪酸コ
レステロールエステル、ステロイドエステル及びPEG−フィトステロールは化
粧品製造に使用されている〔欧州特許出願28,456号、米国特許4,393
,044号及びシュレイダー ドララグアンドコスメテイック インダストリー
(Shrader Drugand Cosmetic Industry)
1983年9月33頁及び1983年10月46頁〕。
サッカー及びクーン(Thakkar and Kuehn、 1969年、ジ
ャーナルオブファーマシューテイカルサイエンス(J、 Phara+、 Sc
i、) 58(7) + 850−852)はステロイド系非イオン界面活性剤
、特にエトキシル化コレステロール(例えば、PEG−コレステロール)の1〜
5%濃度の水溶液を用いるステロイドホルモンの可溶化を開示している。しかし
、インビボにおける可溶化ステロイドホルモンの有効性及び実用性は示されてい
なかった。多くの水溶性コレステロールは生物学1−の流体中のコレステロール
値の決定の水溶性スタンダードとして調製され用いられている(米国特許3゜8
59.047号、米国特許4,040,784号、米国特許4,042,330
号、米国特許4,183,847号、米国特許4,189,400号及び米国特
許4,224,229号)、シニッキー等(Shinitzk!IT et a
l、1979年、(プロシーデイングオブナショナルアカデミーオブサイエンス
(Proc、 Natl、Acad、 Sei、、 USA) 、 76 :
5313−5316)は低濃度のコレステロールとコレステリルヘミスクシネー
トを含有する組織培養媒体中でガン細胞を培養した。細胞膜へのコレステロール
又はコレステリルヘミスクシネートの取り込みは、膜の流動性を減少し、膜脂質
のマイクロ粘度を増大した。
コレステロール及び他のステロール類もまた。脂質二重層の物性を変えるために
リン脂質リボゾーム薄膜に取り入れられている。
例えば、エレンス等(Ellens et al、)は最近の要約(1984,
バイオフィジックスオブジャーナル(Biophys、 J、) 45.70a
)においてホスファチジルエタノールアミンとコレステリルへミサクシネートか
ら成る脂質小球体の安定性に対するHlの影響を論じている。事実、プロツカー
ホフとランサミー(1982,バイオヒミカ・エト・バイオフィジカ・アクタ(
Biochim、 Biophys、Acta、) 6其、227−232)は
安定化のための親水性末端を導入したコレステロールだけで二重層が構成されう
ろことを報告した。マルチラメラ及びユニラメラコレステロールリボゾームを上
記の従来法で有機溶媒に分散したコレステロール誘導体(即ち、コレステロール
−ホスホコリン、コレステロール−ポリエチレングリコール、又はコレステロー
ル−SO,)を蒸発乾固し、反応容器に沈殿した脂質フィルム些残すことにより
調製した。この脂質フィルムをミクロチップ付きの超音波ホモジナイザーを用い
て2IIIQの水の存在下に音波処理した。マルチラメラ小球体の形成には10
分間の音波処理を必要とし、小ユニラメラ小球体の形成には4時間の音波処理を
必要とした。その結果得られたマルチラメラリポゾームの懸濁液は乳白色で、単
層リボゾームの懸濁液は透明だった。
しかし、水溶性薬剤をより多い服用景で投与するため、また水不溶性薬剤の投与
を容易にするため、インビボの投与に適しているステロール小球体中に生物活性
薬剤を効率的に取り込む可能性は今まで追求されていない。
3、澄明の要性
本発明は、二重層がステロールの有機酸誘導体の塩から成るリボゾーム中に種々
の化合物を取り込むための方法及び組成物を包含する。化合物の取り込みはここ
ではりボゾームの水性区画中に水溶性化合物をカプセル化すること又はステロー
ル二重層中に水不溶性化合物を取り込むことと定義される。ステロールの有機酸
誘導体のトリスヒドロキシメチルアミノメタン塩(トリス塩)の形は小球体二重
層成分として特に有用である。
ステロール小球体の調製法は、水性緩衝液に、閉鎖二重層を形成しうるステロー
ルの有機酸誘導体の塩を、水性分を取り込む完全閉鎖二重層を形成するのに充分
な量加えることを包含する。マルチラメラ小球体の懸濁液はその混合物を振り動
かすことで形成される。小球体の形成は、水性緩衝液が溶液中の塩の反対のイオ
ン(カウンターイオン)をも含んでいると容易になる。さらに、ステロールの有
機酸誘導体の解離した塩が中性のpHで負に荷電していると、水性緩衝液は必然
的に二価または多価カチオンを含まない。同様に、ステロールの有機酸誘導体の
解離した塩が中性のPHで正に荷電していると、水性緩衝液は必然的に多価アニ
オンを含まない、懸濁液にエネルギーを加えると、例えば、音波処理したり又は
小球体をフレンチ加圧セル(フレンチプレス)を通して、又は適当な孔径を有す
る多孔フィルターを通して押し出したりすると、マルチラメラ°ステロール小球
体はユニラメラ小球体に変る6水溶性化合物、部分的に水溶性の化合物又は水不
溶性化合物を本発明のステロール小球体中に取り込むためには、多くの方法が可
能である。ステロール二重層中に分配す入き化合物(例えば水不溶性化合物)又
は水溶性化合物は、小球体形成中に、小球体中に試薬を取り込むために小球体の
形成前に水相に加えられる。逆に、水不溶性又は脂質可溶性化合物は、小球体形
成後にステロール小胞の懸濁液に加えられる。この場合、これらの化合物はステ
ロール二重層中に分配される。他の実施態様において、水溶性化合物及びステロ
ールの有機酸誘導体の塩を有機溶媒に添加し、その両方を安定化する(共安定化
)。有機溶媒を次に蒸発すると水不溶性化合物とステロール誘導体が均一分布し
たフィルムが残る。
水不溶性化合物を取り込んでいるステロールリボゾームは、振り動かしながらこ
のフィルムに水性緩衝液に加えると形成される。
本発明のステロールリボゾームは水不溶性又は水に殆ど溶けない生物活性薬剤を
取り込む為に用いられるとき特に有利である。
このことは水不溶性薬剤のインビボの投与を可能にする。また更に1服用量と嵩
の割合を変更できるので、高濃度の水不溶性化合物のインビボの投与を可能にす
る0本発明のステロール小球体は水溶性生物活性薬剤の取り込みの為に用いられ
る場合にも、同様に有利である。加えて1本発明のステロール小球体は、インビ
トロの診断上の分析にも用いられうる。
本発明は次の点において多数の利点を有する:(1)ステロール小球体が容易に
迅速に形成される。
(2)ステロール小球体がリン脂質MLVsと較べて高いカプセル化効率を有す
る。
(3)ステロール小球体がその調製に有機溶媒を必要としない(本発明のステロ
ール小球体は有機溶媒を用いて調製できるとしても)。
(4)ステロール小球体が生物活性薬剤又は医薬剤を取り込むことができ、イン
ビボに投与されたとき、それらの剤は遊離され代謝される。取り込まれた剤のイ
ンビボにおける運命は、投与の型に依存する。
本発明は更にコレステリルヘミスクシネートのトリスヒドロキシメチルアミノメ
タン塩と抗菌性化合物、特に抗菌性製剤がミコナゾール、ターコナゾール、エコ
ナゾール、イソコナゾール、トリコナゾール、ビホナゾール、クロトリマゾール
、ケトコナゾール、ブタコナゾール、イソコナゾール、オキシコナゾール。
フェンチコナゾール、ニスティン、ナフチファイン、アンホテリシンB、ジノコ
ナゾール、又はシクロピロックスオラミンから成る組成物に関する。この組成物
は菌感染を治療するために用いることができ、経口投与、腔内投与などを含む局
所的投与をすることができる。
本発明はコレステリルヘミスクシネートのトリスヒドロキシメチルアミノメタン
塩とペプチド、特に疎水性ペプチド、ヒト生長ホルモン、牛生長ホルモン、豚生
長ホルモン、又はインシュリンとから成る組成物を含む0水組成物は、牛乳生産
の増大又は動物の生長増大又は開始の目的で投与することができる。
4、月面の簡単餐遺−研
第1図は、取り込み溶質(クロム)とマルチラメラリポゾームの調製に用いられ
たコレステロールヘミスクシネートの濃度の反比例の関係を示したグラフである
。
第2図は、4つの異なるCH3−MLV調製に対して得られたX線回折図である
。
第3図は、CI(S−マルチラメラ小球体とEPC−マルチラメラ小球体に対す
る電子スピン共鳴データである。
第4図は、種々の緊張度の水性緩衝液中のコレステロールヘミスクシネート リ
ポゾームと卵ホスファチジルコリン リポゾームの膨潤状態を示すグラフである
。
第5図は、コレステロールヘミスクシネート リポゾーム中に取り込まれたイン
ドメサシンが筋肉内に投与されたときの関節膨張を減少するききめのあることを
示すグラフである。
第6図は、c14ジアゼパムを取り込まずに(遊離のまま)あるいはCH3−5
UVs中に取り込んだ形で、ハッカネズミに静脈注射で投与したときの器官分布
を表わす。
第7図A、B及びCは5ICrをCH3−札vS中に取り込んで(第7図A)、
またはEPC−5PLVs中に取り込んで(第7図B)、あるいは取り込まない
で(第7図C)、ハッカネズミに静脈注射で投与したときの器官分布を表わす。
5・3yし欠詳1じ1文朋一
本発明はその二重層が閉鎖二重層を形成しうるステロールの有機酸誘導体の塩か
ら成るリポゾーム中に水溶性の、部分的に水溶性の又は水に不溶性の化合物を取
り込む方法及び組成物に関する。
従って、本発明のステロールリポゾームは、(1)水性区画中に水溶性化合物を
取り込む;又は(2)ステロール二重層中に水不溶性化合物を分配して取り込む
;又は(3)1つのりポゾーム製剤中に水溶性化合物の取り込みと水不溶性化合
物の取り込みの両方を行うことで調製しうる。
本発明の実施に際して、水溶液中で完全閉鎖二重層(即ちリポゾーム)を形成し
うるステロールの有機酸誘導体のいがなる塩も使用しうる。ステロールの有機酸
誘導体の塩の適切性は水溶性化合物が外部環境と接触しないように該化合物を隔
離する能力に依存する。
いかなるリポゾームの水性区画の中にも取り込みが生していることを最終的に決
定するために、次の基準が確立されている(セ3295参照): (a)ゲル濾
過で分析して隔離された化合物が存在しないという明確な分離でなければならな
い; (b)最も外部の小球体二重層と取り込まれた化合物の間に疎水性相互作
用又は電荷−電荷相互作用があってはならない。このことはりボゾームがら遊離
化合物を分子篩で分離するのを失敗した結果であり、見かけの隔離効率又はカプ
セル化効率を人工的に増大する。この可能性を除去するため、前もって形成され
たりボゾームの懸濁液に添加された水溶性化合物があらかじめ形成されたりボゾ
ームと共溶前しないことが示されなければならない。; (C)洗剤又は他の薄
膜不安定化剤の使用によるゲル濾過したりポゾームの崩壊は〜隔離された分子の
ゲル濾過パターンにおいて、リポゾームピークに符合する位置から、遊離の分子
と共溶前する位置への変化を引き起こさなければならない。
本発明の実施に際して、通常、有機酸を導入することのできるステロールはいか
なるものも使用できる。例えば、このようなステロールとしてコレステロール、
ビタミンD、フィトステロール類(シトステロール、カムステロール、スチグマ
ステロール等があるが、これに限定されない)、ステロイドホルモン類などが挙
げられるが、これに限定されない。
上記ステロールを誘導体とするために使用される有機酸として、カルボン酸、ジ
カルボン酸、ポリカルボン酸、ヒドロキシ酸、アミノ酸及びポリアミノ酸が挙げ
られるが、これに限定されない。
塩の形は有機酸の水安定性を増大するので、いずれの有機酸もステロールを誘導
体とするために用いられうる。しかし、有機酸部分それ自体が水溶性であれば1
つの利点が得られる。このような水溶性有機酸部分として、酢酸、プロピオン酸
、酪酸、吉草酸などの水溶性脂肪族カルボンM(u、C4までのカルボン酸は水
と混合しうる;C1の遊M酸は部分的に可溶であり、それ以上長鎖の遊離カルボ
ン酸は実質的に不溶である);マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、
ピメリン酸、マレイン酸等の水溶性脂肪族ジカルボン酸(L、鎖がより短ければ
、評価できる程度に水溶性はより大きくなる;水溶性の境界線はC,−C,に生
ずる。);ヘミメリチン酸、トリメシン酸、スクシンイミドなどの水不溶性芳香
族ジカルボン酸;グリコール酸、乳酸、マンデル酸、グリセリン酸、リンゴ酸、
酒石酸、クエン酸等の水溶性ヒドロキシ酸(組、カルボニル基のα−炭素に付い
た分枝鎖を含むα−ヒドロキシ酸は加水分解を受けにくいので本発明の実施に有
利である);及び全てのアミノ酸及びポリアミノ酸を挙げることができるが、こ
れに限定されない。
上記有機酸は従来の方法でステロールの水酸基にエステル結合又はエーテル結合
で、結合できる(例えば、米国特許3,859,047号、米国特許4,040
,784号、米国特許4,042,330号、米国特許4,183.847号及
び米国特許4,189,400号参照)、ステロール誘導体の塩はステロールの
有機酸誘導体と塩のカウンターイオン(例えば。
塩の遊離塩基)を適当な揮発性溶媒に溶がし、溶媒を蒸発して除くことにより、
又はステロールの有機酸誘導体の塩から成る残渣を残す同様の方法により製造で
きる。使用されるカウンターイオンとして、2−アミノ−2−メチル−1,3−
プロパンジオール、2−アミノエタノール、ビストリスプロパントリエタノール
アミン等を挙げることができるが、これに限定されない7これらは相当する塩を
形成する。事実、ミコナゾール遊離塩基のようなイオン化しうる生物活性試薬の
遊離塩基はカウンターイオンとして使用できる。このように、生物活性薬剤はカ
ウンターイオンとして使用できる。
本発明のステロールリポゾームは、水相に二重層を形成しうるステロールの有機
酸誘導体の塩を該ステロール誘導体が小球体を形成するのに充分な量存在するよ
うに添加することにより調製される(即ち、完全閉鎖二重層は取り込んだ水性区
画を含有している)、この生成物は次にマルチラメラステロール小球体の乳白色
懸濁液が形成されるまで振とうされる。好ましい実施態様において、水相は小球
体形成を容易にするために溶液中に塩を含有している。更に、ステロールの有機
酸誘導体の解離した塩が中性のpHにおいて負に荷電しているなら、水性緩衝液
は必然的に多価カチオンを含有せず、同様に該有機酸誘導体の解離した塩が中性
のp)Iで正に荷電しているなら、水性緩衝液は必然的に多価アニオンを含有し
ていない。
マルチラメラ小球体形成のための報告された方法〔例えば、プロツカーホフとラ
ムサミイ(Brockerhoff and Ramsammy)のホスホリピ
ドベシクル又はコレステロールリポゾーム(phospholipid ves
icles or the cholesterol liposomes)
1982、バイオヒミ1.227−232)とは正反対に、本発明のステロール
マルチラメラ小球体形成方法は、有機溶媒の使用を必要としない。更に、プロツ
カーホフとラムサミーの方法と異なり、ステロールマルチラメラ小球体を形成す
るのに、(超)音波処理する必要がない、事実、本発明のステロールマルチラメ
ラ小球体乳白色懸濁液の音波処理、あるいは音波処理につづくフレンチプレス(
SLM−Aa+1nco、 Urbana、ILL)の使用はマルチラメラステ
ロール小球体の乳白色懸濁液をユニラメラステロール小球体の透明懸濁液に変え
る目的で行われる。同様に、マルチラメラステロール小球体を中圧で孔径100
mm以下のフィルターを通して何回も押し出すとユニラメラステロール小球体を
得ることができる。この押し出し技術は、ここでも参考例で記載しているカリス
等(Cullis et al、)が、 1984年6月20日に出願し、係属
中の出願第622,690号“ユニラメラ小球体製造のための押し出し技術″に
詳細に説明されている。
前もって説明したように、本発明の実施に際してステロールのどんな有機酸誘導
体も、トリス塩として用いることが有利である。
例えば、ステロールヘミスクシネート又はステロールヘミスクシネート類の混合
物などのステロールヘミジカルボン酸のトリス塩は、インビボに投与されるべき
ステロイドのりポゾームのステロール小球体二重層を形成するのに特に有用であ
る。例えば。
コレステロールヘミスクシネートを用いるとき、小球体を形成するために2.5
−700μモルの該トリス塩をトリス−HCQ (トリスヒドロキシメチルアミ
ノメタンヒドロクロリド)を含有する水性緩衝液2.0mAに添加するとよい。
この場合、水性緩衝液は必然的に二価又は多価のカチオンを含有していない。
本発明によれば、ステロールの有機酸誘導体の塩から成るリポゾーム中に水溶性
化合物、水不溶性化合物又はわずかに可溶な化合物を取り込むことは多くの方法
で達成できる:(1)上記の如くステロールの有機酸誘導体の適当な塩を用いて
調製したステロールリポゾーム(マルチラメラステロール小球体であってもユニ
ラメラステロール小球体であってもよい)のWfk、?!ii液に水不溶性化合
物を添加する。この化合物は、ステロール二重層に分配するのでリポゾーム中に
取り込まれる。この実施態様は次のように便利に実施できる:水不溶性化合物を
過当な溶媒に溶かし、次に溶媒を蒸発させると化合物のフィルムあるいは残渣が
残る。この残渣にあらかじめ形成されたステロールリポゾームの水性懸濁液を添
加すると、この残渣はステロールリポゾームの二重層中に取り込まれる。
(2)水不溶性化合物とステロールの有機酸誘導体の塩とを有機溶媒に一諸に溶
かし1次いで有機溶媒を蒸発させると水不溶性化合物とステロール誘導体が均一
に分布したフィルムが残る。振とうしながらこのフィルムに水相を添加するにつ
れて取り込んだ化合物を含有するマルチラメラステロール小球体の懸濁液が形成
される。このマルチラメラ小胞を上記の如くしてユニラメラ小球体に変えてもよ
い。
(3)ステロール小球体の調製に用いる水相に、水溶性化合物又は水不溶性化合
物を添加することにより水溶性化合物又は水不溶性化合物をステロールリポゾー
ム中に取り込むことができる。即ち、該化合物を、ステロールの有機酸誘導体の
塩の添加より前又は同時に水相に加える。この場合、水不溶性化合物は小球体形
成中に二重層に配分されて取り込まれ、水溶性化合物は小球体形成中にステロー
ル小球体の水区画中に取り込まれる。いずれの場合も、前記の如くしてマルチラ
メラ小球体をユニラメラ小球体に変えることができる。
(4)生物活性薬剤がイオン化しうるものであれば、生物活性薬剤の遊離塩基を
ステロールの有機酸誘導体の塩の調製のためのカウンターイオンとして使用でき
る。ステロールリポゾームはステロールの有機酸誘導体の生物活性薬剤塩を用い
て、ここであらかじめ記載したいずれの方法によってもgmできる0例えば、抗
菌性化合物であるミコナゾールの遊離塩基を本発明のこの実施態様の塩誘導体を
つくるのに用いることができる。
上記の4方法のいずれかを用いて、水溶性化合物と水不溶性化合物は両方とも、
1つのステロールリポゾーム製剤中に取り込むことができる。
本発明のステロール小球体を用いて水不溶性化合物を取り込むための上記の方法
によれば、いったん水不溶性化合物が二重層に分配されれば、小球体がそっくり
そのまま残っている必要はない。事実、化合物が二重層に分配されると、小球体
は妨害又は崩壊されて水性取り込み化合物の漏れ又は放出を導くと思われる。
本発明の1つの実施態様によれば、ステロールリポゾームは次の如くコレステロ
ールへミスクシネートのトリス塩を用いて調製される: 0.OIMのトリス−
HCQと0.14MのNaCQを含有する水性緩衝液1mQ当り4.5−ZOO
■のコレステロールへミスクシネートのトリス塩を添加し、得られる混合物を振
とうするとコレステロールヘミスクシネートマルチラメラ小球体の乳白色懸濁液
が生成する。この小球体を遠心分離で小球形にして水性緩衝液で繰り返し洗って
もよい6コレステロ一ルヘミスクシネートマルチラメラ小球体(C)Is−ML
Vs)の懸濁液をコレステロールヘミスクシネート小ユニラメラ小球体に変える
ために音波処理(例えば浴型ソニケーター中で)してもよい、また、C)Is−
5UVsを形成するために、C84−MLVsはフレンチ加圧セ)Lr (7L
/ ンチプレス)を40,0OOpsiで通過させるか、又は、2個の100r
+mのヌクレオポア(TM)フィルターを300−400paで通過させてもよ
い、コレステロールヘミスクシネート小球体(MLVsと5UVsのいずれも)
は二価カチオンの存在下で不安定である。例えば、二価カチオンにさらされると
、取り込んだ水性区画と水溶性化合物は放たれる。このように、小球体の151
J製時又は保存中に用いられる水性媒体は、二価カチオンを含んでいないことが
不可欠である。
本発明の方法により取り込まれた化合物は、種々の方法で用いられる0例えば、
化合物が生物活性薬剤であれば、ステロールリボゾームに取り込まれた化合物は
、インビボに投与できる。
このことは水溶液中に通常溶けないか殆ど溶けない生物活性薬剤のインビボにお
ける伝達を容易にする。ステロールの有機酸誘導体の塩から成るリボゾーム中に
取り込むことは、このような不溶性化合物のより高い服用量:嵩比での投与を容
易にできる。事実1本発明のステロール小球体は、小球体がインビボに投与する
ための1つ又はそれ以上の生物活性薬剤を取り込むのに用いられうるので、特に
有利にインビボで使用される。更に、本発明の小球体は、有機溶媒を用いないで
調製できるので、インビボに用いられるとき、従来の脂質小球体又はリボゾーム
を越えた利点を与える。取り込まれた薬剤のインビボにおける運命は、投与の経
路又は仕方に依存する。例えば、ステロールリボゾームに取り込まれた薬剤が静
脈注射で投与された場合、その薬剤のインビボにおける排出は、取り込まれない
薬剤又はリン脂質(即ち、MLVs、 5UVs、 REVs、 LUVs)か
ら成る従来のりボゾームに取り込まれた薬剤の経路とは異なる経路を通る。他方
、ステロールリボゾームに取り込まれた薬剤を筋肉内投与すると、イン ビボに
おいてその薬剤は継続して放出される。
本発明のステロールリボゾーム中にいがなる生物活性薬剤も実質的に取り込むこ
とができる。このような薬剤として、抗細菌剤、抗ヴイールス剤、抗菌剤、抗寄
生虫剤、膜種瘍剤、抗代謝産物ポリペプチド、ペプチド、蛋白質、毒薬、酵素、
ホルモン、神経伝達物質、グリコプロティン、リボプロティン、免疫グロブリン
、免疫調整剤、血管膨張剤、染料、放射性ラベル物質、放射線不透過化合物(r
adio−opaque compounds) 、蛍光化合物、レセプター結
合分子(receptor bindiB molecules) 、抗炎症剤
、抗緑内障剤、散瞳剤1局所麻酔剤、麻酔剤、ビタミン、核酸5ポリヌクレオチ
ド、等を挙げることができるが、これに限定されない。
2種以上の化合物の取り込みを同時に行うことは、このような化合物類が補足及
び協働効果を生ずる場合、特に望ましい9ステロールリポゾームに取り込まれた
薬剤は、接種又は注射(例えば、静脈内、腹膜内、筋肉内、皮下、耳内、関節内
、乳ぶさ内など)、局所的使用(例えば、目、皮膚などの部位に、耳の中に、又
は傷や火傷などへの使用)、及び上皮又は粘膜(例えば、鼻の、口の、膣の、直
腸の、胃腸粘膜など)の内層を通っての吸収などの、これに限定されないが、適
切なルートのいずれかでインビボに投与される。
他の使用例において、ステロールリボゾームに取り込まれた化合物は、広範囲の
材料、これに限定されないが1例えば他の脂質の小球体又はリボゾーム、ゲル、
油、乳液などに混ぜ込むことができる1例えば、取り込んだ化合物を含有するス
テロールリボゾームの懸濁液は、どんなタイプのりボゾーム製剤(例えば。
リン脂質MLVs、 5UVs、 LUVs、REVs、その他)においても−
成分として水相に加えることができる。これによりその化合物はリン脂質リボゾ
ームに取り込まれる。
製剤の特別な性質に基づき、当業者は他のいろいろな用途を考えつくことができ
る0例えば、本発明のコレステロールヘミスクシネート リボゾームは二価のカ
チオンに敏感なので、インビトロの比色診断分析での使用に鋭敏な、二価のカチ
オンに感じやすい指示染料を取り込むために5!製することができる。
飢針上互l五に性組成物
コレステリルヘミスクシネートのトリス ヒドロキシメチルアミノメタン塩(”
CH3−トリス″)は高濃度(例えば約100mg/mQ以上)に高温のエタノ
ールのような有機溶媒に溶がし、約25℃まで冷却すると半固体のゲルを形成す
る。得られたゲルは、元の溶媒のCH3−トリス溶液を浴型ソニケーター中で簡
単に音波処理すると、外観がさらに均質になる。ゲル中の溶媒は、大気中又は減
圧下に蒸発して除去できる。(溶媒除去の前又は後の)このゲルは水和すると小
さい小球体として分散する。
生物活性薬剤1例えば抗菌性化合物を、ゲル形成に先だってゲル中に組み込むこ
とができ、このゲルを次に膣内、腸内、局所又は経口投与することができる0本
発明の処理に含まれる抗菌化合物として、ミコナゾール、チルコナゾール、エコ
ナゾール、インコナゾール、チオコナゾール、ビホ〜ナゾール、ブタコナゾール
、イトラコナゾール、オキシコナゾール、フェンチコナゾール、エスタチン、ナ
フチフィン、ケトコナゾール、シクロピロックスロラミン、クロトリマゾール、
ジノコナゾール、アムホテリシンBなどが挙げられる。これらの抗菌性化合物の
遊離塩基又は調剤学的に受け入れられる塩が本発明の範囲に入ることは理解され
るべきである。調剤学的に受け入れられる塩は、毒性がなく容認できない副作用
を引き起さないものである9通常、処方に適合する抗菌剤ならどんなものでも用
いられる。また、最終試料に柔らがさ、なめらかさ、安定性、香気、味などの望
ましい物性を与えるため、ゲル化に先だって他の成分を、そのエタノール溶液に
添加することができる。有用な添加成分として、ワックス、植物性脂肪から誘導
されたラウリン酸の硬質パタートリグリセリド又はココアバターなどの植物性バ
ター、卵ホスホコリンなどのリン脂質が挙げられる。乳酸のような弱い、または
中程度の酸性を有する有機カルボン酸はpHを下げるため及び/又は塩基性薬品
の溶解度を増すために加えることができる。有機カルボン酸の炭素数は好ましく
は12まで、更に好ましくは6までである。チルコナゾールなどの極性の塩基性
抗菌剤のCH3−トリス中の溶解度は、乳酸のような有機カルボン酸が約5〜1
5重量%配合物中に存在していると向上する。乳酸のような化合物は水を保持し
て配合物を柔らかくする能力を有する点においても望ましい。添加成分または賦
形剤は安定で調剤学的に受け入れられるものでなければならない0例えば無毒性
で、生物活性薬剤の効能及び安全性を妨害しないものでなければならない。また
、膣内投与のような投与方法に適切でなければならない。
蓬j町
ゲルはどんな適当な容器の中でも形成できる。坐薬のためには、ゲルは適当な大
きさと形を有する型の中で形成され、膣内生薬の形で投与されると、ゆっくりと
分散してイン ビボでリボゾームとなる。ゲルはその使用に先だって水和してク
リーム又は懸濁液とすることもでき、これを局所的に又は膣内に投与する。X線
回折は、水和ゲルがマルチラメラ構造のりボゾームから成っていることを示して
いる。またこのゲルは当業者に知られている他の方法によってクリーム又は懸濁
液として形成することもできる。
坐薬を製造する場合、CI(S−1−リスゲルはゲル粒子が互に粘着力を欠くの
で、通常成形することは困難である。それ故、ワックス。
植物性バター、リン脂質又は他の成形剤を含ませる。ウニコピーMのような硬質
バターの場合は、硬質バターに対するCH3−トリスの重量−重量比は約0.1
5=1と4:1の間である。レミングトンス77−マシューテイカルサイエンス
(Rewington’s Phars+acautical 5cience
s)第16版、マック出版社、イーストン、PA、1980、1530−153
3頁には生薬処方が論じられており、ここでも参考として取り入れている。
卵ホスホコリンのようなリン脂質の場合は、リン脂質に対するCH3−)−リス
の重量−重量比は約10=1と1:1の間である。卵ホスホコリンのようなリン
脂質が用いられるとき、必要に応じて抗菌剤の溶解性を増すために乳酸などの1
例えば炭素数1〜6の有機カルボン酸を加えることができる。ミコナゾール塩基
又はチルコナゾール塩基のような抗菌剤に対する乳酸の添加量は当モル以下が好
ましい。
ワックス、植物性バターなどは抗菌性CH3−トリス処方と適合し。
室温で固体であり2体温で溶けるものが選ばれる。リン脂質は抗菌性CH3−)
−リス処方と適合し、膣粘液に分散するものが選ばれる。
この業界で知られている他の担体も、本発明の配合物の膣内投与のために用いる
ことができる。
クリーム
本発明のCH3−トリスクリーム配合物は、有機溶媒にCH3−)−リスを好ま
しくは溶媒1mQ当り約50〜100mgのCH3−トリスを溶解することによ
り調製される。メタノール、エタノール及びインプロパツールのようなアルコー
ルを含む有用な溶媒は、その中に抗菌性化合物又は他の生物活性薬剤が溶けるも
のである。このCH3−トリスは沸騰溶媒に添加され1次いで熱源からはずされ
る。次に。
穏やかに撹拌しながら生物活性薬剤を加える。得られた溶液を溶媒の蒸発を容易
にするため、溶液の表面積がかなりさらされるように大きな容器に注ぎ込む。
この溶液をゲル化が始まるまで約30〜180秒間簡単に音波処理する。″ゲル
″及び゛′ゲル化″という言葉は、その感じがゼリー又はゼラチンと似ている粘
稠な組成物をさす。この粘稠な組成物のコロイド性状は知られていない、この容
器はしっかりとおおわれ、ゲル化は約20〜30℃、好ましくは25℃で約4時
間で完了する。
おおいが取り除かれ、溶媒を蒸発させる。溶媒を真空除去することもできる。
得られた乾燥ゲルは固体であり、いくつかに切り分は微細粒状粉末が得られるま
で、凍結二酸化炭素とブレングー中ですり砕くことができる。この粉末は、望ん
だ量の均質なりリームが得られるまで水と混合される。クリームの堅さは加えら
れた水の量による。一般に、CH3−1−リスの最終濃度が約200■/ m
Qより低いなら。
得られる組成物は流体であり、注水として投与できる。また、クリームは、組成
物の粘度を増大するワックスなどを添加して製造することができる。約200−
400■/IIQの濃度ならば、得られる組成物はクリームとして投与できる。
濃度が約450wJ/IIIQより高いならば、得られる組成物は半固体乃至固
体ゲルであり、坐薬として投与できる。
没王
ミコナゾール、チルコナゾールなどの抗菌剤を含む本発明のCH3−トリス配合
物は、カンジダ、例えばカンジダアルビカンスにより人を含む哺乳類に引き起こ
されるような膣感染症の治療に有効である。鶏口癒のような人体の他の部位の感
染症も本発明の配合物を用いて治療できる。これらの処方は潅注、クリーム又は
坐薬として膣内投与するのに便利である。潅注、クリーム又は坐薬の調合におけ
る抗菌剤の量はいくつかの要素1例えば薬品の効力。
薬品により引き起こされる刺激、薬品がどれくらい速く通常の膣分泌物により膣
腔から洗い出されるかなどに依存するが、約10〜1500■の範囲である。例
えば、ミコナゾールでは50■から1.2gが、またチルコナゾールでは約20
■から480■が有用な服用量である。この量の薬品が通常約5mQ以下の坐薬
に混ぜ込まれる。一般に、より濃縮した処方がより少ない量で投与されれば。
便宜上及び患者の安楽さの点から、より望ましい。
しばしば1本発明の処方のたった1回の投与で、その抗菌剤に弱い膣感染症が治
る。従来の処方では通常3〜6乃至14服用量が必要である。
CH3−1−リスペプチド組成物
蛋白質及び他のペプチド、特に生長ホルモン、インシュリン。
低密度リボプロティンなどの疎水性のものは、可溶化するため、放出速度を制御
するため、又は作用部位の的をしぼるために本発明の配合物に含ませることがで
きる。ペプチドは通常、静脈内、筋肉内、腹膜内投与など非経口的に投与される
。使用できる生長ホルモンとして、ヒト生長ホルモン、牛生長ホルモン、豚生長
ホルモンが挙げられる0例えば、牛生長ホルモンはCH3−)−リスを用いて、
水性緩衝液中に可溶化することができる。水性緩衝液11Q当り約5〜17Of
fIg又はそれ以上、好ましくは、 150〜170LIIgの牛生長ホルモン
を水性緩衝液IIIQ当り、好ましくは約5〜300W1g、更に好ましくは、
約25〜50■のCH3−1−リスで可溶化できる。
CH3−トリスを用いて蛋白質及び他のペプチドを可溶化する1っの方法は、水
性緩衝液中でマルチラメラリボゾーム(MLV)を調製することである。その結
果得られるMLVはそのまま用いるか。
又はSUvを得るために音波処理する。ペプチドは水性緩衝液とりボゾームの混
合物中に懸濁され、リポゾームの二重層の中に分配し可溶化される。また可溶化
したペプチドは、 5PLV製造に水相として用いることができる。得られた可
溶化ペプチド組成物は1人などの乳ぶさに投与することができる。
生長ホルモンは、乳産出を増すため、又は生長を増大または開始するために用い
ることができる。乳産出を増大するため乳牛に牛生長ホルモンを筋肉内投与する
場合1通常1日当り約10■が必要である。本発明の30日に制御された放出調
合形態を用いれば、約300〜1200IIIgを1回の服用量として投与でき
る。
ペプチドの制御された放出調合形態のためには、投与量は獣医または医者により
適切に定められる。調合形態の放出特性、体で利用されるペプチドの量、毒物学
上の考察などで正確な服用量が決まる。 1
本発明の説明のため次の実施例を記載するが、これにより本発明の範囲は限定さ
れない。
次の小区分は、アルセナゾm (arsenazom) 、イヌリン又はクロム
を取り込むコレステロールヘミスクシネートを記載する。
カプセル化効率及び取り込み量などのパラメーターが評価され。
コレステロール小球体のカルシウムによる不安定性が証明される。
コレステロールヘミスクシネートの凍結腐蝕電子顕微鏡検査。
X線回折及び電子スピン共鳴も記載される。
6.1.コレステロールヘミスクシネートq刊」3ケ夷m諭ニー次の小区分は、
コレステロールヘミスクシネートの種々の塩を用いるCHSリポゾームの調製を
記載する。
コレステロールヘミスクシネートのトリス塩(以下、CI5 )−リス塩と称す
)を包含するすべての実施例において、CH3I−リス塩はシグマバイオケミカ
ルズ(Sigma Biochemicals) 、セントルイス、 MOから
購入し精製せずに用いたか、あるいは次の如くして合成した。すなわち、トリス
塩基の3.3M溶液301IQを、コレステロール水素スクシネート(ICN、
C1eveland 0hio)の67Mモルエーテル溶液1.5Qに添加し
た。得られた溶液を回転蒸発して湿った残渣とし12時間親液性化した。得られ
たCI5 )−リス塩を3回酢酸エチルから再結晶した。残留酢酸エチルを真空
(o、xmog)下に56℃まで加熱して除去した。
CI5 t−IJ ス塩(54mg)を、 0.OIM ト’) 、X−1(C
Q (p)17.3)と0.14MNaC(lにアルセナゾm (M終濃度4.
’5mM)が溶けている溶液1vaQに添加した。 (JIS−MLVsの乳白
色懸濁液が機械的振り勅がしにより形成された。このCI5−MLVsを10,
0OOX gで15分間遠心分離しテヘレットニシ、コノヘレットをIO+II
Q +7)0.OIM ト’) ス−HCQ (pH7,3)と0.14M N
aCQを用いて3回洗浄した。得られたペレットは、赤色でアルセナゾ■の取り
込みを示していた。
6.1.2.2−アミノ−2−メチル−1,3−プロパンジオールコレステロー
ルヘミスクシネートのMLVsコレステロールヘミスクシネートの2−アミノ−
2−メチル−1,3−プロパンジオール塩(50■)を、0.OIM 2−アミ
ノ−2−メチル−1,3−プロパンジオール−HCQ(PH7,3) 、 0.
07M KCQ及び0.07M NaCQにアルセナゾ■(最終濃度4 、51
f1M )が溶けている溶液11IQに添加した。 CI5−MLVsの懸濁液
がガラスピーズと共に。
うずまき状に混合することにより形成された。このC)Is−MLVsを10.
0OOX gで15分間遠心分離してペレットにし2得られたペレットをセクシ
ョン6.1.1.に記載したようにして3回洗浄した。
得られたペレットは赤色で、アルセナゾ■の取り込みを示していた。
コレステロールへミスクシネートの2−アミノエタノール塩(50mg) を0
.OIM 2−7ミノエタ/ −/l/−1(Cu、0.07M KCQ及び0
.07M NaCQにアルセナゾ■(最終濃度4.5mM)が溶けている溶液1
+all!に添加した。CI5−MLVsの懸濁液がガラスピーズと共に、うず
まき状に混合することにより形成されたにのCI5−MLVsをto、ooox
gで15分間遠心分離してペレットにし、得られたペレットをセクション6.
1.1に記載したようにして3回洗浄した。
得られたべ1ノツトは赤色で、アルセナゾ■の取り込みを示していた。
コレステロールヘミスクシネートのビス−1−リスプロパン塩(50g) ti
:o、oIM ヒス−)−U Xプロパン−HCQ (pH7,3) 、 0.
07MにCQ及び0.07M NaCQにアルセナゾ■(最終濃度4 、5mM
)が溶けている溶液1+*I2に添加した。 Ct(S−MLVsの懸濁液が
ガラスピーズと共に、うずまき状に混合することにより形成された。このCI5
−MLVsを10,0OOx gで15分間遠心分離してペレットにし、得られ
たペレットをセクション6.1.1に記載したようにして3回洗浄した。得られ
たペレットは赤色で、アルセナゾ■の取り込みを示コレステロールヘミスクシネ
ートのトリエタノールアミン塩(5(h+ Q ) をO,OIM I−U:r
−’)) −/L/7ミンーHCQ (pH7,3) 、 0.07MKCQ及
び0.07M NaCQにアルセナゾ■(最終濃度4 、5mM )を溶かした
溶液1mAに添加した。 CI5−MLVsの懸濁液がガラスピーズと共に、う
ずまき状に混合することにより形成された。このCI(S−MLVsを10,0
OOx gで15分間遠心分離してペレットにし、得られたペレットをセクショ
ン6.1.1.に記載したようにして3回洗浄した。得られたペレットは赤色で
、アルセナゾ■の取り込みをミコナゾールの遊離塩基を次の如くしてy4製した
。すなわち、NaOH水溶液を、ミコナゾール硝酸塩がエーテルに懸濁した懸濁
液に滴加して滴定した。エーテル層を集めて、エーテルを蒸発させると、ミコナ
ゾール遊離塩基から成る油が残った。次に、この油をコレステロール水素スクシ
ネートを含有するエタノールに添加した。エタノールを蒸発させると、コレステ
ロールヘミスクシネートのミコナゾール塩からなる薄膜が残った、次に、塩水し
この薄膜に加えた。長いうずまき混合の後にベシクルが溶液中に観察された。
アルセナゾ■を除いた以外はセクション6.1.1.6.1゜2.6,1.3,
6.1.4及び6.1.5に記載した如くしてCH3−MLVsを調製した。小
球体の最終ペレットをそれぞれ、それを調製した緩衝液2mM中に再懸濁させ、
乳白色懸濁液が透明に変わり、 C1(S−MLVsがCH3−5UVsに転化
したことを示すまで浴型ソニケーター中で音波処理した。
C)Isを10mM HEPES及び150mM NaCQ (pH7,5)
(7)中ニ100w/mQの濃度で分散した。この材料を30nmのヌクレオポ
アポリカーボネート フィルターを通して30回押し出すとCH3−5UVsに
なった。
6.1.9.ミコナゾール−CI5− トリスクリームシグマケミカル社(Si
gma CheII+1cal Co、) 、セントルイス。
ミズリーから購入したコレステリルヘミスクシネートのトリスヒドロキシメチル
アミノメタン(゛1トリスパ)塩(“CH3−)−リス”) (20,64g)
ヲ沸騰工9 / /Iz206m Q ニ溶カシた。CH3−トリスエタノー
ル溶液が透明になったら熱がら遠ざけ、エタノール103m Q中のミコナゾー
ル5.1.6gを穏やかに撹拌しながら加えたにの透明な溶液を大きい平らな皿
(243X243X18nvm)に注ぎ、大きい浴型ソニケーター中でゲル化が
始まるまで簡単に音波処理した0次に、この皿にしっかりと蓋をして25℃、4
時間でゲル化を完結させる。蓋を取りはずし、エタノールを蒸発させる。次に。
乾燥ゲルをいくつかに切り分け、氷結二酸化炭素と共にブレンダ−に入れ微粒状
粉末になるまですり砕いた。得られた粉末を殺菌した蒸留水と混合して、最終量
5L6mQの均質クリームが得らハ、そのミコナゾール濃度は100■/ m
Qであったラミコナゾール10.32 gを用いて、この手順を繰り返すことに
より、ミコナゾール濃度200■/mQのクリームが得られた。
この他のミコナゾール−CH5I−リス配合物は上記の手順に従い。
次に示す割合の原料を用いて調製された。
−ミ、−;に1−シーツ艷!−ヱ(コー町−)−qH5−一トΣ−5ξ、?5−
□(−麻5−)−−ネ」畦CH5−トリス(2,0g )を沸騰エタノール20
va Q中に溶がした。CH3−トリスエタノール溶液が透明になったら、熱が
らはずし、チルコナゾール1.Og (エタノール50m Q中)及び旦(+)
−乳酸83■(エタノール2mQ中)を穏やかに撹拌しながら添加した。この透
明な溶液を大きなビーカーに注ぎ″ゲル化″が始まるまで音波処理した。このビ
ーカーにしっがりと蓋をして室温、4時間でゲル化を完結させる。蓋を取りはず
し、エタノールを大気中25℃で蒸発した。乾燥ゲルをいくつかに切り分け、凍
結二酸化炭素と共にブレングー中に入れ、微粒状粉末が得られるまですり砕いた
。
この粉末を6.3gのCH3−1−リスの音波処理した小球体6.3gを含有す
る水10mAと混合した。得られた懸濁液を殺菌した蒸留水と混合して、最終量
20.8mQの均質クリームが得られ、このクリームは1m12当リテルコナゾ
ール48■に6有していた。
6 ・ 1 ・ 11・ −よ−=−ヲニ3イニニニッに一ドH5−7−トリー
三ト2−−コニ−jシをCH3−)−リス(400■)を沸騰エタノール4mQ
に溶かした。エタノ・−ルl@fl中のミコナゾール100■と、植物性油脂か
ら誘導した乳酸のトリグリセリド(ウニコピー□M : PVOIntprna
tion。
BOonton、ニコージ7ジイ)の溶融硬質バター1,2gを撹拌しつつ加え
た。得られた透明溶液を1.5+++Qの小型(r、icrofugQ)ポリプ
ロピレン管に割り入れ、簡単に(約60秒)音波処理してCH3−1−リスを“
ゲル化″させ、室温で4時間放置して完全に固化させたにのポリプロピレン類の
゛′鋳型″を取りはらい、半固体ゲルを真空デシケータ−中で一夜放置して残留
エタノールを除去した。
上記の手順に従って調製した他のCB5− )−リス生薬処方を以下にまとめた
。
ミコナゾールCH3−1−リスウニコピーM乳 酸卵ホスホコリン」5工−−−
A!〔−一□(mg) −−−−(壁と −A13.4 6.8 80.3
3.4 13.6 20.5
6.9 13,8 80.3
6+9 27.6 44.0
+0.3 20.6 80.3
20.0 41.0 12.0
20.6 41.2
20.6 41.2 2.2 10,320.6 41.2 79.4
6.1.12.g内カンジダ感染症に対するインビボにおLす二炸
卵巣摘出ラット(Charles River Breeding Labor
atories)を弱くベーターニストラジオールバレレートで処置して、絶え
ず発情している(及び膣内カンジダ感染に無抵抗な)状態を誘発した。そのラッ
トの膣内にカンジダアルビカンスを5 X 10’CFU接種した。感染したラ
ットを、接種後3日目から1日2回3日間2重量/体積%のミコナゾール硝酸塩
で膣内処置するが、接種後3日目に1回12%ミコナゾール硝酸塩クリームを投
与するが、または接種後3日目に1度だけ本発明のCH3−トリス生薬又はクリ
ーム配合物の1つを投与した。何匹かのラットには処置をしなかった。
接種後6日目又は100日目全てのラットの膣についてカンジダアルビカンへの
検査をした。膣のスワブ当り25CFU未満のラットは治癒したと考察された。
6.2.コレステロールヘミスクシネート肛Vs中つり々−イヌリンの取り立
取り込まれる試薬として3H−イヌリンを取り込んでいるコレステロールヘミス
クシネート多層小胞(CH3−MLVs)が次の如くして調製された J−イヌ
リン(]、0mC1/M Q r New England Nuclear。
Boston、 MA) を0.OIM トリス−HCQ (pH7,3) 、
0.14M NaCQ 2a+Qに溶解した0次に、CB5 l−リス塩40
■をその溶液に添加し、得られた混合物を機械的に振り動かして分散させる。乳
白色の懸濁液が形成され、マルチラメラ小球体の形成を示した。その懸濁液を2
時間放置し、その時、その懸濁液を0.OIM トリス−ICU (pH7゜3
)及び0.14M NaCQ テ稀釈シテ最終斌を]OmQにした。10pQ7
リコートの放射能は、このアリコートをシンチレーション液〔オムニフルオル4
0g (Omnifluor ; New England Nuclear、
Boston。
HA) 、l−ルエン6Q、エチレングリコールモノエチルエーテル4Q)10
+mQに加え、放射能を0.400にセットされた窓を有するベックマンL 6
800液体シンチレーシミンカウンターを用いて測定することにより、24,6
25cpm/ 10μQであると決定された61分当りのカウント(CPIll
)で示される放射能は急冷修正のH#法(Horrock、 D、L、ザナンバ
ーコンセプト(The Number Concept)。
Beckman Instruments、 1977)を応用して1分当りの
崩壊(dpi)に変換された。そのCH3−肚Vsは次に10,0OOX gで
15分間遠心分離してペレット化した。得られたペレットをO,OIM トリス
−HcQ(p)17.3)及び0.14M NaCQ 10mQニ再懸濁し、1
0,0OOX g テ15分間遠心分離して再ペレット化することにより3回洗
浄した。洗浄しテ小球体(7)へL/ ッh ヲo、oIM ト’J 7.、−
HCQ (pH7,3) 、 0.14M NaCQ中に再懸濁して最終量10
+aRとした0部分標品(アリコート)の放射能は3,442cpm/μQであ
ると測定された。従って、全部で原料3H−イヌリンの約14%がCHS−阿L
Vsに取り込まれた。
種々の濃度のコレステロールへミスクシネートからなるMLVsに取り込まれた
イヌリンのカプセル化効率が2種々の濃度の卵ホスファチジルコリンからなるM
l、Vs中に取り込まれたイヌリンのカプセル化効率と比較された。(阻、どん
なリボゾームのカプセル化効率でも二重層で陽離された水性区画分として定義さ
れ、百分率で表わされる。上記セクション2.1を参照)卵ホスファチジルコリ
ン又はCB5 t−リス塩がら成るマルチラメラ小球体はいずれも、カプセル化
効率を比較するために同一の規定書を用いて調製された。従って、5μQの10
−イヌリン(217,0mci/+w)を含むO,01Mトリス−HCQ (p
H7,3) 、 0.14M NaCQ緩衝液2.0+IQ中にCI5 l−リ
ス塩を40■、80■、160■、320■又は400■の濃度で加えうずまき
状に混合し、2時間放置して、取り込み化合物として3H−イヌリンを含むCI
5−MLVsを形成した。0.01Mトリス−HCQ (pH7,3)と0.1
4M NaCQ緩衝液緩衝液3二Q懸濁液に追加し、室温で一夜放置した。次に
0.OIM トリス−HCQ (pH7,3)と0.14M NaCQ緩衝液を
約3mA加え全量10+oQとした。
、マルチラメラ小球体(EPC−MLVs)を次の規定書に従って調製した。
すなわち、40ffIg/mQ、80mg/ n Q 、 160H/ va
Q 、 320ny/ m Q又は400■/ m QのEPCを、このリン脂
質を溶解するのに充分な量のクロロホルムに懸濁させた。このクロロホルムを蒸
発乾固すると、試験管にワックス状の沈殿が残った6次に、5μQの3H−イヌ
リン(217,0mci/ g)を含む、0.OIM トリス−HCU (PI
(7,3) 、 0.14MNaCQ緩衝液2.OmQを添加し、混合物をパ膨
潤″させ、得られたEPC−MLVsを広範囲のうずまき混合で分散させた。0
.OIM トリス−HCQ (pH7,3) 、 O,14M NaCfil緩
衝緩衝液3奢Qの懸濁液に追加し一夜室温で放置した6次に、 0.OIM ト
リス−HCQ (pH7,3) 。
0.14M NaCQ緩衝液で、この混合物を全i10mQにした。
C)Is−MLVs及びEPC−MLVsによる3H−イヌリンのカプセル化効
率は、次の如くして決定された。すなわち、成分の最初の混合物のそれぞれの2
0μQ部分標品(アリコート)中の放射能が、前記の如くしてシンチレーション
カウンターで測定された。リボゾームの形成後、@濁液をto、ooox gで
10〜20分間遠心分離して、リボゾームヲヘレット化シ、各ぺL/フット0.
OIM ト’J ス−HCQ (p)17.3) 、 0゜14M NaCQ緩
衝液緩衝液1申
、3) 、 0.14M NaCQ緩衝液に最終量10mQになるように再懸濁
した.この最終洗浄試料の20μQ部分標品の放射能が測定された。
最終試料中で測定された初期放射能の部分が,脂質小球体中に取り込まれた3H
−イヌリンを表わした。
第1表に示した通り、カプセル化効率の増大はCH5濃度の増大に比例するが、
更に重要なことは、20〜200 mg / m QのCI5を用いて製造され
たCI5−Ml、νSが同じ濃度のリン脂質を用いて製造したEPC−Ml、V
sよりもイヌリンのカプセル化効率が高いことを示すことである。
第1表
リン脂質小球体とコレステロールヘミスクシネート小球体中のイヌリンのカプセ
ル化効率の比較脂質濃度 取り゛んだイヌリン
a)卵ホスファチジルマルチラメラ小球体b) コレステロールヘミスクシネー
トマルチラメラ小球体C H S − M LV sのカプセル化効率が、水性
緩衝液中に存在する遊離の3H−イヌリンとCI(Sが接触している時間量に影
響されるがどうかを調べるために+ CH3−肚Vsを次の如くして調製した。
すなわち、80■又は300■のCll5 )−リス塩を10μQの3H−イヌ
リン(比放射能217mC1/ mg) tr. 含有T ル20m Q ノ0
.OIM トTJ X−HC Q 、 0.14M NaC Q緩衝液中で旋回
混合し、CH5濃度が40I+Ig/mQ及び150mg/mQのCI5−ML
Vsをそれぞれ形成させた。
2種の脂質濃度のそれぞれについて5試料作成し、CI5−MLV懸濁液を21
1Qの0.01M トリス−)IC Q (pH7.3) 、0.14M Na
C Q viil中室温で放置した0次の時間間隔.すなわち0分、15分、3
0分。
60分及び120分おいて、試料を同じ緩衝液で10s Qにした.各試料の最
初の10μQ部分標品は上記の通りシンチレーションカウンターで測定する為に
取り分けられた0次に、試料を10,0OOX gで10分間遠心分離し,各ペ
レットを1On+ Qの緩衝液中で4回洗浄した.最終ペレットを最終量101
IQになるように緩衝液に懸濁させ、各最終試料の10μQ部分橿品の放射能を
各時間点での最初の試料の放射能と比較した.その結果はテストした各脂質濃度
で,上記5時間点についてのカプセル化効率に重大な相異を示さなかった。
このことは、調製物°に加えられた最初の1H−イヌリンの約12%。
又は20%の取り込みは40IIIg/+oQ又は150mg/mQのCI5で
、それぞれ接触時間にかかわりなく生じたことを示している。このことは、従来
の卵ホスファチジルコリンを用いてg製した肚Vsとは異なり、CI5−MLV
sの調製には“膨潤時間″を必要としないことを示している。
6、3.コレステロールヘミスクシネートの5UVs中へのイヌリンの取り込み
被取り込み薬剤として1H−イヌリンを含んでいるコレステロールヘミスクシネ
ートからなる小ユニラメラ小球体を次の通りに調製した.すなわち、 100u
Qの1.0mC1/mQの′Hーイヌリン(NewEngland Nucl
ear, Boston, HA)をCHSトリス塩を100■又は200■加
えた2.5m12の0.OIM)−リス−〇C Q (p)17.3) 、 0
. 14 M NaC Qに溶解した。ガラスピーズと共に旋回混合した後、混
合物をピペットで吸い取り,ビーズと分離し,透明になる迄音波処理、すなわち
約2時間音波処理した。懸濁液の透明化は. CH3−MLVsが小マルチラメ
ラ小球体に移行したことを示している. CH3−5UV懸濁液中の最終CH5
濃度は、それぞれ40■/IIIQ及び80■/mQであった。
イヌリンの取り込み(上記セクション5参照)を証明するため。
このCHS−5UVs tr次の通りにしてゲル濾過によりCH3−5UVsを
取り込みイヌリンから分離した.すなわち、 0.OIM トリス−HC Q
(pH7.3)、0、14M NaCQ緩衝液で平衡にされ検量された、交換範
囲が40,000−15,000,000ドルトン分子量であるバイオ−ゲルA
(Bio−GeQ ^)15m、100−200メツシユアガロースカラム(
Bio−Rad Laborat。
rigs, Riehmond, CA)に各リポゾーム懸濁液を別々に適用し
た。
次に該カラムから溶出した3−vanフラクションを集め,各フラクションの1
0μQ部分標品の放射能を前記の通り測定した.このゲル濾過により隔離された
イヌリンを含まない明確な分離が行なわれ、CH3−5UVs中にイヌリンが取
り込まれていることを示した.この分析は約1%のイヌリンがCH3−5uVs
中に取り込まれた事髪示した。
被取り込み試薬として、G1Crを取り込んでいるコレステロールヘミスクシネ
ートマルチラメラ小球体を次の通りに調製した。
すなわち、15.0 μmo Q 、 40.0 μmo Q、65−8 p
IIIo Q 、 100.O u mo Q −175、O p mo Q、
263.2μmoll 、 526.4μmo(l 又は658.O a mo
Q (7)CHSトリス塩を微量の”Cr (New England Nu
clear, Boston, MA)を含有する5mQの0.OIM トリス
−HcQ 、 0.14M NaCQ pH7.3に添加し、室温で2時間放置
したところ、取り込まれた51Crを含有するCH5−MLVsの懸濁液が生成
した。
6.4,1.−1少−スチロールヘミスクシネート−MLVs中へのL且んΔ九
を欠ル化効率
セクション6.4.で製造したCH5−MLVsのカプセル化効率を測定するた
め、蒸留水中で3回洗浄した透析袋(Thomas 5cientific。
カタログ1ia3787−D22.12,000ドルトンの分子量カットオフ)
に各調製物の試料をピペットで取り分けた。透析袋中の試料を初めにガンマ−カ
ウンター(Tm Ana Q ystic、モデルNa1191)でカウントし
た。次に、試料を、同じ0.OIM トリス−HCQ 、 0.14M NaC
Qp87.3緩衝液で滞留物:透析液の比を1 : 150より大きくして20
時間、それぞれ透析した。透析液は初めの6時間は、2時間毎に取り換えられた
。カプセル化効率は、初めのカウントの残存したパーセンテージを計算して決定
された。
第2図に示した通り、カプセル化効率はCH3I度に比例している。
第2表
コレステロールヘミスクシネート小球体中のクロムのカプセル化効率
CH5p度 取り込まれた
165・020.13
263.2 27.90
6.4.2.コレステロールヘミスクシネート中へのセクション6.4.1の記
載の通り!5iI製されたCH5小球体の取り込み量は次の計算:
を用い、取り込まれた溶質を計算することにより、各濃度のコレステロールヘミ
スクシネートについて決められた。
第1図に説明されたデータは、CH5)−リス塩の濃度が増大するに従い、脂質
1moQ当りの取り込みクロムは減少することを示している。このように、カプ
セル化効率の増大は脂質濃度の増大に比例するが、取り込み溶質は脂質濃度が高
くなるにつれて減少する。点当りの試験数を各点に続くカッコ内に示しである。
イヌリンを省いた以外はセクション6.1.に記載した通りにしてコレステロー
ルヘミスクシネート トリス塩を用いてgj4製されたC)IS−MLVs及び
CH3−5UVsの試料を凍結腐蝕電子顕微鏡検査法〔凍結腐蝕法についてはプ
フェニンガー等(Pfenninger et al、)1975、ジャーナル
オブセルラーバイオロジー(J、 Ce11. Bio、)的、15−28を参
照〕用に作成した。
このCH5−MLVの凍結腐蝕した調製物の電子顕微鏡検査で少なくとも1つの
層、例えばリボゾーム又は脂質小球体により結合された離れ離れの単位があられ
れた。CH5−MLVsの大きさは非常に不均質で、直径が800nmから10
.OOOnmまでの範囲であった。より大きな小球体はいくつかのクラスに分類
することができた。すなわち、1又は小数の外層を有するもの又は多くの層を有
するものであった。大部分のより大きな小球体は粒状の外観を呈し内側に、ある
いは水の部屋を示している、実質的な面積を有していた。多くの例で、小球体又
は小球体群が、より大きな小球体の内側に多かれ少なかれ、自由に、時々は4又
は5層に重なって見えた。この明らかなパネスチング(nesting) ”は
、負に荷電したリン脂質でつくられた従来のりポゾームでも一般に観察された。
時々、密接に位置した層の帯状部分が見られた。これらは従来のリン脂質MLV
sの層すべてに関して同様に現われる。
音波処理した試料を検査すると、50nm〜500nmの範囲の多くの小さな不
完全球体を含んでいた。これらの小球体は多分リン脂質MLVsの音波処理でつ
くられた5UVsにたとえられる。より小さなCI(S−小球体は割れなかった
ので、内部構造又はその成分の層を識別することは不可能だった。
平均サイズ約65nI11の小球体を30nmフィルターを(10回)通して押
し出されたCH3小球体をMFJした。これはフレンチプレス法で調製された。
非常に小さい(平均直径25nm以下) C)Is小球体と著しい相異を示す。
種々のCHS −M L V調製物のX線回折は、この他に記載されている(G
runer、 S、M、、 1977、 PhD thesis、 Pr1nc
eton University。
Pr1nceton NJ 09540 USA ; Reyno Q ds、
Geo、 T、 、 Mi Q ah、 J、R,及びGruner、 S、
M、、 1978.レビューオブサイエンティフィックインストルメンツ(Re
v、 Sci、 In5tr、) 49.1241〜1249 :Ti1coc
k、 C,P、T、、 Ba1ly、 M、B、、 Farren、 S、B、
、 Cu1lis P、R,及びGruner、 s、M、、 198Lバイオ
ケミストリー(Biochem、) 23.2696〜2703) 、三次元像
強化X線検出器を用いて行われた。X線繰返し間隔は±065人で表わされる。
CH3分散液をエポキシの栓で密封されたX線用1.5mガラスキャピラリー
に保持した。検体は穏やかに又は激しく水和された。穏やがな水和には、X線キ
ャピラリーの底の乾燥CI(Sの上に緩衝液を注射器から層に重ねた0次にキャ
ピラリーを卓上遠心分離機中で瞬間的に遠心分離して、その脂質水ペーストから
気泡を除いた0次に、そのキャピラリーを密封して少くとも4時間、5℃で平衡
させた。激しい水和は乾燥cH3を緩衝液及び2個の混合用ガラスピーズと共に
旋回させることにより達成された。次に標品がX線キャピラリーに移された。
X線回折は水和C1(Sがマルチラメラ構造を形成していることを証明した。第
2図a及び第2図すは、それぞれCH368,9重量%及び59.1重量%から
なる穏水和検体から由来した低角度回折を示している。回折の等間隔の順位の4
つまでは、それぞれ可視の68.1人と79.8人のマルチラメラの整列と一致
した繰り返しである。これらの順位は鋭くまたよく分解されており、この格子の
無秩序性はほとんどなかったことを示している。これらの濃縮CH5検体は、目
に見える余分の緩衝液を含まない均一なペースト状外観のものであり、水含有量
が増えるに従って繰返し間隔が増えた事実と一致した。非常に高い水濃度では、
穏水和CH5検体は水和脂質の先端上で過剰の緩衝液がたまっていることを見せ
た。このような試料(全重量中20.2%C1(S)からの回折は第2図Cに示
されている。
より高い角度の回折ピークが巾広くなっていることが格子にかなりの無秩序性が
あることを示している。この格子の無秩序性は決定的な格子指摘を困難にしたが
1層合わせがなされた場合、第2図Cに示されたように、繰返しは約86人であ
り脂質二重層の間に多量の水外間があることを示唆した。
穏水和の代りに、20.7%CH5検体が乾燥脂質を緩衝液と旋回混合して調製
された場合、結果として得られた検体は均一な乳白色の外観を呈していた。第2
図dに示された通り、低角度回折は、鋭く境界が定められた格子の証拠がほとん
どない散乱の巾広いバンドを現わした。同様の回折特徴は、層間水分の広さが広
く変化しているマルチラメラ系にも予想される。稀1cl(S分散液のX線回折
は、層間力が弱いマルチラメラ系から生じているとしてほぼ一致して解明される
。稀薄卵ホスファチジルコリン分散液のような他の脂質系では、X線回折図は鋭
く境界を定めた層格子を示しており、これは重量で大部が脂質であるものである
(Rand、 1981゜アニュアルレビューオブバイオフィジクスアンドバイ
オエンジニアリング(Annu、Rev、 Biophs、 Bioeng、)
10.277−314) 。
このよく境界を定めた格子繰返しは、脂質層分離機能として格子ポテンシャルに
おける比較的鋭い最小値の結果である。ポテンシャル対距離の曲線が浅い凹みの
みを有するなら、弱い層間力とかなりの格子無秩序性が予想される。このことは
、CH5小球体の場合にもそうであると言える。
第2図dの検体は、第2図aの68.1人繰返しと比べて、約86人繰返しを有
する。このことは過剰緩衝液の存在下でCHSリポゾームが、脂質に対する水の
比が大であることを示している。同様の結果が他の荷電脂質系でも観察されてい
る(上記のRand v卵ホスファチジルコリン(EPC)でつくられたマルチ
ラメラリボゾーム(Avanti PoQar Lipids、 Birmin
gham、 AL)をスピンラベルし、本質的に前記の通りに調製し、同様にラ
ベルしたトリス塩CH5−MLVsと比較した。EPCMLVsの場合、1モル
%の5,7.9.10.12又は16ドキシルステアレート〔モレキュラープロ
ーブズ(Molecular Probes) 、 Junction C1t
y、 OR)のいずれかを、クロロホルム中の40■の脂質に添加し、得られた
溶液を回転蒸発により薄膜になるまで乾燥させた。次に2m12のトリス−HC
I2緩衝液を用いて旋回によりこのフィルムを水和すると、薄膜は完全に懸濁し
た。得られたEPC−MLVsを、分光分析に先だって2回洗浄した。
CH5−MLVsの場合は、1モル%の適当なスピンラベルのエタノール溶液を
乾燥させて試験管の側面に薄膜を形成し、これにCHSトリス塩の粉末40■と
トリス−HCQ緩衝液2IlIQを添加した。この懸濁液を旋回し、得られたり
ボゾームを2回洗浄した。全ての電子スピン共鳴実験はIBM Instrum
ents ERlooD ESR分光光度計を用いて行なわれた。順位パラメー
ター(S)は、この他に記載された(Griffith及びJist 、スピン
ラベリング(Spin Labe Q Q ing) 。
BerQiner、 L、T、 (ed、) Academic Press、
N、Y、 1976)ようにして計算された。
第3図は5.6.7.9.1o、12又は16ドキシルステアレートのいずれか
を用いたy4製物をスピンラベルすることにより決定されたCH5−M’、LV
sとEPC−MLVsの順位パラメーター図を示している。EPC二重層は、す
でに報告されている様に、二重層中への炭素数を増加するに従い、順位パラメー
ターは減少している。CH5二重層の前出の分子構造はきわだって異なっている
。すなわち、CH5二重層がEPC二重層よりも劇的に硬いばかりでなく、CH
5系が実際に50番目から90番目までの炭素の整然たる増加を示しており、こ
のことは先に報告されているものとは全く異なった物理的及び化学的二重層構造
であることに示している。
次の一連の実験において、コレステロールへミスクシネート及びリン脂質マルチ
ラメラ小球体の等張膨潤行動が比較された。
(1)セクション6.1.に記載した通りにして、0.OIMl−リス−HCQ
、 0.1M KCIII緩衝液ZarQ中のCH5I−リス塩40■を用いて
、CH5−MLVsをWA製した。
(2)セクション6.2.1に茗己載した通りにして、0.01Mトリス−HC
Q、 O,IM KCQ緩衝液2mQ中のEPC51,8+nzを用いて、EP
C−MLVsを調製した。
(3) EPC−MLν調製のためのセクション6.2.1.に記載された方法
を用いて、0.OIM )−リス−HCQ 、 0.1M KG m緩衝液2m
Q中のEPC41,1,及びEPA9.79mgを用いて、EPC及び卵ホスフ
ァチジン酸(EPA)からなる脂質二重層を有するマルチラメラ小球体を調製し
た。得られたMLVs(EPC: EPA−札νS)は、それぞれEPC: E
PAをモル比8:2で含んでいた。
札Vsの各懸濁液(すなわち、上記のCH5−MLVs、 EPC−MLVs及
びEPC: EPA−札νS)を旋回混合後、予備の緩衝液中で2時間室温で放
置した。次に、各リポゾーム調製物の20μQ部分標品を、KCfl濃度が0.
055M乃至0.5Mの一連の0.01Mトリス−H(l緩衝液1.0mQに添
加した。1時間平衡させた後、550nmの波長で試料の吸光度を測定すると薄
い散乱が認められた。
結果を第4図にグラフとして示した。ここで吸光度は小球体がさらされている媒
体のKCQJ度の逆数に対しプロットされている。
増大した吸光度は脂質小球体の膨潤を示している。曲線B及びDは、予想された
通り、リン脂質MLVs (すなわち、 EPC−MLVs及びEPC: EP
A−肛Vs)が理想的浸透圧計として行動したことを証明している。しかし、曲
線Cは、CH5−MLVsは閉鎖小球体構造として行動するものの、それらは低
張媒体又は高張媒体中では非理想行動をとることを示している。第4図に示され
たこの行動は、プロツカーホフ及びラムサミー(Brockerhoff an
d Ramsammy)、(+982゜バイオヒミカ・エト・バイオフィジカ・
アクタ (Biochim、 Biophys。
Acta、)斗朋、 227−2323がコレステロールリポゾームで観察した
こととは全く異なっている。
水に対する溶解性の乏しい化合物のCH3−リボゾーム中への取り込みを牛生長
ホルモン、インシュリン及びタイロシン(Tylosin)で証明する。
およそ1.91個のアミノ酸の単鎖から成る蛋白質の試料である牛生長ホルモン
(BGH)は部分的に水溶性である。通常の溶解度はpH8,0で1〜1.5■
/raQである。 BGI(は、クロロホルムのような有機溶媒中で沈殿する。
セクション6.2.に記載された通りにして、0.01Mトリス−HCQ (p
)17.4) 、 O,]44MNaCQ緩衝液1mQ中のCHSトリス塩25
■を用いて、C)IS−MLVsを調製した。このCH3−MLV調製物を透明
になるまで音波処理すると、音波処理C)+5−5UVsが形成された。次に、
5、、10..15■、25■、 30■又は166■のBGH(Elf Li
1ly & Co、。
Indianapolis、 IN)を、この音波処理cHs−suvi濁液の
別々の部分標品に添加した。この懸濁液を広範囲に旋回混合すると、CB5−8
UV二重層中にこの蛋白質が分配された。この音波処理C)+5−3UV懸濁液
について、沈殿の有無を1日目、2日目及び21日間に肉眼で観察した。沈殿は
eiaされなかった。このことは、牛生長ホルモンが、室温で21日間テストさ
れた全ての濃度で、CH3−リボゾーム中に取り込まれたままで留まったことを
示している。
ポリペプチドホルモンである亜鉛−インシュリンは、稀酸又はアルカリには速や
かに溶けるがPH4,5〜7.0の水相には実際に不溶である。事実、インシュ
リン溶液が巨大凝集体を形成する傾向は、長期インシュリン投与システムの開発
の障害になっている。
セクション6.2.に記載された通りにして、0.01Mトリス−HCQ (p
)17.4) 、 O,14M NaCQ緩衝液11IQ中のCH5hリス塩2
5■を用いて、CB5−MLVsを51製した。 コ(7)CB5−MLV調製
物を透明になるまで音波処理して音波処理CH3−5UVsを形成した。このC
H3−5UVWA濁液に47■までの亜鉛−インシュリン粉末(Boving
PancreaticInsulin、 Sigma Chemical Co
、、 St、 Louis MO)を添加した。この懸濁液を広範囲に旋回混合
すると、 CH3−5UV二重層中にインシュリンが分配された。この音波処理
CH3−5UVsについて、沈殿の有無を1日日22日目及び21日間に肉眼で
観察した。沈殿は観察されなかった。このことは、5mg/mQの濃度で、イン
シュリンが室温で21日間取り込まれたままであることを示している。インシュ
リンの取り込みは37℃でより速やかに起こる。
タイロシンは25℃の水に5■/IIIQmける抗生物質で、低級アルコール、
エステル、ケトン、塩素化炭化水素、ベンゼン及びエーテルにも可溶である。
小マルチラメラ小球体が次の如くして調製された。すなわち、1100ff1の
タイロシン塩基(Eli Li1ly & Co、、 Indianapoli
s、 IN)及び200■のCHSトリス塩を4mQのリン酸で緩衝した塩水(
p)17.4)中で旋回混合した。得られたCB5−MLVsの乳白色懸濁液を
ブロープチップソニケーターで15分間音波処理した(用心のため、試験管の周
りに水浴を置き、混合物の温度を低く保った)。以上、この混合物を浴型ソニケ
ーター中に1時間45分置いた。
この2時間の音波処理後、この懸濁液を10,0OOX gで10分間遠心分離
することにより、このCH3−5UVをi!!濁液から分離して、ペレットと乳
白光の上澄液を得た。上澄液中の音波処理CH3−5UVSを100■のタイロ
シン塩基(Eli Li11.y & Co、、 Indjanapolis、
IN)を、同量の水に添加した懸濁液と肉眼で比較した。タイロシン塩基の@
濁液には沈殿が生じたが、CHS−5UVタイロシン製剤には沈殿は生じなかっ
た。このように、このタイロシンは少くとも48時間取り込まれたままであった
。
8、実施例:コレステロールヘミスクシネートの脂質可溶性化合物取す暴、4
Of: l々pI東」−脂質可溶性生物活性薬剤の取り込みはインドメサシン及
びジアゼパムで証明される。
プロスタグランジン阻害物質であるインドメサシンは実際には水不溶性である。
インドメサシンの遊離酸はエタノール、エーテル、アセトン及びひまし油に可溶
性である。
生物活性薬剤としているいろな斌のインドメサシンを取り込んでいるCB5−M
LVsを次の通りにして調製した。すなわち、丸底フラスコでCB5 )−リス
塩25w、、インドメサシン1〜5K、及び14C−インドメサシン(22,0
mC1/mmoQ 、 New Enguandへuclear、 Bosto
n。
MA) 10μQを配合した。全ての成分を溶解するのに充分な量のメタノール
を添加した。次に、この混合物を回転蒸発させて容器上に薄膜を形成させ、全て
のメタノールの除去を確実にするために一夜真空乾燥した。次に、各フラスコに
0.OIM)−リス−HCQ (pH7,3) 、0.14M NaCQ緩衝液
を1.omQ添加することによりCB5−MLVsを形成した。この懸濁液をガ
ラスピーズと共に旋回混合して2時間静かに放置した。
2時間後、このCB5−MLVs中に取り込まれたインドメサシンの各々の量を
次の通りにして決定した。すなわち、0.OIM)−リス−HCQ (pl+7
.3) 、 0.14M NaCQ緩衝液9.0mQを各試料に添加し、混合物
を10,0OOX gでlO〜20分間遠心分離した。得られた0、0Mトリス
−HCQ (pH7,3) 、 0.14M NaCQ緩衝液10m12中で3
回洗浄し、最終景1 ya QのO,OIM)−リス−)ICQ (pH7,3
) 、 0.14M NaCQ緩衝液に懸濁した。゛′標準品″は放射性ラベル
化インドメサシンのみが最初の混合物に加えられた以外は、試料調製と同様の方
法で調製された(すなわち、インドメサシン1〜5■がこのCB5−MLV標準
調製物から省かれた)、各試料の濾過された20μQ部分標品中に含有される放
射性がシンチレーション液1OIIIQ中でカウントされた。″標準品″を種々
の濃度のインドメサシンを含有した試料と比較して取り込まれたインドメサシン
のパーセンテージを決定した。結果を第3表に示す。
インドメサシン濃度 CB5−MLVs中に取り込まれた結果は78%までのイ
ンドメサシンが、CB5−MLVs中に取り込まれうろことを示している。
取り込まれたインドメサシンが小球体の薄膜を変化させたかどうかを調べる目的
で、インドメサシンの存在下に調製されたC)IS−MLVs (セクション8
.1.1.を参照)を凍結腐蝕電子顕微鏡検査に関して上記した通りに処置した
。凍結腐蝕電子顕微鏡検査において、低倍率では、空の” CB5−Ml、Vs
は、インドメサシンを含有するCB5−MLVsと区別されなかった。すなわち
、1つを独特なものとして互に区別できる明白な特徴がなかった。しかしながら
。
高倍率ではインドメサシンを含有するC)Is−MLVsの二重層は特異である
。インドメサシンが水不溶性薬剤であり、エタノール、エーテル、アセトン、及
び他の無極性溶媒に可溶なので、インドメサシンが脂質の存在下に水から隔離さ
れるように調製されると予想される。電子顕微鏡検査で見た二重層の考察は、二
重層の厚さが横断破砕において変化していることを示した。これは、インドメサ
シンが二重層の脂質部分に正に分布されていること、厚みの増加及び非常に不均
一な形態の付与が出現したこと、すなわち、厚みは1つの二重層が破砕線に沿っ
て追跡されるに従って変化したことを示唆した。この結果は、二重層の脂質部分
に薬剤を隔離するような、そんな溶解度を有する試薬に特別なものと推定される
。
鎮静剤又はトランキライザー 〔すなわち、バリウム(Valium) )であ
るジアゼパムはクロロホルム、ジメチルホルムアミド、ベンゼン、アセトン及び
アルコールに可溶であるが、水にはほんの少ししか溶けない。
ジアゼパムを取り込んでいるCH3−5IIVsを次の通りにして調製した。す
なわち、ジアゼパム2■、3mg、4■又は5■を5μ息の1H−ジアゼパム(
76,7Ci/mmo Q 、 New England Nuclear、
Bost。
n、 MA)の入った試験管に添加した。この薬剤が溶けるのに充分な量のメタ
ノール(最大2IIQのメタノール)を各試験管に加えた。次に、この混合物を
回転蒸発させて薄膜とし真空で一夜乾燥させて、全てのメタノールの除去を確実
にした。乾燥薄膜を音波処理CH3−5UVsの懸濁液IIIQ中に再懸濁して
、ガラスピーズを用いて旋回混合し、0.22μmのミリポア(Millipo
re)フィルター(Millipore Corp、、 New York、
NY)を用いて濾過した。
CB5−5t!Vsは次の手順に従って調製した。すなわち、CHSトリス塩5
0mg、100mg、又は200■をトリス−HCQ (pH7,3)、 0.
14M NaCQ緩衝液1.0mQとうずまき混合した。ブローブソニケーター
を用いて、混合物を550nmの波長で測定した光学密度が約0.40 (すな
わち、゛′透透明温溶液になるまで音波処理し、次にto、ooox gで遠心
分離して、ソニケータープローブの先端からはずれて来たかも知れないいかなる
チタンも除去した。このCH3−5UVsの懸濁液を次の試験管から他の容器に
注いだ。
音波処理したCH3−5UVsで取り込まれ得たジアゼパムの各々の量が試料を
″標準品″調製物と比較することによって決定された。
゛′標標準品詞調製物放射性ラベル化ジアゼパム列九が゛加えられた以外は試料
調製と同様にして調製された(すなわち、ジアゼパム2〜5mgがこのCH3−
5UV標準調製物から省かれた)。いずれの場合も、濾過された@濁液の10μ
Q部分標品中に含有される放射能がシンチレーション液10μQ中でカウントさ
れた。結果を第4表(mg/ m Q ) C8514度(g/mQ)」刈 ±
亜
2 86 1.00 to0
結果は、 C)Isが100■/ m Q及び200■/ m Qで用いられた
ジアゼパムの最高濃度(5■/ IcQ )の100%取り込みを示している。
CI(Sの100■/mQと200 mg / m Qの両方がジアゼパムを充
分に取り込むのであるから、その100■/ m Qがジアゼパムの取り込みの
ための濃度としてより理想的である。
比較的低濃度のC)Is小球体(1μg / m 0未満のCH5)がリン酸緩
衝塩水(PBS)中で懸濁液から赤血球を強く膠着させたことが観察された。
CH5小胞は(a++及びアミノグリコシド抗生物質のような他のカチオンによ
って沈殿させられる故に、そのCH5小球体は血清中のアミノグリコシド抗生物
質の濃度を次のようにして決定するために用いることができる。すなわち。
(a)一定量のCH3小球体を沈殿させる抗生物質含有血清の稀釈度を決定し。
(b)抗生物質含有血清添加後に沈殿しないで残存する遊離小胞の濃度を凝集滴
定により決定する。
両方の立場において、抗生物質の正確な量を、既知濃度の抗生物質から誘導され
た標準曲線との比較を用いて確証することができた。基本実験について以下に記
載する。
従って、PBS中(1■/ m Q )の硫酸ゲンタマイシン24μQを血清で
順次稀釈した(すなわち、25μQ血清部分標品)。次に、0゜01M)−リス
−HCQ (pH7,3) 、 0.14M NaCQ緩衝液中pH7,4で2
5ffIg/mQの濃度でCH5)−リス塩を音波処理して調製したCH5Jl
t層小球体の24μQ部分標品を各試料に加えた。
室温で約10分経過後、各混合物の濁りが記録された。ゲンタマイシンを50μ
g以上含んでいる混合物だけが、目に見える沈殿を示し、CH8小球体がゲンタ
マイシンと相互に作用したことを表わしている。
次に、沈殿物がペレット化され、上澄液はひよこの赤血球の凝集によるCH3−
5UVsの濃度決定のために用いられた。凝集分析はU−型微細くぼみを有する
プレート96枚中で、順次小球体懸濁液を50μQ PB’Sまで稀釈し1次に
各くぼみで、 PBS中に0.5%RBC40μQを添加することにより行なわ
れた。4℃で60分経過後、凝集を逆鏡で観察した。対照(CH8小球体が不存
在のRBC)は凝集を示さなかった。CI(Sを含有する全ての試料は、前の実
験で濁ったものを例外として、RBCを強く凝集した。この結果は、 CH5小
球体はゲンタマイシンと相互に作用するので、比較的少ない小球体でもC)IS
だけを含んでいる対照@濁液と比較すれば、凝集のために利用できたことを示し
た。
次の各セクションには本発明のコレステロールヘミスクシネートを用いる生物活
性薬剤のインビボの投与のための方法及び組成物について記載する。取り込まれ
た生物活性薬剤の臨床効果が決定され、選択された器官内での薬の分布が適当な
場所で追跡雄の白色ニューシーラントイエウサギ(2〜2.5kg)は、完全な
フロインズ(Freunds)補助薬中で乳化された20IIg/lIQ牛血清
アルブミン(BSA) (Miles Laboratories、 Elkh
art、 IN) 1n+Qを2週間間隔で2回皮下投与して免疫化された。3
週間目にそのイエウサギは右膝関節に関節炎を引き起こすために1.OmQの塩
水中のBSA toffIgの関節内注射を1回うけた。左膝関節は対照として
の役割を果した。関節の直径は感度0.01mmのホウラー(Fov Q er
)ダイアル測径器を用いて測定された。 BSA注射された関節は膨れあがり、
代表的には対照関節より3〜4m大きく測定される。4週間目にそのイエウサギ
は、関節炎を引き起こすために、塩水中のBSA関節内注射をもう1回受けた。
270、Ow:のC1(Sと10■のインドメサシンを用い、セクション8゜1
、に記載された通りにしてC)Is−MLVsを調製した結果、インドメサシン
の最終濃度は1.0mg/mi1となった。炎症の誘発から3日たって、 BS
A注射された動物は、CH3小球体に取り込まれたインドメサシン1■/mQ(
全服用量:1■/動物)の筋肉注射を1回受けた。関節炎は次の日から10日間
測定された。
結果は第5図にグラフで説明され、CI(S−MLVsに取り込まれたインドメ
サシンは筋肉内投与されたとき、関節の膨れを減少させるのに効果があったこと
を示している。
10.2.コレステロールヘミスクシネート5LIVs中に取り゛まれだジアゼ
パムのイン ビボの投与ハッカネズミはセクション8.2.に記載された通りに
調製されたCH3−5UVsに取り込まれたジアゼパムを、体重1kg当り50
Mg静脈内又は筋肉内に接種された。ジアゼパムはハッカネズミに対して鎮静作
用を有しく接種後ハッカネズミは眠りに落ちた)、取り込まれた薬剤の活性の保
持を示した。
10、2.1.艶透内 種後の器官 布被取り込みジアゼパムを含むCH3−5
UVsをセクション8.2.に記載された通りにして調製した。浴型ソニケータ
ー中で音波処理した後、波長550nmで測定した吸光度は0.370であった
0次に、こ(7)CH5−5UV懸濁液(7)44.2μQ部分標品を、40μ
ci(7114C−ジアゼパム(比活性が、エタノール中100μCi/−Ωと
して供給された181μCi/mgに等しい)がガラス試験管の上で窒素下に乾
燥された。
そのガラス試験管に加えた。5分間の旋回混合後、 0.OIM トリス−HC
Q (pH7,3) 、 0.14M NaCQ緩衝液1.282mAをこの溶
液に添加したところ、30倍稀釈@濁液が得られ、ハッカネズミのための治療服
用量0.16711Ig/μQジアゼパムを生じた。
意識のある、拘束した35gのスイス−ウェブスター(Swiss−Vebst
er)ハッカネズミの尾部静脈中にCH3−5UV−14C−ジアゼパムsi液
の0.1mQアリコートを注射した。対照ハッカネズミにはカプセルに取り込ま
れていない″4C−ジアゼパムを等しい服用量で接種した。注射後1.2又は5
時間で、ハッカネズミは頚部脱臼により殺し、内部器官(腎臓、肺、膵臓、肝臓
、腸、脳、心臓、膵臓、及び脂肪)及び血液が摘出された。これらの器官の重さ
が計られ、各々の小試料(20〜40μg)は、マインとコバーグ[Mahin
and Kohberg: 1966、アナリティ力ルバイオケミストリー(
Analytical Biochem、) 16,500〕の方法に従って消
化色抜きされた。次に、試料は、放射能測定前に化学発光を静めるために5日間
暗所適合させられた。
実験の結果を第6図に示す。C)Is−5UVに取り込まれたジアゼパムを接種
したハッカネズミにおいて、薬剤は膵臓に蓄積していない、このことは、インビ
ボで静脈内投与されたとき、 CH3−5UVsに取り込まれたジアゼパムはリ
ン脂質に取り込まれた薬剤と同じには行動しないことを示している。
10.3.コレステロールヘミスクシネート中に取り7 r=ニクロムイン ビ
ボ 与
インビボ投与されたときCH5小球体がそっくりそのまま留まるかどうかを調べ
るために、ハッカネズミに静脈注射した後のCH5小球体に取り込まれた水性マ
ーカーの器官分布と比較して遊離の水性マーカーの器官分布が調べられた。この
目的で、取り込まれないS1クロム(”Cr) 、 CH3−阿LVsに取り込
まれたS1クロム、及びリン脂質に取り込まれたS″クロム比較された0次の報
告書の通りである。すなわち。
(a)取り゛まれていない%1(−r$1(rは殺菌した0、9%塩水のS″C
rO,”’−(New England Nuclear、 Newton、
MA)として供給される。遊離51C「注射液は、0.9%塩水中の”Cr 1
00pQを0.OIM トIJ ス−HCQ 、pH7,3,0,14M Na
CQ、5%ブドウ糖で全jt1.5mQに稀釈することにより31製された。
16匹の40gの雄スイスウェブスター(Swiss Vebster)ハッカ
ネスミハソレぞれ、尾部静脈から0.1mA (約700,0OOcp11)の
静脈注射を受けた。
(b ) CH5−MLVs中(7)”Crは少量(7)slCr(殺菌0.9
%塩水中の51Cry、”’−) t5−含ムO,OIM )−IJ ス−HC
Q、 PH7,3,0,14MNaCQ、5%ブドウ糖中に乾燥CH5hリス塩
粉末を溶解することにより調製された。この混合物は旋回混合され1次の30分
間簡単に音波処理された。遠心分離によりペレット化し、3回前記の通り洗浄し
た後、最終小粒は最終濃度10■/yaQ CH5となるように再沈殿された。
そのサイズはニコンプ凝似弾性(Nicomp quasielastic)光
散乱分析で直径1ミクロンと測定された。12匹の40gの雄スイスウェブスタ
ー(Swiss Webster)ハッカネズミはそれぞれ尾部静脈から0.1
mQ(約120,000cpm)の静脈注射を受けた。
(c ) EPC−5PLVs中の51Crは、ここに参考として記載されてい
る、レンダ等(Lenk et al、)により1983年3月24日に出願さ
れた係属中の出願第476.496号題名″安定な複層ベシクル、その調製と使
用″に詳細に記載された一般方法により調製された。この目的で、5mQバッチ
は卵ホスファチジルコリン65■をクロロホルムに溶かし、乾燥して薄膜を形成
させることにより調製された。この薄膜をエーテル10m1J中に再懸濁し、こ
れに0.9%塩水(pl(8)中の’ ” Cry、 −0,3mQを加えた。
この混合物を次にN2ガス下にエーテルを同時に蒸発させながら音波処理して乳
化した。得られた安定な複層小球体(SPLVs)を0.OIM!−リス−HC
Q 、 pH7,3,0,14M NaC9、5%ブドウ糖の5m+2中に再懸
濁し、遠心分離によりペレット化した。このペレットを3回洗浄して未取り込み
S1クロムを除去し、最終ペレットを5mQのo、。
1Mトリス−HCQ 、 pi(7,3,0,14M NaCQ、5%ブドウ糖
に再懸濁した。 EPCの最終濃度は13■/mQであった612匹の40gの
雄スイスウェブスター(Sνiss警ebster)ハッカネスミハソレソレ尾
部静脈がら0.]n+Q(約1.00,000cpm) (7)静脈注射を受け
た。
1.2.5及び24時間たった時、リボゾーム製剤で処置された各群から3匹、
及びカプセル化されていないS1クロムで処置された群から4匹のハッカネズミ
が頚部脱臼により殺された。器官が通りにして、試験された各器官内に残留して
いる%薬量及び%薬量/gを決定するためにカウントされた。
第7図に示されている結果は、カプセル化されていないクロム(第7図C参照)
は速やかに排出され、試験されたどの器官にも集中していないことを示している
。 EPC及びCH5でカプセル化されたクロムは注射後24時間でも測定可能
な程度で残留しており、CH8小球体はEPC−5PLVsと同様に、イン ビ
ボでそっくりそのまま留まっていることを示している。さらに、0.5ミクロン
から1.0ミクロンの小さい直径を有するEPC−5PLVs (13+ng/
tIQ )は肝臓、肺。
及び牌臓に蓄積している(第7図C参照)。すなわち、これはりボゾーム分布の
代表的パターンである。等モルのCH5小球体は主として肝臓に蓄積し、はるか
に低い程度で肺及び牌臓に蓄積する(第7図C参照)。これは、インビボにおけ
る2種のりボゾーム調製物の分布パターンにおける相異を示している。
10.4.コレステロールヘミスクシネートMLVs中に取り′まれだヒト生長
ホルモンのインビボ投与125ニーヒト生長ホルモン()IGH,New En
gland Nuclear、 Boston。
MA)を取り込んだCHSマルチラメラ小球体を次の如くして調製した。すなわ
ち、CHSトリス塩を1 μci/mA12J−HG)I(New Engla
ndNuclear、 Boston、 MA)を含む0.OIM )−リス−
1(CQ 、O,14M NaCQ−緩衝液(PH7,4)に添加し、最終CH
5)−リス塩濃度25■/ m Qとした。この懸濁液をガラスピーズと共に旋
回混合した。得られたCH5−MLVsは、初めの放射能のカウントと比較して
決定したところ、10%の”’I−HGHを取り込んでいた。
12匹の雌スイスーウェブスター(Swiss Webster) ハッカネズ
ミの一群は、後ろ脚にCH5−MLVに取り込まれた2’ I−HG)I懸濁液
0.5mQを筋肉内注射された。12匹のハツカネズミの対照群は、0.01M
トリス−HCQ、0.14M NaCQ緩衝液中の遊離”J−HGH0,5+a
Qを注射された。両群の各動物はおよそ35.OOOcpm/動物の接種を受け
た。注射後定期的にハツカネズミは殺され、後ろ脚は切り裂かれ、残留している
全放射能のパーセントが調べられた。第5表のデータはCH5−MLVs中に取
り込まれたとき、 ”’I−HGHの保持は実質的に増大していることを証明し
ている。このように、筋肉内注射されたとき、CHSリボゾームに取り込まれた
薬剤は持続的に放出(N=動物12匹) 3 24 72 168対照a
”5I−HIGIH50,70,20,3CH5小球体す中の
”sニーHGIH56372922
ホルモン0.5+aQの接種を受けた。
b 動物は0.01Mトリス−HCQ 、 0.14M NaCQ中のCH3−
小球体(25mg/ 、m Q CH3,中の12″■−ヒト生長ホルモン0.
5+Qの接種を受けた。
取り込まれた溶質
取り込まれたSL (、r7μモルCHS(任意の単位)
δ 閃 (JJA 01 ■
o o−o o 。
第2図
第3図
炭素数
凡例
←−→ EPC
第4図
1/[M]KCL
ヨ
関節の大きさくmm)
第6図
凡例
ロ=CHS−5UVS中の”C−シフfバムロ=遊離の”c−ジアゼパム
第7図A
第7図B
第7図C
国際調査報告
lMnlRIlleMjlAe6LelbenN@PCτノUS8510198
31II+mna+l@AIl^m−會−−”=PCT/US85101983
Claims (101)
- 1.ステロールの有機酸誘導体の塩を含む二重層を有するリポゾームに取り込ま れた化合物をホストに投与することを含む、インビボにおける化合物の投与方法 。
- 2.前記二重層はステロールの有機酸誘導体のトリス(ヒドロキシメチル)アミ ノメタン塩を含む請求の範囲第1項記載の方法。
- 3.前記二重層はステロールのカルボン酸誘導体の塩、ステロールのジカルボン 酸誘導体の塩、ステロールのポリカルボン酸誘導体の塩、ステロールのヒドロキ シルカルボン酸誘導体の塩、ステロールのアミノ酸誘導体の塩又はステロールの ポリアミノ酸誘導体の塩を含む請求の範囲第1項記載の方法。
- 4.前記ジカルボン酸は炭素数7以下の脂肪族ジカルボン酸を含む請求の範囲第 3項記載の方法。
- 5.前記脂肪族ジカルボン酸はスクシネートである請求の範囲第4項記載の方法 。
- 6.前記二重層はコレステロール、ビタミンD、植物ステロール又はステロイド ホルモンの有機酸誘導体の塩を含む請求の範囲第1項記載の方法。
- 7.前記化合物は生物活性薬剤を含む請求の範囲第1項記載の方法。
- 8.前記二重層はコレステロールのヘミスクシネート誘導体のトリス(ヒドロキ シメチル)アミノメタン塩を含む請求の範囲第1項記載の方法。
- 9.前記リポゾームはマルチラメラ小球体を含む請求の範囲第8項記載の方法。
- 10.前記リポゾームはユニラメラ小球体を含む請求の範囲第8項記載の方法。
- 11.前記化合物は生物活性薬剤を含む請求の範囲第8項記載の方法。
- 12.前記生物活性薬剤は抗細菌性化合物である請求の範囲第11項記載の方法 。
- 13.前記抗細菌性化合物はタイロシン(tylosin)である請求の範囲第 12項記載の方法。
- 14.前記生物活性薬剤は抗菌性化合物である請求の範囲第11項記載の方法。
- 15.前記抗菌性化合物は膣内投与される請求の範囲第14項記載の方法。
- 16.前記抗菌性化合物は経口又は局所投与される請求の範囲第14項記載の方 法。
- 17.前記抗菌性化合物はエコナゾール、イソコナゾール、チオコナゾール、ピ ホナゾール、クロトリマゾール、ケトコナゾール、ブタコナゾール、イトラコナ ゾール、オキシコナゾール、フェンチコナゾール、ニスタチン、ナフチフイン、 アムホテリシンB、ジノコナゾール、又はシクロピロックスオラミンである請求 の範囲第14項記載の方法。
- 18.前記抗菌性化合物はミコナゾールである請求の範囲第14項記載の方法。
- 19.ミコナゾールは膣内投与される請求の範囲第18項記載の方法。
- 20.前記抗菌性化合物はテルコナゾールである請求の範囲第14項記載の方法 。
- 21.前記テルコナゾールは膣内投与される請求の範囲第20項記載の方法。
- 22.前記生物活性薬剤は生長ホルモンを含む請求の範囲第11項記載の方法。
- 23.前記成長ホルモンは牛生長ホルモンを含む請求の範囲第22項記載の方法 。
- 24.前記生長ホルモンはヒト生長ホルモンを含む請求の範囲第22項記載の方 法。
- 25.前記生物活性薬剤はインシュリンを含む請求の範囲第11項記載の方法。
- 26.前記生物活性薬剤はイムノグロブリンを含む請求の範囲第11項記載の方 法。
- 27.前記化合物は染料を含む請求の範囲第1項記載の方法。
- 28.前記染料はアルセナゾIIIである請求の範囲第27項記載の方法。
- 29.前記生物活性薬剤は抗炎症性化合物を含む請求の範囲第11項記載の方法 。
- 30.前記生物活性薬剤はインドメサシンを含む請求の範囲第29項記載の方法 。
- 31.前記生物活性薬剤は精神に作用する又は不安のための試薬を含む請求の範 囲第11項記載の方法。
- 32.前記生物活性薬剤はジアゼパムを含む請求の範囲第31項記載の方法。
- 33.前記生物活性薬剤はビタミンを含む請求の範囲第11項記載の方法。
- 34.前記ビタミンはα−トコフェノールを含む請求の範囲第33項記載の方法 。
- 35.完全閉鎖小球体を形成するのに充分な量で閉鎖二重層を形成することので きるステロールの有機酸誘導体の塩を水相に添加し、その混合物を振とうして、 マルチラメラ小球体の乳白色懸濁液を生成させることを含むステロールリポゾー ムの調製方法。
- 36.上記乳白色懸濁液をユニラメラ小球体の懸濁液が形成されるまで音波処理 することを更に含む請求の範囲第35項記載の方法。
- 37.前記二重層はステロールの有機酸誘導体のトリス(ヒドロキシメチル)ア ミノメタン塩を含む請求の範囲第35項記載の方法。
- 38.前記二重層はステロールの有機酸誘導体の2−アミノ−2−メチル−1, 3−プロパンジオール、2−アミノエタノール、ビスートリスプロパン又はトリ エタノールアミンの塩を含む請求の範囲第35項記載の方法。
- 39.前記二重層はステロールの有機酸誘導体の抗菌性化合物の塩を含む請求の 範囲第35項記載の方法。
- 40.前記有機酸誘導体はスクシネートである請求の範囲第39項記載の方法。
- 41.前記ステロールはコレステロールである請求の範囲第40項記載の方法。
- 42.前記二重層はステロールの有機酸誘導体のミコナゾール塩から成る請求の 範囲第35項記載の方法。
- 43.前記有機酸はスクシネートである請求の範囲第42項記載の方法。
- 44.前記ステロールはコレステロールである請求の範囲第43項記載の方法。
- 45.前記二重層はステロールの有機酸誘導体の抗菌性化合物の塩を含む請求の 範囲第35項記載の方法。
- 46.前記有機酸誘導体はスクシネートである請求の範囲第45項記載の方法。
- 47.前記ステロールはコレステロールである請求の範囲第46項記載の方法。
- 48.前記有機酸はスクシネートである請求の範囲第35項記載の方法。
- 49.前記二重層はコレステロールの有機酸誘導体の塩を含む請求の範囲第35 項記載の方法。
- 50.前記二重層はコレステロールのヘミスクシネート誘導体のトリス(ヒドロ キシメチル)アミノメタン塩を含む請求の範囲第35項記載の方法。
- 51.前記水相は本質的に二価のカチオンを含まない請求の範囲第50項記載の 方法。
- 52.前記コレステロールヘミスクシネートは水相1ml当り約4.5mg乃至 約200mgの範囲で存在する請求の範囲第51項記載の方法。
- 53.前記水相にトリス塩を添加することを更に含んでいる請求の範囲第50項 記載の方法。
- 54.前記水相に前記ステロール小球体に取り込まれるべき化合物を添加するこ とを更に含んでいる請求の範囲第35項記載の方法。
- 55.ステロール小球体に水不溶性化合物を取り込む方法であって、(a)水不 溶性化合物を有機溶媒に溶解し、(b)該有機溶媒を除去して、該水不溶性化合 物を含む薄膜を残し、 (c)マルチラメラ小球体又はユニラメラ小球体の懸濁液を添加する ことを含む方法。
- 56.ステロール小球体に水不溶性化合物を取り込む方法であって、(a)水不 溶性化合物と、水相中で小球体を形成し得るステロールの有機酸誘導体の塩とを 有機溶媒に共可溶化し、(b)該有機溶媒を蒸発して該化合物と該ステロールの 有機酸誘導体の塩から成る薄膜を残し、 (c)該薄膜に水相を加え振とうして、完全閉鎖マルチラメラ小球体の乳白色懸 濁液を生成させる ことを含む方法。
- 57.前記乳白色懸濁液を音波処理してユニラメラ小球体を生成させることを更 に含んでいる請求の範囲第56項記載の方法。
- 58.ステロールの有機酸誘導体の塩を含む完全閉鎖二重層を含むステロイドの リポゾーム。
- 59.前記二重層はステロールの有機酸誘導体のトリス(ヒドロキシメチル)ア ミノメタン塩を含む請求の範囲第58項記載のステロイドのリポゾーム。
- 60.前記二重層は1−アミノ−1−メチル−1,3−プロパンジオール、2− アミノエタノール、ビスートリスプロパン又はトリエタノールアミンを含む請求 の範囲第59項記載のステロイドのリポゾーム。
- 61.前記塩はイオン化し得る生物活性薬剤から誘導される請求の範囲第58項 記載のステロイドのリポゾーム。
- 62.前記イオン化し得る生物活性薬剤は抗菌性化合物である請求の範囲第61 項記載のステロイドのリポゾーム。
- 63.前記抗菌性化合物はテルコナゾールである請求の範囲第61項記載のステ ロイドのリポゾーム。
- 64.前記抗菌性化合物はミコナゾールである請求の範囲第61項記載のステロ イドのリポゾーム。
- 65.前記二重層はコレステロールの有機酸誘導体の塩を含む請求の範囲第58 項記載のステロイドのリポゾーム。
- 66.前記二重層はコレステロールのヘミスクシネート誘導体のトリス(ヒドロ キシメチル)アミノメタン塩を含む請求の範囲第58項記載のステロイドのリポ ゾーム。
- 67.前記カチオンはアミノグリコシド抗生物質を含む請求の範囲第66項記載 のステロイドのリポゾーム。
- 68.コレステロールのヘミスクシネート誘導体のトリス(ヒドロキシメチル) アミノメタン塩と抗菌性化合物を含む組成物。
- 69.前記抗菌性化合物はミコナゾールである請求の範囲第68項記載の組成物 。
- 70.前記抗菌性化合物はテルコナゾールである請求の範囲第68項記載の組成 物。
- 71.前記抗菌性化合物はエコナゾール、イソコナゾール、チオコナゾール、ビ ホナゾール、クロトリマゾール、ケトコナゾール、ブタコナゾール、イトラコナ ゾール、オキシコナゾール、フェンチコナゾール、ニスタチン、ナフチフィン、 アムホテリシンB、ジノコナゾール、又はシクロピロックスオラミンである請求 の範囲第68項記載の組成物。
- 72.抗菌効果を発揮する量の請求の範囲第68項記載の組成物を投与する工程 を含む被検者の菌感染を治療する方法。
- 73.前記投与は局所的に行なわれる請求の範囲第72項記載の方法。
- 74.前記投与は経口で行なわれる請求の範囲第72項記載の方法。
- 75.前記投与は膣内に行なわれる請求の範囲第72項記載の方法。
- 76.前記抗菌性化合物はミコナゾールである請求の範囲第74項記載の組成物 。
- 77.前記抗菌性化合物はテルコナゾールである請求の範囲第68項記載の組成 物。
- 78.前記抗菌性化合物はエコナゾール、イソコナゾール、チオコナゾール、ビ ホナゾール、クロトリマゾール、ケトコナゾール、ブタコナゾール、イトラコナ ゾール、オキシコナゾール、フェンチコナゾール、ニスタチン、ナフチフィン、 アムホテリシンB、ジノコナゾール、又はシクロピロックスオラミンである請求 の範囲第68項記載の組成物。
- 79.前記抗菌性化合物はミコナゾールである請求の範囲第72項記載の組成物 。
- 80.前記抗菌性化合物はテルコナゾールである請求の範囲第72項記載の組成 物。
- 81.前記抗菌性化合物はエコナゾール、イソコナゾール、チオコナゾール、ビ ホナゾール、クロトリマゾール、ケトコナゾール、ブタコナゾール、イトラコナ ゾール、オキシコナゾール、フェンチコナゾール、ニスタチン、ナフチフィン、 アムホテリシンB、ジノコナゾール、又はシクロピロックスオラミンである請求 の範囲第72項記載の方法。
- 82.請求の範囲第68項記載の組成物を含むクリーム。
- 83.前記抗菌性化合物はミコナゾールである請求の範囲第82項記載のクリー ム。
- 84.前記抗菌性化合物はテルコナゾールである請求の範囲第82項記載のクリ ーム。
- 85.抗菌効果を発揮する量の請求の範囲第82項記載のクリームを投与する工 程を含む被検者の菌感染を治療する方法。
- 86.前記投与は局所的に行なわれる請求の範囲第85項記載の方法。
- 87.前記投与は経口で行なわれる請求の範囲第85項記載の方法。
- 88.前記投与は膣内に行なわれる請求の範囲第85項記載の方法。
- 89.請求の範囲第68項記載の化合物を含む坐薬。
- 90.前記抗菌性化合物はミコナゾールである請求の範囲第89項記載の坐薬。
- 91.前記抗菌性化合物はテルコナゾールである請求の範囲第89項記載の坐薬 。
- 92.抗菌効果を発揮する量の請求の範囲第89項記載の坐薬を投与する工程を 含む被検者の菌感染を治療する方法。
- 93.前記投与は膣内に行なわれる請求の範囲第92項記載の方法。
- 94.コレスチリルヘミスクシネートのトリス−(ヒドロキシメチル)−アミノ メタン塩とペプチドを含む組成物。
- 95.前記ペプチドは疎水性である請求の範囲第94項記載の組成物。
- 96.前記ペプチドはヒト生長ホルモンである請求の範囲第94項記載の組成物 。
- 97.前記ペプチドは牛生長ホルモンである請求の範囲第94項記載の組成物。
- 98.前記ペプチドは豚生長ホルモンである請求の範囲第94項記載の組成物。
- 99.前記ペプチドはインシュリンである請求の範囲第94項記載の組成物。
- 100.ペプチドが生長ホルモンである請求の範囲第94項記載の組成物を効果 を発揮する量投与する工程を含む、哺乳動物の乳生産の増加、又は成長を増大あ るいは開始する方法。
- 101.前記生長ホルモンは牛生長ホルモンである請求の範囲第100項記載の 方法。
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