JPS62502464A - ステロイダル リポゾ−ム - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ステロイダル　リボゾーム １久 頁 １、発明の分野　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・　５２、発明の背景 　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・　５２．１　リボゾームズ　・・・ ・・・・・・・・・・・・　５２．２　水溶性ステロール類　・・・・・・・・ ・・・・　８３、発明の要約　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・１０４ 、図面の簡単な説明　・・・・・・・・・・・・・・・・１３、発明の詳細な説 明　・・・・・・・・・・・・・・・・１４６、実施例：　水溶性化合物を取り 込むコレステロールヘミスクシネート　リポゾームズ　・・・・・・・　２８６ ．１　コレステロールヘミスクシネートの種々の塩を用いて調製したりポゾーム ズ　・・・・・・・・・・　２９６．１．１コレステロールヘミスクシネート　 トリス塩Ｍ　Ｌ　Ｖ　ｓ　・・・・・・・・・・・・・・　２９６．１．２２− アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオールコレステロールヘミスクシネー ト−Ｍ　Ｌ　Ｖ　ｓ　−嘩・・・・・・・・・・・・　２９６．１．３２−アミ ノエタノールコレステロールヘミスクシネート−Ｍ　Ｌ　Ｖ　ｓ・・・・・・・ ・・　３０６．１．４ビス−トリス−プロパンコレステロールヘミスクシネート −Ｍ　Ｌ　Ｖ　ｓ・・・・・・・・　３０６．１．５　トリエタノールアミンコ レステロールヘミスクシネート−Ｍ　Ｔ、　Ｖ　ｓ　・・・・・・・・　３１６ ．１．６　ミナコゾールコレステロールヘミスクシネート−Ｍ　Ｌ　Ｖ　ｓ　・ ・・・・・・・　３１６．１．７音波処理により調製されたコレステロールヘミ スクシネート−５Ｕ　Ｖ　ｓ　・・・・・・・　３２６．１．８押出し技術によ り調製されたコレステロールヘミスクシネート−８Ｕ　Ｖ　ｓ・・・・・・・　 ３２６．１．９　ミナコゾールーＣＨ３−トリスクリーム　３２６．１．１０チ ルコナゾール−ＣＲ２−）−リスクリーム　３３６．１．１１　ミナコゾールー ＣＨ３−トリス坐薬　３４６．１．１２膣内カンジダ感染症に対するインビボ活 性３４６．２　コレステロールヘミスクシネートＭ　Ｌ　Ｖ　ｓ中へのイヌリン の取り込み　・・・・・・・・・・・３５６．２．１　コレステロールへミスク シネート−Ｍ　Ｌ　Ｖ　ｓ及・び卵ホスファチジルコリン−Ｍ　Ｌ　Ｖ　ｓ中へ のイヌリンの取り込み効率　・・・・・・・　３６６．３　コレステロールへミ スクシネート−３ＵＶｓ中へのイヌリンの取り込み　・・・・・・・・・・３９ ６．４　コレステロールへミスクシネートＭＬＶｓ中へのクロムの取り込み　・ ・・・・・・・・・・・４Ｑ６．４．１　コレステロールヘミスクシネート−Ｍ 　Ｌ　ｖｓ中へのクロムの取り込み効率　・・・・・・　４１６．４．２コレス テロールヘミスクシネート−Ｍ　Ｌ　Ｖ　ｓ　中への取り込み体積ニクロム取り 込み及びコレステロールヘミスクシネート濃度　・・・　４２６．５　コレステ ロールヘミスクシネート　リボゾームの限外構造　・・・・・・・・・・・・・ ・　４２６．６　コレステロールヘミスクシネート　リボゾームのＸ線回折分析 　・・・・・・・・・・・・・・・４３６．７　コレステロールヘミスクシネー ト　リボゾームの電子スピン共鳴分析　・・・・・・・・・・・・４６６．８　 コレステロールヘミスクシネート　リボゾームの等張膨潤　・・・・・・・・・ ・・・４７７、かなり可溶性の化合物を取り込むコレステロールヘミスクシネー ト　リボゾーム　・・・・・・・・・・・・４８７．１　コレステロールヘミス クシネート−８Ｕｖｓ中に取り込まれた中成長ホルモン　・・・・・・・４８７ ．２　コレステロールヘミスクシネート　Ｓ　Ｕ　Ｖ　ｓ中に取り込まれたイン シュリン　・・・・・・・４９７．３　コレステロールヘミスクシネート−３Ｕ 　Ｖ　ｓ中に取り込まれたタイロシン（Ｔｙｌｏｓｉｎ）　５０８、実施例：脂 溶性化合物を取り込むためのコレステロールヘミスクシネート　リボゾームの使 用　・・・・　５０８．１　コレステロールヘミスクシネート−Ｍ　Ｌ　Ｖ　ｓ 　中に取り込まれたインドメサシン　・・・・　５１８．１．２インドメサシン を含有するコレステロールヘミスクシネート小球体の限外構造　・・・・　５２ ８．２　コレステロールヘミスクシネート−５Ｕ　Ｖ　ｓ中に取り込まれたジア ゼパム゛　・・・・　５３９、実施例：血清中のアミノグリコシド濃度を決定す るためのコレステロールヘミスクシネート　リボゾームの使用　５５１０、コレ ステロールヘミスクシネート　リボゾームのインビボ投与　・・・・・・・・・ ・・・・・・・　５６１０．１　コレステロールヘミスクシネート−Ｍ　Ｌ　Ｖ 　ｓ中に取り込まれたインドメサシンを使用する関節炎の治療　・・・・・・・ ・・・・・・・・　５６１０、２　コレステロールヘミスクシネート−８Ｕ　Ｖ 　ｓ中に取り込まれたジアゼパムのインビボ投与　５７１０．２．１静脈内接種 後の器官分布　５７１０．３　コレステロールヘミスクシネート−Ｍ　Ｕ　Ｖ　 ｓ中に取り込まれたクロムのインビボ投与　・・・　５９１Ｏ９４コレステロー ルヘミスクシネート−Ｍ　Ｌ　Ｖ　ｓ中に取り込まれたヒト成長ホルモンのイン ビボ投与　６１１・月浬ＩＬ医訪 本発明は、二重層（バイレイヤー、　ｂｉｌａｙｅｒｓ）形成性ステロールの有 機酸誘導体の塩から成るリボゾーム中への化合物の取り込み（ｅｎｔｒａｐ）方 法及び組成物に関する。 コレステロール又は他の脂質などのステロール類は、有機酸塩などの親水性部を 取り付けて、マルチラメラ（ｍｕｌｔｉｌａｍａｌｌａｒ）又は小さいユニラメ ラ（ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ）の小球体（ｖｅｓｉｃｌｅ）の＠濁液を調製する 為に用いることができる０本発明のステロールリボゾームは、有機溶媒を用いて 又は用いずに調製することができる。 これらの小球体は、水溶性化合物１部分的に水溶性の化合物及び水不溶性化合物 を取り込むことができる。 ここに記載されるステロール小球体は、生物学的に活性な化合物又はインビボ（ ｉｎ　ｖｉν０）に投与されうる医薬化合物の取り込みに特に有用である。また 、本発明のステロールリポゾームはインビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）にも用いら れうる。例えば、ここに記載のコレステロールヘミスクシネート　リボゾーム類 は、二価カチオン依存分析システムにおいてイン　ビトロに使用できる。 ２・叉肌立笈員 ２．１．リボゾーム リボゾームはカプセルに包まれた水相を含有する完全に閉鎖した二重層薄膜であ る。リボゾームは種々のマルチラメラ小球体（水の層でそれぞれが分離された複 数の同心の薄膜二重層であることを特徴とする玉ねぎ様構造）又はユニラメラ小 球体（単一簿膜二重層を有する）であってもよい。 リボゾーム調製の二つのパラメーターは、小球体の大きさと脂質濃度の関数であ る。すなわち、（１）一定量の脂質で閉じ込められた体積として定義される取り 込み量は、全脂質１モル当り（１ｍｏ　Ｑ　−”　）の取り込まれた脂質をリッ トルで表わす、取り込み量は、小球体の脂質組成と媒体のイオン組成とにより順 次影響されるリボゾームの半径に依存する。（２）カプセル化効率は、二重層で 隔離された水の区画のフラクションとして定義され、百分率で表わされる。カプ セル化効率は、脂質濃度に直接的に比例し。 より多くの脂質が存在するとより多くの溶質がリボゾームの中に隔離される〔デ ィーマーとアスター、１９８３．リボゾームプレパレーション：メソッズアンド メカニズム、リボゾーム中、エム・オストロ、マルセルデッカー社編、ＮＹ、２ ７−５７ページ　（Ｄｅａｍｅｒａｎｄ　Ｕｓｔｅｒ、１９８３．　Ｌｉｐｏｓ ｏｍｅ　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　：　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ｍｅｃｈａｎ ｉｓｍｓ、ｉｎ　７．　ｃｄ、　Ｍ　０ｓｔｒｏ、　Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅ ｒ、　Ｉｎｃ、、　ＮＹｔ　ｐρ、２７−５１）参照〕。 リボゾーム調製の最初の方法〔バングハム（Ｂａｎｇｈａｍ）はが。 １９６５、ジャーナルオブモレキュラーバイオロジー（Ｊ、　Ｍｏｌ。 Ｂｉｏｌ、）　１３．２３８−２５２）は次の通りである。すなわち、有機溶媒 にリン脂質を懸濁させ、次いで蒸発乾固させると反応容器にリン脂質のワックス 状沈殿物が残った１次に適量の水相を加え、この混合物を膨潤させ、その結果得 られるマルチラメラ小球体（以下、％ｌＶｓと称する）から成るリボゾームを機 械的手段で分散させた。 結果として得られる薄膜二重層の構造は、脂質の疎水性（無極性）゛′尾部′″ は二重層の中心に向いており、一方、親水性（極性）“頭部″は水相に向いてい る。この技術はパパハドジャプロスとミラー（Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ 　ａｎｄ　Ｍｉｌｌｅｒ）、　１９６７、バイオヒミヵ・エト・バイレイヤー・ アクタ　（Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈ、ｙｓ、　Ａｃｔａ、）、１３５，６ ２４−６３８）により記載された小さい音波処理されたユニラメラ小球体（以下 、　５ＵＶｓと称す）の開発の基礎を提供した。しかし、ＭＬＶｓ及び５ｕＶｓ は両方ともモデルシステムとしての限界を有している。 取り込みｆｔ　（ｃａｐｔｕｒｅｄ　ｖｏｌｕｍｅ）又はカプセル化効率を増大 させる試みとしてリン脂質二重層からなるリボゾームの：Ａ′！Ａ法が数多く開 発されている。しかし、すべての方法で有機溶媒の使用が必要である。以下にこ れらの方法のいくつかを簡単に記載する。 カプセル化効率を増大させるための努力は、リボゾームプレカーサー又はミセル 、例えば極性頭部が水相に向くように方向づけられた脂質分子のユニラメラにと り囲まれた水相を含有する小球体を先ず形成することを包含した。リボゾームプ レカーサーは極性脂質を有機溶媒に溶かした溶液にカプセル化されるべき水溶液 を加え音波処理することにより形成される。リボゾームプレカーサーは次に過剰 の脂質の存在下に第二の水相中で乳化され。 蒸発させる。その結果得られるリボゾームは脂質の二重層でカプセル化された水 相から成り、水相に分散されている（米国特許４゜２２４　、１７９号、１９８ ０年９月２３日付、Ｍ、　５ｅｈｒｅｉｄｅｒ参照）。 カプセル化効率を最大にする他の試みとして、パパハドジョプロス（Ｐａｐａｈ ａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ、米国特許４，２３５，８７１号、　１９８０年１１月２ ′５日付）は逆相蒸発小球体（以下、ＲＥＶｓと称する）としても知られている オリゴラメラ（Ｏｌｉｇｏｌａｍｅｌｌａｒ）脂質小球体を作る為の゛″逆相蒸 発法”　（ｒｅｖｅｒｓｅ−ｐｈａｓｅ　ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ　ｐｒｏｃｅ ｓｓ）を記載している。この操作によれば、カプセル化すべき水性物質が有機溶 媒に極性脂質を溶かした混合物に加えられる。次に均質な油中水型乳液が形成さ れ、そしてゲルが形成されるまで有機溶媒を蒸発する６次に、そのゲルは、その ゲル状混合物を水性媒体中に分散させることにより５懸濁液に変えられる。製造 されたＲＥＶｓは大部分はユニラメラ小球体（多くのユニラメラ小球体、又はＬ ＵＶｓ）と幾分かのオリゴラメラ−小球体から成っている。オリゴラメラ−小球 体は単に水性物質の入った大きな内部間隙を有するいくっがの同心二重層を特徴 としている。 薬品調合方式の為にリボゾームを使用する可能性に関して多くの記載がある。例 えば、米国特許３，９９３，７５４号、１９７６年１１月２３日付、イエーーエ ア　ラーマンとエリザベスエイ　サーニー（ＹｅｕｈＥｒｈ　Ｒａｈｍａｎ　ａ ｎｄ　Ｅｌｉｚａｂｅｔｈ　Ａ、　Ｃｅｒｎｙ）及び米国特許４，１４５，４１ ０号、１９７９年３月２０日付、バリイーディーシイアス（Ｂａｒｒｙ　Ｄ。 ５ｅａｒｓ）を参照、リボゾーム薬品調合方式において、薬剤はりボゾーム形成 中に取り込まれ１次いで治療すべき患者に投与される。 薬剤は水溶性でも無極性溶媒に可溶性でもよい。典型的開示は米国特許４，２３ ５，８７１号、１９８０年１１月２５日、パパハドジアプロスとスゾカ（Ｐａｐ ａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ　ａｎｄ　５ｚｏｋａ）及び米国特許４，２２４，１ ７９号。 １９８０年９月２３日付、エムシュナイダー（Ｍ、　５ｃｈｎｅｉｄｅｒ）であ る。 インビボに使用するりボゾームの調製に際して、（１）リボゾームの調製中に有 機溶媒を使用する必要性を除去すること及び（２）−服用量当りに調合されうる 取り込み物質の嵩と濃度をより多くするためカプセル化効率と取り込み量を最大 にすることは種々のステロール類及びその水溶性誘導体は化粧用、医薬用及び診 断上の目的に使用されている。水溶性ステロールの中で１例えば、分枝脂肪酸コ レステロールエステル、ステロイドエステル及びＰＥＧ−フィトステロールは化 粧品製造に使用されている〔欧州特許出願２８，４５６号、米国特許４，３９３ ，０４４号及びシュレイダー　ドララグアンドコスメテイック　インダストリー （Ｓｈｒａｄｅｒ　Ｄｒｕｇａｎｄ　Ｃｏｓｍｅｔｉｃ　Ｉｎｄｕｓｔｒｙ）　 １９８３年９月３３頁及び１９８３年１０月４６頁〕。 サッカー及びクーン（Ｔｈａｋｋａｒ　ａｎｄ　Ｋｕｅｈｎ、　１９６９年、ジ ャーナルオブファーマシューテイカルサイエンス（Ｊ、　Ｐｈａｒａ＋、　Ｓｃ ｉ、）　５８（７）　＋　８５０−８５２）はステロイド系非イオン界面活性剤 、特にエトキシル化コレステロール（例えば、ＰＥＧ−コレステロール）の１〜 ５％濃度の水溶液を用いるステロイドホルモンの可溶化を開示している。しかし 、インビボにおける可溶化ステロイドホルモンの有効性及び実用性は示されてい なかった。多くの水溶性コレステロールは生物学１−の流体中のコレステロール 値の決定の水溶性スタンダードとして調製され用いられている（米国特許３゜８ ５９．０４７号、米国特許４，０４０，７８４号、米国特許４，０４２，３３０ 号、米国特許４，１８３，８４７号、米国特許４，１８９，４００号及び米国特 許４，２２４，２２９号）、シニッキー等（Ｓｈｉｎｉｔｚｋ！ＩＴ　ｅｔ　ａ ｌ、１９７９年、（プロシーデイングオブナショナルアカデミーオブサイエンス （Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｅｉ、、　ＵＳＡ）　、　７６　：　 ５３１３−５３１６）は低濃度のコレステロールとコレステリルヘミスクシネー トを含有する組織培養媒体中でガン細胞を培養した。細胞膜へのコレステロール 又はコレステリルヘミスクシネートの取り込みは、膜の流動性を減少し、膜脂質 のマイクロ粘度を増大した。 コレステロール及び他のステロール類もまた。脂質二重層の物性を変えるために リン脂質リボゾーム薄膜に取り入れられている。 例えば、エレンス等（Ｅｌｌｅｎｓ　ｅｔ　ａｌ、）は最近の要約（１９８４， バイオフィジックスオブジャーナル（Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｊ、）　４５．７０ａ ）においてホスファチジルエタノールアミンとコレステリルへミサクシネートか ら成る脂質小球体の安定性に対するＨｌの影響を論じている。事実、プロツカー ホフとランサミー（１９８２，バイオヒミカ・エト・バイオフィジカ・アクタ（ Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、）　６其、２２７−２３２）は 安定化のための親水性末端を導入したコレステロールだけで二重層が構成されう ろことを報告した。マルチラメラ及びユニラメラコレステロールリボゾームを上 記の従来法で有機溶媒に分散したコレステロール誘導体（即ち、コレステロール −ホスホコリン、コレステロール−ポリエチレングリコール、又はコレステロー ル−ＳＯ，）を蒸発乾固し、反応容器に沈殿した脂質フィルム些残すことにより 調製した。この脂質フィルムをミクロチップ付きの超音波ホモジナイザーを用い て２ＩＩＩＱの水の存在下に音波処理した。マルチラメラ小球体の形成には１０ 分間の音波処理を必要とし、小ユニラメラ小球体の形成には４時間の音波処理を 必要とした。その結果得られたマルチラメラリポゾームの懸濁液は乳白色で、単 層リボゾームの懸濁液は透明だった。 しかし、水溶性薬剤をより多い服用景で投与するため、また水不溶性薬剤の投与 を容易にするため、インビボの投与に適しているステロール小球体中に生物活性 薬剤を効率的に取り込む可能性は今まで追求されていない。 ３、澄明の要性 本発明は、二重層がステロールの有機酸誘導体の塩から成るリボゾーム中に種々 の化合物を取り込むための方法及び組成物を包含する。化合物の取り込みはここ ではりボゾームの水性区画中に水溶性化合物をカプセル化すること又はステロー ル二重層中に水不溶性化合物を取り込むことと定義される。ステロールの有機酸 誘導体のトリスヒドロキシメチルアミノメタン塩（トリス塩）の形は小球体二重 層成分として特に有用である。 ステロール小球体の調製法は、水性緩衝液に、閉鎖二重層を形成しうるステロー ルの有機酸誘導体の塩を、水性分を取り込む完全閉鎖二重層を形成するのに充分 な量加えることを包含する。マルチラメラ小球体の懸濁液はその混合物を振り動 かすことで形成される。小球体の形成は、水性緩衝液が溶液中の塩の反対のイオ ン（カウンターイオン）をも含んでいると容易になる。さらに、ステロールの有 機酸誘導体の解離した塩が中性のｐＨで負に荷電していると、水性緩衝液は必然 的に二価または多価カチオンを含まない。同様に、ステロールの有機酸誘導体の 解離した塩が中性のＰＨで正に荷電していると、水性緩衝液は必然的に多価アニ オンを含まない、懸濁液にエネルギーを加えると、例えば、音波処理したり又は 小球体をフレンチ加圧セル（フレンチプレス）を通して、又は適当な孔径を有す る多孔フィルターを通して押し出したりすると、マルチラメラ°ステロール小球 体はユニラメラ小球体に変る６水溶性化合物、部分的に水溶性の化合物又は水不 溶性化合物を本発明のステロール小球体中に取り込むためには、多くの方法が可 能である。ステロール二重層中に分配す入き化合物（例えば水不溶性化合物）又 は水溶性化合物は、小球体形成中に、小球体中に試薬を取り込むために小球体の 形成前に水相に加えられる。逆に、水不溶性又は脂質可溶性化合物は、小球体形 成後にステロール小胞の懸濁液に加えられる。この場合、これらの化合物はステ ロール二重層中に分配される。他の実施態様において、水溶性化合物及びステロ ールの有機酸誘導体の塩を有機溶媒に添加し、その両方を安定化する（共安定化 ）。有機溶媒を次に蒸発すると水不溶性化合物とステロール誘導体が均一分布し たフィルムが残る。 水不溶性化合物を取り込んでいるステロールリボゾームは、振り動かしながらこ のフィルムに水性緩衝液に加えると形成される。 本発明のステロールリボゾームは水不溶性又は水に殆ど溶けない生物活性薬剤を 取り込む為に用いられるとき特に有利である。 このことは水不溶性薬剤のインビボの投与を可能にする。また更に１服用量と嵩 の割合を変更できるので、高濃度の水不溶性化合物のインビボの投与を可能にす る０本発明のステロール小球体は水溶性生物活性薬剤の取り込みの為に用いられ る場合にも、同様に有利である。加えて１本発明のステロール小球体は、インビ トロの診断上の分析にも用いられうる。 本発明は次の点において多数の利点を有する：（１）ステロール小球体が容易に 迅速に形成される。 （２）ステロール小球体がリン脂質ＭＬＶｓと較べて高いカプセル化効率を有す る。 （３）ステロール小球体がその調製に有機溶媒を必要としない（本発明のステロ ール小球体は有機溶媒を用いて調製できるとしても）。 （４）ステロール小球体が生物活性薬剤又は医薬剤を取り込むことができ、イン ビボに投与されたとき、それらの剤は遊離され代謝される。取り込まれた剤のイ ンビボにおける運命は、投与の型に依存する。 本発明は更にコレステリルヘミスクシネートのトリスヒドロキシメチルアミノメ タン塩と抗菌性化合物、特に抗菌性製剤がミコナゾール、ターコナゾール、エコ ナゾール、イソコナゾール、トリコナゾール、ビホナゾール、クロトリマゾール 、ケトコナゾール、ブタコナゾール、イソコナゾール、オキシコナゾール。 フェンチコナゾール、ニスティン、ナフチファイン、アンホテリシンＢ、ジノコ ナゾール、又はシクロピロックスオラミンから成る組成物に関する。この組成物 は菌感染を治療するために用いることができ、経口投与、腔内投与などを含む局 所的投与をすることができる。 本発明はコレステリルヘミスクシネートのトリスヒドロキシメチルアミノメタン 塩とペプチド、特に疎水性ペプチド、ヒト生長ホルモン、牛生長ホルモン、豚生 長ホルモン、又はインシュリンとから成る組成物を含む０水組成物は、牛乳生産 の増大又は動物の生長増大又は開始の目的で投与することができる。 ４、月面の簡単餐遺−研 第１図は、取り込み溶質（クロム）とマルチラメラリポゾームの調製に用いられ たコレステロールヘミスクシネートの濃度の反比例の関係を示したグラフである 。 第２図は、４つの異なるＣＨ３−ＭＬＶ調製に対して得られたＸ線回折図である 。 第３図は、ＣＩ（Ｓ−マルチラメラ小球体とＥＰＣ−マルチラメラ小球体に対す る電子スピン共鳴データである。 第４図は、種々の緊張度の水性緩衝液中のコレステロールヘミスクシネート　リ ポゾームと卵ホスファチジルコリン　リポゾームの膨潤状態を示すグラフである 。 第５図は、コレステロールヘミスクシネート　リポゾーム中に取り込まれたイン ドメサシンが筋肉内に投与されたときの関節膨張を減少するききめのあることを 示すグラフである。 第６図は、ｃ１４ジアゼパムを取り込まずに（遊離のまま）あるいはＣＨ３−５ ＵＶｓ中に取り込んだ形で、ハッカネズミに静脈注射で投与したときの器官分布 を表わす。 第７図Ａ、Ｂ及びＣは５ＩＣｒをＣＨ３−札ｖＳ中に取り込んで（第７図Ａ）、 またはＥＰＣ−５ＰＬＶｓ中に取り込んで（第７図Ｂ）、あるいは取り込まない で（第７図Ｃ）、ハッカネズミに静脈注射で投与したときの器官分布を表わす。 ５・３ｙし欠詳１じ１文朋一 本発明はその二重層が閉鎖二重層を形成しうるステロールの有機酸誘導体の塩か ら成るリポゾーム中に水溶性の、部分的に水溶性の又は水に不溶性の化合物を取 り込む方法及び組成物に関する。 従って、本発明のステロールリポゾームは、（１）水性区画中に水溶性化合物を 取り込む；又は（２）ステロール二重層中に水不溶性化合物を分配して取り込む ；又は（３）１つのりポゾーム製剤中に水溶性化合物の取り込みと水不溶性化合 物の取り込みの両方を行うことで調製しうる。 本発明の実施に際して、水溶液中で完全閉鎖二重層（即ちリポゾーム）を形成し うるステロールの有機酸誘導体のいがなる塩も使用しうる。ステロールの有機酸 誘導体の塩の適切性は水溶性化合物が外部環境と接触しないように該化合物を隔 離する能力に依存する。 いかなるリポゾームの水性区画の中にも取り込みが生していることを最終的に決 定するために、次の基準が確立されている（セ３２９５参照）：　（ａ）ゲル濾 過で分析して隔離された化合物が存在しないという明確な分離でなければならな い；　（ｂ）最も外部の小球体二重層と取り込まれた化合物の間に疎水性相互作 用又は電荷−電荷相互作用があってはならない。このことはりボゾームがら遊離 化合物を分子篩で分離するのを失敗した結果であり、見かけの隔離効率又はカプ セル化効率を人工的に増大する。この可能性を除去するため、前もって形成され たりボゾームの懸濁液に添加された水溶性化合物があらかじめ形成されたりボゾ ームと共溶前しないことが示されなければならない。；　（Ｃ）洗剤又は他の薄 膜不安定化剤の使用によるゲル濾過したりポゾームの崩壊は〜隔離された分子の ゲル濾過パターンにおいて、リポゾームピークに符合する位置から、遊離の分子 と共溶前する位置への変化を引き起こさなければならない。 本発明の実施に際して、通常、有機酸を導入することのできるステロールはいか なるものも使用できる。例えば、このようなステロールとしてコレステロール、 ビタミンＤ、フィトステロール類（シトステロール、カムステロール、スチグマ ステロール等があるが、これに限定されない）、ステロイドホルモン類などが挙 げられるが、これに限定されない。 上記ステロールを誘導体とするために使用される有機酸として、カルボン酸、ジ カルボン酸、ポリカルボン酸、ヒドロキシ酸、アミノ酸及びポリアミノ酸が挙げ られるが、これに限定されない。 塩の形は有機酸の水安定性を増大するので、いずれの有機酸もステロールを誘導 体とするために用いられうる。しかし、有機酸部分それ自体が水溶性であれば１ つの利点が得られる。このような水溶性有機酸部分として、酢酸、プロピオン酸 、酪酸、吉草酸などの水溶性脂肪族カルボンＭ（ｕ、Ｃ４までのカルボン酸は水 と混合しうる；Ｃ１の遊Ｍ酸は部分的に可溶であり、それ以上長鎖の遊離カルボ ン酸は実質的に不溶である）；マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、 ピメリン酸、マレイン酸等の水溶性脂肪族ジカルボン酸（Ｌ、鎖がより短ければ 、評価できる程度に水溶性はより大きくなる；水溶性の境界線はＣ，−Ｃ，に生 ずる。）；ヘミメリチン酸、トリメシン酸、スクシンイミドなどの水不溶性芳香 族ジカルボン酸；グリコール酸、乳酸、マンデル酸、グリセリン酸、リンゴ酸、 酒石酸、クエン酸等の水溶性ヒドロキシ酸（組、カルボニル基のα−炭素に付い た分枝鎖を含むα−ヒドロキシ酸は加水分解を受けにくいので本発明の実施に有 利である）；及び全てのアミノ酸及びポリアミノ酸を挙げることができるが、こ れに限定されない。 上記有機酸は従来の方法でステロールの水酸基にエステル結合又はエーテル結合 で、結合できる（例えば、米国特許３，８５９，０４７号、米国特許４，０４０ ，７８４号、米国特許４，０４２，３３０号、米国特許４，１８３．８４７号及 び米国特許４，１８９，４００号参照）、ステロール誘導体の塩はステロールの 有機酸誘導体と塩のカウンターイオン（例えば。 塩の遊離塩基）を適当な揮発性溶媒に溶がし、溶媒を蒸発して除くことにより、 又はステロールの有機酸誘導体の塩から成る残渣を残す同様の方法により製造で きる。使用されるカウンターイオンとして、２−アミノ−２−メチル−１，３− プロパンジオール、２−アミノエタノール、ビストリスプロパントリエタノール アミン等を挙げることができるが、これに限定されない７これらは相当する塩を 形成する。事実、ミコナゾール遊離塩基のようなイオン化しうる生物活性試薬の 遊離塩基はカウンターイオンとして使用できる。このように、生物活性薬剤はカ ウンターイオンとして使用できる。 本発明のステロールリポゾームは、水相に二重層を形成しうるステロールの有機 酸誘導体の塩を該ステロール誘導体が小球体を形成するのに充分な量存在するよ うに添加することにより調製される（即ち、完全閉鎖二重層は取り込んだ水性区 画を含有している）、この生成物は次にマルチラメラステロール小球体の乳白色 懸濁液が形成されるまで振とうされる。好ましい実施態様において、水相は小球 体形成を容易にするために溶液中に塩を含有している。更に、ステロールの有機 酸誘導体の解離した塩が中性のｐＨにおいて負に荷電しているなら、水性緩衝液 は必然的に多価カチオンを含有せず、同様に該有機酸誘導体の解離した塩が中性 のｐ）Ｉで正に荷電しているなら、水性緩衝液は必然的に多価アニオンを含有し ていない。 マルチラメラ小球体形成のための報告された方法〔例えば、プロツカーホフとラ ムサミイ（Ｂｒｏｃｋｅｒｈｏｆｆ　ａｎｄ　Ｒａｍｓａｍｍｙ）のホスホリピ ドベシクル又はコレステロールリポゾーム（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ　ｖｅｓ ｉｃｌｅｓ　ｏｒ　ｔｈｅ　ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ　ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ）　 １９８２、バイオヒミ１．２２７−２３２）とは正反対に、本発明のステロール マルチラメラ小球体形成方法は、有機溶媒の使用を必要としない。更に、プロツ カーホフとラムサミーの方法と異なり、ステロールマルチラメラ小球体を形成す るのに、（超）音波処理する必要がない、事実、本発明のステロールマルチラメ ラ小球体乳白色懸濁液の音波処理、あるいは音波処理につづくフレンチプレス（ ＳＬＭ−Ａａ＋１ｎｃｏ、　Ｕｒｂａｎａ、ＩＬＬ）の使用はマルチラメラステ ロール小球体の乳白色懸濁液をユニラメラステロール小球体の透明懸濁液に変え る目的で行われる。同様に、マルチラメラステロール小球体を中圧で孔径１００ ｍｍ以下のフィルターを通して何回も押し出すとユニラメラステロール小球体を 得ることができる。この押し出し技術は、ここでも参考例で記載しているカリス 等（Ｃｕｌｌｉｓ　ｅｔ　ａｌ、）が、　１９８４年６月２０日に出願し、係属 中の出願第６２２，６９０号“ユニラメラ小球体製造のための押し出し技術″に 詳細に説明されている。 前もって説明したように、本発明の実施に際してステロールのどんな有機酸誘導 体も、トリス塩として用いることが有利である。 例えば、ステロールヘミスクシネート又はステロールヘミスクシネート類の混合 物などのステロールヘミジカルボン酸のトリス塩は、インビボに投与されるべき ステロイドのりポゾームのステロール小球体二重層を形成するのに特に有用であ る。例えば。 コレステロールヘミスクシネートを用いるとき、小球体を形成するために２．５ −７００μモルの該トリス塩をトリス−ＨＣＱ　（トリスヒドロキシメチルアミ ノメタンヒドロクロリド）を含有する水性緩衝液２．０ｍＡに添加するとよい。 この場合、水性緩衝液は必然的に二価又は多価のカチオンを含有していない。 本発明によれば、ステロールの有機酸誘導体の塩から成るリポゾーム中に水溶性 化合物、水不溶性化合物又はわずかに可溶な化合物を取り込むことは多くの方法 で達成できる：（１）上記の如くステロールの有機酸誘導体の適当な塩を用いて 調製したステロールリポゾーム（マルチラメラステロール小球体であってもユニ ラメラステロール小球体であってもよい）のＷｆｋ、？！ｉｉ液に水不溶性化合 物を添加する。この化合物は、ステロール二重層に分配するのでリポゾーム中に 取り込まれる。この実施態様は次のように便利に実施できる：水不溶性化合物を 過当な溶媒に溶かし、次に溶媒を蒸発させると化合物のフィルムあるいは残渣が 残る。この残渣にあらかじめ形成されたステロールリポゾームの水性懸濁液を添 加すると、この残渣はステロールリポゾームの二重層中に取り込まれる。 （２）水不溶性化合物とステロールの有機酸誘導体の塩とを有機溶媒に一諸に溶 かし１次いで有機溶媒を蒸発させると水不溶性化合物とステロール誘導体が均一 に分布したフィルムが残る。振とうしながらこのフィルムに水相を添加するにつ れて取り込んだ化合物を含有するマルチラメラステロール小球体の懸濁液が形成 される。このマルチラメラ小胞を上記の如くしてユニラメラ小球体に変えてもよ い。 （３）ステロール小球体の調製に用いる水相に、水溶性化合物又は水不溶性化合 物を添加することにより水溶性化合物又は水不溶性化合物をステロールリポゾー ム中に取り込むことができる。即ち、該化合物を、ステロールの有機酸誘導体の 塩の添加より前又は同時に水相に加える。この場合、水不溶性化合物は小球体形 成中に二重層に配分されて取り込まれ、水溶性化合物は小球体形成中にステロー ル小球体の水区画中に取り込まれる。いずれの場合も、前記の如くしてマルチラ メラ小球体をユニラメラ小球体に変えることができる。 （４）生物活性薬剤がイオン化しうるものであれば、生物活性薬剤の遊離塩基を ステロールの有機酸誘導体の塩の調製のためのカウンターイオンとして使用でき る。ステロールリポゾームはステロールの有機酸誘導体の生物活性薬剤塩を用い て、ここであらかじめ記載したいずれの方法によってもｇｍできる０例えば、抗 菌性化合物であるミコナゾールの遊離塩基を本発明のこの実施態様の塩誘導体を つくるのに用いることができる。 上記の４方法のいずれかを用いて、水溶性化合物と水不溶性化合物は両方とも、 １つのステロールリポゾーム製剤中に取り込むことができる。 本発明のステロール小球体を用いて水不溶性化合物を取り込むための上記の方法 によれば、いったん水不溶性化合物が二重層に分配されれば、小球体がそっくり そのまま残っている必要はない。事実、化合物が二重層に分配されると、小球体 は妨害又は崩壊されて水性取り込み化合物の漏れ又は放出を導くと思われる。 本発明の１つの実施態様によれば、ステロールリポゾームは次の如くコレステロ ールへミスクシネートのトリス塩を用いて調製される：　０．ＯＩＭのトリス− ＨＣＱと０．１４ＭのＮａＣＱを含有する水性緩衝液１ｍＱ当り４．５−ＺＯＯ ■のコレステロールへミスクシネートのトリス塩を添加し、得られる混合物を振 とうするとコレステロールヘミスクシネートマルチラメラ小球体の乳白色懸濁液 が生成する。この小球体を遠心分離で小球形にして水性緩衝液で繰り返し洗って もよい６コレステロ一ルヘミスクシネートマルチラメラ小球体（Ｃ）Ｉｓ−ＭＬ Ｖｓ）の懸濁液をコレステロールヘミスクシネート小ユニラメラ小球体に変える ために音波処理（例えば浴型ソニケーター中で）してもよい、また、Ｃ）Ｉｓ− ５ＵＶｓを形成するために、Ｃ８４−ＭＬＶｓはフレンチ加圧セ）Ｌｒ　（７Ｌ ／　ンチプレス）を４０，０ＯＯｐｓｉで通過させるか、又は、２個の１００ｒ ＋ｍのヌクレオポア（ＴＭ）フィルターを３００−４００ｐａで通過させてもよ い、コレステロールヘミスクシネート小球体（ＭＬＶｓと５ＵＶｓのいずれも） は二価カチオンの存在下で不安定である。例えば、二価カチオンにさらされると 、取り込んだ水性区画と水溶性化合物は放たれる。このように、小球体の１５１ Ｊ製時又は保存中に用いられる水性媒体は、二価カチオンを含んでいないことが 不可欠である。 本発明の方法により取り込まれた化合物は、種々の方法で用いられる０例えば、 化合物が生物活性薬剤であれば、ステロールリボゾームに取り込まれた化合物は 、インビボに投与できる。 このことは水溶液中に通常溶けないか殆ど溶けない生物活性薬剤のインビボにお ける伝達を容易にする。ステロールの有機酸誘導体の塩から成るリボゾーム中に 取り込むことは、このような不溶性化合物のより高い服用量：嵩比での投与を容 易にできる。事実１本発明のステロール小球体は、小球体がインビボに投与する ための１つ又はそれ以上の生物活性薬剤を取り込むのに用いられうるので、特に 有利にインビボで使用される。更に、本発明の小球体は、有機溶媒を用いないで 調製できるので、インビボに用いられるとき、従来の脂質小球体又はリボゾーム を越えた利点を与える。取り込まれた薬剤のインビボにおける運命は、投与の経 路又は仕方に依存する。例えば、ステロールリボゾームに取り込まれた薬剤が静 脈注射で投与された場合、その薬剤のインビボにおける排出は、取り込まれない 薬剤又はリン脂質（即ち、ＭＬＶｓ、　５ＵＶｓ、　ＲＥＶｓ、　ＬＵＶｓ）か ら成る従来のりボゾームに取り込まれた薬剤の経路とは異なる経路を通る。他方 、ステロールリボゾームに取り込まれた薬剤を筋肉内投与すると、イン　ビボに おいてその薬剤は継続して放出される。 本発明のステロールリボゾーム中にいがなる生物活性薬剤も実質的に取り込むこ とができる。このような薬剤として、抗細菌剤、抗ヴイールス剤、抗菌剤、抗寄 生虫剤、膜種瘍剤、抗代謝産物ポリペプチド、ペプチド、蛋白質、毒薬、酵素、 ホルモン、神経伝達物質、グリコプロティン、リボプロティン、免疫グロブリン 、免疫調整剤、血管膨張剤、染料、放射性ラベル物質、放射線不透過化合物（ｒ ａｄｉｏ−ｏｐａｑｕｅ　ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）　、蛍光化合物、レセプター結 合分子（ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｂｉｎｄｉＢ　ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）　、抗炎症剤 、抗緑内障剤、散瞳剤１局所麻酔剤、麻酔剤、ビタミン、核酸５ポリヌクレオチ ド、等を挙げることができるが、これに限定されない。 ２種以上の化合物の取り込みを同時に行うことは、このような化合物類が補足及 び協働効果を生ずる場合、特に望ましい９ステロールリポゾームに取り込まれた 薬剤は、接種又は注射（例えば、静脈内、腹膜内、筋肉内、皮下、耳内、関節内 、乳ぶさ内など）、局所的使用（例えば、目、皮膚などの部位に、耳の中に、又 は傷や火傷などへの使用）、及び上皮又は粘膜（例えば、鼻の、口の、膣の、直 腸の、胃腸粘膜など）の内層を通っての吸収などの、これに限定されないが、適 切なルートのいずれかでインビボに投与される。 他の使用例において、ステロールリボゾームに取り込まれた化合物は、広範囲の 材料、これに限定されないが１例えば他の脂質の小球体又はリボゾーム、ゲル、 油、乳液などに混ぜ込むことができる１例えば、取り込んだ化合物を含有するス テロールリボゾームの懸濁液は、どんなタイプのりボゾーム製剤（例えば。 リン脂質ＭＬＶｓ、　５ＵＶｓ、　ＬＵＶｓ、ＲＥＶｓ、その他）においても− 成分として水相に加えることができる。これによりその化合物はリン脂質リボゾ ームに取り込まれる。 製剤の特別な性質に基づき、当業者は他のいろいろな用途を考えつくことができ る０例えば、本発明のコレステロールヘミスクシネート　リボゾームは二価のカ チオンに敏感なので、インビトロの比色診断分析での使用に鋭敏な、二価のカチ オンに感じやすい指示染料を取り込むために５！製することができる。 飢針上互ｌ五に性組成物 コレステリルヘミスクシネートのトリス　ヒドロキシメチルアミノメタン塩（” ＣＨ３−トリス″）は高濃度（例えば約１００ｍｇ／ｍＱ以上）に高温のエタノ ールのような有機溶媒に溶がし、約２５℃まで冷却すると半固体のゲルを形成す る。得られたゲルは、元の溶媒のＣＨ３−トリス溶液を浴型ソニケーター中で簡 単に音波処理すると、外観がさらに均質になる。ゲル中の溶媒は、大気中又は減 圧下に蒸発して除去できる。（溶媒除去の前又は後の）このゲルは水和すると小 さい小球体として分散する。 生物活性薬剤１例えば抗菌性化合物を、ゲル形成に先だってゲル中に組み込むこ とができ、このゲルを次に膣内、腸内、局所又は経口投与することができる０本 発明の処理に含まれる抗菌化合物として、ミコナゾール、チルコナゾール、エコ ナゾール、インコナゾール、チオコナゾール、ビホ〜ナゾール、ブタコナゾール 、イトラコナゾール、オキシコナゾール、フェンチコナゾール、エスタチン、ナ フチフィン、ケトコナゾール、シクロピロックスロラミン、クロトリマゾール、 ジノコナゾール、アムホテリシンＢなどが挙げられる。これらの抗菌性化合物の 遊離塩基又は調剤学的に受け入れられる塩が本発明の範囲に入ることは理解され るべきである。調剤学的に受け入れられる塩は、毒性がなく容認できない副作用 を引き起さないものである９通常、処方に適合する抗菌剤ならどんなものでも用 いられる。また、最終試料に柔らがさ、なめらかさ、安定性、香気、味などの望 ましい物性を与えるため、ゲル化に先だって他の成分を、そのエタノール溶液に 添加することができる。有用な添加成分として、ワックス、植物性脂肪から誘導 されたラウリン酸の硬質パタートリグリセリド又はココアバターなどの植物性バ ター、卵ホスホコリンなどのリン脂質が挙げられる。乳酸のような弱い、または 中程度の酸性を有する有機カルボン酸はｐＨを下げるため及び／又は塩基性薬品 の溶解度を増すために加えることができる。有機カルボン酸の炭素数は好ましく は１２まで、更に好ましくは６までである。チルコナゾールなどの極性の塩基性 抗菌剤のＣＨ３−トリス中の溶解度は、乳酸のような有機カルボン酸が約５〜１ ５重量％配合物中に存在していると向上する。乳酸のような化合物は水を保持し て配合物を柔らかくする能力を有する点においても望ましい。添加成分または賦 形剤は安定で調剤学的に受け入れられるものでなければならない０例えば無毒性 で、生物活性薬剤の効能及び安全性を妨害しないものでなければならない。また 、膣内投与のような投与方法に適切でなければならない。 蓬ｊ町 ゲルはどんな適当な容器の中でも形成できる。坐薬のためには、ゲルは適当な大 きさと形を有する型の中で形成され、膣内生薬の形で投与されると、ゆっくりと 分散してイン　ビボでリボゾームとなる。ゲルはその使用に先だって水和してク リーム又は懸濁液とすることもでき、これを局所的に又は膣内に投与する。Ｘ線 回折は、水和ゲルがマルチラメラ構造のりボゾームから成っていることを示して いる。またこのゲルは当業者に知られている他の方法によってクリーム又は懸濁 液として形成することもできる。 坐薬を製造する場合、ＣＩ（Ｓ−１−リスゲルはゲル粒子が互に粘着力を欠くの で、通常成形することは困難である。それ故、ワックス。 植物性バター、リン脂質又は他の成形剤を含ませる。ウニコピーＭのような硬質 バターの場合は、硬質バターに対するＣＨ３−トリスの重量−重量比は約０．１ ５＝１と４：１の間である。レミングトンス７７−マシューテイカルサイエンス （Ｒｅｗｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｓ＋ａｃａｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅ ｓ）第１６版、マック出版社、イーストン、ＰＡ、１９８０、１５３０−１５３ ３頁には生薬処方が論じられており、ここでも参考として取り入れている。 卵ホスホコリンのようなリン脂質の場合は、リン脂質に対するＣＨ３−）−リス の重量−重量比は約１０＝１と１：１の間である。卵ホスホコリンのようなリン 脂質が用いられるとき、必要に応じて抗菌剤の溶解性を増すために乳酸などの１ 例えば炭素数１〜６の有機カルボン酸を加えることができる。ミコナゾール塩基 又はチルコナゾール塩基のような抗菌剤に対する乳酸の添加量は当モル以下が好 ましい。 ワックス、植物性バターなどは抗菌性ＣＨ３−トリス処方と適合し。 室温で固体であり２体温で溶けるものが選ばれる。リン脂質は抗菌性ＣＨ３−） −リス処方と適合し、膣粘液に分散するものが選ばれる。 この業界で知られている他の担体も、本発明の配合物の膣内投与のために用いる ことができる。 クリーム 本発明のＣＨ３−トリスクリーム配合物は、有機溶媒にＣＨ３−）−リスを好ま しくは溶媒１ｍＱ当り約５０〜１００ｍｇのＣＨ３−トリスを溶解することによ り調製される。メタノール、エタノール及びインプロパツールのようなアルコー ルを含む有用な溶媒は、その中に抗菌性化合物又は他の生物活性薬剤が溶けるも のである。このＣＨ３−トリスは沸騰溶媒に添加され１次いで熱源からはずされ る。次に。 穏やかに撹拌しながら生物活性薬剤を加える。得られた溶液を溶媒の蒸発を容易 にするため、溶液の表面積がかなりさらされるように大きな容器に注ぎ込む。 この溶液をゲル化が始まるまで約３０〜１８０秒間簡単に音波処理する。″ゲル ″及び゛′ゲル化″という言葉は、その感じがゼリー又はゼラチンと似ている粘 稠な組成物をさす。この粘稠な組成物のコロイド性状は知られていない、この容 器はしっかりとおおわれ、ゲル化は約２０〜３０℃、好ましくは２５℃で約４時 間で完了する。 おおいが取り除かれ、溶媒を蒸発させる。溶媒を真空除去することもできる。 得られた乾燥ゲルは固体であり、いくつかに切り分は微細粒状粉末が得られるま で、凍結二酸化炭素とブレングー中ですり砕くことができる。この粉末は、望ん だ量の均質なりリームが得られるまで水と混合される。クリームの堅さは加えら れた水の量による。一般に、ＣＨ３−１−リスの最終濃度が約２００■／　ｍ　 Ｑより低いなら。 得られる組成物は流体であり、注水として投与できる。また、クリームは、組成 物の粘度を増大するワックスなどを添加して製造することができる。約２００− ４００■／ＩＩＱの濃度ならば、得られる組成物はクリームとして投与できる。 濃度が約４５０ｗＪ／ＩＩＩＱより高いならば、得られる組成物は半固体乃至固 体ゲルであり、坐薬として投与できる。 没王 ミコナゾール、チルコナゾールなどの抗菌剤を含む本発明のＣＨ３−トリス配合 物は、カンジダ、例えばカンジダアルビカンスにより人を含む哺乳類に引き起こ されるような膣感染症の治療に有効である。鶏口癒のような人体の他の部位の感 染症も本発明の配合物を用いて治療できる。これらの処方は潅注、クリーム又は 坐薬として膣内投与するのに便利である。潅注、クリーム又は坐薬の調合におけ る抗菌剤の量はいくつかの要素１例えば薬品の効力。 薬品により引き起こされる刺激、薬品がどれくらい速く通常の膣分泌物により膣 腔から洗い出されるかなどに依存するが、約１０〜１５００■の範囲である。例 えば、ミコナゾールでは５０■から１．２ｇが、またチルコナゾールでは約２０ ■から４８０■が有用な服用量である。この量の薬品が通常約５ｍＱ以下の坐薬 に混ぜ込まれる。一般に、より濃縮した処方がより少ない量で投与されれば。 便宜上及び患者の安楽さの点から、より望ましい。 しばしば１本発明の処方のたった１回の投与で、その抗菌剤に弱い膣感染症が治 る。従来の処方では通常３〜６乃至１４服用量が必要である。 ＣＨ３−１−リスペプチド組成物 蛋白質及び他のペプチド、特に生長ホルモン、インシュリン。 低密度リボプロティンなどの疎水性のものは、可溶化するため、放出速度を制御 するため、又は作用部位の的をしぼるために本発明の配合物に含ませることがで きる。ペプチドは通常、静脈内、筋肉内、腹膜内投与など非経口的に投与される 。使用できる生長ホルモンとして、ヒト生長ホルモン、牛生長ホルモン、豚生長 ホルモンが挙げられる０例えば、牛生長ホルモンはＣＨ３−）−リスを用いて、 水性緩衝液中に可溶化することができる。水性緩衝液１１Ｑ当り約５〜１７Ｏｆ ｆＩｇ又はそれ以上、好ましくは、　１５０〜１７０ＬＩＩｇの牛生長ホルモン を水性緩衝液ＩＩＩＱ当り、好ましくは約５〜３００Ｗ１ｇ、更に好ましくは、 約２５〜５０■のＣＨ３−１−リスで可溶化できる。 ＣＨ３−トリスを用いて蛋白質及び他のペプチドを可溶化する１っの方法は、水 性緩衝液中でマルチラメラリボゾーム（ＭＬＶ）を調製することである。その結 果得られるＭＬＶはそのまま用いるか。 又はＳＵｖを得るために音波処理する。ペプチドは水性緩衝液とりボゾームの混 合物中に懸濁され、リポゾームの二重層の中に分配し可溶化される。また可溶化 したペプチドは、　５ＰＬＶ製造に水相として用いることができる。得られた可 溶化ペプチド組成物は１人などの乳ぶさに投与することができる。 生長ホルモンは、乳産出を増すため、又は生長を増大または開始するために用い ることができる。乳産出を増大するため乳牛に牛生長ホルモンを筋肉内投与する 場合１通常１日当り約１０■が必要である。本発明の３０日に制御された放出調 合形態を用いれば、約３００〜１２００ＩＩＩｇを１回の服用量として投与でき る。 ペプチドの制御された放出調合形態のためには、投与量は獣医または医者により 適切に定められる。調合形態の放出特性、体で利用されるペプチドの量、毒物学 上の考察などで正確な服用量が決まる。　１ 本発明の説明のため次の実施例を記載するが、これにより本発明の範囲は限定さ れない。 次の小区分は、アルセナゾｍ　（ａｒｓｅｎａｚｏｍ）　、イヌリン又はクロム を取り込むコレステロールヘミスクシネートを記載する。 カプセル化効率及び取り込み量などのパラメーターが評価され。 コレステロール小球体のカルシウムによる不安定性が証明される。 コレステロールヘミスクシネートの凍結腐蝕電子顕微鏡検査。 Ｘ線回折及び電子スピン共鳴も記載される。 ６．１．コレステロールヘミスクシネートｑ刊」３ケ夷ｍ諭ニー次の小区分は、 コレステロールヘミスクシネートの種々の塩を用いるＣＨＳリポゾームの調製を 記載する。 コレステロールヘミスクシネートのトリス塩（以下、ＣＩ５　）−リス塩と称す ）を包含するすべての実施例において、ＣＨ３Ｉ−リス塩はシグマバイオケミカ ルズ（Ｓｉｇｍａ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）　、セントルイス、　ＭＯから 購入し精製せずに用いたか、あるいは次の如くして合成した。すなわち、トリス 塩基の３．３Ｍ溶液３０１ＩＱを、コレステロール水素スクシネート（ＩＣＮ、 　Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ　０ｈｉｏ）の６７Ｍモルエーテル溶液１．５Ｑに添加し た。得られた溶液を回転蒸発して湿った残渣とし１２時間親液性化した。得られ たＣＩ５　）−リス塩を３回酢酸エチルから再結晶した。残留酢酸エチルを真空 （ｏ、ｘｍｏｇ）下に５６℃まで加熱して除去した。 ＣＩ５　ｔ−ＩＪ　ス塩（５４ｍｇ）を、　０．ＯＩＭ　ト’）　、Ｘ−１（Ｃ Ｑ　（ｐ）１７．３）と０．１４ＭＮａＣ（ｌにアルセナゾｍ　（Ｍ終濃度４． ’５ｍＭ）が溶けている溶液１ｖａＱに添加した。　（ＪＩＳ−ＭＬＶｓの乳白 色懸濁液が機械的振り勅がしにより形成された。このＣＩ５−ＭＬＶｓを１０， ０ＯＯＸ　ｇで１５分間遠心分離しテヘレットニシ、コノヘレットをＩＯ＋ＩＩ Ｑ　＋７）０．ＯＩＭ　ト’）　ス−ＨＣＱ　（ｐＨ７，３）と０．１４Ｍ　Ｎ ａＣＱを用いて３回洗浄した。得られたペレットは、赤色でアルセナゾ■の取り 込みを示していた。 ６．１．２．２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオールコレステロー ルヘミスクシネートのＭＬＶｓコレステロールヘミスクシネートの２−アミノ− ２−メチル−１，３−プロパンジオール塩（５０■）を、０．ＯＩＭ　２−アミ ノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール−ＨＣＱ（ＰＨ７，３）　、　０． ０７Ｍ　ＫＣＱ及び０．０７Ｍ　ＮａＣＱにアルセナゾ■（最終濃度４　、５１ ｆ１Ｍ　）が溶けている溶液１１ＩＱに添加した。　ＣＩ５−ＭＬＶｓの懸濁液 がガラスピーズと共に。 うずまき状に混合することにより形成された。このＣ）Ｉｓ−ＭＬＶｓを１０． ０ＯＯＸ　ｇで１５分間遠心分離してペレットにし２得られたペレットをセクシ ョン６．１．１．に記載したようにして３回洗浄した。 得られたペレットは赤色で、アルセナゾ■の取り込みを示していた。 コレステロールへミスクシネートの２−アミノエタノール塩（５０ｍｇ）　を０ ．ＯＩＭ　２−７ミノエタ／　−／ｌ／−１（Ｃｕ、０．０７Ｍ　ＫＣＱ及び０ ．０７Ｍ　ＮａＣＱにアルセナゾ■（最終濃度４．５ｍＭ）が溶けている溶液１ ＋ａｌｌ！に添加した。ＣＩ５−ＭＬＶｓの懸濁液がガラスピーズと共に、うず まき状に混合することにより形成されたにのＣＩ５−ＭＬＶｓをｔｏ、ｏｏｏｘ 　ｇで１５分間遠心分離してペレットにし、得られたペレットをセクション６． １．１に記載したようにして３回洗浄した。 得られたべ１ノツトは赤色で、アルセナゾ■の取り込みを示していた。 コレステロールヘミスクシネートのビス−１−リスプロパン塩（５０ｇ）　ｔｉ ：ｏ、ｏＩＭ　ヒス−）−Ｕ　Ｘプロパン−ＨＣＱ　（ｐＨ７，３）　、　０． ０７ＭにＣＱ及び０．０７Ｍ　ＮａＣＱにアルセナゾ■（最終濃度４　、５ｍＭ 　）が溶けている溶液１＋＊Ｉ２に添加した。　Ｃｔ（Ｓ−ＭＬＶｓの懸濁液が ガラスピーズと共に、うずまき状に混合することにより形成された。このＣＩ５ −ＭＬＶｓを１０，０ＯＯｘ　ｇで１５分間遠心分離してペレットにし、得られ たペレットをセクション６．１．１に記載したようにして３回洗浄した。得られ たペレットは赤色で、アルセナゾ■の取り込みを示コレステロールヘミスクシネ ートのトリエタノールアミン塩（５（ｈ＋　Ｑ　）　をＯ，ＯＩＭ　Ｉ−Ｕ：ｒ −’））　−／Ｌ／７ミンーＨＣＱ　（ｐＨ７，３）　、　０．０７ＭＫＣＱ及 び０．０７Ｍ　ＮａＣＱにアルセナゾ■（最終濃度４　、５ｍＭ　）を溶かした 溶液１ｍＡに添加した。　ＣＩ５−ＭＬＶｓの懸濁液がガラスピーズと共に、う ずまき状に混合することにより形成された。このＣＩ（Ｓ−ＭＬＶｓを１０，０ ＯＯｘ　ｇで１５分間遠心分離してペレットにし、得られたペレットをセクショ ン６．１．１．に記載したようにして３回洗浄した。得られたペレットは赤色で 、アルセナゾ■の取り込みをミコナゾールの遊離塩基を次の如くしてｙ４製した 。すなわち、ＮａＯＨ水溶液を、ミコナゾール硝酸塩がエーテルに懸濁した懸濁 液に滴加して滴定した。エーテル層を集めて、エーテルを蒸発させると、ミコナ ゾール遊離塩基から成る油が残った。次に、この油をコレステロール水素スクシ ネートを含有するエタノールに添加した。エタノールを蒸発させると、コレステ ロールヘミスクシネートのミコナゾール塩からなる薄膜が残った、次に、塩水し この薄膜に加えた。長いうずまき混合の後にベシクルが溶液中に観察された。 アルセナゾ■を除いた以外はセクション６．１．１．６．１゜２．６，１．３， ６．１．４及び６．１．５に記載した如くしてＣＨ３−ＭＬＶｓを調製した。小 球体の最終ペレットをそれぞれ、それを調製した緩衝液２ｍＭ中に再懸濁させ、 乳白色懸濁液が透明に変わり、　Ｃ１（Ｓ−ＭＬＶｓがＣＨ３−５ＵＶｓに転化 したことを示すまで浴型ソニケーター中で音波処理した。 Ｃ）Ｉｓを１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ及び１５０ｍＭ　ＮａＣＱ　（ｐＨ７，５）　 （７）中ニ１００ｗ／ｍＱの濃度で分散した。この材料を３０ｎｍのヌクレオポ アポリカーボネート　フィルターを通して３０回押し出すとＣＨ３−５ＵＶｓに なった。 ６．１．９．ミコナゾール−ＣＩ５−　トリスクリームシグマケミカル社（Ｓｉ ｇｍａ　ＣｈｅＩＩ＋１ｃａｌ　Ｃｏ、）　、セントルイス。 ミズリーから購入したコレステリルヘミスクシネートのトリスヒドロキシメチル アミノメタン（゛１トリスパ）塩（“ＣＨ３−）−リス”）　（２０，６４ｇ） 　ヲ沸騰工９　／　／Ｉｚ２０６ｍ　Ｑ　ニ溶カシた。ＣＨ３−トリスエタノー ル溶液が透明になったら熱がら遠ざけ、エタノール１０３ｍ　Ｑ中のミコナゾー ル５．１．６ｇを穏やかに撹拌しながら加えたにの透明な溶液を大きい平らな皿 （２４３Ｘ２４３Ｘ１８ｎｖｍ）に注ぎ、大きい浴型ソニケーター中でゲル化が 始まるまで簡単に音波処理した０次に、この皿にしっかりと蓋をして２５℃、４ 時間でゲル化を完結させる。蓋を取りはずし、エタノールを蒸発させる。次に。 乾燥ゲルをいくつかに切り分け、氷結二酸化炭素と共にブレンダ−に入れ微粒状 粉末になるまですり砕いた。得られた粉末を殺菌した蒸留水と混合して、最終量 ５Ｌ６ｍＱの均質クリームが得らハ、そのミコナゾール濃度は１００■／　ｍ　 Ｑであったラミコナゾール１０．３２　ｇを用いて、この手順を繰り返すことに より、ミコナゾール濃度２００■／ｍＱのクリームが得られた。 この他のミコナゾール−ＣＨ５Ｉ−リス配合物は上記の手順に従い。 次に示す割合の原料を用いて調製された。 −ミ、−；に１−シーツ艷！−ヱ（コー町−）−ｑＨ５−一トΣ−５ξ、？５− □（−麻５−）−−ネ」畦ＣＨ５−トリス（２，０ｇ　）を沸騰エタノール２０ ｖａ　Ｑ中に溶がした。ＣＨ３−トリスエタノール溶液が透明になったら、熱が らはずし、チルコナゾール１．Ｏｇ　（エタノール５０ｍ　Ｑ中）及び旦（＋） −乳酸８３■（エタノール２ｍＱ中）を穏やかに撹拌しながら添加した。この透 明な溶液を大きなビーカーに注ぎ″ゲル化″が始まるまで音波処理した。このビ ーカーにしっがりと蓋をして室温、４時間でゲル化を完結させる。蓋を取りはず し、エタノールを大気中２５℃で蒸発した。乾燥ゲルをいくつかに切り分け、凍 結二酸化炭素と共にブレングー中に入れ、微粒状粉末が得られるまですり砕いた 。 この粉末を６．３ｇのＣＨ３−１−リスの音波処理した小球体６．３ｇを含有す る水１０ｍＡと混合した。得られた懸濁液を殺菌した蒸留水と混合して、最終量 ２０．８ｍＱの均質クリームが得られ、このクリームは１ｍ１２当リテルコナゾ ール４８■に６有していた。 ６　・　１　・　１１・　−よ−＝−ヲニ３イニニニッに一ドＨ５−７−トリー 三ト２−−コニ−ｊシをＣＨ３−）−リス（４００■）を沸騰エタノール４ｍＱ に溶かした。エタノ・−ルｌ＠ｆｌ中のミコナゾール１００■と、植物性油脂か ら誘導した乳酸のトリグリセリド（ウニコピー□Ｍ　：　ＰＶＯＩｎｔｐｒｎａ ｔｉｏｎ。 ＢＯｏｎｔｏｎ、ニコージ７ジイ）の溶融硬質バター１，２ｇを撹拌しつつ加え た。得られた透明溶液を１．５＋＋＋Ｑの小型（ｒ、ｉｃｒｏｆｕｇＱ）ポリプ ロピレン管に割り入れ、簡単に（約６０秒）音波処理してＣＨ３−１−リスを“ ゲル化″させ、室温で４時間放置して完全に固化させたにのポリプロピレン類の ゛′鋳型″を取りはらい、半固体ゲルを真空デシケータ−中で一夜放置して残留 エタノールを除去した。 上記の手順に従って調製した他のＣＢ５−　）−リス生薬処方を以下にまとめた 。 ミコナゾールＣＨ３−１−リスウニコピーＭ乳　酸卵ホスホコリン」５工−−− Ａ！〔−一□（ｍｇ）　−−−−（壁と　−Ａ１３．４　６．８　８０．３ ３．４　１３．６　２０．５ ６．９　１３，８　８０．３ ６＋９　２７．６　４４．０ ＋０．３　２０．６　８０．３ ２０．０　４１．０　１２．０ ２０．６　４１．２ ２０．６　４１．２　２．２　１０，３２０．６　４１．２　７９．４ ６．１．１２．ｇ内カンジダ感染症に対するインビボにおＬす二炸 卵巣摘出ラット（Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ　Ｂｒｅｅｄｉｎｇ　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｉｅｓ）を弱くベーターニストラジオールバレレートで処置して、絶え ず発情している（及び膣内カンジダ感染に無抵抗な）状態を誘発した。そのラッ トの膣内にカンジダアルビカンスを５　Ｘ　１０’ＣＦＵ接種した。感染したラ ットを、接種後３日目から１日２回３日間２重量／体積％のミコナゾール硝酸塩 で膣内処置するが、接種後３日目に１回１２％ミコナゾール硝酸塩クリームを投 与するが、または接種後３日目に１度だけ本発明のＣＨ３−トリス生薬又はクリ ーム配合物の１つを投与した。何匹かのラットには処置をしなかった。 接種後６日目又は１００日目全てのラットの膣についてカンジダアルビカンへの 検査をした。膣のスワブ当り２５ＣＦＵ未満のラットは治癒したと考察された。 ６．２．コレステロールヘミスクシネート肛Ｖｓ中つり々−イヌリンの取り立 取り込まれる試薬として３Ｈ−イヌリンを取り込んでいるコレステロールヘミス クシネート多層小胞（ＣＨ３−ＭＬＶｓ）が次の如くして調製された　Ｊ−イヌ リン（］、０ｍＣ１／Ｍ　Ｑ　ｒ　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ。 Ｂｏｓｔｏｎ、　ＭＡ）　を０．ＯＩＭ　トリス−ＨＣＱ　（ｐＨ７，３）　、 　０．１４Ｍ　ＮａＣＱ　２ａ＋Ｑに溶解した０次に、ＣＢ５　ｌ−リス塩４０ ■をその溶液に添加し、得られた混合物を機械的に振り動かして分散させる。乳 白色の懸濁液が形成され、マルチラメラ小球体の形成を示した。その懸濁液を２ 時間放置し、その時、その懸濁液を０．ＯＩＭ　トリス−ＩＣＵ　（ｐＨ７゜３ ）及び０．１４Ｍ　ＮａＣＱ　テ稀釈シテ最終斌を］ＯｍＱにした。１０ｐＱ７ リコートの放射能は、このアリコートをシンチレーション液〔オムニフルオル４ ０ｇ　（Ｏｍｎｉｆｌｕｏｒ　；　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ、 　Ｂｏｓｔｏｎ。 ＨＡ）　、ｌ−ルエン６Ｑ、エチレングリコールモノエチルエーテル４Ｑ）１０ ＋ｍＱに加え、放射能を０．４００にセットされた窓を有するベックマンＬ　６ ８００液体シンチレーシミンカウンターを用いて測定することにより、２４，６ ２５ｃｐｍ／　１０μＱであると決定された６１分当りのカウント（ＣＰＩｌｌ ）で示される放射能は急冷修正のＨ＃法（Ｈｏｒｒｏｃｋ、　Ｄ、Ｌ、ザナンバ ーコンセプト（Ｔｈｅ　Ｎｕｍｂｅｒ　Ｃｏｎｃｅｐｔ）。 Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、　１９７７）を応用して１分当りの 崩壊（ｄｐｉ）に変換された。そのＣＨ３−肚Ｖｓは次に１０，０ＯＯＸ　ｇで １５分間遠心分離してペレット化した。得られたペレットをＯ，ＯＩＭ　トリス −ＨｃＱ（ｐ）１７．３）及び０．１４Ｍ　ＮａＣＱ　１０ｍＱニ再懸濁し、１ ０，０ＯＯＸ　ｇ　テ１５分間遠心分離して再ペレット化することにより３回洗 浄した。洗浄しテ小球体（７）へＬ／　ッｈ　ヲｏ、ｏＩＭ　ト’Ｊ　７．、− ＨＣＱ　（ｐＨ７，３）　、　０．１４Ｍ　ＮａＣＱ中に再懸濁して最終量１０ ＋ａＲとした０部分標品（アリコート）の放射能は３，４４２ｃｐｍ／μＱであ ると測定された。従って、全部で原料３Ｈ−イヌリンの約１４％がＣＨＳ−阿Ｌ Ｖｓに取り込まれた。 種々の濃度のコレステロールへミスクシネートからなるＭＬＶｓに取り込まれた イヌリンのカプセル化効率が２種々の濃度の卵ホスファチジルコリンからなるＭ ｌ、Ｖｓ中に取り込まれたイヌリンのカプセル化効率と比較された。（阻、どん なリボゾームのカプセル化効率でも二重層で陽離された水性区画分として定義さ れ、百分率で表わされる。上記セクション２．１を参照）卵ホスファチジルコリ ン又はＣＢ５　ｔ−リス塩がら成るマルチラメラ小球体はいずれも、カプセル化 効率を比較するために同一の規定書を用いて調製された。従って、５μＱの１０ −イヌリン（２１７，０ｍｃｉ／＋ｗ）を含むＯ，０１Ｍトリス−ＨＣＱ　（ｐ Ｈ７，３）　、　０．１４Ｍ　ＮａＣＱ緩衝液２．０＋ＩＱ中にＣＩ５　ｌ−リ ス塩を４０■、８０■、１６０■、３２０■又は４００■の濃度で加えうずまき 状に混合し、２時間放置して、取り込み化合物として３Ｈ−イヌリンを含むＣＩ ５−ＭＬＶｓを形成した。０．０１Ｍトリス−ＨＣＱ　（ｐＨ７，３）と０．１ ４Ｍ　ＮａＣＱ緩衝液緩衝液３二Ｑ懸濁液に追加し、室温で一夜放置した。次に ０．ＯＩＭ　トリス−ＨＣＱ　（ｐＨ７，３）と０．１４Ｍ　ＮａＣＱ緩衝液を 約３ｍＡ加え全量１０＋ｏＱとした。 、マルチラメラ小球体（ＥＰＣ−ＭＬＶｓ）を次の規定書に従って調製した。 すなわち、４０ｆｆＩｇ／ｍＱ、８０ｍｇ／　ｎ　Ｑ　、　１６０Ｈ／　ｖａ　 Ｑ　、　３２０ｎｙ／　ｍ　Ｑ又は４００■／　ｍ　ＱのＥＰＣを、このリン脂 質を溶解するのに充分な量のクロロホルムに懸濁させた。このクロロホルムを蒸 発乾固すると、試験管にワックス状の沈殿が残った６次に、５μＱの３Ｈ−イヌ リン（２１７，０ｍｃｉ／　ｇ）を含む、０．ＯＩＭ　トリス−ＨＣＵ　（ＰＩ （７，３）　、　０．１４ＭＮａＣＱ緩衝液２．ＯｍＱを添加し、混合物をパ膨 潤″させ、得られたＥＰＣ−ＭＬＶｓを広範囲のうずまき混合で分散させた。０ ．ＯＩＭ　トリス−ＨＣＱ　（ｐＨ７，３）　、　Ｏ，１４Ｍ　ＮａＣｆｉｌ緩 衝緩衝液３奢Ｑの懸濁液に追加し一夜室温で放置した６次に、　０．ＯＩＭ　ト リス−ＨＣＱ　（ｐＨ７，３）　。 ０．１４Ｍ　ＮａＣＱ緩衝液で、この混合物を全ｉ１０ｍＱにした。 Ｃ）Ｉｓ−ＭＬＶｓ及びＥＰＣ−ＭＬＶｓによる３Ｈ−イヌリンのカプセル化効 率は、次の如くして決定された。すなわち、成分の最初の混合物のそれぞれの２ ０μＱ部分標品（アリコート）中の放射能が、前記の如くしてシンチレーション カウンターで測定された。リボゾームの形成後、＠濁液をｔｏ、ｏｏｏｘ　ｇで １０〜２０分間遠心分離して、リボゾームヲヘレット化シ、各ぺＬ／フット０． ＯＩＭ　ト’Ｊ　ス−ＨＣＱ　（ｐ）１７．３）　、　０゜１４Ｍ　ＮａＣＱ緩 衝液緩衝液１申 、３）　、　０．１４Ｍ　ＮａＣＱ緩衝液に最終量１０ｍＱになるように再懸濁 した．この最終洗浄試料の２０μＱ部分標品の放射能が測定された。 最終試料中で測定された初期放射能の部分が，脂質小球体中に取り込まれた３Ｈ −イヌリンを表わした。 第１表に示した通り、カプセル化効率の増大はＣＨ５濃度の増大に比例するが、 更に重要なことは、２０〜２００　ｍｇ　／　ｍ　ＱのＣＩ５を用いて製造され たＣＩ５−Ｍｌ、νＳが同じ濃度のリン脂質を用いて製造したＥＰＣ−Ｍｌ、Ｖ ｓよりもイヌリンのカプセル化効率が高いことを示すことである。 第１表 リン脂質小球体とコレステロールヘミスクシネート小球体中のイヌリンのカプセ ル化効率の比較脂質濃度　取り゛んだイヌリン ａ）卵ホスファチジルマルチラメラ小球体ｂ）　コレステロールヘミスクシネー トマルチラメラ小球体Ｃ　Ｈ　Ｓ　−　Ｍ　ＬＶ　ｓのカプセル化効率が、水性 緩衝液中に存在する遊離の３Ｈ−イヌリンとＣＩ（Ｓが接触している時間量に影 響されるがどうかを調べるために＋　ＣＨ３−肚Ｖｓを次の如くして調製した。 すなわち、８０■又は３００■のＣｌｌ５　）−リス塩を１０μＱの３Ｈ−イヌ リン（比放射能２１７ｍＣ１／　ｍｇ）　ｔｒ．　含有Ｔ　ル２０ｍ　Ｑ　ノ０ ．ＯＩＭ　トＴＪ　Ｘ−ＨＣ　Ｑ　、　０．１４Ｍ　ＮａＣ　Ｑ緩衝液中で旋回 混合し、ＣＨ５濃度が４０Ｉ＋Ｉｇ／ｍＱ及び１５０ｍｇ／ｍＱのＣＩ５−ＭＬ Ｖｓをそれぞれ形成させた。 ２種の脂質濃度のそれぞれについて５試料作成し、ＣＩ５−ＭＬＶ懸濁液を２１ １Ｑの０．０１Ｍ　トリス−）ＩＣ　Ｑ　（ｐＨ７．３）　、０．１４Ｍ　Ｎａ Ｃ　Ｑ　ｖｉｉｌ中室温で放置した０次の時間間隔．すなわち０分、１５分、３ ０分。 ６０分及び１２０分おいて、試料を同じ緩衝液で１０ｓ　Ｑにした．各試料の最 初の１０μＱ部分標品は上記の通りシンチレーションカウンターで測定する為に 取り分けられた０次に、試料を１０，０ＯＯＸ　ｇで１０分間遠心分離し，各ペ レットを１Ｏｎ＋　Ｑの緩衝液中で４回洗浄した．最終ペレットを最終量１０１ ＩＱになるように緩衝液に懸濁させ、各最終試料の１０μＱ部分橿品の放射能を 各時間点での最初の試料の放射能と比較した．その結果はテストした各脂質濃度 で，上記５時間点についてのカプセル化効率に重大な相異を示さなかった。 このことは、調製物°に加えられた最初の１Ｈ−イヌリンの約１２％。 又は２０％の取り込みは４０ＩＩＩｇ／＋ｏＱ又は１５０ｍｇ／ｍＱのＣＩ５で 、それぞれ接触時間にかかわりなく生じたことを示している。このことは、従来 の卵ホスファチジルコリンを用いてｇ製した肚Ｖｓとは異なり、ＣＩ５−ＭＬＶ ｓの調製には“膨潤時間″を必要としないことを示している。 ６、３．コレステロールヘミスクシネートの５ＵＶｓ中へのイヌリンの取り込み 被取り込み薬剤として１Ｈ−イヌリンを含んでいるコレステロールヘミスクシネ ートからなる小ユニラメラ小球体を次の通りに調製した．すなわち、　１００ｕ 　Ｑの１．０ｍＣ１／ｍＱの′Ｈーイヌリン（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌ ｅａｒ，　Ｂｏｓｔｏｎ，　ＨＡ）をＣＨＳトリス塩を１００■又は２００■加 えた２．５ｍ１２の０．ＯＩＭ）−リス−〇Ｃ　Ｑ　（ｐ）１７．３）　、　０ ．　１４　Ｍ　ＮａＣ　Ｑに溶解した。ガラスピーズと共に旋回混合した後、混 合物をピペットで吸い取り，ビーズと分離し，透明になる迄音波処理、すなわち 約２時間音波処理した。懸濁液の透明化は．　ＣＨ３−ＭＬＶｓが小マルチラメ ラ小球体に移行したことを示している．　ＣＨ３−５ＵＶ懸濁液中の最終ＣＨ５ 濃度は、それぞれ４０■／ＩＩＩＱ及び８０■／ｍＱであった。 イヌリンの取り込み（上記セクション５参照）を証明するため。 このＣＨＳ−５ＵＶｓ　ｔｒ次の通りにしてゲル濾過によりＣＨ３−５ＵＶｓを 取り込みイヌリンから分離した．すなわち、　０．ＯＩＭ　トリス−ＨＣ　Ｑ　 （ｐＨ７．３）、０、１４Ｍ　ＮａＣＱ緩衝液で平衡にされ検量された、交換範 囲が４０，０００−１５，０００，０００ドルトン分子量であるバイオ−ゲルＡ 　（Ｂｉｏ−ＧｅＱ　＾）１５ｍ、１００−２００メツシユアガロースカラム（ Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔ。 ｒｉｇｓ，　Ｒｉｅｈｍｏｎｄ，　ＣＡ）に各リポゾーム懸濁液を別々に適用し た。 次に該カラムから溶出した３−ｖａｎフラクションを集め，各フラクションの１ ０μＱ部分標品の放射能を前記の通り測定した．このゲル濾過により隔離された イヌリンを含まない明確な分離が行なわれ、ＣＨ３−５ＵＶｓ中にイヌリンが取 り込まれていることを示した．この分析は約１％のイヌリンがＣＨ３−５ｕＶｓ 中に取り込まれた事髪示した。 被取り込み試薬として、Ｇ１Ｃｒを取り込んでいるコレステロールヘミスクシネ ートマルチラメラ小球体を次の通りに調製した。 すなわち、１５．０　μｍｏ　Ｑ　、　４０．０　μｍｏ　Ｑ、６５−８　ｐ　 ＩＩＩｏ　Ｑ　、　１００．Ｏ　ｕ　ｍｏ　Ｑ　−１７５、Ｏ　ｐ　ｍｏ　Ｑ、 ２６３．２μｍｏｌｌ　、　５２６．４μｍｏ（ｌ　又は６５８．Ｏ　ａ　ｍｏ 　Ｑ　（７）ＣＨＳトリス塩を微量の”Ｃｒ　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕ ｃｌｅａｒ，　Ｂｏｓｔｏｎ，　ＭＡ）を含有する５ｍＱの０．ＯＩＭ　トリス −ＨｃＱ　、　０．１４Ｍ　ＮａＣＱ　ｐＨ７．３に添加し、室温で２時間放置 したところ、取り込まれた５１Ｃｒを含有するＣＨ５−ＭＬＶｓの懸濁液が生成 した。 ６．４，１．−１少−スチロールヘミスクシネート−ＭＬＶｓ中へのＬ且んΔ九 を欠ル化効率 セクション６．４．で製造したＣＨ５−ＭＬＶｓのカプセル化効率を測定するた め、蒸留水中で３回洗浄した透析袋（Ｔｈｏｍａｓ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ。 カタログ１ｉａ３７８７−Ｄ２２．１２，０００ドルトンの分子量カットオフ） に各調製物の試料をピペットで取り分けた。透析袋中の試料を初めにガンマ−カ ウンター（Ｔｍ　Ａｎａ　Ｑ　ｙｓｔｉｃ、モデルＮａ１１９１）でカウントし た。次に、試料を、同じ０．ＯＩＭ　トリス−ＨＣＱ　、　０．１４Ｍ　ＮａＣ Ｑｐ８７．３緩衝液で滞留物：透析液の比を１　：　１５０より大きくして２０ 時間、それぞれ透析した。透析液は初めの６時間は、２時間毎に取り換えられた 。カプセル化効率は、初めのカウントの残存したパーセンテージを計算して決定 された。 第２図に示した通り、カプセル化効率はＣＨ３Ｉ度に比例している。 第２表 コレステロールヘミスクシネート小球体中のクロムのカプセル化効率 ＣＨ５ｐ度　取り込まれた １６５・０２０．１３ ２６３．２　２７．９０ ６．４．２．コレステロールヘミスクシネート中へのセクション６．４．１の記 載の通り！５ｉＩ製されたＣＨ５小球体の取り込み量は次の計算： を用い、取り込まれた溶質を計算することにより、各濃度のコレステロールヘミ スクシネートについて決められた。 第１図に説明されたデータは、ＣＨ５）−リス塩の濃度が増大するに従い、脂質 １ｍｏＱ当りの取り込みクロムは減少することを示している。このように、カプ セル化効率の増大は脂質濃度の増大に比例するが、取り込み溶質は脂質濃度が高 くなるにつれて減少する。点当りの試験数を各点に続くカッコ内に示しである。 イヌリンを省いた以外はセクション６．１．に記載した通りにしてコレステロー ルヘミスクシネート　トリス塩を用いてｇｊ４製されたＣ）ＩＳ−ＭＬＶｓ及び ＣＨ３−５ＵＶｓの試料を凍結腐蝕電子顕微鏡検査法〔凍結腐蝕法についてはプ フェニンガー等（Ｐｆｅｎｎｉｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、）１９７５、ジャーナル オブセルラーバイオロジー（Ｊ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏ、）的、１５−２８を参 照〕用に作成した。 このＣＨ５−ＭＬＶの凍結腐蝕した調製物の電子顕微鏡検査で少なくとも１つの 層、例えばリボゾーム又は脂質小球体により結合された離れ離れの単位があられ れた。ＣＨ５−ＭＬＶｓの大きさは非常に不均質で、直径が８００ｎｍから１０ ．ＯＯＯｎｍまでの範囲であった。より大きな小球体はいくつかのクラスに分類 することができた。すなわち、１又は小数の外層を有するもの又は多くの層を有 するものであった。大部分のより大きな小球体は粒状の外観を呈し内側に、ある いは水の部屋を示している、実質的な面積を有していた。多くの例で、小球体又 は小球体群が、より大きな小球体の内側に多かれ少なかれ、自由に、時々は４又 は５層に重なって見えた。この明らかなパネスチング（ｎｅｓｔｉｎｇ）　”は 、負に荷電したリン脂質でつくられた従来のりポゾームでも一般に観察された。 時々、密接に位置した層の帯状部分が見られた。これらは従来のリン脂質ＭＬＶ ｓの層すべてに関して同様に現われる。 音波処理した試料を検査すると、５０ｎｍ〜５００ｎｍの範囲の多くの小さな不 完全球体を含んでいた。これらの小球体は多分リン脂質ＭＬＶｓの音波処理でつ くられた５ＵＶｓにたとえられる。より小さなＣＩ（Ｓ−小球体は割れなかった ので、内部構造又はその成分の層を識別することは不可能だった。 平均サイズ約６５ｎＩ１１の小球体を３０ｎｍフィルターを（１０回）通して押 し出されたＣＨ３小球体をＭＦＪした。これはフレンチプレス法で調製された。 非常に小さい（平均直径２５ｎｍ以下）　Ｃ）Ｉｓ小球体と著しい相異を示す。 種々のＣＨＳ　−Ｍ　Ｌ　Ｖ調製物のＸ線回折は、この他に記載されている（Ｇ ｒｕｎｅｒ、　Ｓ、Ｍ、、　１９７７、　ＰｈＤ　ｔｈｅｓｉｓ、　Ｐｒ１ｎｃ ｅｔｏｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ。 Ｐｒ１ｎｃｅｔｏｎ　ＮＪ　０９５４０　ＵＳＡ　；　Ｒｅｙｎｏ　Ｑ　ｄｓ、 　Ｇｅｏ、　Ｔ、　、　Ｍｉ　Ｑ　ａｈ、　Ｊ、Ｒ，及びＧｒｕｎｅｒ、　Ｓ、 Ｍ、、　１９７８．レビューオブサイエンティフィックインストルメンツ（Ｒｅ ｖ、　Ｓｃｉ、　Ｉｎ５ｔｒ、）　４９．１２４１〜１２４９　：Ｔｉ１ｃｏｃ ｋ、　Ｃ，Ｐ、Ｔ、、　Ｂａ１ｌｙ、　Ｍ、Ｂ、、　Ｆａｒｒｅｎ、　Ｓ、Ｂ、 、　Ｃｕ１ｌｉｓ　Ｐ、Ｒ，及びＧｒｕｎｅｒ、　ｓ、Ｍ、、　１９８Ｌバイオ ケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍ、）　２３．２６９６〜２７０３）　、三次元像 強化Ｘ線検出器を用いて行われた。Ｘ線繰返し間隔は±０６５人で表わされる。 　ＣＨ３分散液をエポキシの栓で密封されたＸ線用１．５ｍガラスキャピラリー に保持した。検体は穏やかに又は激しく水和された。穏やがな水和には、Ｘ線キ ャピラリーの底の乾燥ＣＩ（Ｓの上に緩衝液を注射器から層に重ねた０次にキャ ピラリーを卓上遠心分離機中で瞬間的に遠心分離して、その脂質水ペーストから 気泡を除いた０次に、そのキャピラリーを密封して少くとも４時間、５℃で平衡 させた。激しい水和は乾燥ｃＨ３を緩衝液及び２個の混合用ガラスピーズと共に 旋回させることにより達成された。次に標品がＸ線キャピラリーに移された。 Ｘ線回折は水和Ｃ１（Ｓがマルチラメラ構造を形成していることを証明した。第 ２図ａ及び第２図すは、それぞれＣＨ３６８，９重量％及び５９．１重量％から なる穏水和検体から由来した低角度回折を示している。回折の等間隔の順位の４ つまでは、それぞれ可視の６８．１人と７９．８人のマルチラメラの整列と一致 した繰り返しである。これらの順位は鋭くまたよく分解されており、この格子の 無秩序性はほとんどなかったことを示している。これらの濃縮ＣＨ５検体は、目 に見える余分の緩衝液を含まない均一なペースト状外観のものであり、水含有量 が増えるに従って繰返し間隔が増えた事実と一致した。非常に高い水濃度では、 穏水和ＣＨ５検体は水和脂質の先端上で過剰の緩衝液がたまっていることを見せ た。このような試料（全重量中２０．２％Ｃ１（Ｓ）からの回折は第２図Ｃに示 されている。 より高い角度の回折ピークが巾広くなっていることが格子にかなりの無秩序性が あることを示している。この格子の無秩序性は決定的な格子指摘を困難にしたが １層合わせがなされた場合、第２図Ｃに示されたように、繰返しは約８６人であ り脂質二重層の間に多量の水外間があることを示唆した。 穏水和の代りに、２０．７％ＣＨ５検体が乾燥脂質を緩衝液と旋回混合して調製 された場合、結果として得られた検体は均一な乳白色の外観を呈していた。第２ 図ｄに示された通り、低角度回折は、鋭く境界が定められた格子の証拠がほとん どない散乱の巾広いバンドを現わした。同様の回折特徴は、層間水分の広さが広 く変化しているマルチラメラ系にも予想される。稀１ｃｌ（Ｓ分散液のＸ線回折 は、層間力が弱いマルチラメラ系から生じているとしてほぼ一致して解明される 。稀薄卵ホスファチジルコリン分散液のような他の脂質系では、Ｘ線回折図は鋭 く境界を定めた層格子を示しており、これは重量で大部が脂質であるものである （Ｒａｎｄ、　１９８１゜アニュアルレビューオブバイオフィジクスアンドバイ オエンジニアリング（Ａｎｎｕ、Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｐｈｓ、　Ｂｉｏｅｎｇ、） 　１０．２７７−３１４）　。 このよく境界を定めた格子繰返しは、脂質層分離機能として格子ポテンシャルに おける比較的鋭い最小値の結果である。ポテンシャル対距離の曲線が浅い凹みの みを有するなら、弱い層間力とかなりの格子無秩序性が予想される。このことは 、ＣＨ５小球体の場合にもそうであると言える。 第２図ｄの検体は、第２図ａの６８．１人繰返しと比べて、約８６人繰返しを有 する。このことは過剰緩衝液の存在下でＣＨＳリポゾームが、脂質に対する水の 比が大であることを示している。同様の結果が他の荷電脂質系でも観察されてい る（上記のＲａｎｄ　ｖ卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）でつくられたマルチ ラメラリボゾーム（Ａｖａｎｔｉ　ＰｏＱａｒ　Ｌｉｐｉｄｓ、　Ｂｉｒｍｉｎ ｇｈａｍ、　ＡＬ）をスピンラベルし、本質的に前記の通りに調製し、同様にラ ベルしたトリス塩ＣＨ５−ＭＬＶｓと比較した。ＥＰＣＭＬＶｓの場合、１モル ％の５，７．９．１０．１２又は１６ドキシルステアレート〔モレキュラープロ ーブズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ）　、　Ｊｕｎｃｔｉｏｎ　Ｃ１ｔ ｙ、　ＯＲ）のいずれかを、クロロホルム中の４０■の脂質に添加し、得られた 溶液を回転蒸発により薄膜になるまで乾燥させた。次に２ｍ１２のトリス−ＨＣ Ｉ２緩衝液を用いて旋回によりこのフィルムを水和すると、薄膜は完全に懸濁し た。得られたＥＰＣ−ＭＬＶｓを、分光分析に先だって２回洗浄した。 ＣＨ５−ＭＬＶｓの場合は、１モル％の適当なスピンラベルのエタノール溶液を 乾燥させて試験管の側面に薄膜を形成し、これにＣＨＳトリス塩の粉末４０■と トリス−ＨＣＱ緩衝液２ＩｌＩＱを添加した。この懸濁液を旋回し、得られたり ボゾームを２回洗浄した。全ての電子スピン共鳴実験はＩＢＭ　Ｉｎｓｔｒｕｍ ｅｎｔｓ　ＥＲｌｏｏＤ　ＥＳＲ分光光度計を用いて行なわれた。順位パラメー ター（Ｓ）は、この他に記載された（Ｇｒｉｆｆｉｔｈ及びＪｉｓｔ　、スピン ラベリング（Ｓｐｉｎ　Ｌａｂｅ　Ｑ　Ｑ　ｉｎｇ）　。 ＢｅｒＱｉｎｅｒ、　Ｌ、Ｔ、　（ｅｄ、）　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、 Ｎ、Ｙ、　１９７６）ようにして計算された。 第３図は５．６．７．９．１ｏ、１２又は１６ドキシルステアレートのいずれか を用いたｙ４製物をスピンラベルすることにより決定されたＣＨ５−Ｍ’、ＬＶ ｓとＥＰＣ−ＭＬＶｓの順位パラメーター図を示している。ＥＰＣ二重層は、す でに報告されている様に、二重層中への炭素数を増加するに従い、順位パラメー ターは減少している。ＣＨ５二重層の前出の分子構造はきわだって異なっている 。すなわち、ＣＨ５二重層がＥＰＣ二重層よりも劇的に硬いばかりでなく、ＣＨ ５系が実際に５０番目から９０番目までの炭素の整然たる増加を示しており、こ のことは先に報告されているものとは全く異なった物理的及び化学的二重層構造 であることに示している。 次の一連の実験において、コレステロールへミスクシネート及びリン脂質マルチ ラメラ小球体の等張膨潤行動が比較された。 （１）セクション６．１．に記載した通りにして、０．ＯＩＭｌ−リス−ＨＣＱ 、　０．１Ｍ　ＫＣＩＩＩ緩衝液ＺａｒＱ中のＣＨ５Ｉ−リス塩４０■を用いて 、ＣＨ５−ＭＬＶｓをＷＡ製した。 （２）セクション６．２．１に茗己載した通りにして、０．０１Ｍトリス−ＨＣ Ｑ、　Ｏ，ＩＭ　ＫＣＱ緩衝液２ｍＱ中のＥＰＣ５１，８＋ｎｚを用いて、ＥＰ Ｃ−ＭＬＶｓを調製した。 （３）　ＥＰＣ−ＭＬν調製のためのセクション６．２．１．に記載された方法 を用いて、０．ＯＩＭ　）−リス−ＨＣＱ　、　０．１Ｍ　ＫＧ　ｍ緩衝液２ｍ Ｑ中のＥＰＣ４１，１，及びＥＰＡ９．７９ｍｇを用いて、ＥＰＣ及び卵ホスフ ァチジン酸（ＥＰＡ）からなる脂質二重層を有するマルチラメラ小球体を調製し た。得られたＭＬＶｓ（ＥＰＣ：　ＥＰＡ−札νＳ）は、それぞれＥＰＣ：　Ｅ ＰＡをモル比８：２で含んでいた。 札Ｖｓの各懸濁液（すなわち、上記のＣＨ５−ＭＬＶｓ、　ＥＰＣ−ＭＬＶｓ及 びＥＰＣ：　ＥＰＡ−札νＳ）を旋回混合後、予備の緩衝液中で２時間室温で放 置した。次に、各リポゾーム調製物の２０μＱ部分標品を、ＫＣｆｌ濃度が０． ０５５Ｍ乃至０．５Ｍの一連の０．０１Ｍトリス−Ｈ（ｌ緩衝液１．０ｍＱに添 加した。１時間平衡させた後、５５０ｎｍの波長で試料の吸光度を測定すると薄 い散乱が認められた。 結果を第４図にグラフとして示した。ここで吸光度は小球体がさらされている媒 体のＫＣＱＪ度の逆数に対しプロットされている。 増大した吸光度は脂質小球体の膨潤を示している。曲線Ｂ及びＤは、予想された 通り、リン脂質ＭＬＶｓ　（すなわち、　ＥＰＣ−ＭＬＶｓ及びＥＰＣ：　ＥＰ Ａ−肛Ｖｓ）が理想的浸透圧計として行動したことを証明している。しかし、曲 線Ｃは、ＣＨ５−ＭＬＶｓは閉鎖小球体構造として行動するものの、それらは低 張媒体又は高張媒体中では非理想行動をとることを示している。第４図に示され たこの行動は、プロツカーホフ及びラムサミー（Ｂｒｏｃｋｅｒｈｏｆｆ　ａｎ ｄ　Ｒａｍｓａｍｍｙ）、（＋９８２゜バイオヒミカ・エト・バイオフィジカ・ アクタ　（Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ。 Ａｃｔａ、）斗朋、　２２７−２３２３がコレステロールリポゾームで観察した こととは全く異なっている。 水に対する溶解性の乏しい化合物のＣＨ３−リボゾーム中への取り込みを牛生長 ホルモン、インシュリン及びタイロシン（Ｔｙｌｏｓｉｎ）で証明する。 およそ１．９１個のアミノ酸の単鎖から成る蛋白質の試料である牛生長ホルモン （ＢＧＨ）は部分的に水溶性である。通常の溶解度はｐＨ８，０で１〜１．５■ ／ｒａＱである。　ＢＧＩ（は、クロロホルムのような有機溶媒中で沈殿する。 セクション６．２．に記載された通りにして、０．０１Ｍトリス−ＨＣＱ　（ｐ ）１７．４）　、　Ｏ，］４４ＭＮａＣＱ緩衝液１ｍＱ中のＣＨＳトリス塩２５ ■を用いて、Ｃ）ＩＳ−ＭＬＶｓを調製した。このＣＨ３−ＭＬＶ調製物を透明 になるまで音波処理すると、音波処理Ｃ）＋５−５ＵＶｓが形成された。次に、 ５、、１０．．１５■、２５■、　３０■又は１６６■のＢＧＨ（Ｅｌｆ　Ｌｉ １ｌｙ　＆　Ｃｏ、。 Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、　ＩＮ）を、この音波処理ｃＨｓ−ｓｕｖｉ濁液の 別々の部分標品に添加した。この懸濁液を広範囲に旋回混合すると、ＣＢ５−８ ＵＶ二重層中にこの蛋白質が分配された。この音波処理Ｃ）＋５−３ＵＶ懸濁液 について、沈殿の有無を１日目、２日目及び２１日間に肉眼で観察した。沈殿は ｅｉａされなかった。このことは、牛生長ホルモンが、室温で２１日間テストさ れた全ての濃度で、ＣＨ３−リボゾーム中に取り込まれたままで留まったことを 示している。 ポリペプチドホルモンである亜鉛−インシュリンは、稀酸又はアルカリには速や かに溶けるがＰＨ４，５〜７．０の水相には実際に不溶である。事実、インシュ リン溶液が巨大凝集体を形成する傾向は、長期インシュリン投与システムの開発 の障害になっている。 セクション６．２．に記載された通りにして、０．０１Ｍトリス−ＨＣＱ　（ｐ ）１７．４）　、　Ｏ，１４Ｍ　ＮａＣＱ緩衝液１１ＩＱ中のＣＨ５ｈリス塩２ ５■を用いて、ＣＢ５−ＭＬＶｓを５１製した。　コ（７）ＣＢ５−ＭＬＶ調製 物を透明になるまで音波処理して音波処理ＣＨ３−５ＵＶｓを形成した。このＣ Ｈ３−５ＵＶＷＡ濁液に４７■までの亜鉛−インシュリン粉末（Ｂｏｖｉｎｇ　 ＰａｎｃｒｅａｔｉｃＩｎｓｕｌｉｎ、　Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ 、、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ　ＭＯ）を添加した。この懸濁液を広範囲に旋回混合 すると、　ＣＨ３−５ＵＶ二重層中にインシュリンが分配された。この音波処理 ＣＨ３−５ＵＶｓについて、沈殿の有無を１日日２２日目及び２１日間に肉眼で 観察した。沈殿は観察されなかった。このことは、５ｍｇ／ｍＱの濃度で、イン シュリンが室温で２１日間取り込まれたままであることを示している。インシュ リンの取り込みは３７℃でより速やかに起こる。 タイロシンは２５℃の水に５■／ＩＩＩＱｍける抗生物質で、低級アルコール、 エステル、ケトン、塩素化炭化水素、ベンゼン及びエーテルにも可溶である。 小マルチラメラ小球体が次の如くして調製された。すなわち、１１００ｆｆ１の タイロシン塩基（Ｅｌｉ　Ｌｉ１ｌｙ　＆　Ｃｏ、、　Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉ ｓ、　ＩＮ）及び２００■のＣＨＳトリス塩を４ｍＱのリン酸で緩衝した塩水（ ｐ）１７．４）中で旋回混合した。得られたＣＢ５−ＭＬＶｓの乳白色懸濁液を ブロープチップソニケーターで１５分間音波処理した（用心のため、試験管の周 りに水浴を置き、混合物の温度を低く保った）。以上、この混合物を浴型ソニケ ーター中に１時間４５分置いた。 この２時間の音波処理後、この懸濁液を１０，０ＯＯＸ　ｇで１０分間遠心分離 することにより、このＣＨ３−５ＵＶをｉ！！濁液から分離して、ペレットと乳 白光の上澄液を得た。上澄液中の音波処理ＣＨ３−５ＵＶＳを１００■のタイロ シン塩基（Ｅｌｉ　Ｌｉ１１．ｙ　＆　Ｃｏ、、　Ｉｎｄｊａｎａｐｏｌｉｓ、 　ＩＮ）を、同量の水に添加した懸濁液と肉眼で比較した。タイロシン塩基の＠ 濁液には沈殿が生じたが、ＣＨＳ−５ＵＶタイロシン製剤には沈殿は生じなかっ た。このように、このタイロシンは少くとも４８時間取り込まれたままであった 。 ８、実施例：コレステロールヘミスクシネートの脂質可溶性化合物取す暴、４　 Ｏｆ：　ｌ々ｐＩ東」−脂質可溶性生物活性薬剤の取り込みはインドメサシン及 びジアゼパムで証明される。 プロスタグランジン阻害物質であるインドメサシンは実際には水不溶性である。 インドメサシンの遊離酸はエタノール、エーテル、アセトン及びひまし油に可溶 性である。 生物活性薬剤としているいろな斌のインドメサシンを取り込んでいるＣＢ５−Ｍ ＬＶｓを次の通りにして調製した。すなわち、丸底フラスコでＣＢ５　）−リス 塩２５ｗ、、インドメサシン１〜５Ｋ、及び１４Ｃ−インドメサシン（２２，０ ｍＣ１／ｍｍｏＱ　、　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｕａｎｄへｕｃｌｅａｒ、　Ｂｏｓｔｏ ｎ。 ＭＡ）　１０μＱを配合した。全ての成分を溶解するのに充分な量のメタノール を添加した。次に、この混合物を回転蒸発させて容器上に薄膜を形成させ、全て のメタノールの除去を確実にするために一夜真空乾燥した。次に、各フラスコに ０．ＯＩＭ）−リス−ＨＣＱ　（ｐＨ７，３）　、０．１４Ｍ　ＮａＣＱ緩衝液 を１．ｏｍＱ添加することによりＣＢ５−ＭＬＶｓを形成した。この懸濁液をガ ラスピーズと共に旋回混合して２時間静かに放置した。 ２時間後、このＣＢ５−ＭＬＶｓ中に取り込まれたインドメサシンの各々の量を 次の通りにして決定した。すなわち、０．ＯＩＭ）−リス−ＨＣＱ　（ｐｌ＋７ ．３）　、　０．１４Ｍ　ＮａＣＱ緩衝液９．０ｍＱを各試料に添加し、混合物 を１０，０ＯＯＸ　ｇでｌＯ〜２０分間遠心分離した。得られた０、０Ｍトリス −ＨＣＱ　（ｐＨ７，３）　、　０．１４Ｍ　ＮａＣＱ緩衝液１０ｍ１２中で３ 回洗浄し、最終景１　ｙａ　ＱのＯ，ＯＩＭ）−リス−）ＩＣＱ　（ｐＨ７，３ ）　、　０．１４Ｍ　ＮａＣＱ緩衝液に懸濁した。゛′標準品″は放射性ラベル 化インドメサシンのみが最初の混合物に加えられた以外は、試料調製と同様の方 法で調製された（すなわち、インドメサシン１〜５■がこのＣＢ５−ＭＬＶ標準 調製物から省かれた）、各試料の濾過された２０μＱ部分標品中に含有される放 射性がシンチレーション液１ＯＩＩＩＱ中でカウントされた。″標準品″を種々 の濃度のインドメサシンを含有した試料と比較して取り込まれたインドメサシン のパーセンテージを決定した。結果を第３表に示す。 インドメサシン濃度　ＣＢ５−ＭＬＶｓ中に取り込まれた結果は７８％までのイ ンドメサシンが、ＣＢ５−ＭＬＶｓ中に取り込まれうろことを示している。 取り込まれたインドメサシンが小球体の薄膜を変化させたかどうかを調べる目的 で、インドメサシンの存在下に調製されたＣ）ＩＳ−ＭＬＶｓ　（セクション８ ．１．１．を参照）を凍結腐蝕電子顕微鏡検査に関して上記した通りに処置した 。凍結腐蝕電子顕微鏡検査において、低倍率では、空の”　ＣＢ５−Ｍｌ、Ｖｓ は、インドメサシンを含有するＣＢ５−ＭＬＶｓと区別されなかった。すなわち 、１つを独特なものとして互に区別できる明白な特徴がなかった。しかしながら 。 高倍率ではインドメサシンを含有するＣ）Ｉｓ−ＭＬＶｓの二重層は特異である 。インドメサシンが水不溶性薬剤であり、エタノール、エーテル、アセトン、及 び他の無極性溶媒に可溶なので、インドメサシンが脂質の存在下に水から隔離さ れるように調製されると予想される。電子顕微鏡検査で見た二重層の考察は、二 重層の厚さが横断破砕において変化していることを示した。これは、インドメサ シンが二重層の脂質部分に正に分布されていること、厚みの増加及び非常に不均 一な形態の付与が出現したこと、すなわち、厚みは１つの二重層が破砕線に沿っ て追跡されるに従って変化したことを示唆した。この結果は、二重層の脂質部分 に薬剤を隔離するような、そんな溶解度を有する試薬に特別なものと推定される 。 鎮静剤又はトランキライザー　〔すなわち、バリウム（Ｖａｌｉｕｍ）　）であ るジアゼパムはクロロホルム、ジメチルホルムアミド、ベンゼン、アセトン及び アルコールに可溶であるが、水にはほんの少ししか溶けない。 ジアゼパムを取り込んでいるＣＨ３−５ＩＩＶｓを次の通りにして調製した。す なわち、ジアゼパム２■、３ｍｇ、４■又は５■を５μ息の１Ｈ−ジアゼパム（ ７６，７Ｃｉ／ｍｍｏ　Ｑ　、　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ、　 Ｂｏｓｔ。 ｎ、　ＭＡ）の入った試験管に添加した。この薬剤が溶けるのに充分な量のメタ ノール（最大２ＩＩＱのメタノール）を各試験管に加えた。次に、この混合物を 回転蒸発させて薄膜とし真空で一夜乾燥させて、全てのメタノールの除去を確実 にした。乾燥薄膜を音波処理ＣＨ３−５ＵＶｓの懸濁液ＩＩＩＱ中に再懸濁して 、ガラスピーズを用いて旋回混合し、０．２２μｍのミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏ ｒｅ）フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｃｏｒｐ、、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　 ＮＹ）を用いて濾過した。 ＣＢ５−５ｔ！Ｖｓは次の手順に従って調製した。すなわち、ＣＨＳトリス塩５ ０ｍｇ、１００ｍｇ、又は２００■をトリス−ＨＣＱ　（ｐＨ７，３）、　０． １４Ｍ　ＮａＣＱ緩衝液１．０ｍＱとうずまき混合した。ブローブソニケーター を用いて、混合物を５５０ｎｍの波長で測定した光学密度が約０．４０　（すな わち、゛′透透明温溶液になるまで音波処理し、次にｔｏ、ｏｏｏｘ　ｇで遠心 分離して、ソニケータープローブの先端からはずれて来たかも知れないいかなる チタンも除去した。このＣＨ３−５ＵＶｓの懸濁液を次の試験管から他の容器に 注いだ。 音波処理したＣＨ３−５ＵＶｓで取り込まれ得たジアゼパムの各々の量が試料を ″標準品″調製物と比較することによって決定された。 ゛′標標準品詞調製物放射性ラベル化ジアゼパム列九が゛加えられた以外は試料 調製と同様にして調製された（すなわち、ジアゼパム２〜５ｍｇがこのＣＨ３− ５ＵＶ標準調製物から省かれた）。いずれの場合も、濾過された＠濁液の１０μ Ｑ部分標品中に含有される放射能がシンチレーション液１０μＱ中でカウントさ れた。結果を第４表（ｍｇ／　ｍ　Ｑ　）　Ｃ８５１４度（ｇ／ｍＱ）」刈　± 　亜 ２　８６　１．００　ｔｏ０ 結果は、　Ｃ）Ｉｓが１００■／　ｍ　Ｑ及び２００■／　ｍ　Ｑで用いられた ジアゼパムの最高濃度（５■／　ＩｃＱ　）の１００％取り込みを示している。 ＣＩ（Ｓの１００■／ｍＱと２００　ｍｇ　／　ｍ　Ｑの両方がジアゼパムを充 分に取り込むのであるから、その１００■／　ｍ　Ｑがジアゼパムの取り込みの ための濃度としてより理想的である。 比較的低濃度のＣ）Ｉｓ小球体（１μｇ　／　ｍ　０未満のＣＨ５）がリン酸緩 衝塩水（ＰＢＳ）中で懸濁液から赤血球を強く膠着させたことが観察された。　 ＣＨ５小胞は（ａ＋＋及びアミノグリコシド抗生物質のような他のカチオンによ って沈殿させられる故に、そのＣＨ５小球体は血清中のアミノグリコシド抗生物 質の濃度を次のようにして決定するために用いることができる。すなわち。 （ａ）一定量のＣＨ３小球体を沈殿させる抗生物質含有血清の稀釈度を決定し。 （ｂ）抗生物質含有血清添加後に沈殿しないで残存する遊離小胞の濃度を凝集滴 定により決定する。 両方の立場において、抗生物質の正確な量を、既知濃度の抗生物質から誘導され た標準曲線との比較を用いて確証することができた。基本実験について以下に記 載する。 従って、ＰＢＳ中（１■／　ｍ　Ｑ　）の硫酸ゲンタマイシン２４μＱを血清で 順次稀釈した（すなわち、２５μＱ血清部分標品）。次に、０゜０１Ｍ）−リス −ＨＣＱ　（ｐＨ７，３）　、　０．１４Ｍ　ＮａＣＱ緩衝液中ｐＨ７，４で２ ５ｆｆＩｇ／ｍＱの濃度でＣＨ５）−リス塩を音波処理して調製したＣＨ５Ｊｌ ｔ層小球体の２４μＱ部分標品を各試料に加えた。 室温で約１０分経過後、各混合物の濁りが記録された。ゲンタマイシンを５０μ ｇ以上含んでいる混合物だけが、目に見える沈殿を示し、ＣＨ８小球体がゲンタ マイシンと相互に作用したことを表わしている。 次に、沈殿物がペレット化され、上澄液はひよこの赤血球の凝集によるＣＨ３− ５ＵＶｓの濃度決定のために用いられた。凝集分析はＵ−型微細くぼみを有する プレート９６枚中で、順次小球体懸濁液を５０μＱ　ＰＢ’Ｓまで稀釈し１次に 各くぼみで、　ＰＢＳ中に０．５％ＲＢＣ４０μＱを添加することにより行なわ れた。４℃で６０分経過後、凝集を逆鏡で観察した。対照（ＣＨ８小球体が不存 在のＲＢＣ）は凝集を示さなかった。ＣＩ（Ｓを含有する全ての試料は、前の実 験で濁ったものを例外として、ＲＢＣを強く凝集した。この結果は、　ＣＨ５小 球体はゲンタマイシンと相互に作用するので、比較的少ない小球体でもＣ）ＩＳ だけを含んでいる対照＠濁液と比較すれば、凝集のために利用できたことを示し た。 次の各セクションには本発明のコレステロールヘミスクシネートを用いる生物活 性薬剤のインビボの投与のための方法及び組成物について記載する。取り込まれ た生物活性薬剤の臨床効果が決定され、選択された器官内での薬の分布が適当な 場所で追跡雄の白色ニューシーラントイエウサギ（２〜２．５ｋｇ）は、完全な フロインズ（Ｆｒｅｕｎｄｓ）補助薬中で乳化された２０ＩＩｇ／ｌＩＱ牛血清 アルブミン（ＢＳＡ）　（Ｍｉｌｅｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｅｌｋｈ ａｒｔ、　ＩＮ）　１ｎ＋Ｑを２週間間隔で２回皮下投与して免疫化された。３ 週間目にそのイエウサギは右膝関節に関節炎を引き起こすために１．ＯｍＱの塩 水中のＢＳＡ　ｔｏｆｆＩｇの関節内注射を１回うけた。左膝関節は対照として の役割を果した。関節の直径は感度０．０１ｍｍのホウラー（Ｆｏｖ　Ｑ　ｅｒ ）ダイアル測径器を用いて測定された。　ＢＳＡ注射された関節は膨れあがり、 代表的には対照関節より３〜４ｍ大きく測定される。４週間目にそのイエウサギ は、関節炎を引き起こすために、塩水中のＢＳＡ関節内注射をもう１回受けた。 ２７０、Ｏｗ：のＣ１（Ｓと１０■のインドメサシンを用い、セクション８゜１ 、に記載された通りにしてＣ）Ｉｓ−ＭＬＶｓを調製した結果、インドメサシン の最終濃度は１．０ｍｇ／ｍｉ１となった。炎症の誘発から３日たって、　ＢＳ Ａ注射された動物は、ＣＨ３小球体に取り込まれたインドメサシン１■／ｍＱ（ 全服用量：１■／動物）の筋肉注射を１回受けた。関節炎は次の日から１０日間 測定された。 結果は第５図にグラフで説明され、ＣＩ（Ｓ−ＭＬＶｓに取り込まれたインドメ サシンは筋肉内投与されたとき、関節の膨れを減少させるのに効果があったこと を示している。 １０．２．コレステロールヘミスクシネート５ＬＩＶｓ中に取り゛まれだジアゼ パムのイン　ビボの投与ハッカネズミはセクション８．２．に記載された通りに 調製されたＣＨ３−５ＵＶｓに取り込まれたジアゼパムを、体重１ｋｇ当り５０ Ｍｇ静脈内又は筋肉内に接種された。ジアゼパムはハッカネズミに対して鎮静作 用を有しく接種後ハッカネズミは眠りに落ちた）、取り込まれた薬剤の活性の保 持を示した。 １０、２．１．艶透内　種後の器官　布被取り込みジアゼパムを含むＣＨ３−５ ＵＶｓをセクション８．２．に記載された通りにして調製した。浴型ソニケータ ー中で音波処理した後、波長５５０ｎｍで測定した吸光度は０．３７０であった ０次に、こ（７）ＣＨ５−５ＵＶ懸濁液（７）４４．２μＱ部分標品を、４０μ ｃｉ（７１１４Ｃ−ジアゼパム（比活性が、エタノール中１００μＣｉ／−Ωと して供給された１８１μＣｉ／ｍｇに等しい）がガラス試験管の上で窒素下に乾 燥された。 そのガラス試験管に加えた。５分間の旋回混合後、　０．ＯＩＭ　トリス−ＨＣ Ｑ　（ｐＨ７，３）　、　０．１４Ｍ　ＮａＣＱ緩衝液１．２８２ｍＡをこの溶 液に添加したところ、３０倍稀釈＠濁液が得られ、ハッカネズミのための治療服 用量０．１６７１１Ｉｇ／μＱジアゼパムを生じた。 意識のある、拘束した３５ｇのスイス−ウェブスター（Ｓｗｉｓｓ−Ｖｅｂｓｔ ｅｒ）ハッカネズミの尾部静脈中にＣＨ３−５ＵＶ−１４Ｃ−ジアゼパムｓｉ液 の０．１ｍＱアリコートを注射した。対照ハッカネズミにはカプセルに取り込ま れていない″４Ｃ−ジアゼパムを等しい服用量で接種した。注射後１．２又は５ 時間で、ハッカネズミは頚部脱臼により殺し、内部器官（腎臓、肺、膵臓、肝臓 、腸、脳、心臓、膵臓、及び脂肪）及び血液が摘出された。これらの器官の重さ が計られ、各々の小試料（２０〜４０μｇ）は、マインとコバーグ［Ｍａｈｉｎ 　ａｎｄ　Ｋｏｈｂｅｒｇ：　１９６６、アナリティ力ルバイオケミストリー（ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、）　１６，５００〕の方法に従って消 化色抜きされた。次に、試料は、放射能測定前に化学発光を静めるために５日間 暗所適合させられた。 実験の結果を第６図に示す。Ｃ）Ｉｓ−５ＵＶに取り込まれたジアゼパムを接種 したハッカネズミにおいて、薬剤は膵臓に蓄積していない、このことは、インビ ボで静脈内投与されたとき、　ＣＨ３−５ＵＶｓに取り込まれたジアゼパムはリ ン脂質に取り込まれた薬剤と同じには行動しないことを示している。 １０．３．コレステロールヘミスクシネート中に取り７　ｒ＝ニクロムイン　ビ ボ　与 インビボ投与されたときＣＨ５小球体がそっくりそのまま留まるかどうかを調べ るために、ハッカネズミに静脈注射した後のＣＨ５小球体に取り込まれた水性マ ーカーの器官分布と比較して遊離の水性マーカーの器官分布が調べられた。この 目的で、取り込まれないＳ１クロム（”Ｃｒ）　、　ＣＨ３−阿ＬＶｓに取り込 まれたＳ１クロム、及びリン脂質に取り込まれたＳ″クロム比較された０次の報 告書の通りである。すなわち。 （ａ）取り゛まれていない％１（−ｒ＄１（ｒは殺菌した０、９％塩水のＳ″Ｃ ｒＯ，”’−（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ、　Ｎｅｗｔｏｎ、　 ＭＡ）として供給される。遊離５１Ｃ「注射液は、０．９％塩水中の”Ｃｒ　１ ００ｐＱを０．ＯＩＭ　トＩＪ　ス−ＨＣＱ　、ｐＨ７，３，０，１４Ｍ　Ｎａ ＣＱ、５％ブドウ糖で全ｊｔ１．５ｍＱに稀釈することにより３１製された。　 １６匹の４０ｇの雄スイスウェブスター（Ｓｗｉｓｓ　Ｖｅｂｓｔｅｒ）ハッカ ネスミハソレぞれ、尾部静脈から０．１ｍＡ　（約７００，０ＯＯｃｐ１１）の 静脈注射を受けた。 （ｂ　）　ＣＨ５−ＭＬＶｓ中（７）”Ｃｒは少量（７）ｓｌＣｒ（殺菌０．９ ％塩水中の５１Ｃｒｙ、”’−）　ｔ５−含ムＯ，ＯＩＭ　）−ＩＪ　ス−ＨＣ Ｑ、　ＰＨ７，３，０，１４ＭＮａＣＱ、５％ブドウ糖中に乾燥ＣＨ５ｈリス塩 粉末を溶解することにより調製された。この混合物は旋回混合され１次の３０分 間簡単に音波処理された。遠心分離によりペレット化し、３回前記の通り洗浄し た後、最終小粒は最終濃度１０■／ｙａＱ　ＣＨ５となるように再沈殿された。 そのサイズはニコンプ凝似弾性（Ｎｉｃｏｍｐ　ｑｕａｓｉｅｌａｓｔｉｃ）光 散乱分析で直径１ミクロンと測定された。１２匹の４０ｇの雄スイスウェブスタ ー（Ｓｗｉｓｓ　Ｗｅｂｓｔｅｒ）ハッカネズミはそれぞれ尾部静脈から０．１ ｍＱ（約１２０，０００ｃｐｍ）の静脈注射を受けた。 （ｃ　）　ＥＰＣ−５ＰＬＶｓ中の５１Ｃｒは、ここに参考として記載されてい る、レンダ等（Ｌｅｎｋ　ｅｔ　ａｌ、）により１９８３年３月２４日に出願さ れた係属中の出願第４７６．４９６号題名″安定な複層ベシクル、その調製と使 用″に詳細に記載された一般方法により調製された。この目的で、５ｍＱバッチ は卵ホスファチジルコリン６５■をクロロホルムに溶かし、乾燥して薄膜を形成 させることにより調製された。この薄膜をエーテル１０ｍ１Ｊ中に再懸濁し、こ れに０．９％塩水（ｐｌ（８）中の’　”　Ｃｒｙ、　−０，３ｍＱを加えた。 この混合物を次にＮ２ガス下にエーテルを同時に蒸発させながら音波処理して乳 化した。得られた安定な複層小球体（ＳＰＬＶｓ）を０．ＯＩＭ！−リス−ＨＣ Ｑ　、　ｐＨ７，３，０，１４Ｍ　ＮａＣ９、５％ブドウ糖の５ｍ＋２中に再懸 濁し、遠心分離によりペレット化した。このペレットを３回洗浄して未取り込み Ｓ１クロムを除去し、最終ペレットを５ｍＱのｏ、。 １Ｍトリス−ＨＣＱ　、　ｐｉ（７，３，０，１４Ｍ　ＮａＣＱ、５％ブドウ糖 に再懸濁した。　ＥＰＣの最終濃度は１３■／ｍＱであった６１２匹の４０ｇの 雄スイスウェブスター（Ｓνｉｓｓ警ｅｂｓｔｅｒ）ハッカネスミハソレソレ尾 部静脈がら０．］ｎ＋Ｑ（約１．００，０００ｃｐｍ）　（７）静脈注射を受け た。 １．２．５及び２４時間たった時、リボゾーム製剤で処置された各群から３匹、 及びカプセル化されていないＳ１クロムで処置された群から４匹のハッカネズミ が頚部脱臼により殺された。器官が通りにして、試験された各器官内に残留して いる％薬量及び％薬量／ｇを決定するためにカウントされた。 第７図に示されている結果は、カプセル化されていないクロム（第７図Ｃ参照） は速やかに排出され、試験されたどの器官にも集中していないことを示している 。　ＥＰＣ及びＣＨ５でカプセル化されたクロムは注射後２４時間でも測定可能 な程度で残留しており、ＣＨ８小球体はＥＰＣ−５ＰＬＶｓと同様に、イン　ビ ボでそっくりそのまま留まっていることを示している。さらに、０．５ミクロン から１．０ミクロンの小さい直径を有するＥＰＣ−５ＰＬＶｓ　（１３＋ｎｇ／ 　ｔＩＱ　）は肝臓、肺。 及び牌臓に蓄積している（第７図Ｃ参照）。すなわち、これはりボゾーム分布の 代表的パターンである。等モルのＣＨ５小球体は主として肝臓に蓄積し、はるか に低い程度で肺及び牌臓に蓄積する（第７図Ｃ参照）。これは、インビボにおけ る２種のりボゾーム調製物の分布パターンにおける相異を示している。 １０．４．コレステロールヘミスクシネートＭＬＶｓ中に取り′まれだヒト生長 ホルモンのインビボ投与１２５ニーヒト生長ホルモン（）ＩＧＨ，Ｎｅｗ　Ｅｎ ｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ、　Ｂｏｓｔｏｎ。 ＭＡ）を取り込んだＣＨＳマルチラメラ小球体を次の如くして調製した。すなわ ち、ＣＨＳトリス塩を１　μｃｉ／ｍＡ１２Ｊ−ＨＧ）Ｉ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａ ｎｄＮｕｃｌｅａｒ、　Ｂｏｓｔｏｎ、　ＭＡ）を含む０．ＯＩＭ　）−リス− １（ＣＱ　、Ｏ，１４Ｍ　ＮａＣＱ−緩衝液（ＰＨ７，４）に添加し、最終ＣＨ ５）−リス塩濃度２５■／　ｍ　Ｑとした。この懸濁液をガラスピーズと共に旋 回混合した。得られたＣＨ５−ＭＬＶｓは、初めの放射能のカウントと比較して 決定したところ、１０％の”’Ｉ−ＨＧＨを取り込んでいた。 １２匹の雌スイスーウェブスター（Ｓｗｉｓｓ　Ｗｅｂｓｔｅｒ）　ハッカネズ ミの一群は、後ろ脚にＣＨ５−ＭＬＶに取り込まれた２’　Ｉ−ＨＧ）Ｉ懸濁液 ０．５ｍＱを筋肉内注射された。１２匹のハツカネズミの対照群は、０．０１Ｍ トリス−ＨＣＱ、０．１４Ｍ　ＮａＣＱ緩衝液中の遊離”Ｊ−ＨＧＨ０，５＋ａ Ｑを注射された。両群の各動物はおよそ３５．ＯＯＯｃｐｍ／動物の接種を受け た。注射後定期的にハツカネズミは殺され、後ろ脚は切り裂かれ、残留している 全放射能のパーセントが調べられた。第５表のデータはＣＨ５−ＭＬＶｓ中に取 り込まれたとき、　”’Ｉ−ＨＧＨの保持は実質的に増大していることを証明し ている。このように、筋肉内注射されたとき、ＣＨＳリボゾームに取り込まれた 薬剤は持続的に放出（Ｎ＝動物１２匹）　３　２４　７２　１６８対照ａ ”５Ｉ−ＨＩＧＩＨ５０，７０，２０，３ＣＨ５小球体す中の ”ｓニーＨＧＩＨ５６３７２９２２ ホルモン０．５＋ａＱの接種を受けた。 ｂ　動物は０．０１Ｍトリス−ＨＣＱ　、　０．１４Ｍ　ＮａＣＱ中のＣＨ３− 小球体（２５ｍｇ／　、ｍ　Ｑ　ＣＨ３，中の１２″■−ヒト生長ホルモン０． ５＋Ｑの接種を受けた。 取り込まれた溶質 取り込まれたＳＬ　（、ｒ７μモルＣＨＳ（任意の単位） δ　閃　（ＪＪＡ　０１　■ ｏ　ｏ−ｏ　ｏ　。 第２図 第３図 炭素数 凡例 ←−→　ＥＰＣ 第４図 １／［Ｍ］ＫＣＬ ヨ 関節の大きさくｍｍ） 第６図 凡例 ロ＝ＣＨＳ−５ＵＶＳ中の”Ｃ−シフｆバムロ＝遊離の”ｃ−ジアゼパム 第７図Ａ 第７図Ｂ 第７図Ｃ 国際調査報告 ｌＭｎｌＲＩｌｌｅＭｊｌＡｅ６ＬｅｌｂｅｎＮ＠ＰＣτノＵＳ８５１０１９８ ３１ＩＩ＋ｍｎａ＋ｌ＠ＡＩｌ＾ｍ−會−−”＝ＰＣＴ／ＵＳ８５１０１９８３

Claims (101)

【特許請求の範囲】
1. １．ステロールの有機酸誘導体の塩を含む二重層を有するリポゾームに取り込ま れた化合物をホストに投与することを含む、インビボにおける化合物の投与方法 。
2. ２．前記二重層はステロールの有機酸誘導体のトリス（ヒドロキシメチル）アミ ノメタン塩を含む請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．前記二重層はステロールのカルボン酸誘導体の塩、ステロールのジカルボン 酸誘導体の塩、ステロールのポリカルボン酸誘導体の塩、ステロールのヒドロキ シルカルボン酸誘導体の塩、ステロールのアミノ酸誘導体の塩又はステロールの ポリアミノ酸誘導体の塩を含む請求の範囲第１項記載の方法。
4. ４．前記ジカルボン酸は炭素数７以下の脂肪族ジカルボン酸を含む請求の範囲第 ３項記載の方法。
5. ５．前記脂肪族ジカルボン酸はスクシネートである請求の範囲第４項記載の方法 。
6. ６．前記二重層はコレステロール、ビタミンＤ、植物ステロール又はステロイド ホルモンの有機酸誘導体の塩を含む請求の範囲第１項記載の方法。
7. ７．前記化合物は生物活性薬剤を含む請求の範囲第１項記載の方法。
8. ８．前記二重層はコレステロールのヘミスクシネート誘導体のトリス（ヒドロキ シメチル）アミノメタン塩を含む請求の範囲第１項記載の方法。
9. ９．前記リポゾームはマルチラメラ小球体を含む請求の範囲第８項記載の方法。
10. １０．前記リポゾームはユニラメラ小球体を含む請求の範囲第８項記載の方法。
11. １１．前記化合物は生物活性薬剤を含む請求の範囲第８項記載の方法。
12. １２．前記生物活性薬剤は抗細菌性化合物である請求の範囲第１１項記載の方法 。
13. １３．前記抗細菌性化合物はタイロシン（ｔｙｌｏｓｉｎ）である請求の範囲第 １２項記載の方法。
14. １４．前記生物活性薬剤は抗菌性化合物である請求の範囲第１１項記載の方法。
15. １５．前記抗菌性化合物は膣内投与される請求の範囲第１４項記載の方法。
16. １６．前記抗菌性化合物は経口又は局所投与される請求の範囲第１４項記載の方 法。
17. １７．前記抗菌性化合物はエコナゾール、イソコナゾール、チオコナゾール、ピ ホナゾール、クロトリマゾール、ケトコナゾール、ブタコナゾール、イトラコナ ゾール、オキシコナゾール、フェンチコナゾール、ニスタチン、ナフチフイン、 アムホテリシンＢ、ジノコナゾール、又はシクロピロックスオラミンである請求 の範囲第１４項記載の方法。
18. １８．前記抗菌性化合物はミコナゾールである請求の範囲第１４項記載の方法。
19. １９．ミコナゾールは膣内投与される請求の範囲第１８項記載の方法。
20. ２０．前記抗菌性化合物はテルコナゾールである請求の範囲第１４項記載の方法 。
21. ２１．前記テルコナゾールは膣内投与される請求の範囲第２０項記載の方法。
22. ２２．前記生物活性薬剤は生長ホルモンを含む請求の範囲第１１項記載の方法。
23. ２３．前記成長ホルモンは牛生長ホルモンを含む請求の範囲第２２項記載の方法 。
24. ２４．前記生長ホルモンはヒト生長ホルモンを含む請求の範囲第２２項記載の方 法。
25. ２５．前記生物活性薬剤はインシュリンを含む請求の範囲第１１項記載の方法。
26. ２６．前記生物活性薬剤はイムノグロブリンを含む請求の範囲第１１項記載の方 法。
27. ２７．前記化合物は染料を含む請求の範囲第１項記載の方法。
28. ２８．前記染料はアルセナゾＩＩＩである請求の範囲第２７項記載の方法。
29. ２９．前記生物活性薬剤は抗炎症性化合物を含む請求の範囲第１１項記載の方法 。
30. ３０．前記生物活性薬剤はインドメサシンを含む請求の範囲第２９項記載の方法 。
31. ３１．前記生物活性薬剤は精神に作用する又は不安のための試薬を含む請求の範 囲第１１項記載の方法。
32. ３２．前記生物活性薬剤はジアゼパムを含む請求の範囲第３１項記載の方法。
33. ３３．前記生物活性薬剤はビタミンを含む請求の範囲第１１項記載の方法。
34. ３４．前記ビタミンはα−トコフェノールを含む請求の範囲第３３項記載の方法 。
35. ３５．完全閉鎖小球体を形成するのに充分な量で閉鎖二重層を形成することので きるステロールの有機酸誘導体の塩を水相に添加し、その混合物を振とうして、 マルチラメラ小球体の乳白色懸濁液を生成させることを含むステロールリポゾー ムの調製方法。
36. ３６．上記乳白色懸濁液をユニラメラ小球体の懸濁液が形成されるまで音波処理 することを更に含む請求の範囲第３５項記載の方法。
37. ３７．前記二重層はステロールの有機酸誘導体のトリス（ヒドロキシメチル）ア ミノメタン塩を含む請求の範囲第３５項記載の方法。
38. ３８．前記二重層はステロールの有機酸誘導体の２−アミノ−２−メチル−１， ３−プロパンジオール、２−アミノエタノール、ビスートリスプロパン又はトリ エタノールアミンの塩を含む請求の範囲第３５項記載の方法。
39. ３９．前記二重層はステロールの有機酸誘導体の抗菌性化合物の塩を含む請求の 範囲第３５項記載の方法。
40. ４０．前記有機酸誘導体はスクシネートである請求の範囲第３９項記載の方法。
41. ４１．前記ステロールはコレステロールである請求の範囲第４０項記載の方法。
42. ４２．前記二重層はステロールの有機酸誘導体のミコナゾール塩から成る請求の 範囲第３５項記載の方法。
43. ４３．前記有機酸はスクシネートである請求の範囲第４２項記載の方法。
44. ４４．前記ステロールはコレステロールである請求の範囲第４３項記載の方法。
45. ４５．前記二重層はステロールの有機酸誘導体の抗菌性化合物の塩を含む請求の 範囲第３５項記載の方法。
46. ４６．前記有機酸誘導体はスクシネートである請求の範囲第４５項記載の方法。
47. ４７．前記ステロールはコレステロールである請求の範囲第４６項記載の方法。
48. ４８．前記有機酸はスクシネートである請求の範囲第３５項記載の方法。
49. ４９．前記二重層はコレステロールの有機酸誘導体の塩を含む請求の範囲第３５ 項記載の方法。
50. ５０．前記二重層はコレステロールのヘミスクシネート誘導体のトリス（ヒドロ キシメチル）アミノメタン塩を含む請求の範囲第３５項記載の方法。
51. ５１．前記水相は本質的に二価のカチオンを含まない請求の範囲第５０項記載の 方法。
52. ５２．前記コレステロールヘミスクシネートは水相１ｍｌ当り約４．５ｍｇ乃至 約２００ｍｇの範囲で存在する請求の範囲第５１項記載の方法。
53. ５３．前記水相にトリス塩を添加することを更に含んでいる請求の範囲第５０項 記載の方法。
54. ５４．前記水相に前記ステロール小球体に取り込まれるべき化合物を添加するこ とを更に含んでいる請求の範囲第３５項記載の方法。
55. ５５．ステロール小球体に水不溶性化合物を取り込む方法であって、（ａ）水不 溶性化合物を有機溶媒に溶解し、（ｂ）該有機溶媒を除去して、該水不溶性化合 物を含む薄膜を残し、 （ｃ）マルチラメラ小球体又はユニラメラ小球体の懸濁液を添加する ことを含む方法。
56. ５６．ステロール小球体に水不溶性化合物を取り込む方法であって、（ａ）水不 溶性化合物と、水相中で小球体を形成し得るステロールの有機酸誘導体の塩とを 有機溶媒に共可溶化し、（ｂ）該有機溶媒を蒸発して該化合物と該ステロールの 有機酸誘導体の塩から成る薄膜を残し、 （ｃ）該薄膜に水相を加え振とうして、完全閉鎖マルチラメラ小球体の乳白色懸 濁液を生成させる ことを含む方法。
57. ５７．前記乳白色懸濁液を音波処理してユニラメラ小球体を生成させることを更 に含んでいる請求の範囲第５６項記載の方法。
58. ５８．ステロールの有機酸誘導体の塩を含む完全閉鎖二重層を含むステロイドの リポゾーム。
59. ５９．前記二重層はステロールの有機酸誘導体のトリス（ヒドロキシメチル）ア ミノメタン塩を含む請求の範囲第５８項記載のステロイドのリポゾーム。
60. ６０．前記二重層は１−アミノ−１−メチル−１，３−プロパンジオール、２− アミノエタノール、ビスートリスプロパン又はトリエタノールアミンを含む請求 の範囲第５９項記載のステロイドのリポゾーム。
61. ６１．前記塩はイオン化し得る生物活性薬剤から誘導される請求の範囲第５８項 記載のステロイドのリポゾーム。
62. ６２．前記イオン化し得る生物活性薬剤は抗菌性化合物である請求の範囲第６１ 項記載のステロイドのリポゾーム。
63. ６３．前記抗菌性化合物はテルコナゾールである請求の範囲第６１項記載のステ ロイドのリポゾーム。
64. ６４．前記抗菌性化合物はミコナゾールである請求の範囲第６１項記載のステロ イドのリポゾーム。
65. ６５．前記二重層はコレステロールの有機酸誘導体の塩を含む請求の範囲第５８ 項記載のステロイドのリポゾーム。
66. ６６．前記二重層はコレステロールのヘミスクシネート誘導体のトリス（ヒドロ キシメチル）アミノメタン塩を含む請求の範囲第５８項記載のステロイドのリポ ゾーム。
67. ６７．前記カチオンはアミノグリコシド抗生物質を含む請求の範囲第６６項記載 のステロイドのリポゾーム。
68. ６８．コレステロールのヘミスクシネート誘導体のトリス（ヒドロキシメチル） アミノメタン塩と抗菌性化合物を含む組成物。
69. ６９．前記抗菌性化合物はミコナゾールである請求の範囲第６８項記載の組成物 。
70. ７０．前記抗菌性化合物はテルコナゾールである請求の範囲第６８項記載の組成 物。
71. ７１．前記抗菌性化合物はエコナゾール、イソコナゾール、チオコナゾール、ビ ホナゾール、クロトリマゾール、ケトコナゾール、ブタコナゾール、イトラコナ ゾール、オキシコナゾール、フェンチコナゾール、ニスタチン、ナフチフィン、 アムホテリシンＢ、ジノコナゾール、又はシクロピロックスオラミンである請求 の範囲第６８項記載の組成物。
72. ７２．抗菌効果を発揮する量の請求の範囲第６８項記載の組成物を投与する工程 を含む被検者の菌感染を治療する方法。
73. ７３．前記投与は局所的に行なわれる請求の範囲第７２項記載の方法。
74. ７４．前記投与は経口で行なわれる請求の範囲第７２項記載の方法。
75. ７５．前記投与は膣内に行なわれる請求の範囲第７２項記載の方法。
76. ７６．前記抗菌性化合物はミコナゾールである請求の範囲第７４項記載の組成物 。
77. ７７．前記抗菌性化合物はテルコナゾールである請求の範囲第６８項記載の組成 物。
78. ７８．前記抗菌性化合物はエコナゾール、イソコナゾール、チオコナゾール、ビ ホナゾール、クロトリマゾール、ケトコナゾール、ブタコナゾール、イトラコナ ゾール、オキシコナゾール、フェンチコナゾール、ニスタチン、ナフチフィン、 アムホテリシンＢ、ジノコナゾール、又はシクロピロックスオラミンである請求 の範囲第６８項記載の組成物。
79. ７９．前記抗菌性化合物はミコナゾールである請求の範囲第７２項記載の組成物 。
80. ８０．前記抗菌性化合物はテルコナゾールである請求の範囲第７２項記載の組成 物。
81. ８１．前記抗菌性化合物はエコナゾール、イソコナゾール、チオコナゾール、ビ ホナゾール、クロトリマゾール、ケトコナゾール、ブタコナゾール、イトラコナ ゾール、オキシコナゾール、フェンチコナゾール、ニスタチン、ナフチフィン、 アムホテリシンＢ、ジノコナゾール、又はシクロピロックスオラミンである請求 の範囲第７２項記載の方法。
82. ８２．請求の範囲第６８項記載の組成物を含むクリーム。
83. ８３．前記抗菌性化合物はミコナゾールである請求の範囲第８２項記載のクリー ム。
84. ８４．前記抗菌性化合物はテルコナゾールである請求の範囲第８２項記載のクリ ーム。
85. ８５．抗菌効果を発揮する量の請求の範囲第８２項記載のクリームを投与する工 程を含む被検者の菌感染を治療する方法。
86. ８６．前記投与は局所的に行なわれる請求の範囲第８５項記載の方法。
87. ８７．前記投与は経口で行なわれる請求の範囲第８５項記載の方法。
88. ８８．前記投与は膣内に行なわれる請求の範囲第８５項記載の方法。
89. ８９．請求の範囲第６８項記載の化合物を含む坐薬。
90. ９０．前記抗菌性化合物はミコナゾールである請求の範囲第８９項記載の坐薬。
91. ９１．前記抗菌性化合物はテルコナゾールである請求の範囲第８９項記載の坐薬 。
92. ９２．抗菌効果を発揮する量の請求の範囲第８９項記載の坐薬を投与する工程を 含む被検者の菌感染を治療する方法。
93. ９３．前記投与は膣内に行なわれる請求の範囲第９２項記載の方法。
94. ９４．コレスチリルヘミスクシネートのトリス−（ヒドロキシメチル）−アミノ メタン塩とペプチドを含む組成物。
95. ９５．前記ペプチドは疎水性である請求の範囲第９４項記載の組成物。
96. ９６．前記ペプチドはヒト生長ホルモンである請求の範囲第９４項記載の組成物 。
97. ９７．前記ペプチドは牛生長ホルモンである請求の範囲第９４項記載の組成物。
98. ９８．前記ペプチドは豚生長ホルモンである請求の範囲第９４項記載の組成物。
99. ９９．前記ペプチドはインシュリンである請求の範囲第９４項記載の組成物。
100. １００．ペプチドが生長ホルモンである請求の範囲第９４項記載の組成物を効果 を発揮する量投与する工程を含む、哺乳動物の乳生産の増加、又は成長を増大あ るいは開始する方法。
101. １０１．前記生長ホルモンは牛生長ホルモンである請求の範囲第１００項記載の 方法。