JPS63267281A - 修正されたプロテインa - Google Patents
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-
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/305—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F)
- C07K14/31—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
プロティンAは、スタフィロコッカス オーレウス(5
taphylococcus aureus、)中に見
出される細胞表面蛋白質である。これはクラス18Gの
哺乳類抗体のFc領域を結合する性質を持つが、親和性
は宿主の種および抗体サブクラスによって変化する(徹
底的に吟味するにはランゴーン、ジエイ。
taphylococcus aureus、)中に見
出される細胞表面蛋白質である。これはクラス18Gの
哺乳類抗体のFc領域を結合する性質を持つが、親和性
は宿主の種および抗体サブクラスによって変化する(徹
底的に吟味するにはランゴーン、ジエイ。
ジェイ(+982)アドバンシズ イン イミュノロジ
ー (Advances in 1mmunolo
gy) 32:157−252を参照)。プロティン
Aは、スタフィロコッカス細胞壁から直接単離できるか
またはプロティンAを分泌する突然変異菌株の成育培地
から単離できる。
ー (Advances in 1mmunolo
gy) 32:157−252を参照)。プロティン
Aは、スタフィロコッカス細胞壁から直接単離できるか
またはプロティンAを分泌する突然変異菌株の成育培地
から単離できる。
さらに、プロティンAに対する遺伝子は、大腸菌中でク
ローン化され表現されている(ロフダール。
ローン化され表現されている(ロフダール。
ニス0.ガス、ビー9.ウーレン、エム1.フィリップ
ソン、エル、およびリンドバーグ、エム。
ソン、エル、およびリンドバーグ、エム。
(1983) Proc、 Natl、 Acad、
Sci、 USA 80: 697−701;コルバー
ト、ディー1.アニリオニス、ニー。
Sci、 USA 80: 697−701;コルバー
ト、ディー1.アニリオニス、ニー。
、ゲレップ、ビー0.ファーレー、ジェイ、およびプレ
イヤー、アール、(1984) J、 Biologi
calResponse Modifiers 3:
255−259) eこれは、大量の組み替えプロティ
ンAの製造を可能とした。
イヤー、アール、(1984) J、 Biologi
calResponse Modifiers 3:
255−259) eこれは、大量の組み替えプロティ
ンAの製造を可能とした。
プロティンAのIgG結合性に基づいた幾つかの応用が
開発された。これらには以下のものが含まれる: 抗体の分画および精製 プロティンAは、血清から抗体を分画するのに、そして
モノクローナル抗体を精製するのに使用されてきた。こ
れらの目的には、プロティンAは架橋されたアガロース
、トリサクリルTP″(TRISACRYLTM)
(エルケービー インストラメンツにより分配されてい
る、メリーランド州ガイサースバーグ)、または珪素に
、基づいた物質(ランボーン。
開発された。これらには以下のものが含まれる: 抗体の分画および精製 プロティンAは、血清から抗体を分画するのに、そして
モノクローナル抗体を精製するのに使用されてきた。こ
れらの目的には、プロティンAは架橋されたアガロース
、トリサクリルTP″(TRISACRYLTM)
(エルケービー インストラメンツにより分配されてい
る、メリーランド州ガイサースバーグ)、または珪素に
、基づいた物質(ランボーン。
ジエイ、ジェイ−(1982) J、 In+1Iun
o1. Methods55 : 277−296)等
の固体マトリックスに結合される。
o1. Methods55 : 277−296)等
の固体マトリックスに結合される。
治療的な血漿交換(TPE)
血漿から循環している免疫複合体を、プロティンAに対
する結合によフて除去することは、ある種の自己免疫疾
患および悪性疾患に治療効果を有する、という証拠があ
る(サリナス、エフ、ニー。
する結合によフて除去することは、ある種の自己免疫疾
患および悪性疾患に治療効果を有する、という証拠があ
る(サリナス、エフ、ニー。
およびハンナ、エム、ジー、 (1985)コンテン
ポラリー トピックス イン イミュノロジー(C。
ポラリー トピックス イン イミュノロジー(C。
ntemporary Topics in Immu
nology) 、ブレナムプレス、ニューヨーク、1
5巻、免疫複合体および人のガン)。これを達成する為
には、血漿は不活性の無毒性の支持体に取り付けられた
プロティンAからなる装置上を通過させられる。
nology) 、ブレナムプレス、ニューヨーク、1
5巻、免疫複合体および人のガン)。これを達成する為
には、血漿は不活性の無毒性の支持体に取り付けられた
プロティンAからなる装置上を通過させられる。
免疫化学手順
プロティンAは、酵素とリンクさせた免疫吸着検定(E
LISA)などの免疫化学方法の幾つかにおいてIgG
のプローブとして使用することができる。
LISA)などの免疫化学方法の幾つかにおいてIgG
のプローブとして使用することができる。
ELISAは、プロティンAが他の蛋白質、例えばアル
カリフォスファターゼまたは西洋わさびパーオキシダー
ゼに結合することを要求する(ランゴーン、ジェイ、ジ
ェイ、 (1982) J、 Immunol、 M
ethads 55 : 27?−296)。
カリフォスファターゼまたは西洋わさびパーオキシダー
ゼに結合することを要求する(ランゴーン、ジェイ、ジ
ェイ、 (1982) J、 Immunol、 M
ethads 55 : 27?−296)。
組織化学方法
プロティンAは、細胞表面抗原の研究など、組織化学ま
たは細胞学方法に於いて使用できる。これらの用途には
、プロティンAは、例えばフルオレスセインイソチオシ
アネートとの反応によるなどしばしば蛍光標識に結合さ
れる。
たは細胞学方法に於いて使用できる。これらの用途には
、プロティンAは、例えばフルオレスセインイソチオシ
アネートとの反応によるなどしばしば蛍光標識に結合さ
れる。
上記の議論から、はとんどの用途においてプロティンA
は他の物質に共有結合によって結合されなければならな
いことが明らかである。多くの結合化学が考え出された
が、はとんどはプロティンAのアミノ基を通じての結合
に導かれた。しかしながら結合の正確な位置は曖昧であ
る。プロティンAは、同様な反応性の約50のアミノ基
を含んでおり、これらの任意の一つまたは幾つかが結合
に関与し得る。この不明瞭さが以下の実際的な欠点とな
り得る。
は他の物質に共有結合によって結合されなければならな
いことが明らかである。多くの結合化学が考え出された
が、はとんどはプロティンAのアミノ基を通じての結合
に導かれた。しかしながら結合の正確な位置は曖昧であ
る。プロティンAは、同様な反応性の約50のアミノ基
を含んでおり、これらの任意の一つまたは幾つかが結合
に関与し得る。この不明瞭さが以下の実際的な欠点とな
り得る。
(1)プロティンAの抗体結合機能に要求され名アミノ
基を通じて、結合が起こり得ること、その基が直接関与
しないとしても、それを通じての固定はFc結合領域の
構造を混乱し得る。
基を通じて、結合が起こり得ること、その基が直接関与
しないとしても、それを通じての固定はFc結合領域の
構造を混乱し得る。
(2)プロティンAが幾つかの場所で結合し得ること。
個々の位置が、抗体結合に要求されないとしても幾つか
の場所を通じた結合は、プロティン八分子の柔軟性を制
限することがあり得、それによフて抗体に結合する能力
を減少させる。
の場所を通じた結合は、プロティン八分子の柔軟性を制
限することがあり得、それによフて抗体に結合する能力
を減少させる。
(3)結合した生成物が均一でないこと、従って、固体
支持体に結合した時に、異なる分子が固定の場所に依存
して抗体に体する違った親和性を有し得る。この事は、
抗体が汚染物質から分離されるアフィニティークロマト
グラフィーなどの用途に於いて欠点となる。同様に、プ
ロティンAの蛍光標識は、生成物の混合物を与え得る。
支持体に結合した時に、異なる分子が固定の場所に依存
して抗体に体する違った親和性を有し得る。この事は、
抗体が汚染物質から分離されるアフィニティークロマト
グラフィーなどの用途に於いて欠点となる。同様に、プ
ロティンAの蛍光標識は、生成物の混合物を与え得る。
このことは、免疫検定に於いて再現性の無い結果に導き
得る。
得る。
本発明は、プロティン八分子上の単一の定義された場所
を通じて他の物質に結合できる新規なプロティンA、ま
たはプロティンA様の分子に間するものである。このプ
ロティンAまたはプロティンA様の分子は、アミノ酸配
列における決められた場所に於いて、単一のシスティン
アミノ酸残基を含有する蛋白質を表現するように修飾さ
れた組み替えプロティンA遺伝子の生成物である。本明
細書で例示される新規なプロティンA様の分子は、シス
テイニル−tプロテインA ” (Cysteinyl
−rProtein A”) (マサチューセッツ州
ケンブリッジのレブリゲンコーポレーションの商標)(
式A)と呼ばれる。システイニル−tプロテインATM
をコードするヌクレオチド配列は、式Bに示される。
を通じて他の物質に結合できる新規なプロティンA、ま
たはプロティンA様の分子に間するものである。このプ
ロティンAまたはプロティンA様の分子は、アミノ酸配
列における決められた場所に於いて、単一のシスティン
アミノ酸残基を含有する蛋白質を表現するように修飾さ
れた組み替えプロティンA遺伝子の生成物である。本明
細書で例示される新規なプロティンA様の分子は、シス
テイニル−tプロテインA ” (Cysteinyl
−rProtein A”) (マサチューセッツ州
ケンブリッジのレブリゲンコーポレーションの商標)(
式A)と呼ばれる。システイニル−tプロテインATM
をコードするヌクレオチド配列は、式Bに示される。
プロティンAの遺伝子は5つの抗体結合領域(E、 A
、 8. C5およびD)および抗体と結合しないC−
末端領域(又は”X”領域)に対してコードを有してい
る(コルバート、ディーら上記)、x領域はアミノ酸G
lu−310および式Aの全てのそれに続くアミノ酸を
含んでいる。本発明は、システィン残基がC−末端XM
域において表現されている様に遺伝子を修飾することか
らなる。抗体結合領域またはそれらの領域の組み合わせ
のいずれの一つも修飾されたC−末#l領域と共に表現
でき、独特のシスティン残基を含有しているプロティン
A様の分子を与える。
、 8. C5およびD)および抗体と結合しないC−
末端領域(又は”X”領域)に対してコードを有してい
る(コルバート、ディーら上記)、x領域はアミノ酸G
lu−310および式Aの全てのそれに続くアミノ酸を
含んでいる。本発明は、システィン残基がC−末端XM
域において表現されている様に遺伝子を修飾することか
らなる。抗体結合領域またはそれらの領域の組み合わせ
のいずれの一つも修飾されたC−末#l領域と共に表現
でき、独特のシスティン残基を含有しているプロティン
A様の分子を与える。
式AニジステイニルーtプロテインATVのアミノ酸配
列。
列。
式BニジステイニルーtプロテインA1”のヌクレオチ
ド配列。
ド配列。
式C:26塩基対挿入物の配列。
式D : Bs5HIIで制限されたpBG3−2ΔN
に挿入された新しいオリゴヌクレオチドデユーブレック
ス。
に挿入された新しいオリゴヌクレオチドデユーブレック
ス。
プロティンAは、そのアミノ酸配列中にシスティン残基
を含有しない。コルバート ディーら(+984)ジャ
ーナル オブ バイオロジカル レスポンス モディフ
ァイアーズ 3: 255−259を参照、システイニ
ル−tプロテインAT“は、組替えプロティンA遺伝子
を変更し、大腸菌宿主中でその遺伝子を表現し鞘み替え
生成物を精製することによって製造された。変更された
プロティンA遺伝子を構築するのに使用する手順は、第
1図に概略が示される。プラスミド98G3−2ΔNは
、大Ill菌蛋白質からの323の塩基対(bp)配列
、スタフィロコツ力スオーレウスプロテインA遺伝子か
らの1+61bp配列、プロティンA遺伝子に対するス
トップコドンを含有している26bpの合成りNA配列
、および良く知られたプラスミドpBR325からの3
722bp配列を含んでいる。合成の挿入物は、pBG
3−2ΔNの他のどこにも見出されない二つのass)
t II制限位置を含有している。この遺伝子は、as
s)I IIでプラスミドpBG3−2ΔNを制限し、
切取った挿入物をシスティン残基に対するコドンを含有
している新たな合成挿入物と置き換えることによって修
飾される。
を含有しない。コルバート ディーら(+984)ジャ
ーナル オブ バイオロジカル レスポンス モディフ
ァイアーズ 3: 255−259を参照、システイニ
ル−tプロテインAT“は、組替えプロティンA遺伝子
を変更し、大腸菌宿主中でその遺伝子を表現し鞘み替え
生成物を精製することによって製造された。変更された
プロティンA遺伝子を構築するのに使用する手順は、第
1図に概略が示される。プラスミド98G3−2ΔNは
、大Ill菌蛋白質からの323の塩基対(bp)配列
、スタフィロコツ力スオーレウスプロテインA遺伝子か
らの1+61bp配列、プロティンA遺伝子に対するス
トップコドンを含有している26bpの合成りNA配列
、および良く知られたプラスミドpBR325からの3
722bp配列を含んでいる。合成の挿入物は、pBG
3−2ΔNの他のどこにも見出されない二つのass)
t II制限位置を含有している。この遺伝子は、as
s)I IIでプラスミドpBG3−2ΔNを制限し、
切取った挿入物をシスティン残基に対するコドンを含有
している新たな合成挿入物と置き換えることによって修
飾される。
大腸菌宿主中のプラスミドpBG3−2ΔNは、アメリ
カ合衆国 61604 イリノイ州 ベオリア ノー
スユニバーシティ−ストリート 1815の米国農務省
ノーザン リージョナル リサーチ センターにあるア
グリカルチュラル リサーチ カルチャー コレクショ
ン(NRRL)に寄託されている。
カ合衆国 61604 イリノイ州 ベオリア ノー
スユニバーシティ−ストリート 1815の米国農務省
ノーザン リージョナル リサーチ センターにあるア
グリカルチュラル リサーチ カルチャー コレクショ
ン(NRRL)に寄託されている。
その寄託番号はNRRL B−15910である。この
プラスミドはこの宿主から標準の手順、例えば透明にし
た溶菌物密度勾配平衡方法によってその宿主から除去す
ることができる。
プラスミドはこの宿主から標準の手順、例えば透明にし
た溶菌物密度勾配平衡方法によってその宿主から除去す
ることができる。
新たな合成挿入物の配列は、以下の様にして選択された
。pBG3−2ΔN中の26bp挿入物の配列は式Cに
示され、ここでBs5H■の制限位置および対応するア
ミノ酸配列が示されている。pBG3−2ΔNから表現
された組み替えプロティンAのC−末端アミノ酸残基は
セリンである。この残基はシステイニル−tプロテイン
A”中でシスティン残基に置き換えられた。C−末端シ
スティン残基のスルフヒドリル基のp14FLは、内部
システィン残基のpKaよりも高いので末端基は反応性
がより低い、従って、システイニル−tプロテインA”
に対して、システィンに対するC−末端に新たなグリシ
ン残基が挿入された。しかしながら、グリシン残基は臨
界的なものとは考えられない、更に、他のアミノ酸は、
システィンと隣接することができる。C・末端領域の望
ましいアミノ酸配列、及びこれを表現する一つのDNA
配列は式りに示されている。示されているDNA配列は
、Bs5HII−制限ブラスミドρBG3−2ΔN中に
挿入され、そして従って式Cに示されている16bpの
8ssHII断片を置き換えた0式りにおけるDNA配
列は、パリンドローム(右から呼んでも左から呼んでも
同じ)であることに注目されたい。これは次の利点を有
する。DNAは自己相補性である、従って挿入されたデ
ユーブレックス二本鎖の一つの鎖のみが合成される必要
があるだけである。
。pBG3−2ΔN中の26bp挿入物の配列は式Cに
示され、ここでBs5H■の制限位置および対応するア
ミノ酸配列が示されている。pBG3−2ΔNから表現
された組み替えプロティンAのC−末端アミノ酸残基は
セリンである。この残基はシステイニル−tプロテイン
A”中でシスティン残基に置き換えられた。C−末端シ
スティン残基のスルフヒドリル基のp14FLは、内部
システィン残基のpKaよりも高いので末端基は反応性
がより低い、従って、システイニル−tプロテインA”
に対して、システィンに対するC−末端に新たなグリシ
ン残基が挿入された。しかしながら、グリシン残基は臨
界的なものとは考えられない、更に、他のアミノ酸は、
システィンと隣接することができる。C・末端領域の望
ましいアミノ酸配列、及びこれを表現する一つのDNA
配列は式りに示されている。示されているDNA配列は
、Bs5HII−制限ブラスミドρBG3−2ΔN中に
挿入され、そして従って式Cに示されている16bpの
8ssHII断片を置き換えた0式りにおけるDNA配
列は、パリンドローム(右から呼んでも左から呼んでも
同じ)であることに注目されたい。これは次の利点を有
する。DNAは自己相補性である、従って挿入されたデ
ユーブレックス二本鎖の一つの鎖のみが合成される必要
があるだけである。
そして、合成二本鎖は二つの方向の可能性のいずれにも
挿入でき、所望のDNA配列を与える。さらに、式りに
示されるDNA配列は二つのsph I制限位置を含ん
でいる。そのような位置は、pBG3−2ΔNのどこに
も見出せないので、組み替え分子中の挿入物の存在は、
分子を解裂する制限エンドヌクレアーゼSph iの能
力によって試験され得る。
挿入でき、所望のDNA配列を与える。さらに、式りに
示されるDNA配列は二つのsph I制限位置を含ん
でいる。そのような位置は、pBG3−2ΔNのどこに
も見出せないので、組み替え分子中の挿入物の存在は、
分子を解裂する制限エンドヌクレアーゼSph iの能
力によって試験され得る。
システイニル−tプロテインA”を表現する組み替えプ
ラスミドの構築、システイニル−tプロテインA′rM
の精製、およびシステイニル−tプロテインA”の使用
について詳細に記す前に、使用された一般方法を述べる
。
ラスミドの構築、システイニル−tプロテインA′rM
の精製、およびシステイニル−tプロテインA”の使用
について詳細に記す前に、使用された一般方法を述べる
。
(1)大腸菌菌株
全ての大腸菌菌株は、大腸菌に一12誘導菌である。
菌株大腸菌J旧05、大腸菌JM103、および大腸菌
PR+3(F−1l]nl+3、rna−19、thr
−1,IeuR−6、thi−1゜1acYI、 xy
l−7、mt12、a+alA1.5trAt32)は
、この技術でよく知られており、既知の培養基保存機関
または市販の給源から得ることが出来る0例えば、大腸
菌JMI05は寄託番号NRRL B−18067、そ
して大腸菌J旧03は寄託番号NRRL B−3940
3を有している。
PR+3(F−1l]nl+3、rna−19、thr
−1,IeuR−6、thi−1゜1acYI、 xy
l−7、mt12、a+alA1.5trAt32)は
、この技術でよく知られており、既知の培養基保存機関
または市販の給源から得ることが出来る0例えば、大腸
菌JMI05は寄託番号NRRL B−18067、そ
して大腸菌J旧03は寄託番号NRRL B−3940
3を有している。
培養基寄託
次の本出願に開示される培養基の寄託は、アメリカ合衆
国 61604 イリノイ州 ベオリアノースユニバ
ーシティーストリート 1815米国農務省のノーザン
リージョナル リサーチセンター、アグリカルチュラル
リサーチ カルチャー コレクション(NRRL)中
で行なわれた。
国 61604 イリノイ州 ベオリアノースユニバ
ーシティーストリート 1815米国農務省のノーザン
リージョナル リサーチセンター、アグリカルチュラル
リサーチ カルチャー コレクション(NRRL)中
で行なわれた。
この培養基は37 CFR1,14および35 usc
122のもとに特許商標庁長官によって権限があると
決定された人に対し、本特許出願の継続中に培養基を入
手することが保証されている、という条件下で寄託され
ている。この寄託物は、この出願、またはその子孫に対
応するものが出願されている国々の外国特許法によって
要求されるならば入手できる。しかしながら、寄託物を
入手することが出来ることは、行政行為によって与えら
れた特許権を侵害して本発明を実施する実施権を構成す
るものではないことを理解されるべきである。
122のもとに特許商標庁長官によって権限があると
決定された人に対し、本特許出願の継続中に培養基を入
手することが保証されている、という条件下で寄託され
ている。この寄託物は、この出願、またはその子孫に対
応するものが出願されている国々の外国特許法によって
要求されるならば入手できる。しかしながら、寄託物を
入手することが出来ることは、行政行為によって与えら
れた特許権を侵害して本発明を実施する実施権を構成す
るものではないことを理解されるべきである。
更に、この培養基寄託は微生物の寄託に対するブタペス
ト条約の条項に従って保存され、そして一般に入手可能
とされる。即ち、寄託物の試料を提出することが最も最
近要求された後、少なくとも5年間の期間、どのような
場合においても少なくとも寄託後30年間または培養基
を開示している発行され得るどんな特許の権利行使可能
な寿命の閏、生きたままモして汚染されずに保つのに必
要な全ての注意をもって保存される。寄託者は、寄託物
の状態の為に寄託所が要求された時に試料を提供するこ
とが出来ないならば寄託物を置き換える任務があること
を認める。この培養基寄託の一般への人手可能性に間す
る全ての制限は、開示した特許の付与によって非可逆的
に取除かれる。
ト条約の条項に従って保存され、そして一般に入手可能
とされる。即ち、寄託物の試料を提出することが最も最
近要求された後、少なくとも5年間の期間、どのような
場合においても少なくとも寄託後30年間または培養基
を開示している発行され得るどんな特許の権利行使可能
な寿命の閏、生きたままモして汚染されずに保つのに必
要な全ての注意をもって保存される。寄託者は、寄託物
の状態の為に寄託所が要求された時に試料を提供するこ
とが出来ないならば寄託物を置き換える任務があること
を認める。この培養基寄託の一般への人手可能性に間す
る全ての制限は、開示した特許の付与によって非可逆的
に取除かれる。
(2)大腸菌培養基
培養基は、YT培地(リットル当り8グラムのトリプト
ン、5グラムの酵母抽出物、および5グラムのNaC1
)中で成育された。要求される時は30μν1の濃度に
クロラムフェニコールを加えた。プレートの調製につい
ては、寒天を培地に1.5zの濃度に加えた。
ン、5グラムの酵母抽出物、および5グラムのNaC1
)中で成育された。要求される時は30μν1の濃度に
クロラムフェニコールを加えた。プレートの調製につい
ては、寒天を培地に1.5zの濃度に加えた。
(3)プラスミドDNAの調製
プラスミドは、ホルメス及びクイグレー(ホルメス デ
ィー ニス及びクイグレー エム [1981コアナリ
テイ力ル バイオケミストリー 114:193−19
7)の急速沸騰方法の変法を用いて大腸菌培養基から製
造された。51の培養基を37’Cで一夜成育させそし
てペレット化した。ペレット化した細胞を0.41の5
TET緩衝液(8%庶糖、5χトライ) ン(TRIT
ON) X−100[ペンシルバニア州フィアラデルフ
ィアのロームアンドハースカンパニー製]、 50n+
M )リス(ヒドロキシメチル)アミノメタン−MCI
、p)18.0.50+mMエチレンジアミンテトラ酢
酸[EDTA] )中に再懸濁した。30μmのリゾチ
ーム(10mg/水1)を加え、混合物を沸騰水浴中に
2分装置いた。混合物を次に遠心分離しく 10000
g io分)、固体を除去し、そして上澄みを等しい容
量のイソプロパツールで処理した。−106Cで10分
間放置後、固体を遠心によってペレット化しく1000
0g 15分)そして上澄みを捨てた。ペレットを75
μmのTE緩衝液(10wM )リス−MCI、pH
8,0,0,5mM EDTA)中に溶解し、そして7
5μm07.5酢酸アンモニウムで処理した。 4’C
で10分間放置後、固体を遠心によりペレット化しく1
0000g 15分)そして上澄みを除去し3容量のエ
タノールで処理した。−io”cで10分間放置後、沈
殿したプラスミドDNAを遠心によってペレット化しく
10000g 15分)エタノールで洗浄し、空気乾燥
した。ペレットを50μmのTE中に溶解し、−20”
Cで冷凍貯蔵した。
ィー ニス及びクイグレー エム [1981コアナリ
テイ力ル バイオケミストリー 114:193−19
7)の急速沸騰方法の変法を用いて大腸菌培養基から製
造された。51の培養基を37’Cで一夜成育させそし
てペレット化した。ペレット化した細胞を0.41の5
TET緩衝液(8%庶糖、5χトライ) ン(TRIT
ON) X−100[ペンシルバニア州フィアラデルフ
ィアのロームアンドハースカンパニー製]、 50n+
M )リス(ヒドロキシメチル)アミノメタン−MCI
、p)18.0.50+mMエチレンジアミンテトラ酢
酸[EDTA] )中に再懸濁した。30μmのリゾチ
ーム(10mg/水1)を加え、混合物を沸騰水浴中に
2分装置いた。混合物を次に遠心分離しく 10000
g io分)、固体を除去し、そして上澄みを等しい容
量のイソプロパツールで処理した。−106Cで10分
間放置後、固体を遠心によってペレット化しく1000
0g 15分)そして上澄みを捨てた。ペレットを75
μmのTE緩衝液(10wM )リス−MCI、pH
8,0,0,5mM EDTA)中に溶解し、そして7
5μm07.5酢酸アンモニウムで処理した。 4’C
で10分間放置後、固体を遠心によりペレット化しく1
0000g 15分)そして上澄みを除去し3容量のエ
タノールで処理した。−io”cで10分間放置後、沈
殿したプラスミドDNAを遠心によってペレット化しく
10000g 15分)エタノールで洗浄し、空気乾燥
した。ペレットを50μmのTE中に溶解し、−20”
Cで冷凍貯蔵した。
(4)制限エンドヌクレアーゼ消化
制限エンドヌクレアーゼ消化は、装填業者によって推奨
される方法を用いて実施した。使用した*衝液は10m
M )リス−HCl、pH7,5,10+nM MgC
l2.75mM NaCl、および100.ug/ml
牛血清アルブミンであった。
される方法を用いて実施した。使用した*衝液は10m
M )リス−HCl、pH7,5,10+nM MgC
l2.75mM NaCl、および100.ug/ml
牛血清アルブミンであった。
(5) DNA断片の電気泳動分離
制限断片を0.5μg/mlの臭化エチジウムを含有し
ているTOE緩衝液(90aM )リス塩基、0.89
Mホウ酸、2mM EDTA)中の1zアガロースゲル
上で電気泳動することによって分離した。断片を紫外線
を照射することによって見ることができるようにし、そ
れらの寸法を既知の寸法の断片と参照することによって
測定した。
ているTOE緩衝液(90aM )リス塩基、0.89
Mホウ酸、2mM EDTA)中の1zアガロースゲル
上で電気泳動することによって分離した。断片を紫外線
を照射することによって見ることができるようにし、そ
れらの寸法を既知の寸法の断片と参照することによって
測定した。
(6)コンピテント大腸菌細胞の製造
大腸菌の培養基を、600nmにおける吸光度が0.3
になるまで攪拌しなから37°Cで成育させた。細胞を
次に氷の上で冷却し、遠心によりペレット化しく410
0g 10分間)、氷冷50mM CaCl2の最初の
容量の2分の1の中に再懸濁し、そして氷上で20分間
培養した。細胞を遠心によって上記の様に集め、氷冷5
0mM CaCl2の最初の容量の25分の1の中に再
懸濁した。11の部分を一80°Cで冷凍保存した。
になるまで攪拌しなから37°Cで成育させた。細胞を
次に氷の上で冷却し、遠心によりペレット化しく410
0g 10分間)、氷冷50mM CaCl2の最初の
容量の2分の1の中に再懸濁し、そして氷上で20分間
培養した。細胞を遠心によって上記の様に集め、氷冷5
0mM CaCl2の最初の容量の25分の1の中に再
懸濁した。11の部分を一80°Cで冷凍保存した。
(7)コンピテント細胞の形質転換
凍結したコンピテント膿胞を解凍し、そして0゜21を
5ないし20μIのTEの中のおよそ0.4μgのプラ
スミドDNAで処理した。30分間氷上で放置後、混合
物を2分間37’Cの水浴中に入れ、次に1mlのYT
培地で処理し、37”Cで1時間培養した。培養基を次
に30μg/mlクロラムフェニコールを含有している
YT培地上でプレートにし、37”Cで成育させた。
5ないし20μIのTEの中のおよそ0.4μgのプラ
スミドDNAで処理した。30分間氷上で放置後、混合
物を2分間37’Cの水浴中に入れ、次に1mlのYT
培地で処理し、37”Cで1時間培養した。培養基を次
に30μg/mlクロラムフェニコールを含有している
YT培地上でプレートにし、37”Cで成育させた。
(8)ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PA
すp− 電気泳動をラエムリ(ラエムリ ュー ケイ[+970
1ネイチヤー [ロンドンコ227 : 680−68
5)によって記載されるようにドデシル硫酸ナトリウム
(5DS)の存在下でポリアクリルアミドゲル上で実施
した。スラブゲルは1.5mmの厚みで121の合計ア
クリルアミド濃度を含有していた。試料(25μmまで
)を25μmの試料緩衝液(62,5剛門トリス−MC
I、p)16.8.2% SDS、5% 2−メルカプ
トエタノール、IO!グリセロール、および0.002
5!ブロモフエノールブルー)と混合し、2分間沸騰水
浴中に入れ、冷却し、そしてゲルに装填した。電気泳動
をホエファー サイエンティフィック インストラメン
ツ(カリフォルニア州すンフランシスコ)から購入した
装置中で75mAにおいて実施した。ゲルを5:5:1
のメタノール/水/酢酸中のクマシーブル−0,53/
lの溶液で染色し、そして765x酢酸中で脱染色−し
た。
すp− 電気泳動をラエムリ(ラエムリ ュー ケイ[+970
1ネイチヤー [ロンドンコ227 : 680−68
5)によって記載されるようにドデシル硫酸ナトリウム
(5DS)の存在下でポリアクリルアミドゲル上で実施
した。スラブゲルは1.5mmの厚みで121の合計ア
クリルアミド濃度を含有していた。試料(25μmまで
)を25μmの試料緩衝液(62,5剛門トリス−MC
I、p)16.8.2% SDS、5% 2−メルカプ
トエタノール、IO!グリセロール、および0.002
5!ブロモフエノールブルー)と混合し、2分間沸騰水
浴中に入れ、冷却し、そしてゲルに装填した。電気泳動
をホエファー サイエンティフィック インストラメン
ツ(カリフォルニア州すンフランシスコ)から購入した
装置中で75mAにおいて実施した。ゲルを5:5:1
のメタノール/水/酢酸中のクマシーブル−0,53/
lの溶液で染色し、そして765x酢酸中で脱染色−し
た。
(9)オリゴデオキシリボヌクレオチドの合成及オリゴ
ヌクレオチドdCGCGCATGCGGCTAGCCG
CATGをアプライド バイオシステムズ(カリフォル
ニア州フォスターシティ−)モデル380A DNAシ
ンセサイザーを用いて製造業者によって推奨されるホス
ホルアミダイト手順を用いて合成した。脱保護したオリ
ゴマーを7トキンソン及びスミス(アトキンソン ティ
ー及びスミス エム [1984]オリゴヌクレオチド
シンセシス:実際的な方法、ゲイト エム ジエイ編
、アイアールエルブレス、バージニア州アーリントン、
35−81頁)の電気泳動方法を用いて精製した。精製
したオリゴマー(29μg)を30μmの50+wM
)リス−)ICI、pH7,6,10w+M MgCl
2.5mMヂチオスレイトール(DTT) 、0.1m
Mスペルミジン、0.1mM EDTA及び0.15M
アデノシン三燐酸(ATP)中のT4ポリヌクレオチド
キナーゼ10単位で処理した。溶液を30分間37°C
で培養し、次にDNAを10分の1容量の3M酢酸ナト
リウム、pH4,7、および3容量のエタノール(−1
O°C110分閏)で沈殿させた。このDNAを遠心に
よりペレット化しく10000g、 15分間)、エタ
ノールで洗浄し乾燥した。ベレットを30μmのTE中
で再溶解し、60°Cに加熱し、そしてDNAデユーブ
レックスを形成する為にゆっくりと室温で冷却した。
ヌクレオチドdCGCGCATGCGGCTAGCCG
CATGをアプライド バイオシステムズ(カリフォル
ニア州フォスターシティ−)モデル380A DNAシ
ンセサイザーを用いて製造業者によって推奨されるホス
ホルアミダイト手順を用いて合成した。脱保護したオリ
ゴマーを7トキンソン及びスミス(アトキンソン ティ
ー及びスミス エム [1984]オリゴヌクレオチド
シンセシス:実際的な方法、ゲイト エム ジエイ編
、アイアールエルブレス、バージニア州アーリントン、
35−81頁)の電気泳動方法を用いて精製した。精製
したオリゴマー(29μg)を30μmの50+wM
)リス−)ICI、pH7,6,10w+M MgCl
2.5mMヂチオスレイトール(DTT) 、0.1m
Mスペルミジン、0.1mM EDTA及び0.15M
アデノシン三燐酸(ATP)中のT4ポリヌクレオチド
キナーゼ10単位で処理した。溶液を30分間37°C
で培養し、次にDNAを10分の1容量の3M酢酸ナト
リウム、pH4,7、および3容量のエタノール(−1
O°C110分閏)で沈殿させた。このDNAを遠心に
よりペレット化しく10000g、 15分間)、エタ
ノールで洗浄し乾燥した。ベレットを30μmのTE中
で再溶解し、60°Cに加熱し、そしてDNAデユーブ
レックスを形成する為にゆっくりと室温で冷却した。
以下は、本発明の実施の手順を説明する実施例である。
これらの実施例は制限するものと解釈すべきでない。全
てのパーセントは重量により、全ての溶媒混合物割合は
、別に記載されてなければ容量による。
てのパーセントは重量により、全ての溶媒混合物割合は
、別に記載されてなければ容量による。
1μ8のpBG3−2ΔNを(4)で記載した緩衝液中
で120分間37’Cで12単位のBs5HIIと培養
した。1μm(20単位)のアルカリフォスファターゼ
(子牛のこう丸)を加え、溶液を更に1時間37°Cで
培養した。溶液を次に100μmにTEで希釈し、フェ
ノール50μm部分2回で抽出し、ジエチルエーテル1
00μm部分2回で抽出し、3M酢酸ナトリウム(p)
14.7) 10分の1容量で処理し、3容量のエタノ
ールで沈殿させた。制限されたホスホリル化したDNA
を遠心によってペレット化しくtoooog、 15分
間)、エタノールで洗浄し、乾燥し30μmのTE中で
溶解した。
で120分間37’Cで12単位のBs5HIIと培養
した。1μm(20単位)のアルカリフォスファターゼ
(子牛のこう丸)を加え、溶液を更に1時間37°Cで
培養した。溶液を次に100μmにTEで希釈し、フェ
ノール50μm部分2回で抽出し、ジエチルエーテル1
00μm部分2回で抽出し、3M酢酸ナトリウム(p)
14.7) 10分の1容量で処理し、3容量のエタノ
ールで沈殿させた。制限されたホスホリル化したDNA
を遠心によってペレット化しくtoooog、 15分
間)、エタノールで洗浄し、乾燥し30μmのTE中で
溶解した。
実施例2−一−−オリゴヌクレオチド挿入物の連結11
BG3−2ΔN(0,5μg)の脱ホルホリル化された
Bs5HII制限断片、(9)中で記載した合成オリゴ
ヌクレオチド二本鎖(デユーブレックス)(5μg)、
及びT4 DNAリガーゼ(400単位)を50mM
)リス−HCl、pH7,8,6++M MgCl2、
In+M ATPを含有している20mM DTT中で
15時間16°Cで培養した。反応混合物をコンピテン
ト大II菌JM105m胞を(7)に記載したように、
形質転換するのに使用した。
BG3−2ΔN(0,5μg)の脱ホルホリル化された
Bs5HII制限断片、(9)中で記載した合成オリゴ
ヌクレオチド二本鎖(デユーブレックス)(5μg)、
及びT4 DNAリガーゼ(400単位)を50mM
)リス−HCl、pH7,8,6++M MgCl2、
In+M ATPを含有している20mM DTT中で
15時間16°Cで培養した。反応混合物をコンピテン
ト大II菌JM105m胞を(7)に記載したように、
形質転換するのに使用した。
プラスミドDNAを実施例2からの形質転換物の10個
のコロニーから単離した。このDNAをsph I及び
EcoRIの混合物によって制限した。アガロース電気
泳動は、式りに示されるDNA配列のpBG3−2ΔN
のBs5HIf制限断片への挿入から期待される断片を
表した。即ち、1.2kbl)の一つ及び4.0kbp
の一つである。試験された全ての10個の形質転換物か
らのプラスミドDNAは、消化するとこれらの断片を与
えた。対照的に、プラスミドpBG3−2ΔNは期待さ
れるように5.2kbpの単一断片しか与えなかった。
のコロニーから単離した。このDNAをsph I及び
EcoRIの混合物によって制限した。アガロース電気
泳動は、式りに示されるDNA配列のpBG3−2ΔN
のBs5HIf制限断片への挿入から期待される断片を
表した。即ち、1.2kbl)の一つ及び4.0kbp
の一つである。試験された全ての10個の形質転換物か
らのプラスミドDNAは、消化するとこれらの断片を与
えた。対照的に、プラスミドpBG3−2ΔNは期待さ
れるように5.2kbpの単一断片しか与えなかった。
形質転換物から単離されたプラスミドは消化されたpB
G3−Cysである。
G3−Cysである。
実施例4 −−−− pBG3−Csによる大腸菌PR
13の形質転換 実施例3に記載された形質転換物の一つからのプラスミ
ドpBG3−Cysを、コンピテント大腸iJM103
細胞の形質転換に使用した。大腸菌JM103 (pB
G3−Cys)形質転換物の4つから単離されたプラス
ミドを、実施例3に記載されるようにsph Iの位置
に対してスクリーニングし、全てがそれを含んでいるこ
とがわかった。これらの形質転換物の1からのプラスミ
ドを、コンピテント大腸菌PR13+II胞を形質転換
するのに使用した。プラスミドを大腸菌PR+3 (P
OC3−Cys)形質転換物の4つから単離し、Sph
1位置の存在に対してスクリーニングした。
13の形質転換 実施例3に記載された形質転換物の一つからのプラスミ
ドpBG3−Cysを、コンピテント大腸iJM103
細胞の形質転換に使用した。大腸菌JM103 (pB
G3−Cys)形質転換物の4つから単離されたプラス
ミドを、実施例3に記載されるようにsph Iの位置
に対してスクリーニングし、全てがそれを含んでいるこ
とがわかった。これらの形質転換物の1からのプラスミ
ドを、コンピテント大腸菌PR13+II胞を形質転換
するのに使用した。プラスミドを大腸菌PR+3 (P
OC3−Cys)形質転換物の4つから単離し、Sph
1位置の存在に対してスクリーニングした。
全て4つがその位置を含有しているのがわかった。
実施例5−−−一大腸HPR+3 (pBG3−Cys
)によるシ大腸菌PR13(pBG3−Cys)及び大
腸菌PR13(pBG3−2ΔN)の培養基を一夜37
℃で成育させ、そして各々の50μmをペレット化した
。ペレットを25μmの試料緩衝液中に懸濁し、モして
(8)で記載されるように5DS−PAGEにかけた。
)によるシ大腸菌PR13(pBG3−Cys)及び大
腸菌PR13(pBG3−2ΔN)の培養基を一夜37
℃で成育させ、そして各々の50μmをペレット化した
。ペレットを25μmの試料緩衝液中に懸濁し、モして
(8)で記載されるように5DS−PAGEにかけた。
脱染色したゲルは、大腸菌PR13(pBG3−Cys
)培養基が大腸MPR+3(pBG3−2ΔN)によっ
て表現されることが知られている組み替えプロティンA
と同じ外見分子量、及び同じ量の蛋白質を表現した。
)培養基が大腸MPR+3(pBG3−2ΔN)によっ
て表現されることが知られている組み替えプロティンA
と同じ外見分子量、及び同じ量の蛋白質を表現した。
実施例6−一一一大腸菌PR13(、8G3−Cys)
の大規模&! 大II M PR+3 (pBG3−Cys)の30g
g/mlクロラムフェニコールを含有するYT中の一夜
培養基の101を201ケマペツクフアーメンターにュ
ーヨーク州ウッドベリーのケマペックインコーボレーテ
ッド)中の10mg/Iのクロラムフェニコールを含有
している101の修飾された2x培地(20g/Iの酵
母抽出物、20g/ Iのカサミノ酸、20g/Iのカ
ゼインペプトン、2g/lのに2HPO,,2g/Iの
KH2PO4,2g/lのNa2HPO4”7H20〉
を接種するのに使用した0組み替え細胞を37゜C15
0!(7)溶解した02と共ニ37″Cテ成育した。
pHを85χ乳酸及び50X Na0)1で6.81に
保持した0発泡はアンチフオーム8(プラウエア州つィ
ルミントンのイー アイ デュポン デ ネモアーズ
アンド カンパニー インコーホレーテッド製)の添加
によって抑制した。細胞を遠心によって、後期対数相に
おいて収穫した( 3500X g、20分間)。
の大規模&! 大II M PR+3 (pBG3−Cys)の30g
g/mlクロラムフェニコールを含有するYT中の一夜
培養基の101を201ケマペツクフアーメンターにュ
ーヨーク州ウッドベリーのケマペックインコーボレーテ
ッド)中の10mg/Iのクロラムフェニコールを含有
している101の修飾された2x培地(20g/Iの酵
母抽出物、20g/ Iのカサミノ酸、20g/Iのカ
ゼインペプトン、2g/lのに2HPO,,2g/Iの
KH2PO4,2g/lのNa2HPO4”7H20〉
を接種するのに使用した0組み替え細胞を37゜C15
0!(7)溶解した02と共ニ37″Cテ成育した。
pHを85χ乳酸及び50X Na0)1で6.81に
保持した0発泡はアンチフオーム8(プラウエア州つィ
ルミントンのイー アイ デュポン デ ネモアーズ
アンド カンパニー インコーホレーテッド製)の添加
によって抑制した。細胞を遠心によって、後期対数相に
おいて収穫した( 3500X g、20分間)。
細胞収量は、リットル当り30gの湿潤細胞重量(wC
讐)であった。
讐)であった。
実施例7−一一一組み替え細胞の溶菌
収穫した大腸菌PR13(pBG3−Cys)細胞(1
50g)を11の溶菌緩?Ijt11(fOmM )リ
ス−HCl、pH8,3,5IIIM EDTA、 1
mM DTT、 0.1mMフェニルメチルスルフォニ
ルフルオライド[PMSF] 、及び0.5X )ライ
) ン(TRITON) X−100)中に懸濁した。
50g)を11の溶菌緩?Ijt11(fOmM )リ
ス−HCl、pH8,3,5IIIM EDTA、 1
mM DTT、 0.1mMフェニルメチルスルフォニ
ルフルオライド[PMSF] 、及び0.5X )ライ
) ン(TRITON) X−100)中に懸濁した。
溶菌を懸濁液を2回、1.21のガラスビード(直径0
.5−0.7nm+)で充填したダイノミルモデルにO
L−パイロットにュージャージー州メイウッドのインパ
デックス)を通過させることによって行なった。溶菌物
を遠心によって透明にした(7310g、 45分間)
。
.5−0.7nm+)で充填したダイノミルモデルにO
L−パイロットにュージャージー州メイウッドのインパ
デックス)を通過させることによって行なった。溶菌物
を遠心によって透明にした(7310g、 45分間)
。
実施例8−一一一システイニルーtプロテインATMの
精製 DEAE−セファロース高速流にュージャージー州ビス
力タウエイのファルマシア ファイン ケミカルス!り
の11X13cmOカラムを洗浄緩衝液(35n+M
)リス−HCl、pH8,3,2mM EDTA、 1
mM DTT。
精製 DEAE−セファロース高速流にュージャージー州ビス
力タウエイのファルマシア ファイン ケミカルス!り
の11X13cmOカラムを洗浄緩衝液(35n+M
)リス−HCl、pH8,3,2mM EDTA、 1
mM DTT。
0.1wM PMSF)で平衡化し、そして1.51の
透明にした溶菌物(実施例7)を流速100m1/分に
おいてカラムを通過させた。洗浄緩衝液(31)を次に
100m1/分においてカラムを通過させた。流速を次
に10m1/分に減少させ、そしてシステイニル−tプ
ロテインA”を41の洗浄緩衝液及び41の溶離緩衝液
(洗浄緩衝液は200mMのにC1を含有している)か
ら形成された線形勾配によって溶離した。200m l
のフラクションを集め、各フラクションからの試料を5
DS−PAGEによって分析した。40キロダルトン(
kd)のみかけ分子m<システイニル−tプロテインA
TM)の部分を含有しているフラクションを集め、モし
て85°Cで10分間加熱した。沈殿した汚染物を遠心
によってベレット化しく7310g、30分間)、そし
て上澄みを0.45−ミクロンフィルターを通過させた
。濾液を3容量のエタノールで処理し、そして30分間
室温で攪拌した。生じる沈殿を遠心で集め(7310g
、30分間)そしそ乾燥させた。
透明にした溶菌物(実施例7)を流速100m1/分に
おいてカラムを通過させた。洗浄緩衝液(31)を次に
100m1/分においてカラムを通過させた。流速を次
に10m1/分に減少させ、そしてシステイニル−tプ
ロテインA”を41の洗浄緩衝液及び41の溶離緩衝液
(洗浄緩衝液は200mMのにC1を含有している)か
ら形成された線形勾配によって溶離した。200m l
のフラクションを集め、各フラクションからの試料を5
DS−PAGEによって分析した。40キロダルトン(
kd)のみかけ分子m<システイニル−tプロテインA
TM)の部分を含有しているフラクションを集め、モし
て85°Cで10分間加熱した。沈殿した汚染物を遠心
によってベレット化しく7310g、30分間)、そし
て上澄みを0.45−ミクロンフィルターを通過させた
。濾液を3容量のエタノールで処理し、そして30分間
室温で攪拌した。生じる沈殿を遠心で集め(7310g
、30分間)そしそ乾燥させた。
ベレットを滅ITE中で溶解させ、4″Cでlff1M
DTTの存在下で保存した。40kdの生成物は5D
S−PAGEによって901より純度が大であると判断
された。275 rmにおける吸光度によって測定され
た収率は、5B/gの冒Cνであった。
DTTの存在下で保存した。40kdの生成物は5D
S−PAGEによって901より純度が大であると判断
された。275 rmにおける吸光度によって測定され
た収率は、5B/gの冒Cνであった。
実施例9−一一一フルオレスセイン標識プロティンへ
試薬のフルオレスセイン−5−マレイミド(オレゴン州
ニージーンのモレキュラーブローブインコーボレーテッ
ドから入手可能)は、蛋白質のスルフヒドリル基と反応
し安定な共有結合を形成する。
ニージーンのモレキュラーブローブインコーボレーテッ
ドから入手可能)は、蛋白質のスルフヒドリル基と反応
し安定な共有結合を形成する。
システイニル−tプロテインA ” (28μg)及び
フルオレスセイン−5−マレイミド(16μg)を、部
μmの0゜団燐酸ナトリウムpH7,5,0,5a+M
EDTA中で30分間37°Cで培養した。溶液を上
の(8)に記載1ノだように、5DS−PAGEにかけ
蛍光発生する生成物を、詳しい染色前に紫外線の照射に
よフて見ることが出来るようにした。これは、システイ
ニル−rプロテインA”に対応する40kd分子量の強
度に蛍光発生性の蛋白質を表した。同じ条件下で、大腸
菌PR+3 (、pBG3−2ΔN)からの組み替えプ
ロティンAは、はとんど蛍光を有しないか又は蛍光を発
生しない生成物を示した。
フルオレスセイン−5−マレイミド(16μg)を、部
μmの0゜団燐酸ナトリウムpH7,5,0,5a+M
EDTA中で30分間37°Cで培養した。溶液を上
の(8)に記載1ノだように、5DS−PAGEにかけ
蛍光発生する生成物を、詳しい染色前に紫外線の照射に
よフて見ることが出来るようにした。これは、システイ
ニル−rプロテインA”に対応する40kd分子量の強
度に蛍光発生性の蛋白質を表した。同じ条件下で、大腸
菌PR+3 (、pBG3−2ΔN)からの組み替えプ
ロティンAは、はとんど蛍光を有しないか又は蛍光を発
生しない生成物を示した。
システイニル−tプロテインATM及びフルオレスセイ
ン−5−マレイミドの反応生成物を、アガロースに固定
された人IgGOカラム上を通過させたくマイニス イ
ー エル ブイ[+984]メソツズインモレキユラー
バイオロジー、1巻、プロテインズ、ウォルカー ジ
エイ エム編、フマナブレス、ニューシャーシ−Hりリ
フトン、13−20頁)、蛍光性の生成物はカラムに結
合され、そして燐酸塩緩衝液塩水(PBS)で充分に洗
浄しても溶離しなかった。蛍光発生性の蛋白質を0.2
Mグリシン、pH2,0,によってプロティンA様の物
質に対して期待されるように、溶離した。カラム溶履物
の5O5−PAGEによって40kdの蛍光性の蛋白質
が出現した。
ン−5−マレイミドの反応生成物を、アガロースに固定
された人IgGOカラム上を通過させたくマイニス イ
ー エル ブイ[+984]メソツズインモレキユラー
バイオロジー、1巻、プロテインズ、ウォルカー ジ
エイ エム編、フマナブレス、ニューシャーシ−Hりリ
フトン、13−20頁)、蛍光性の生成物はカラムに結
合され、そして燐酸塩緩衝液塩水(PBS)で充分に洗
浄しても溶離しなかった。蛍光発生性の蛋白質を0.2
Mグリシン、pH2,0,によってプロティンA様の物
質に対して期待されるように、溶離した。カラム溶履物
の5O5−PAGEによって40kdの蛍光性の蛋白質
が出現した。
アクティベイテッドチオールセファロース4B(ファル
マシア ファイン ケミカルス)は還元されたスルフヒ
ドリル基と反応し、安定な共有ジスルフィド結合を形成
するゲルである。0.51の0゜1燐酸ナトリウム、p
)17.5.0.5n+M EDTA中のシステイニル
−tプロテインA TT(2mg)を0.51の膨潤さ
せたアクティベイテッドチオールセファロース4Bと混
合し、2時間室温で調整した。ゲルを蛋白質が洗液中に
観測されなくなるまでPBSで洗浄した。ゲルを次にジ
スルフィド結合を還元し、それによって結合された蛋白
質を放出する為に10mMDTTで処理した。5DS−
PAGEによって測定されるように、およそIBの40
kd蛋白質がゲル1当り遊離された。実験を大腸菌PR
13(+)8G3−2ΔN)によって表現される組み替
えプロティンAを用いて実施した時、DTT処理によっ
てゲルから蛋白質は放出されなかった。
マシア ファイン ケミカルス)は還元されたスルフヒ
ドリル基と反応し、安定な共有ジスルフィド結合を形成
するゲルである。0.51の0゜1燐酸ナトリウム、p
)17.5.0.5n+M EDTA中のシステイニル
−tプロテインA TT(2mg)を0.51の膨潤さ
せたアクティベイテッドチオールセファロース4Bと混
合し、2時間室温で調整した。ゲルを蛋白質が洗液中に
観測されなくなるまでPBSで洗浄した。ゲルを次にジ
スルフィド結合を還元し、それによって結合された蛋白
質を放出する為に10mMDTTで処理した。5DS−
PAGEによって測定されるように、およそIBの40
kd蛋白質がゲル1当り遊離された。実験を大腸菌PR
13(+)8G3−2ΔN)によって表現される組み替
えプロティンAを用いて実施した時、DTT処理によっ
てゲルから蛋白質は放出されなかった。
システイニル−tプロテインATMをコードしているヌ
クレオチド配列は、この技術で良く知られた遺伝子機械
によって製造することが出来る。これは、ヌクレオチド
配列が開示されているので可能となる。
クレオチド配列は、この技術で良く知られた遺伝子機械
によって製造することが出来る。これは、ヌクレオチド
配列が開示されているので可能となる。
システイニル−tプロテインATMはBOC及びFMO
C(メリフィールド アール ビー[+963コJ、A
mer、 Chew、 Soc、 85: 2149;
チャング シー及びマイネンホーファー ジエイ[19
78] 1nt、 J、 Peptide Prote
in Res、 +1 : 246)等の固相ペプチド
合成技術によって化学的に合成することが出来る。
C(メリフィールド アール ビー[+963コJ、A
mer、 Chew、 Soc、 85: 2149;
チャング シー及びマイネンホーファー ジエイ[19
78] 1nt、 J、 Peptide Prote
in Res、 +1 : 246)等の固相ペプチド
合成技術によって化学的に合成することが出来る。
この技術で良くしられているように、蛋白質のアミノ酸
配列はDNAのヌクレオチド配列によって決定される。
配列はDNAのヌクレオチド配列によって決定される。
遺伝子コードの冗長性のために、即ち蛋白質を作るのに
使用されるアミノ酸配列の殆どに、一つ以上のコード化
ヌクレオチドトリブレット(コドン)が使用できるので
、特定のアミノ酸配列に対し異なるヌクレオチド配列が
コートし得る。従って、遺伝子コードは以下の様に描か
れる。
使用されるアミノ酸配列の殆どに、一つ以上のコード化
ヌクレオチドトリブレット(コドン)が使用できるので
、特定のアミノ酸配列に対し異なるヌクレオチド配列が
コートし得る。従って、遺伝子コードは以下の様に描か
れる。
キー: 各々の3つの文字のデオキシヌクレオチドトリ
ブレットが51−末端を左側に、そして3′−を右側に
有するmRNAのトリヌクレオチドに相当する。
ブレットが51−末端を左側に、そして3′−を右側に
有するmRNAのトリヌクレオチドに相当する。
本明細書に与えられる全てのDNA配列は、その配列が
、チミンがウラシルに置き換えられているraRNA配
列に対応するものの鎖である0文字は、デオキシヌクレ
オチド配列を形成しているプリン又はピリミジン塩基を
表している。
、チミンがウラシルに置き換えられているraRNA配
列に対応するものの鎖である0文字は、デオキシヌクレ
オチド配列を形成しているプリン又はピリミジン塩基を
表している。
A=アデニン
G=ニブアニ
ン=シトシン
T=チミン
YがA又はG(7)時、X=T又はC
YがC又はTの時、X=C
xがCの時、Y=A、G、C又はT
XがTの時、Y=A又はG
zがA又はGの時、W=C又はA
ZがC又はTの時、W=C
WがCの時、Z=A、G%C又はT
Wがへの時、Z=A又はG
SがT又はCの時、QR=AG
J=A又はG
K=T又はC
L=A、T、C又はG
M=組C又はT
上記は新規な本発明のアミノ酸配列が、ここに開示され
たヌクレオチド配列以外によって製造できることを示し
ている。システイニル−tプロテインA”、又はプロテ
ィンA様の活性を有するその断片の新規なアミノ酸配列
をコードしている機能的に同等なヌクレオチド配列は、
既知の合成手順によって製造することができる。従って
、本発明はそのような機能的に同等のヌクレオチド配列
も含んでいる。
たヌクレオチド配列以外によって製造できることを示し
ている。システイニル−tプロテインA”、又はプロテ
ィンA様の活性を有するその断片の新規なアミノ酸配列
をコードしている機能的に同等なヌクレオチド配列は、
既知の合成手順によって製造することができる。従って
、本発明はそのような機能的に同等のヌクレオチド配列
も含んでいる。
更に、同定された構造及び機能の蛋白質は、変化が蛋白
質の二次構造を変化しないならば、アミノ酸配列を変化
することによって同じ構造及び機能の蛋白質を製造する
ことができることも示されている(カイザー イー テ
ィー及びケラディーエフ ジエイ[1984]サイエン
ス 223 : 249・255)。従って本発明は、
蛋白質の二次構造を変化させない本明細書に記載された
アミノ酸配列の変異物も含むか、又は構造が変化されて
いるならば、生物活性がある程度保持されている変異物
も含む。
質の二次構造を変化しないならば、アミノ酸配列を変化
することによって同じ構造及び機能の蛋白質を製造する
ことができることも示されている(カイザー イー テ
ィー及びケラディーエフ ジエイ[1984]サイエン
ス 223 : 249・255)。従って本発明は、
蛋白質の二次構造を変化させない本明細書に記載された
アミノ酸配列の変異物も含むか、又は構造が変化されて
いるならば、生物活性がある程度保持されている変異物
も含む。
上に示されているように、微生物的方法によって蛋白質
を製造する為に、本発明のシステイニル−tプロテイン
AT”活性をコード化しているヌクレオチド配列を使用
することは、遺伝子工学における当業者の成し得ること
である。そのような配列を表現ベクター中に融合させ、
真核宿主(酵母又は哺乳類の細胞)又は原核宿主(微生
物細胞)のいずれかの宿主中に形質転換又はトランスフ
ェクションさせることは、他の良く知られた蛋白質、例
えばインシュリン、インターフェロン、人の成長ホルモ
ン、その他を製造するのに使用される標準の手順である
。同様な方法又は自明なその修正は、微生物手段又は哺
乳類組織培養技術によって本発明のシステイニル−tプ
ロテインA”を製造するのに使用できる。更に、プロテ
ィンAの抗体結合領域は標準の遺伝子機械手順によって
製造できる。これらの領域は、独立に又はそれに融合さ
れた本明細書に開示されるX領域と種々組み合わせて使
用することができる。X領域をシスティン残基に対し、
コードするように修正することは、標準の手順によって
その領域に融合させる前か、又はさせた後に行なうこと
が出来る。
を製造する為に、本発明のシステイニル−tプロテイン
AT”活性をコード化しているヌクレオチド配列を使用
することは、遺伝子工学における当業者の成し得ること
である。そのような配列を表現ベクター中に融合させ、
真核宿主(酵母又は哺乳類の細胞)又は原核宿主(微生
物細胞)のいずれかの宿主中に形質転換又はトランスフ
ェクションさせることは、他の良く知られた蛋白質、例
えばインシュリン、インターフェロン、人の成長ホルモ
ン、その他を製造するのに使用される標準の手順である
。同様な方法又は自明なその修正は、微生物手段又は哺
乳類組織培養技術によって本発明のシステイニル−tプ
ロテインA”を製造するのに使用できる。更に、プロテ
ィンAの抗体結合領域は標準の遺伝子機械手順によって
製造できる。これらの領域は、独立に又はそれに融合さ
れた本明細書に開示されるX領域と種々組み合わせて使
用することができる。X領域をシスティン残基に対し、
コードするように修正することは、標準の手順によって
その領域に融合させる前か、又はさせた後に行なうこと
が出来る。
プロティンA遺伝子はまたIgG結合領域(単数又は複
数)の前に、N末端コーディング配列中においてシステ
ィンを入れるように修正することができる。別の方法と
して、N末端システィンはプロティンA遺伝子の5′末
端に於いて、合成りNA配列を挿入することによってシ
スティンとIgG結合領域の間にポリペプチドスペーサ
ーを作ることによってIgG結合領域からさらに取除く
ことができる。このスペーサーは長さが約1ないし約1
00個のアミノ酸であり得る。本明細書に開示されるよ
うに、この修正は、任意のプロティンA領域に対し行な
うことができ、そしてその領域は独立に又はそれに融合
された修飾された領域と種々組み合わせて使用すること
が出来る。システィン残基が100結合領域の外側であ
るこれらの修正は、標準の手順を用いて当業者によって
容易になし得ることである。
数)の前に、N末端コーディング配列中においてシステ
ィンを入れるように修正することができる。別の方法と
して、N末端システィンはプロティンA遺伝子の5′末
端に於いて、合成りNA配列を挿入することによってシ
スティンとIgG結合領域の間にポリペプチドスペーサ
ーを作ることによってIgG結合領域からさらに取除く
ことができる。このスペーサーは長さが約1ないし約1
00個のアミノ酸であり得る。本明細書に開示されるよ
うに、この修正は、任意のプロティンA領域に対し行な
うことができ、そしてその領域は独立に又はそれに融合
された修飾された領域と種々組み合わせて使用すること
が出来る。システィン残基が100結合領域の外側であ
るこれらの修正は、標準の手順を用いて当業者によって
容易になし得ることである。
式 A
システイニル−tプロテインA領域のアミノ酸配夕11
0:er”:t’r’ づ >r>r’> 0 ω
〉 づ i ISl、、1.<ビQべωにφΦωヒΦ
dグのOりφωΦcOコφ”ti c ”c+ Dべ(
5)Φ〔自り t−’ −cc>r’t−”>>
○ >>>+>r’roro ゴ【 (φ 火 ■
ω 切 −ヒ ヒ φ × ψ Oへ仁 Φ φ ω
口 ω 仁 ℃ ロ コ 印 郷 p べ °CCr
>r’t”>>00φG〕ωiくづ<t−”a<ω<Φ
φ硝Pビl’D+Ql冥銅ゴΦOべω コ ψ α ℃
ロ ロ Cべ Cべ ψ ヒ ffi+・(0> >
00 ω ○ 〉 ○ cn>”cs>c’+ 0
> OOωω?−’ )−’ IDビωビΦベゴφ
PPωヒP℃ コ コ G I G コ
コ −OQ l’D ’C+ < コ
コ ロ ロ+t ○ の Cn 00 >:
e’H>S>Ocn:l: 工 日ぺ?−’ l−’
ItI+−’ )−11−’ )−’ゴω< + t
−’Φrot−J・γOL:=jM 口 5 印 −
弓 口 Hm 仁 べ 自 ω べCA O> の
C/)> ?cl Y > G;”) Oに
’)> T= m > mのSのl−Iυ目ゴぺ
ω)−’ )−’ )−1)−’Φdωべr 仁 :
j 巨 H(5) Φ 0 り 冥 仁 ロ 郷 C
O・oOのの>>>>sr−”<mHoot”>0日1
−I + )−’ )−’ +−’ φ <
× Φ グ P ビ −【 ω ビ ゴ:Iクー印郷口
dリビOOづ口ωコC1tn :> m We
> 00>r’+r’>t”>r’>>Oべ 0+1
い P ヒ ヒ Oビ Q ω 【 ω O−べ弓
oq o o 口 【 仁 郷 仁 ro(コ
ψ ℃ 仁 Φ 図> > @ t” r’ m s
> 00>t’t−’>>○OSの<<Φゴビωヒビ
φ塁QωいPビ ー ロ ベ ψ 口 roro ℃ 【
コ コ ψ 仁 ℃ = 琶 GシSS
二「=げけSTI謬シマ=S= コ<α…erocコ(:l−11−1(Dり0郷口O*
X領域はGlu−310及びそれに続く全てのアミノ
酸から成っている。
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二「=げけSTI謬シマ=S= コ<α…erocコ(:l−11−1(Dり0郷口O*
X領域はGlu−310及びそれに続く全てのアミノ
酸から成っている。
式 B
システイニル−tプロテインA”のヌクレオチド配列
式 C
26の塩基対挿入物の配列
式 D
Oss)l IIで制限されたpBG3−2ΔNに挿入
された新規なオリゴヌクレオチドデユーブレックスAr
g Ala Cys Gly 5top5’ CGC
GCA TGCGGCTAG CCG CAT G
3’3’ GT ACG CCG ATCG
GCGTA CGCGC5’Sph I
Sph 1
された新規なオリゴヌクレオチドデユーブレックスAr
g Ala Cys Gly 5top5’ CGC
GCA TGCGGCTAG CCG CAT G
3’3’ GT ACG CCG ATCG
GCGTA CGCGC5’Sph I
Sph 1
第1図はシステイニル−tプロテインATI″を表現す
る新規なプラスミド(pBG3−Cys)を構築するの
に使用する手順を示す。
る新規なプラスミド(pBG3−Cys)を構築するの
に使用する手順を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、修飾が単一のシステイン残基を有するプロテインA
の表現を生じ、その修飾がIgG結合領域の外側である
修正されたプロテインA遺伝子。 2、修飾が単一システイン残基を有するプロテインAの
表現を生じ、その修飾がC−末端X領域中である特許請
求の範囲第1項に記載の修飾されたプロテインA遺伝子
。 3、式Aに示されるアミノ酸配列を有する特許請求の範
囲第2項のシステイニル−rプロテインA^T^Mに対
するコードを有するDNA。 4、修飾が、単一のシステイン残基を有するプロテイン
Aの領域またはプロテインA領域の組み合わせの表現を
生じ、その修飾がIgG結合領域の外側である領域E、
A、B、C、またはDから選ばれる修飾されたプロテイ
ンA遺伝子領域。 5、修飾が単一システイン残基を有するプロテインA領
域またはプロテインA領域の組み合わせの表現を生じ、
上記修飾がC−末端X領域中である領域E、A、B、C
、またはDから選ばれる特許請求の範囲第4項に記載の
修飾されたプロテインA遺伝子領域。 6、IgG結合領域の外側にシステイン残基を有するプ
ロテインA分子からなる修飾されたプロテインA。 7、X領域中にシステイン残基を有するプロテインA分
子からなる特許請求の範囲第6項に記載の修飾されたプ
ロテインA。 8、特許請求の範囲第7項に記載のシステイニル−rプ
ロテインA^T^M。 9、IgG結合領域の外側にシステイン残基を有する領
域E、A、B、C、またはD、またはこれらの領域の組
み合わせから選ばれる修飾されたプロテインA領域。 10、X領域中にシステイン残基を有する領域E、A、
B、C、またはD、または上記領域の組み合わせから選
ばれる特許請求の範囲第9項に記載の修飾されたプロテ
インA領域。 11、IgG結合領域の外側にシステイン残基を有する
プロテインA分子からなる修飾されたプロテインAに対
してコードしているDNAを含むDNAトランスファー
ベクター。 12、C−末端X領域中にシステイン残基を有するプロ
テインA分子からなる修飾されたプロテインAに対して
コードするDNAを含んでる特許請求の範囲第11項に
記載のDNAトランスファーベクター。 13、IgG結合領域の外側にシステイン残基を有する
領域E、A、B、C、またはD、またはそれらの領域の
組み合わせから選ばれる修飾されたプロテインA領域に
対してコードするDNAを含んでいるDNAトランスフ
ァーベクター。 14、C−末端X領域中にシステイン残基を有する領域
E、A、B、C、またはD、またはそれらの領域の組み
合わせから選ばれる修飾されたプロテインA領域に対し
てコードを有しているDNAを含んでいる特許請求の範
囲第13項に記載のDNAトランスファーベクター。 15、式Aに示されるアミノ酸配列のシステイニル−r
プロテインA^T^Mに対してコードを有しているDN
Aを含む特許請求の範囲第14項に記載のDNAトラン
スファーベクター。 16、プラスミドpBG3−Cysである特許請求の範
囲第15項に記載のトランスファーベクター。 17、原核宿主または真核宿主中に形質転換され、複製
された特許請求の範囲11、12、13または14項に
記載のDNAトランスファーベクター。 18、大腸菌PR13(pBG3−Cys)、NRRL
B−18194である特許請求の範囲第17項に従っ
て形質転換された宿主。 19、システイン残基をIgG結合領域の外側に有して
いるプロテインA分子からなる修飾されたプロテインA
を共有結合させることからなる (a)血清からの抗体の分画方法、または (b)モノクローナル抗体の精製方法、または(c)血
漿から循環している免疫複合体を除去する方法、または (d)免疫化学方法におけるIgGの探査方法または(
e)組織化学または細胞学方法。 20、X領域中にシステイン残基を有するプロテインA
分子からなる修飾されたプロテインAの共有結合からな
る特許請求の範囲第19項に記載の方法。 21、修飾されたプロテインAがシステイニル−rプロ
テインA^T^Mである特許請求の範囲第20項に記載
の方法。 22、システイニル−rプロテインA^T^Mをフルオ
レスセイン−5−マレイミドと結合させ、フルオレスセ
イン標識システイニル−rプロテインA^T^Mを与え
る特許請求の範囲第21項に記載の方法。 23、システイニル−tプロテインA^T^Mが、チオ
ール親和性物質に結合される特許請求の範囲第21項に
記載の方法。 24、上記チオール親和性物質が活性化チオールセファ
ロース4Bである特許請求の範囲第23項に記載の方法
。 25、IgG結合領域の外にシステイン残基を有するプ
ロテインA分子に対してコードするDNAを含んでいる
DNAトランスファーベクターで形質転換した微生物宿
主を培養することからなる修飾したプロテインAを製造
する方法。 26、X領域中にシステイン残基を有するプロテインA
分子に対しコードを有するDNAを含んでいるDNAト
ランスファーベクターで形質転換した微生物宿主を培養
することからなる修飾されたプロテインAを製造する特
許請求の範囲第25項に記載の方法。 27、修飾したプロテインAがシステイニル−rプロテ
インA^T^Mである特許請求の範囲第26項に記載の
方法。 28、微生物宿主が大腸菌PR13(pBG3−Cys
)、NRRLB−18194である特許請求の範囲第2
6項に記載の方法。 29、IgG結合領域の外側にシステイン残基を有する
修飾されたプロテインA領域、またはそれらの領域の組
合せに対するコードを有するDNAを含んでいるDNA
トランスファーベクターで形質転換した微生物宿主を培
養することからなるIgG結合領域の外側にシステイン
残基を有している領域E、A、B、C、またはD、また
はこれらの領域の組合せから選ばれる修飾されたプロテ
インA領域を製造する方法。 30、X領域にシステイン残基を有する修飾されたプロ
テインA領域またはその領域の組合せに対するコードを
有しているDNAを含んでいるDNAトランスファーベ
クターで形質転換された微生物宿主を培養することから
なるX領域中にシステイン残基を有する領域E、A、B
、C、またはD、またはこれらの領域の組合せから選ば
れる修飾されたプロテインA領域を製造する特許請求の
範囲第29項に記載の方法。
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