JPH068322B2 - ペクチンの製造法 - Google Patents

ペクチンの製造法

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Description

【発明の詳細な説明】 （イ）産業上の利用分野 この発明はバチルス属に属する微生物を利用して、ペク
チンを構成成分として含有する植物からペクチンを単離
する方法に関する。ペクチンは、高等植物に高含量で含
有されている。食品，医薬品，化粧品の原料に用いられ
る産業上有用な多糖類である。
（ロ）従来の技術と問題点 従来、ペクチンの製造は、ペクチンを構成成分とする植
物組織をキレート剤、酸などの存在下で熱抽出を行うこ
とにより行われてきた。しかしながら、このような方法
では、ペクチンの単離が困難で、用いる装置や残渣の処
理にも種々の問題があった。
上記問題点を改善する方法として、ペクチンを構成成分
とする植物組織に作用してペクチンを遊離する活性を有
する酵素を産生する微生物が見出され、かかる微生物ま
たはその培養液もしくはその処理物を、前記植物組織に
作用させて、ペクチンを遊離させて採取する方法が提案
されている（特公昭55-46157号，同61-50961号）。しか
しこれらの方法に用いられている微生物が産生するペク
チン遊離酵素のプロトペクチナーゼは、ペクチンを植物
組織から遊離するだけでなく、いずれも一旦遊離された
ペクチンを限定分解する酵素であった（発酵と工業、第
37巻，928〜938頁，1979年参照）。すなわち、ペクチン
を遊離する活性（プロトペクチーゼ活性）と遊離のペク
チンを分解する活性（ポリガラクチュロナーゼ活性）を
有していた。従ってペクチンが遊離されているときに、
遊離されたペクチンの分解が併行しておこり、ペクチン
の収率を高めるべく酵素反応を充分に行うとペクチンの
分解がおこり品質が低下する問題点がある。
（ハ）問題点を解決するための手段と作用 この発明の発明者は、上記問題点を改善するために鋭意
研究の結果、ペクチンを構成成分とする植物に作用して
ペクチンを遊離するが、遊離のペクチンを実質的に分解
しない酵素を産生する一群の微生物を見出し、この発明
に到達した。すなわちこの発明は、バチルス属に属し植
物組織よりペクチンを遊離する活性をもつがペクチンを
分解する活性を実質的にもたない微生物、またはその培
養液もしくはその処理物を、ペクチンを構成成分として
含有する植物組織に作用させて該組織からペクチンを遊
離させ、採取することを特徴とするペクチンの製造法を
提供するものである。
この発明に用いる微生物はバチルス属に属し、具体例を
挙げれば次のとおりである。
バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)、バチルス
・アミロリクェファシエンス(Bacillus amyloliquefaci
ens)、バチルス・サーキュランス(Bacillus circulan
s)、バチルス・コアギュランス(Bacillus coagulans)、
バチルス・ファームス(Bacillus firmus)、バチルス・
リケニホルミス(Bacillus licheniformis)、バチルス・
プミルス(Bacillus pumilus)、バチルス・マセランス(B
acillus macerans)、およびこれらの菌株に類似する
菌、並びにこれらの変異株である。
上記した「これら菌株に類似する」とは、ペクチン遊離
活性をもつがペクチンを分解する活性を実質的にもたな
い細菌学的に性質が類似するものをいう。また「これら
の変異株」とは具体的に例示した菌株およびそれに類似
する菌を化学的または物理的な手段により人工的に変異
させたものおよび自然に変異したものを含む。人工的に
変異さす手段は、当該分野で公知のものを利用すること
ができる。
またバチルス属に属する微生物で、ペクチンを遊離する
がペクチンを実質的に分解しない酵素を産生する細菌は
新株であっても、かかる酵素を産生する限り、この発明
に含まれる。
この発明に用いる好ましい微生物としては、いずれも財
団法人発酵研究所（ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＦＯＲ ＦＥ
ＲＭＥＮＴＡＴＩＯＮ，ＯＳＡＫＡ）に寄託された次の
微生物が挙げられる。なおＩＦＯの番号は寄託番号を示
す。
１）バチルス・サブチリス ＩＦＯ 3108,3134,3336,3
513,12112,12113,12210,13719,13721,14117および14140 ２）バチルス・アミロリクェファシエンスＩＦＯ 1414
1 ３）バチルス・セレウス ＩＦＯ 3002および3132 ４）バチルス・サーキュランス ＩＦＯ 13632 ５）バチルス・コアギュランス ＩＦＯ 12583 ６）バチルス・ファームス ＩＦＯ 3330 ７）バチルス・リケニホルミス ＩＦＯ 14206 ８）バチルス・プミルス ＩＦＯ 12087 ９）バチルス・マセランス ＩＦＯ 3490 これらの微生物のなかで特に好ましいのは、バチルス・
サブチリス ＩＦＯ 12113および同13719である。
この発明の方法によって植物組織からペクチンを遊離さ
せるに当っては、上記微生物を直接処理すべき植物組織
に接種して、常法に従って静置，撹拌，通気培養等を行
うか、または上記微生物の培養によって得られる培養液
またはその処理物を該植物組織に作用させるか何れであ
ってもよい。
上記微生物の培養、すなわち種培養において用いられる
培地は、特に制限されず、バチルス属の微生物の培養に
従来汎用されている各種栄養源を添加した培地のいずれ
も使用できる。汎用される培地には、ペプトン，カゼイ
ン加水分解物，酵母エキス，ブドウ糖，あるいは、場合
によっては、リン酸塩，マグネシウム塩，カリウム塩な
どの無機塩類も適当に添加することができる。また、種
培養培地として、植物組織によってはそれだけを加熱滅
菌するだけで何らの栄養源の添加をも必要とせずに用い
ることができる。特に柑橘類の果皮は有利な培地であ
る。
上記の培地での微生物の培養条件は、目的とする酵素の
生産量が最大となるよう適宜に決定されるが、通常20〜
37℃，10〜50時間培養される。培養は振盪，静置，通気
撹拌，あるいは固体培養のいずれでもよい。かかる培養
により、菌体が増殖し、また菌体外に酵素が産生され
る。培養液はそのまま、あるいは濃縮物や精製酵素液の
形のような処理物でも利用できる。この濃縮物は、必要
によって濾過処理した培養液を緩和な条件下で、例え
ば、低温低圧下で水を蒸発させるかあるいは限外濾過膜
を用いて濃縮すれば得られる。また精製酵素液は、培養
液を濾過し、濃縮し、硫安添加による分別沈澱を繰り返
すか、または培養液を濾過し、その濾液をＣＭ−セファ
デックス吸脱着カラムクロマトグラフィ及びセファデッ
クスＧ−７５ゲル濾過に付すことによっても得ることが
できる。
この発明の方法における作用機序は、前記微生物から生
産された酵素が、植物組織中に滲入し、ペクチン質こと
に水不溶性のプロトペクチンに作用し、水溶性のペクチ
ンを生成させ、植物組織外に遊離させるものと考えられ
る。
この発明の方法によって植物組織から遊離されたペクチ
ンは、通常の方法によって単離することができる。例え
ば、上記のようにした処理液を濾過し、残渣を除去した
後、これに３倍容の水と混和性の有機溶媒、例えばエタ
ノールを添加するとペクチンが凝析する。これを集めて
前記と同様の有機溶媒、例えばエタノールで洗浄し、乾
燥することにより高純度のペクチンが得られる。こうし
て得られたペクチンは、前記のいずれの微生物を用いて
分離したものも分子量は約11万以上であり、そしてこの
ペクチンは、従来の化学処理法と異なり、分子量分布が
狭く、天然のままに近いものである。さらにこのペクチ
ンは、化学薬品の混入がなく、食品や医薬として用いる
のに好ましいものである。なお、得られるペクチンの性
質は原料の種類により多少異なる。
この発明は、上記のように、バチルス属に属する微生物
を利用して、植物組織から簡単に高収率，高純度のペク
チンを取得する方法に関するものであると同時に、植物
組織からのペクチンの除去あるいは、ペクチンを含有す
る植物の抽出液の製造にも利用できるという特徴ある方
法である。
なお、本発明で処理対象とする植物組織は特に限定され
ず、安価でペクチン含量の多いもの程好ましい。温州ミ
カン，夏ミカン，レモン，グレープフルーツ，オレンジ
などの柑橘類がその例である。これら柑橘類の外果皮、
内果皮のいずれも原料として用いることができる。すな
わち、柑橘類から果汁を搾汁した残渣を用いることがで
きて、原料が安価であり、廃棄物の利用を兼ねることが
できる。この外ビートパルプ，西瓜，うり類などのよう
な果菜類の果皮なども好適な原料である。
この発明によれば、ペクチンを構成成分とする植物組織
に作用させる、微生物またはその培養液もしくはその処
理物に含まれる酵素は、従来知られているペクチンを遊
離させる酵素がペクチン自体を分解するのと異なり、遊
離するペクチンを実質的に分解しないので、植物組織に
充分作用させることによって、ペクチンを最高限に遊離
させ高収率でしかも高分子量のペクチンを得ることがで
きる。
次にこの発明を実施例によって説明するが、この発明を
限定するものではない。
（ニ）実施例 実施例１ 第１表に掲げる各菌株を可溶性デンプン0.5％，脱脂大
豆粉5%，(NH4)2ＰＯ4１％，ＣａＣｌ2，２Ｈ2Ｏ 0.01
％，酵母エキス0.01％(pH6.5)よりなる培地で、37℃，4
0時間振盪培養した。菌体を除いた上澄を酵素源として
レモン果皮から調製したプロトペクチン （Agric.Biol.Chem.46巻,667頁,1982年に記載の方法で
調製した）を基質として37℃で反応させてペクチンを遊
離させて、プロトペクチナーゼ活性を測定したところ第
１表の結果を得た。
なお、プロトペクチナーゼ活性は、Agric.Biol.Chem.46
巻,667頁,(1982年)に記載の方法により測定し、反応時
間に１m当り１マイクロモルのガラクチュロン酸に相
当するペクチンを生成する活性をプロトペクチナーゼの
１単位とした。
第１表の結果からみて、バチルス属に属する広範囲の細
菌が、ペクチン遊離活性を有することが分かる。
次に上記上澄をプロトペクチンとペクチンとに作用させ
てその時間経過を調べた。
（ｉ）プロトペクチン 上記のプロトペクチン200mg含有の１ｍの水溶液に、
プロトペクチナーゼ活性が15ユニットの前記培養上澄液
を含有する酢酸緩衝液(pH5.0)を37℃で反応させて遊離
ペクチン量の時間経過を測定して第１図に示した。
（）ペクチン レモンより製造されたペクチン（和光純薬工業ＫＫ製）
の0.5％水溶液に、上記（ｉ）と同じ上澄液を含有する
酢酸緩衝液(pH5.0)を37℃で反応させて、ペクチン分解
活性の時間経過を測定して第１図に示した。ペクチン分
解活性は、Agric.Biol.Chem.46巻，667頁，1982年に記
載の方法で測定した。
第１図に示した結果からみて、上記上澄液が含有するプ
ロトペクチナーゼはペクチン遊離活性を有するがペクチ
ン分解活性をもたないことは明らかである。
なお第１表に挙げた微生物から産生されたプロトペクチ
ナーゼも、すべてペクチン分解活性をもたないことが確
認された。
実施例２ バチルス・サブチリス ＩＦＯ 12113とＩＦＯ 13719
を可溶性デンプン0.5％，(NH4)2PO4 1%,CaCl2・2H2O 0.0
1%,酵母エキス0.01%(pH6.5)よりなる培地中で24時間(30
℃）培養し、培養濾液100mを2.5gの温州ミカン果皮
（乾重）と混合し、60℃で24時間反応させた。その上澄
を濾液で集め３倍容のエチルアルコールと混じて生成し
たペクチンを集め乾燥し、ペクチンを得た。このペクチ
ン標品の収量と性質を第２表に示した。上記のように60
℃のような高温で充分反応させて高収量で高分子量のペ
クチンが得られた。
実施例３ バチルス・サブチリス ＩＦＯ 12113を実施例１に用
いた培養液を可溶性デンプンの代りにデキストリンを加
えた培地で30℃，40時間培養した。この培養濾液を酵素
液とし、その40ユニットを第３表に掲げる起源のプロト
ペクチン1gを含む液(pH5.0)50m中に加え、37℃で１時
間反応させた。その際遊離したペクチンの量を第３表に
示す。
実施例４ バチルス・サブチリス ＩＦＯ 12113を実施例１に用
いた培地のリン酸アンモニウムの代りにペプトン0.5％
を加えた培地で30℃，36時間培養した。この培養濾液を
酵素液として、レモンより調製したプロトペクチン10g
を含む反応液(pH5.0)100mに加え37℃で反応させ、遊
離したペクチンの量とその分子量を経時的に測定し第２
図に示した。
第２図の結果からみて、遊離したペクチンが分解されて
いないことは明らかである。
次にバチルス・サブチリス ＩＦＯ 12113の産生する
プロトペクチナーゼを精製してその物性を測定した結果
を示す。
精製法 本菌を実施例１に示す培地で２０時間培養し、その培養
ろ液（２０リットル）を２リットルに濃縮し20mMの酢酸
緩衝液に透析する。これを同じバッファーで処理したCM
−セファデックスＣ−50のカラム(5×46cm)に吸着させN
aC(0-500mM)の濃度勾配で溶出した。この酸素液をDEA
E−トヨパール650のカラム(2.1×15cm)に通し、通過し
た液を集めた。これを４ｍに濃縮しトヨパールHW55S
カラム(2.5×75cm)を用いてクロマトグラフィーを行っ
た。プロトペクチナーゼ画分を集め濃縮しこれに粉末の
硫酸アンモニウムを加え冷蔵庫中に１週間保存し針状の
結晶42mgをえた。この酵素は新規のプロトペクチナーゼ
でありプロトペクチナーゼ−Ｂ(PPase-B)と命名した。
この酵素の物性を第４表にアミノ酸分析結果を第５表に
示した。
PPase-Bの物性の測定法およびアミノ酸分析法は次のと
おりである。
PPase-Bの性質とその測定方法： 分子量 SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳導法：J.Biol.Che
m.244巻，4406頁，1969年に記載のWeberとOsbornの方法
によった。
ゲル濾過法：上に示した酵素の精製におけるゲル濾過の
条件で行った。上記の場合標準タンパク質として、シト
クロームＣ、リゾチーム、α−キモトリプシノーゲン
Ａ、オバルブミン、牛血清アルブミンを用いた。
超遠心分離法：Biochemistry 3巻，297頁，1964年に記
載のYphantisの方法によった。
沈澱係数：100mMのNaCをふくむ20mMの酢酸緩衝液(pH
6.0)に酵素を5mg/mになるように溶解し日立232型分析
用超遠心分離機を用い60000回転で遠心分離を行い分析
した。
等電点 ｐＨ9.4 最適ｐＨ． 最適温度の測定は実施例１の方法に準
じて行った。
アミノ酸分析 精製酵素(18mg)を６Ｎの塩酸に溶解し
封管中で110℃で３０，４８，７２時間分解し、日立KLA
-5型自動アミノ酸分析装置を用いて分析した。
なおPPase-Bの作用機序を検討した結果、この酵素が大
豆由来のアラビノガラクタンのエンド部位のグリコシド
結合を切断することが確認された。また、バチルス・サ
ブチリスＩＦＯ12113以外の本願発明に用いられる各種
菌株は、同種の酵素を産生する。
この発明に用いられる微生物が産生するプロトペクチナ
ーゼとPPase-Bとの免疫的相同性を測定しその結果を第
６表に示す。相同性試験は、ラビットで調製した抗血清
を精製PPase-Bに対して用い、Ouchterlonyの二重免疫拡
散法(O.Ouchterlony,Acta Pathol.Microbiol.Scand.26
P.507,1940年）によって行った。バチルス・コアギュラ
ンス IFO 12583、バチルス・リケニホルミス IFO 14
206およびバチルス・マセランス3490の粗製酵素は、PPa
se-Bの抗血清によって沈澱を形成したが、これらの酵素
は、その沈澱の状況から判断してプロトペクチナーゼＢ
と同一物ではないことが分かった。またその他の酵素は
沈澱を形成しなかった。
アラビノガラクタン分解活性の測定は次のようにして行
った。１％アラビノガラクタン溶液３ｍと、0.2Mの酢
酸／酢酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)0.5mによる酵素溶
液１ｍを37℃で３分間培養した。PPase-Bの作用で放
出された還元糖を、Nelson-Somogyi法(M.Somogyi,J.Bio
l.Chem.,195,19頁，1952年）によって、ガラクトースと
して測定した。
(ホ)発明の効果 この発明によれば、ペクチンを構成成分とする植物組織
より、高分子量のペクチンを簡便に高収率で得ることが
できる。
【図面の簡単な説明】
第１図は、この発明の一実施例におけるプロトペクチナ
ーゼ含有の培養上澄液を、プロトペクチンとペクチンに
作用させた場合の遊離ペクチン量とペクチン分解活性の
時間的経過を示すグラフ図、第２図はこの発明の一実施
例におけるプロトペクチナーゼ含有の培養上澄液を、プ
ロトペクチンに作用させた場合の遊離ペクチン量と遊離
ペクチンの分子量の時間経過を示すグラフ図である。

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】バチルス属に属し植物組織よりペクチンを
    遊離する活性をもつがペクチンを分解する活性を実質的
    にもたない微生物、またはその培養液もしくはその処理
    物を、ペクチンを構成成分として含有する植物組織に作
    用させて該組織からペクチンを遊離させ、採取すること
    を特徴とするペクチンの製造法。
JP62046605A 1987-02-28 1987-02-28 ペクチンの製造法 Expired - Lifetime JPH068322B2 (ja)

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