JPH0568239B2 - - Google Patents
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Description
本発明は5量体以上のN−アセチルキトオリゴ
糖の製造方法に関する。 N−アセチルキトオリゴ糖は臨床検査薬におけ
るリゾチームやβ−N−アセチルグルコサミニダ
ーゼの測定基質として有用である。特にリゾチー
ムの基質としては、5量体以上のN−アセチルキ
トオリゴ糖が極めて有用であり、また最近では6
量体であるN−アセチルキトヘキサオークの免疫
機能増強作用、抗腫瘍効果などが報告され注目を
集めている。 しかしながら現在、5量体以上のN−アセチル
キトオリゴ糖は、大量生産することが非常に困難
である。例えば従来からの酸によるキチンの限定
加水分解では、2〜4量体は比較的高い収率で得
られるが5量体以上N−アセチルキトオリゴ糖の
収率は非常に低いものである。そこで本発明者等
は、5量体以上のN−アセチルキトオリゴ糖の大
量生産を目的に種々酵素を検索したところ、ノカ
ルデイア属に属する微生物の生産するキチナーゼ
は、3量体以上のN−アセチルキトオリゴ糖に作
用し、糖転移反応により効率良く5量体以上のN
−アセチルキトオリゴ糖を生産することを見い出
し本発明を完成した。従来、N−アセチルキトオ
リゴ糖のリゾチームによる糖転移反応によつて得
られるオリゴ糖についての報告はあるがキチナー
ゼについての糖転移反応による報告は未だ見当ら
ない。本発明によれば、N−アセチルキトオリゴ
糖に対して、リゾチームよりも強い糖転移反応性
を有しており、効率良く5量体以上のN−アセチ
ルキトオリゴ糖が生産できる。すなわち本発明は
5量体以上のN−アセチルキトオリゴ糖の製造法
を提供するものである。 本発明の方法に於いて用いられる酵素は、ノカ
ルデイア属に属する微生物の生産するキチナーゼ
であつて次に示す如き理化学的性質を有する。 (a) 作用 N−アセチルキトオリゴ糖に作用し強い糖転
移反応を起こす。本酵素の酵素量に対し過剰の
N−アセチルキトオリゴ糖を作用させた場合、
糖転移反応により重合度の高いN−アセチルキ
トオリゴ糖を生成する。またキチンまたはN−
アセチルキトオリゴ糖に作用し、これを加水分
解する。 (b) 至適PH コロイドキチンを基質として40℃で反応を行
つた場合、本酵素はPH5.5に至適PHを有する。 (c) PH安定性 本酵素は4℃で24時間の処理においてPH5.0
〜8.0で安定である。 (d) 至適温度 コロイドキチンを基質としてPH5.6で反応を
行なつた場合、本酵素は70℃付近に至適PHを有
する。 (e) 熱安定性 本酵素はPH5.6で30分間の処理において50℃
以下で安定である。 (f) 分子量 SDS−デイスク電気泳動法による本酵素の分
子量は約44000である。 (g) 等電点 アクリルアミドゲル焦点電気泳動による本酵
素の等電点はPH9.1付近である。 上記の如き性質を有するキチナーゼは、次のよ
うにして製造することができる。 酵素生産に用いるノカルデイア属に属するキチ
ナーゼ生産菌としては、ノカルデイア属に属しキ
チナーゼを生産する菌であればいずれでも良い。
その例としてはたとえばノカルデイア・オリエン
タリス(Nocardia Orientalis)が挙げられ、具
体的にはノカルデイア・オリエンタリス
IFO12360、IFO12361、IFO12362、IFO12806、
JCM4235、JCM4600などが挙げられる。上記
IFO12360、IFO12361、IFO12362、IFO12806株
は、財団法人発酵研究所のリスト・オブ・カルチ
ユアーズ1984年第7版(Institute for Fermen−
tation、Osaka、List of Cultures、1984、7th
Edition)に掲載されている。上記JCM4235、
JCM4600株は、理化学研究所微生物系統保存施
設のカタログ・オブ・ストレインズ1984年第2版
(Japan Collection of Micro−organisms、
Catalogue of Stains、1984、2ndEdition)に掲
載されている。本発明に、用いられるキチナーゼ
はノカルデイア属に属するキチナーゼ生産菌を培
地に培養し、培養物中に生産せしめることにより
製造される。培養に用いられる培地は、上記微生
物が利用し得る栄養源を含むものであればいづれ
でも良いが、キチナーゼの生産能をより高めるに
は誘導基質であるキチンを添加することが好まし
い。例えばコロイドキチン0.5%、N−アセチル
グルコサミン0.5%、ペプトン0.2%、酵母エキス
0.01%、リン酸2水素カリウム0.03%、リン酸1
水素カリウム0.07%、硫酸マグネシウム・7水和
物0.05%を含有するもの(PH7.0に調整)が挙げ
られる。液体培地でも固体培地でも良いが、大量
に行う場合には液体培地が好ましい。培養の方法
は振盪培養が好ましい。培養の条件は培地の組
成、菌株の種類によつて異なるが、培養温度は20
〜35℃、さらに好ましくは25〜30℃、培養時間は
2〜7日、さらに好ましくは2〜5日である。目
的とするキチナーゼは通常菌体外に蓄積されるの
で周知の分離、精製手段により培養物から分離、
精製される。たとえば、培養物から遠心分離ある
いは濾過により菌体を除去した後、培養濾液に硫
酸アンモニウムを加え塩析を行なう。塩析により
析出した蛋白質を遠心分離により採取し、10mM
酢酸緩衝液(PH5.0)中で透析し、これを遠心分
離してその上清液を粗酵素溶液とする。粗酵素溶
液中には目的とするキチナーゼの他、キトビアー
ゼや他の理化学的性質を有するキチナーゼなどが
含まれている。粗酵素溶液から目的とするキチナ
ーゼの分離、精製はSP−セフアデツクスC−50
(フアルマシア社製)のイオン交換クロマトグラ
フイーおよびバイオゲルP−60(バイオラド社製)
への特異的吸着性を利用して行うことができる。 このようにして得られるキチナーゼの活性や糖
転移反応は次のようにして測定する。 (1) キチナーゼの活性 0.2%コロイドキチンを含む0.2M酢酸緩衝液
(PH5.6)2.0mlに酵素液を加えて40℃で10分間
反応させる。反応後シヤール試薬(0.5gのフ
エリシアン化カリウムを0.5M炭酸ナトリウム
溶液1に溶解)3.0mlを加え沸騰湯中で15分
間加熱する。水で冷却後遠心分離して不溶物を
除き上清液の420nmにおける吸光度の減少を
測定する。還元糖の生成はN−アセチルグルコ
サミンを用いた標準曲線から求める。酵素活性
1Uは1分間に1μmoleのN−アセチルグルコサ
ミンを生成する酵素量とした。 (2) 糖転移反応 5%のN−アセチルキトテトラオースを含む
0.1Mリン酸緩衝液(PH5.6)2mlに酵素溶液を
加えて40℃で48時間反応させる。一定時間ごと
に反応液を採取し沸騰湯中で10分間加熱し反応
を停止させる。これら溶液を高速液体クロマト
グラフイーに供し、反応生成物を確認した。 本発明の原料としては、キチン部分加水分解
物、N−アセチルキトオリゴ糖等が用いられる。
このキチン部分加水分解は、キチンを濃塩酸で40
℃で2〜3時間加水分解しアルカリで中和した
後、活性炭に吸着させアルコールで溶出すること
によつて調製できる。キチン部分加水分解物は、
2〜8量体のN−アセチルキトオリゴ糖を含み、
それぞれのN−アセチルキトオリゴ糖は、上記ア
ルコール溶出時に、アルコール濃度勾配をかけて
溶出したり、あるいは、ゲル濾過や高速液体クロ
マトグラフイー等の手段により分離し調整するこ
とができる。 本発明で上記原料と上記キチナーゼを作用させ
るには、キチン部分加水分解物あるいはN−アセ
チルキトオリゴ糖を0.5〜30重量%を含むものを
基質とし、PH3〜7、温度30〜60℃で、酵素量は
基質1g当たり50〜2000Uを用いて反応させると
良い。反応時間は、基質量、反応PH、温度、酵素
量等によつて大きく異なるが、通常30分〜48時間
である。かくして酵素反応を終了した反応混合物
は沸騰湯中で10分加熱し反応を停止させる。 上記酵素反応により5量体以上のN−アセチル
キトオリゴ糖を多く含む反応混合物が得られる。
このようにして得られる反応混合物からの5量体
以上のN−アセチルキトオリゴ糖の分離、精製
は、周知の分離、精製手段により行なうことがで
きる。たとえば、活性炭に反応混合物を吸着さ
せ、アルコール濃度勾配法により分離溶出させる
方法や、ゲル濾過、高速液体クロマトグラフイー
等の手段により分離、精製することができる。 次に、本発明の参考例及び実施例について更に
具体的に説明するが、かかる説明によつて本発明
が何ら限定されるものでないことは勿論である。 参考例 1 キチナーゼの調製 グルコース1%、ペプトン1%、酵母エキス
0.5%、リン酸2水素カリウム0.03%、リン酸1
水素カリウム0.07%、硫酸マグネシウム・7水和
物0.05%(PH7.0に調整)の組成の前培養培地10
mlを含む100ml容フラスコに、ノカルデイア・オ
リエンタリスIFO12806の一白金耳を接種し、30
℃で1日間振盪培養した。 次にコロイドチキン0.5%、N−アセチルグル
コサミン0.5%、ペプトン0.2%、酵母エキス0.01
%、リン酸2水素カリウム0.03%、リン酸1水素
カリウム0.07%、硫酸マグネシウム・7水和物
0.05%の組成の本培養培地150mlを含む1000ml容
フラスコに、前記前培養終了液を接種し30℃で3
日間振盪培養した。このような操作により得られ
た培養液450ml(150ml×3)を10000rpm、15分
間遠心分離して菌体を除き、上清液を75%飽和と
なるように固型硫安を加え4℃で塩析を行なつ
た。塩析により沈澱した蛋白質を4℃で
8000rpm、15分間遠心分離して採取し、これを少
量の水に溶解し10mM酢酸緩衝液(PH5.0)に透
析した。透析液を4℃で10000rpm、15分間遠心
分離して上清液30mlを得、これを粗酵素液とし
た。 粗酵素液30mlを10mM酢酸緩衝液(PH5.0)で
平衡化したSP−セフアデツクスC−50(フアルマ
シア社製)のカラム(2.5×40cm)に吸着させた。
溶出は0→0.5Mの食塩を含む同上緩衝液による
塩濃度勾配溶出法で行なつた。なお流速は60ml/
hrであつた。ここで得られた活性画分149mlに80
%飽和となるように固形硫安を加え4℃で塩析を
行なつた。塩析により沈澱した蛋白質を4℃で
8000rpm、15分間遠心分離して採取し、0.5M食
塩を含む50mM酢酸緩衝液(PH5.6)に透析した。
透析液を4℃で10000rpm、15分間遠心分離して
上清液3mlを得た。上記で得られた上清液3mlを
0.5M食塩を含む50mM酢酸緩衝液(PH5.6)で平
衡化したバイオゲルP−60(バイオラド社製)の
カラム(2.2×77cm)に供した。溶出は同上緩衝
液により行ない、バイオゲルP−60への特異的吸
着性により遅れて分離された活性画分100mlを得
た。なお流速は12.8ml/hrであつた。以上の精製
の要約を第1表に示す。このようにして得られた
キチナーゼは、SDS−デイスク電気泳動で均一で
あつた。
糖の製造方法に関する。 N−アセチルキトオリゴ糖は臨床検査薬におけ
るリゾチームやβ−N−アセチルグルコサミニダ
ーゼの測定基質として有用である。特にリゾチー
ムの基質としては、5量体以上のN−アセチルキ
トオリゴ糖が極めて有用であり、また最近では6
量体であるN−アセチルキトヘキサオークの免疫
機能増強作用、抗腫瘍効果などが報告され注目を
集めている。 しかしながら現在、5量体以上のN−アセチル
キトオリゴ糖は、大量生産することが非常に困難
である。例えば従来からの酸によるキチンの限定
加水分解では、2〜4量体は比較的高い収率で得
られるが5量体以上N−アセチルキトオリゴ糖の
収率は非常に低いものである。そこで本発明者等
は、5量体以上のN−アセチルキトオリゴ糖の大
量生産を目的に種々酵素を検索したところ、ノカ
ルデイア属に属する微生物の生産するキチナーゼ
は、3量体以上のN−アセチルキトオリゴ糖に作
用し、糖転移反応により効率良く5量体以上のN
−アセチルキトオリゴ糖を生産することを見い出
し本発明を完成した。従来、N−アセチルキトオ
リゴ糖のリゾチームによる糖転移反応によつて得
られるオリゴ糖についての報告はあるがキチナー
ゼについての糖転移反応による報告は未だ見当ら
ない。本発明によれば、N−アセチルキトオリゴ
糖に対して、リゾチームよりも強い糖転移反応性
を有しており、効率良く5量体以上のN−アセチ
ルキトオリゴ糖が生産できる。すなわち本発明は
5量体以上のN−アセチルキトオリゴ糖の製造法
を提供するものである。 本発明の方法に於いて用いられる酵素は、ノカ
ルデイア属に属する微生物の生産するキチナーゼ
であつて次に示す如き理化学的性質を有する。 (a) 作用 N−アセチルキトオリゴ糖に作用し強い糖転
移反応を起こす。本酵素の酵素量に対し過剰の
N−アセチルキトオリゴ糖を作用させた場合、
糖転移反応により重合度の高いN−アセチルキ
トオリゴ糖を生成する。またキチンまたはN−
アセチルキトオリゴ糖に作用し、これを加水分
解する。 (b) 至適PH コロイドキチンを基質として40℃で反応を行
つた場合、本酵素はPH5.5に至適PHを有する。 (c) PH安定性 本酵素は4℃で24時間の処理においてPH5.0
〜8.0で安定である。 (d) 至適温度 コロイドキチンを基質としてPH5.6で反応を
行なつた場合、本酵素は70℃付近に至適PHを有
する。 (e) 熱安定性 本酵素はPH5.6で30分間の処理において50℃
以下で安定である。 (f) 分子量 SDS−デイスク電気泳動法による本酵素の分
子量は約44000である。 (g) 等電点 アクリルアミドゲル焦点電気泳動による本酵
素の等電点はPH9.1付近である。 上記の如き性質を有するキチナーゼは、次のよ
うにして製造することができる。 酵素生産に用いるノカルデイア属に属するキチ
ナーゼ生産菌としては、ノカルデイア属に属しキ
チナーゼを生産する菌であればいずれでも良い。
その例としてはたとえばノカルデイア・オリエン
タリス(Nocardia Orientalis)が挙げられ、具
体的にはノカルデイア・オリエンタリス
IFO12360、IFO12361、IFO12362、IFO12806、
JCM4235、JCM4600などが挙げられる。上記
IFO12360、IFO12361、IFO12362、IFO12806株
は、財団法人発酵研究所のリスト・オブ・カルチ
ユアーズ1984年第7版(Institute for Fermen−
tation、Osaka、List of Cultures、1984、7th
Edition)に掲載されている。上記JCM4235、
JCM4600株は、理化学研究所微生物系統保存施
設のカタログ・オブ・ストレインズ1984年第2版
(Japan Collection of Micro−organisms、
Catalogue of Stains、1984、2ndEdition)に掲
載されている。本発明に、用いられるキチナーゼ
はノカルデイア属に属するキチナーゼ生産菌を培
地に培養し、培養物中に生産せしめることにより
製造される。培養に用いられる培地は、上記微生
物が利用し得る栄養源を含むものであればいづれ
でも良いが、キチナーゼの生産能をより高めるに
は誘導基質であるキチンを添加することが好まし
い。例えばコロイドキチン0.5%、N−アセチル
グルコサミン0.5%、ペプトン0.2%、酵母エキス
0.01%、リン酸2水素カリウム0.03%、リン酸1
水素カリウム0.07%、硫酸マグネシウム・7水和
物0.05%を含有するもの(PH7.0に調整)が挙げ
られる。液体培地でも固体培地でも良いが、大量
に行う場合には液体培地が好ましい。培養の方法
は振盪培養が好ましい。培養の条件は培地の組
成、菌株の種類によつて異なるが、培養温度は20
〜35℃、さらに好ましくは25〜30℃、培養時間は
2〜7日、さらに好ましくは2〜5日である。目
的とするキチナーゼは通常菌体外に蓄積されるの
で周知の分離、精製手段により培養物から分離、
精製される。たとえば、培養物から遠心分離ある
いは濾過により菌体を除去した後、培養濾液に硫
酸アンモニウムを加え塩析を行なう。塩析により
析出した蛋白質を遠心分離により採取し、10mM
酢酸緩衝液(PH5.0)中で透析し、これを遠心分
離してその上清液を粗酵素溶液とする。粗酵素溶
液中には目的とするキチナーゼの他、キトビアー
ゼや他の理化学的性質を有するキチナーゼなどが
含まれている。粗酵素溶液から目的とするキチナ
ーゼの分離、精製はSP−セフアデツクスC−50
(フアルマシア社製)のイオン交換クロマトグラ
フイーおよびバイオゲルP−60(バイオラド社製)
への特異的吸着性を利用して行うことができる。 このようにして得られるキチナーゼの活性や糖
転移反応は次のようにして測定する。 (1) キチナーゼの活性 0.2%コロイドキチンを含む0.2M酢酸緩衝液
(PH5.6)2.0mlに酵素液を加えて40℃で10分間
反応させる。反応後シヤール試薬(0.5gのフ
エリシアン化カリウムを0.5M炭酸ナトリウム
溶液1に溶解)3.0mlを加え沸騰湯中で15分
間加熱する。水で冷却後遠心分離して不溶物を
除き上清液の420nmにおける吸光度の減少を
測定する。還元糖の生成はN−アセチルグルコ
サミンを用いた標準曲線から求める。酵素活性
1Uは1分間に1μmoleのN−アセチルグルコサ
ミンを生成する酵素量とした。 (2) 糖転移反応 5%のN−アセチルキトテトラオースを含む
0.1Mリン酸緩衝液(PH5.6)2mlに酵素溶液を
加えて40℃で48時間反応させる。一定時間ごと
に反応液を採取し沸騰湯中で10分間加熱し反応
を停止させる。これら溶液を高速液体クロマト
グラフイーに供し、反応生成物を確認した。 本発明の原料としては、キチン部分加水分解
物、N−アセチルキトオリゴ糖等が用いられる。
このキチン部分加水分解は、キチンを濃塩酸で40
℃で2〜3時間加水分解しアルカリで中和した
後、活性炭に吸着させアルコールで溶出すること
によつて調製できる。キチン部分加水分解物は、
2〜8量体のN−アセチルキトオリゴ糖を含み、
それぞれのN−アセチルキトオリゴ糖は、上記ア
ルコール溶出時に、アルコール濃度勾配をかけて
溶出したり、あるいは、ゲル濾過や高速液体クロ
マトグラフイー等の手段により分離し調整するこ
とができる。 本発明で上記原料と上記キチナーゼを作用させ
るには、キチン部分加水分解物あるいはN−アセ
チルキトオリゴ糖を0.5〜30重量%を含むものを
基質とし、PH3〜7、温度30〜60℃で、酵素量は
基質1g当たり50〜2000Uを用いて反応させると
良い。反応時間は、基質量、反応PH、温度、酵素
量等によつて大きく異なるが、通常30分〜48時間
である。かくして酵素反応を終了した反応混合物
は沸騰湯中で10分加熱し反応を停止させる。 上記酵素反応により5量体以上のN−アセチル
キトオリゴ糖を多く含む反応混合物が得られる。
このようにして得られる反応混合物からの5量体
以上のN−アセチルキトオリゴ糖の分離、精製
は、周知の分離、精製手段により行なうことがで
きる。たとえば、活性炭に反応混合物を吸着さ
せ、アルコール濃度勾配法により分離溶出させる
方法や、ゲル濾過、高速液体クロマトグラフイー
等の手段により分離、精製することができる。 次に、本発明の参考例及び実施例について更に
具体的に説明するが、かかる説明によつて本発明
が何ら限定されるものでないことは勿論である。 参考例 1 キチナーゼの調製 グルコース1%、ペプトン1%、酵母エキス
0.5%、リン酸2水素カリウム0.03%、リン酸1
水素カリウム0.07%、硫酸マグネシウム・7水和
物0.05%(PH7.0に調整)の組成の前培養培地10
mlを含む100ml容フラスコに、ノカルデイア・オ
リエンタリスIFO12806の一白金耳を接種し、30
℃で1日間振盪培養した。 次にコロイドチキン0.5%、N−アセチルグル
コサミン0.5%、ペプトン0.2%、酵母エキス0.01
%、リン酸2水素カリウム0.03%、リン酸1水素
カリウム0.07%、硫酸マグネシウム・7水和物
0.05%の組成の本培養培地150mlを含む1000ml容
フラスコに、前記前培養終了液を接種し30℃で3
日間振盪培養した。このような操作により得られ
た培養液450ml(150ml×3)を10000rpm、15分
間遠心分離して菌体を除き、上清液を75%飽和と
なるように固型硫安を加え4℃で塩析を行なつ
た。塩析により沈澱した蛋白質を4℃で
8000rpm、15分間遠心分離して採取し、これを少
量の水に溶解し10mM酢酸緩衝液(PH5.0)に透
析した。透析液を4℃で10000rpm、15分間遠心
分離して上清液30mlを得、これを粗酵素液とし
た。 粗酵素液30mlを10mM酢酸緩衝液(PH5.0)で
平衡化したSP−セフアデツクスC−50(フアルマ
シア社製)のカラム(2.5×40cm)に吸着させた。
溶出は0→0.5Mの食塩を含む同上緩衝液による
塩濃度勾配溶出法で行なつた。なお流速は60ml/
hrであつた。ここで得られた活性画分149mlに80
%飽和となるように固形硫安を加え4℃で塩析を
行なつた。塩析により沈澱した蛋白質を4℃で
8000rpm、15分間遠心分離して採取し、0.5M食
塩を含む50mM酢酸緩衝液(PH5.6)に透析した。
透析液を4℃で10000rpm、15分間遠心分離して
上清液3mlを得た。上記で得られた上清液3mlを
0.5M食塩を含む50mM酢酸緩衝液(PH5.6)で平
衡化したバイオゲルP−60(バイオラド社製)の
カラム(2.2×77cm)に供した。溶出は同上緩衝
液により行ない、バイオゲルP−60への特異的吸
着性により遅れて分離された活性画分100mlを得
た。なお流速は12.8ml/hrであつた。以上の精製
の要約を第1表に示す。このようにして得られた
キチナーゼは、SDS−デイスク電気泳動で均一で
あつた。
【表】
実施例 1
キチンの加水分解により得られたN−アセチル
キトテトラオース1gを40mlの0.1Mリン酸緩衝
液(PH5.6)に溶解し40℃に保つた後、参考例1
と同様の方法で調製したキチナーゼを400U添加
して、40℃で6時間反応させた。反応終了後、
100℃で10分間加熱し反応を停止させる。得られ
た反応混合物はイオン交換樹脂による脱塩を行な
い、さらに減圧濃縮後凍結乾燥することにより
0.95gの白色粉末となつた。この白色粉末の生成
物組成は、高速液体クロマトグラフイーによつて
確認したところ、N−アセチルキトヘキサオース
18%、N−アセチルキトテトラオース60%、N−
アセチルキトビオース20%であつた。 実施例 2 キチンの加水分解により得られたN−アセチル
キトペンタオース1gを20mlの0.1Mリン酸緩衝
液(PH5.6)に溶解し40℃に保つた後、参考例1
と同様の方法で調製したキチナーゼを200U添加
して、40℃で15時間反応させた。反応終了後、
100℃で10分間加熱し反応を停止させる。得られ
た反応混合物はイオン交換樹脂による脱塩を行な
い、さらに減圧濃縮後凍結乾燥することにより
0.92gの白色粉末となつた。この白色粉末の生成
物組成は、高速液体クロマトグラフイーによつて
確認したところ、N−アセチルキトヘプタオース
5%、N−アセチルキトペンタオース33%、N−
アセチルキトテトラオース10%、N−アセチルキ
トトリオース31%、N−アセチルキトビオース20
%、N−アセチルグルコサミン1%であつた。 実施例 3 キチンの加水分解により得られたN−アセチル
キトテトラオース10gを160mlの0.1Mリン酸緩衝
液(PH5.6)に溶解し40℃に保つた後、参考例1
と同様の方法で調製したキチナーゼを2300U添加
して、40℃で26時間反応させた。反応終了後、
100℃で10分間加熱し反応を停止させる。得られ
た反応混合物は、活炭カラム(4.4×100cm)に供
して生成したオリゴ糖を吸着させ、0→50%のエ
タノール濃度勾配法で、溶出液16を用いてオリ
ゴ糖を分離溶出した。次いで得られたそれぞれの
画分を減圧濃縮後、凍結乾燥して、N−アセチル
キトヘキサオース1.6g、その他、N−アセチル
キトビオース2.5g、N−アセチルキトテトラオ
ース5.5gを得た。
キトテトラオース1gを40mlの0.1Mリン酸緩衝
液(PH5.6)に溶解し40℃に保つた後、参考例1
と同様の方法で調製したキチナーゼを400U添加
して、40℃で6時間反応させた。反応終了後、
100℃で10分間加熱し反応を停止させる。得られ
た反応混合物はイオン交換樹脂による脱塩を行な
い、さらに減圧濃縮後凍結乾燥することにより
0.95gの白色粉末となつた。この白色粉末の生成
物組成は、高速液体クロマトグラフイーによつて
確認したところ、N−アセチルキトヘキサオース
18%、N−アセチルキトテトラオース60%、N−
アセチルキトビオース20%であつた。 実施例 2 キチンの加水分解により得られたN−アセチル
キトペンタオース1gを20mlの0.1Mリン酸緩衝
液(PH5.6)に溶解し40℃に保つた後、参考例1
と同様の方法で調製したキチナーゼを200U添加
して、40℃で15時間反応させた。反応終了後、
100℃で10分間加熱し反応を停止させる。得られ
た反応混合物はイオン交換樹脂による脱塩を行な
い、さらに減圧濃縮後凍結乾燥することにより
0.92gの白色粉末となつた。この白色粉末の生成
物組成は、高速液体クロマトグラフイーによつて
確認したところ、N−アセチルキトヘプタオース
5%、N−アセチルキトペンタオース33%、N−
アセチルキトテトラオース10%、N−アセチルキ
トトリオース31%、N−アセチルキトビオース20
%、N−アセチルグルコサミン1%であつた。 実施例 3 キチンの加水分解により得られたN−アセチル
キトテトラオース10gを160mlの0.1Mリン酸緩衝
液(PH5.6)に溶解し40℃に保つた後、参考例1
と同様の方法で調製したキチナーゼを2300U添加
して、40℃で26時間反応させた。反応終了後、
100℃で10分間加熱し反応を停止させる。得られ
た反応混合物は、活炭カラム(4.4×100cm)に供
して生成したオリゴ糖を吸着させ、0→50%のエ
タノール濃度勾配法で、溶出液16を用いてオリ
ゴ糖を分離溶出した。次いで得られたそれぞれの
画分を減圧濃縮後、凍結乾燥して、N−アセチル
キトヘキサオース1.6g、その他、N−アセチル
キトビオース2.5g、N−アセチルキトテトラオ
ース5.5gを得た。
Claims (1)
- 1 キチンの加水分解により得られた4〜5量体
のN−アセチルキトオリゴ糖を基質とし、これ
に、ノカルデイア属の生産するキチナーゼを作用
させ、その糖転移反応により、重合度の高いN−
アセチルキトオリゴ糖を得ることを特徴とする、
酵素によるN−アセチルキトオリゴ糖の製造法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP60286665A JPS62146598A (ja) | 1985-12-19 | 1985-12-19 | 酵素によるn−アセチルキトオリゴ糖の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP60286665A JPS62146598A (ja) | 1985-12-19 | 1985-12-19 | 酵素によるn−アセチルキトオリゴ糖の製造法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS62146598A JPS62146598A (ja) | 1987-06-30 |
JPH0568239B2 true JPH0568239B2 (ja) | 1993-09-28 |
Family
ID=17707365
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP60286665A Granted JPS62146598A (ja) | 1985-12-19 | 1985-12-19 | 酵素によるn−アセチルキトオリゴ糖の製造法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS62146598A (ja) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5262310A (en) * | 1991-05-31 | 1993-11-16 | Akebono Brake Industry Co, Ltd. | Enzymatic decomposition method of chitin-containing materials |
JP4709343B2 (ja) * | 2000-03-10 | 2011-06-22 | フード インダストリー リサーチ アンド ディヴェロップメント インスティテュート | 細胞の酸化窒素の生産を阻害するためのキチン質物質の使用 |
JP5553295B2 (ja) * | 2009-02-04 | 2014-07-16 | 焼津水産化学工業株式会社 | 高級n−アセチルキトオリゴ糖の製造方法 |
-
1985
- 1985-12-19 JP JP60286665A patent/JPS62146598A/ja active Granted
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPS62146598A (ja) | 1987-06-30 |
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