JPS63304994A - ストレプトコッカス・ボヴィスの産生するデキストランスクラ−ゼによるロイクロ−スの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はストレプトコッカスやボヴイス（Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｃｏｃｃｕｓ　ｂｏｖｉｓ　ｓ以下ニス・ボヴイスと
いう）の産生ずるデキストランスクラーゼ（ｄｅｘｔｒ
ａ、ｎ５ｕｃｒａｓｅ）によるロイクロース（１ｅｕｃ
ｒｏｓｅ）の製造方法に関する。

ロイクロースなどのオリゴ糖は、肥満予防の甘味料、ビ
フィズス菌の増殖因子あるいは虫歯予防の甘味料など医
薬、食品工業の分野での幅広い用途が期待されている。

〔従来の技術〕

ロイクロースはエイチΦエイチ・ストドーラ（Ｈ，Ｈｙ
Ｓｔｏｄｏｌａ）らにより、ロイコノストック・メセン
テロイデス（ＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃＩｅＳｅｎｔθｒ
ｏｉｄｅｓ　、以下エル拳メセンテロイデスという）を
用いてデキストラン（ｄｅｘｔｒａｎ）を合成する際に
、微量のロイクロースが生じることが報告されている（
ジャーナル・オブ・アメリカン−ケミカル・ソサイアテ
ィー（Ｊ、Ａｓ、Ｃｈｅｓ。

Ｓｏｃ、）７８巻、２５１４頁（１９５１３）参照）。

また、ロイクロースはデキストランスクラーゼの転移作
用により生じることも知られている（イー争ジエイ・ブ
ールン（Ｅ、Ｊ、Ｂｏｕｒｎｅ）ら、バイオケミカル・
ジャーナル（Ｂｌｏｃｈｅｓ、Ｊ、）７９巻、５４９頁
（１９８１）参照）。

従来より行なわれてきたロイクロースの製造法はデキス
トラン合成時の副産物として生じるロイクロースを分取
するものであり、基本的には発酵法と酵素法に分けられ
るが、そのいずれもエル拳メセンテロイデスを用いて行
なわれている。

発酵法は、スクロースを含む培地でエル・メセンテロイ
デスを培養し、培地中に副産物として少量束じるロイク
ロースを種々の工程を経て分離・精製するものである。

また、酵素法はやはりスクロースを含む培地でエル・メ
センテロイデスを培養し、培地中に産生されるデキスト
ランスクラーゼを酵素源として、スクロース−フルクト
ースの混合系で酵素反応を行ないロイクロースを製造す
るものである。

〔発明の解決しようとする問題点〕

しかしながら、このような製造法に用いるエル・メセン
テロイデスは、栄養要求性が大きいため、その培養に多
種のビタミン、アミノ酸など比較的高価な栄養成分を必
要とし、しかも増殖速度が小さいため、ロイクロースま
たは酵素の産生に数日を要する。

また、酵素法では、完全な基質誘導酵素であるテキスト
ランスクラーゼが、エル・メセンテロイデスによりスク
ロース培地でのみ産生されるため、発酵液中に多量のデ
キストランが蓄積し、産生された酵素の回収が困難であ
ると同時に、デキストランとの複合体形成により不活性
化されやすく、酵素作用最適温度が３０℃と比較的低い
ため、反応速度は小さい。

さらに発酵法での収率は極めて低く、酵素法についても
２％スクロースの酵素反応条件下において、対消費糖あ
たり２〜６％と生産効率は低い。

したがって、ロイクロースを高収量でしかも迅速に製造
できる新しいプロセスの開発が望まれている。

本発明者らは、かかる実情に鑑み鋭意研究を重ねた結果
、牛の第１胃（以下、牛ルーメンという）から分離した
ニス・ボヴイスの産生ずるデキストランスクラーゼによ
るロイクロースの製造法は、培養においてニス・ボヴイ
スが栄養要求性が小さくビタミンとしてはビオチンのみ
を必要とし窒素栄養としては無機窒素のみで生育するこ
と、増殖速度も対数増殖期（ｌｏｇｐｈａｓｅ）　２〜
６時間、世代交代時間１０分程度ときわめて速く、しか
もグルコース培地において効率よくデキストランスクラ
ーゼを産生じ、その際にデキストランが生じないことに
より除菌作用も容易に行なえること、さらにこの産生さ
れた酵素が、デキストランとの複合体を形成することが
ないために反応中の酵素活性低下現象がほとんど見られ
ず、産生された酵素の酵素作用最適温度が４０℃と比較
的高いため、２％スクロースの酵素反応条件下における
ロイクロースの収率は対消費糖あたり３０％にもおよぶ
ことなどの有利な点を有し、従来のエル・メセンテロイ
デスの産生ずるデキストランスクラーゼによる製造法よ
りもはるかに優れた方法であることを見い出し、本発明
を完成するに至った。

〔問題点を解決するための手段〕

すなわち本発明は、ニス・ボヴイスをデキストランスク
ラーゼを誘導する炭素源を含む培地で嫌気的に培養し、
産生されたデキストランスクラーゼをスクロースと、あ
るいは受容体の存布下でスクロースと反応させることを
特徴とするニス−ボヴイスの産生ずるデキストランスク
ラーゼによるロイクロースの製造法に関する。

〔作用および実施例〕

本発明の方法に用いるデキストランスクラーゼ生産菌の
代表的なものとして、牛ルーメンから単離した１４８菌
株があげられる。

この菌株は運動性はなく、ダラム染色は陽性であり、菌
学的形状は連鎖状の球菌である。本菌株はまた、カタラ
ーゼテストには陰性を示し、グルコースがＥＭＰ経路を
経て右旋性の乳酸にまで代謝されるいわゆるホモ型乳酸
発酵を示す。

また、１０℃では生育がみられず、４５℃で生育を示し
、また６、５％のＮａＣｌ濃度やｐＨ９，８以上での生
育はみられない。さらに、澱粉を強力に分解し、４０％
胆汁培地（ｂｌｌｅ　ｂｌｏｏｄ　ａｇａｒ　ｓｅｄｌ
ｕｍ）で成育する性質がある。叙上の菌学的性質から、
１４８菌株は、バーシーズ・マニアル・オブ拳デタミネ
イティブ・バクテリオロジー第８版記載のニス・ボヴイ
スに属する菌株であることは明らかである。よって、本
菌株をニス・ボヴイスに属する　１４ｇ菌株とした。な
お本菌株は工業技術院微生物工業技術研究所に受託番号
微工研菌寄第９３９０号（以下、ＦＥＲＮ　Ｐ−９３９
０という）として寄託されている。

なお、菌学的性質は、きわめて変異しやすく、自然的な
あるいは人工的な変異（たとえば紫外線照射、ニトロソ
グアニジンなどの変異剤の使用など）により変異するこ
とは周知の事実であるため、人工変異株はもちろん、自
然変異株も含めて、ニス・ボヴイスに属する菌株はデキ
ストランスクラーゼ産生菌としてすべて本発明に使用す
ることができるものとする。

ロイクロースの製造にあたっては、まずニス・ボヴイス
に属するデキストランスクラーゼ産生菌をデキストラン
スクラーゼを誘導する炭素源を含む栄養培地に接種して
、嫌気的に培養し、デキストランスクラーゼをうる。

デキストランスクラーゼ産生菌の培養に用いる栄養培地
としてはスクロース、グルコースなどデキストランスク
ラーゼを誘導できる糖類などの炭素源、硫酸アンモニウ
ム、硝酸アンモニウムなどの無機窒素源またはイースト
エキス、肉エキスなどのを機窒素源、塩化ナトリウム、
リン酸塩、塩化カルシウムなどの無機塩、その他必要に
応じて、微量のビオチンなどのビタミン類などを添加し
た培地が通常用いられ、培養方法としては液体培養が好
ましい。

とくに、炭素源としてはデキストランスクラーゼの精製
の妨害因子となり、また酵素活性の低下現象を引き起こ
すデキストランが生じないようにグルコースを用いるの
が好ましいが、培養液をそのまま酵素反応に供するばあ
いは酵素産生効率の高いスクロースを用いてもよい。

デキストランスクラーゼは、たとえばニス・ボヴイスに
属する　１４８ｉｉｉ株を栄養培地に接種して、たとえ
ば培地中炭酸ガスを通じながら、温度は２５〜５０℃好
ましくは４０℃付近で、ｐＨはたとえばＮａ２ＣＯ３を
添加しながら５〜７に好ましくは６〜６．５に保持しな
がら培養し、対数増殖期の終期で培養を終了させること
により、培養液中にえられる。

えられた培養液はそのままでも酵素反応に供することが
できるが、通常は培養終了後遠心分離などの操作で菌体
を除き、上澄液を使用する。

さらに、その上澄液を通常の精製方法にしたがって精製
して使用してもよいし、さらにまた固定化して用いても
よい。

そのような精製方法としては、培養液中の酵素を直接セ
ファデックスゲル（５ｅｐｈａｄｅｘ”　　Ｇ−５０〜
２００、ファルマシア・ファインΦケミカルス社製）に
特異的に吸着させ、侠雑物を冷水にて洗浄除去したのち
、酵素を溶出させるものがあげられる。酵素はこの方法
で電気泳動的にほぼ単一の状態にまで精製され、しかも
この精製酵素は糖が全く検出されないという特異性の高
いものである。セファデックスゲルはＧ−５０〜２００
（品番）のものが酵素の吸着率が高く、最大でほぼ１０
０％近い吸着率を示す。吸着法にはバッチ法も可能であ
るが、好ましくはカラムを用いた吸着法が良好な結果を
示す。ゲルに対する酵素の最大吸着量を分析したところ
、セファデックスゲル（Ｇ−２００）　１　ｇ　（乾燥
重量換算）あたり　１８０，０００単位（単位の条件は
後述）の酵素が吸着され、これは２ｇの培地で産生され
る酵素量に相当する。また、洗浄に用いる冷水（５〜２
０℃）には、緩衝液などの適当な保護剤を添加すれば酵
素の安定化に効果がある。吸着された酵素の溶出には、
溶出液に様々な糖類を添加し、４５℃で溶出させれば効
果的であるが、糖類を添加しない溶出液による４５℃の
温水溶出でも約７Ｑ％の溶出が可能である。

このようなセファデックスゲルへの効率的な吸着現象や
、またえられた酵素から糖が検出されないことなどは本
菌株の産生ずる酵素に特異的なものであり、エル・メセ
ンテロイデスにはみられない現象である。

つぎに、このようにしてえられたデキストランスクラー
ゼを用いてロイクロースを製造する方法について説明す
る。

本発明において、ロイクロース製造の基質としてはスク
ロースを用いる。また、受容体としてフルクトースの存
在下でスクロースを用いると効率よく単一のオリゴ糖と
してロイクロースが生成する。添加する糖類の濃度は、
酵素単位を考慮して決定すればよい。

ただし、スクロースに対するフルクトースのモル濃度比
が低いばあいには高分子のデキストランが主産物として
生じ、フルクトースのモル比を上げるにしたがいデキス
トラン合成が抑制され、ロイクロースの生成割合が増加
する傾向にある。なお、スクロースに対するフルクトー
スのモル比を１：４より大きくするとデキストラン合成
が抑制されるだけでなく、ロイクロース合成そのものも
抑制されることから、効率的なロイクロース生産にはス
クロースとフルクトースとのモル濃度比は１：１〜１：
４であるのが好ましい。

反応は通常２０〜５０℃で行なえばよいが、反応速度、
酵素の安定性の面から４０℃付近で行なうのが好ましい
。反応液中のｐＨは５〜７好ましくは５．５〜６．５で
反応させるとよい。また、反応時間は酵素単位および基
質濃度で異なるが、スクロースがほぼ消費されつくした
時点で終了させる。その他反応促進のため微量の金属塩
、たとえば塩化カルシウムなどを添加することもできる
。

えられたロイクロースは活性炭カラムによって分離精製
することができる。たとえば、活性炭を詰めたカラムに
酵素反応液を流し、ロイクロースおよびデキストランを
活性炭に吸着させる。ついで蒸留水でその活性炭を充分
に洗浄したのち、２〜４％のエチルアルコール水溶液を
流して目的とするロイクロースを分離精製する。

つぎに本発明を実施例を用いてさらに詳しく説明するが
、本発明はもとよりこれら実施例のみに限定されるもの
ではない。

実施例においてえられた反応液を、以下の分析試験に供
した。

（高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣという
）による定量分析） イオン交換樹脂（ＩＲ（ＩＩ”　）　１２０）などで脱
イオンさせた酵素反応液０．４ｍｌをアセトニトリル１
．５ｍｌとメタノール０．２ｍｌとの混合液に撹拌しな
がら加え、ついで遠心骨Ｒ（１５，０００ｒｐｍ　ｘ　
５０１ｉｎ）後、上澄液１　ｍｌに内部標準液（０，２
％ラクトース水溶液）１ｍｌを加え、０．４５　、ｉａ
非水系フィルターでの処理によりＨＰＬＣに供するサン
プルを調製した。この１０μｇを）ＩＰＩ、Ｃに供し、
反応液中のフルクトース、グルコース、スクロース、パ
ラチノースおよびロイクロースを同定し、定量した。

測定は、以下の分析条件を用いてトリロータ■（商品名
、日本分光■製）で行ない、検出器として高感度示差屈
折計（センシュー科学■製）を使用した。なお、ロイク
ロースは約ｌ００２分後に溶出した。

分析条件； カ　ラ　ム：センシューφパックＮＩＩ＝　−１２５１
−Ｎ　（商品名、センシュー科学■ 製）、　４．Ｂφ×２５０關 流　　速：１ｍｌ／■ｉｎ カラム温度＝３０℃ 溶出液（容量比）ニアセトニトリル／水−またデキスト
ランスクラーゼの酵素活性は、７．５％スクロース溶液
（溶媒０．０５Ｍリン酸緩衝液ｐＨ５，５）中で１時間
酵素反応を行なわせ、遊離するフラクトースをソモギ法
（ツチャら、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ
、Ｂａｃｔ、）。

６４巻、５２１頁（１９８２）参照）で定量することに
より求められた。この反応条件で０．５２■／　ｍｌの
フラクトースを生成する酵素活性を１単位とした。

なお、反応液中に生成するデキストラン量は次の方法で
求められた。すなわち反応液１　ｍｌに蒸留水１　ｍｌ
を加え充分に撹拌後、この溶液１　ｍｌに無水エタノー
ル１　ｍｌを撹拌しながら加え、遠心分離（１５，００
０ｒｐｍ　ｘ　１５ｍ１ｎ）後、沈殿物を同エタノール
で２度洗浄し、えられた沈殿物を蒸留水で溶解しｆｏｗ
ｌに定容後、さらにここから０．５ｍｌを採取し１０ｍ
１に定容を行ない、フェノール硫酸法にて定量した糖量
よりデキストラン量を推算した。

実施例１ ２Ｒ容のフラスコにグルコース５０ｇ−、ホリベブトン
１０　ｇ　ｓイーストエキス５ｇ、硫安２ｇ。

重曹３ｇ、システィン塩酸塩ｏ、ｓｇ、リン酸−カリウ
ム２．２５ｇ、リン酸二カリウム２．２５ｇ５ＮａＣ＆
　０．９ｇ　％Ｍｇ５Ｏａ　　０．０９　ｇおよびＣａ
ＣＩｚｏ、０９　ｇを加え水道水１ｇに溶解した。つい
でフラスコに綿栓を施して１２０℃、１５分間殺菌を行
ない培地（以下、（Ａ）培地という）を調製した。

放冷後、炭酸ガスを無菌的に培地内に通じ、培養系を炭
酸ガスによる嫌気条件下にしたのち、同一組成培地にて
１０時間前に培養したニス・ボヴイス１４ｇ菌株（ＦＥ
ＲＮ　Ｐ−９３９０）　２０ｍ１を（Ａ）培地に植菌し
、温度４０℃で、Ｎａ２ＣＯｓを経時的に添加してｐＨ
を６〜６．５に調整しながら培養した。

培養は対数増殖期の終期に入ったところで終了させ遠心
分離（ｌｏ、０００ｒｐｍ　Ｘ２０ｍ１ｎ　）により上
澄液をえた。

上澄液を、−昼夜流水中で透析し、つぎに温度５〜１０
℃でセファデックスゲル（Ｇ−２００）カラム（３０φ
Ｘ　　３０ｈａ）に流速２　ｍｌ−／　ｗｉｎで流し、
酵素を吸着させたのち、０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
５，５）を同流速で流し洗浄を行なった。

さらにゲルをカラムから０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
５，５）でビーカー内に洗い流し、これを４５℃にまで
加温したのち、吸引濾過を行ない、濾紙上のゲルを４５
℃同緩衝液で洗浄し、よられた濾液（約５０ｍ１）を酵
素液として酵素反応に用いた。

なおこのようにしてえられた酵素は電気泳動的に単一の
ものであった。

この精製酵素を用いて、ロイクロース生産におよぼす温
度、ｐｉ、金属塩の影響を調べた。

酵素反応は、５％スクロース水溶液２．０ｍｌ、０．０
５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５，０〜７．０）２．０ｍｌ　
、酵素液（１００単位）　　０．５ｍｌ、および蒸留水
０．５ｍｌの組成で２４時間行なった。

温度の影響を調べるばあいは、ｐｎｓ、ｓのリン酸緩衝
液を用い、１０〜４５℃の範囲で酵素反応を行なわせた
。

ｐＨの影響をみるばあいは、ｐＨ５，０〜７．０のリン
酸緩衝液を用い、４０℃で反応を進めた。

また金属塩の影響をみるばあいは、蒸留水０．５ｍｌの
かわりに０．００５Ｍの各種金属塩の水溶液ＣＣａＣｌ
２　、ＨｇＣｆ１２　、ＨｎＣＩ２　、Ｐｅ５Ｏａ　、
ＣｏＣｌ２、Ｃｕ５Ｏ４）　　０．５ｍｌを用い、さら
にｐＨ５，５のリン酸緩衝液のもと４０℃で反応を行な
わせた。

酵素反応によりえられたオリゴ糖は活性炭カラムを用い
て分離精製され、その加水分解物についてＨＰＬＣで分
析した結果グルコースとフルクトースよりなる三糖類で
あることが明らかにさ　　□れた。またこのオリゴ糖は
、同じくグルコースとフルクトースよりなる三糖類であ
るスクロースやパラチノースともクロマト的に明らかに
異なっており、ＨＰＬＣにより、ロイクロースと同定さ
れた。

なお、えられた反応液中に残存するスクロースと生成し
たロイクロースをＨＰＬＣで、また生成したデキストラ
ンを前記フェノール硫酸法で分析し、その結果を、生成
したロイクロース量のスクロースの消費量および初期添
加量に対する収率（対糖収率）とともに第１表に示す。

〔以下余白〕

実施例２ 実施例１と同様に、精製酵素を用い、ロイクロース生産
における基質（スクロース）濃度と、受容体（フルクト
ース）添加量の影響をみた。

酵素反応は、スクロース水溶液またはスクロース・フル
クトース混合水溶液２．０ｍｌ、０．１２５Ｈリン酸緩
衝液（ｐＨ５，５）２．０ｍｌ、酵素液（１００単位）
０．５ｍｌ、および蒸留水０　、５　ｍｌの組成で、４
０℃、２４時間行なった。

基質濃度の影響は、１６２５〜２５％のスクロース水溶
液を最終濃度が第２表に示す濃度になるように用いて調
べた。

また、受容体添加量の影響は、スクロース最終濃度が５
％と１０％のばあいめそれぞれについてスクロースに対
してフルクトースがモル濃度比で１　：　　０．２５〜
１：４の範囲で混合している水溶液を用いて調べた。

いずれの反応系においても、単一のオリゴ糖が生成した
が、受容体添加量に比べ受容体添加量ではオリゴ糖の生
成率が高い結果となった。

酵素反応によりえられたオリゴ糖は活性炭カラムを用い
て分離精製され、その加水分解物についてＨＰＬＣで分
析した結果グルコースとフルクトースよりなる三糖類で
あることが明らかにされた。またこのオリゴ糖は、同じ
くグルコースとフルクトースよりなる三糖類であるスク
ロースやパラチノースともクロマト的に明らかに異なっ
ており、ＨＰＬＣにより、ロイクロースと同定された。

なお、えられた反応液中に残存するスクロースと生成し
たロイクロースをＨＰＬＣで、また生成したデキストラ
ンを前記フェノール硫酸法で分析し、その結果を、生成
したロイクロース量のスクロースの消費量および初期添
加量に対する収率（対糖収率）とともに第２表に示す。

〔以下余白〕

〔発明の効果〕 本発明の方法は、医薬、食品工業の分野での幅広い用途
が期待されるロイクロースを高収量でしかも迅速に製造
しうるという効果を奏する。

また、本発明の方法は、デキストランスクラーゼ産生菌
として、その培養に高価な栄養成分を必要としないスト
レプトコッカス・ボヴィスを使用するので経済的にすぐ
れている。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　ストレプトコッカス・ボヴィスをデキストランスク
   ラーゼを誘導する炭素源を含む培地で嫌気的に培養し、
   産生されたデキストランスクラーゼをスクロースと、あ
   るいは受容体の存在下でスクロースと反応させることを
   特徴とするストレプトコッカス・ボヴィスの産生するデ
   キストランスクラーゼによるロイクロースの製造法。 ２　前記ストレプトコッカス・ボヴィスとしてストレプ
   トコッカス・ボヴィスに属する１４８菌株（ＦＥＲＭ　
   Ｐ−９３９０）を用いる特許請求の範囲第１項記載の製
   造法。 ３　前記炭素源がグルコースまたはスクロースである特
   許請求の範囲第１項または第２項記載の製造法。 ４　前記受容体がフルクトースである特許請求の範囲第
   １項または第２項記載の製造法。 ５　前記スクロースとフルクトースとのモル濃度比が１
   ：１〜１：４である特許請求の範囲第４項記載の製造法
   。