JPS63246339A - 親油性有効成分のリポタンパク質への取り込み方法、そのリポタンパク質および医薬組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野１ 本発明は、罹病細胞に１または複数の油溶性の有効成分
を輸送するようにした、リポタンパク質から成る医薬組
成物と、この組成物を得ることができる方法とに関する
。

［従来技術および解決すべき課８］ これらの組成物は、多くの感染の治療、たとえば寄生虫
、真菌、またはバクテリアによる感染の治療を目的とす
る。

これらの感染の治療は、実際、感染性作因の細胞内局在
化および入手可能な治療剤の無視し得ないｆｚｉ性によ
って、一般に困難となっている。

たとえば、リーシュマニア症は、細網内皮系の細胞に寄
生する原生動物、リーシュマニアにより引き起される。

アルブリングＣＡｌｖｒｉｎｇ）（１）によれば、１２
００万Å以上の人がこれに苦しめられている。この病状
に対して有効な化合物も存在するが、これらを使用する
ことは、残念ながらその高毒性のために限定されている
。

この治療上の問題は、寄生虫、真菌またはバクテリア原
因によるものであるかどうかはともかく、すべて、細網
内皮系の細胞間感染に関するものである。

さらに一般的に言えば、今１」の治療の大きな欠点の１
つは、有効分子の特異性が不十分なことである。これら
の有効分子の大多数は、余りにも変化のある部位のレベ
ルにおいて、十分な識別なく作用し、その投与は、はと
んどいつも、好ましくない影響の出現となって現われる
。

この問題を解決する一つの方法は１選定した部位へ、す
なわち、ねらいとする標的へのみ有効成分を案内するこ
とができるビヒクルを使用することから成る。ビヒクル
の不可欠の特性は、予定される用途と関連する：すなわ
ち、ねらいとする単一の標的に対しては、生分解性、無
毒性、向性である。これのほかに、工業的限定も加味さ
れなければならない：すなわち、大規模生産、十分な期
間の保存である。これまで種々のビヒクルが考えられて
いる：すなわち、高分子、細胞外皮、リポソーム、ナノ
カプセル等である。

現在では、リポタンパク質が細胞に対して、特に細網内
皮系の細胞に対して、極めて顕著な向性を有しているこ
とは確証されている。この向性は、生物体のコレスチロ
ール・サイクルと関連している。実際、リポタンパク質
は、生物体中でコレスチロールを担持する錯体である。

これらの錯体は、キロミクロン密度に従って、極低密度
リポタンパク質（ＶＬＤＬ）、低密度リポタンパク質（
ＬＤＬ）および高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）に分類
される。

リポタンパク質の細胞向性は、つぎのような方法で図式
的に説ＩＪＪすることができる：コレスチロール内での
必要を満たすために、細胞はこれらのリポタンパク質を
吸収する：これを行なうために、リポタンパク質は細胞
受容体に固定される；細胞受容体は細胞の表面において
空乏領域に移動する：これらの領域はだんだんと細胞の
細胞質内に侵入し、最後に全受容体−リポタンパク質ユ
ニットをふさいで小胞を形成する；これらの小胞は細胞
内に移動する；この移動中に、受容体はリポタンパク質
から分離され、細胞表面に戻る；遊離したリポタンパク
質は、酵素の作用によってコレスチロールを解放させる
リポソームと合体する。

細胞に対するこの極めてｍ！な向性によって、リポタン
パク質は、種々の症状の感染の治療において優れた細胞
間薬効ベクターを形成する。

１９８２９８２年カランセルｕｎｃｅｌｌ）と同僚（２
）は、ＬＤＬを薬剤ベクターとして用いる可能性を挙げ
ている。実際、細網内皮系、またはコレスチロールに対
して高代謝を有する組織に向けて有効成分を案内するの
に、ＬＤＬの単一の特異性の利益を受けることは可能で
ある。

さらに、ＬＤＬはその構造によって、種々の親油性化合
物、特に抗ガン作用を有する脂肪族鎖ヴィンカアルカロ
イド（Ｖｉｎｃａ　ａｌｃａｌｏｉｄ）ｉ４導体の極く
小さい容積（約２０ＯＡ径）内に封入できるものでなけ
ればならない。

リポタンパク質、特にＬＤＬ内に治療用化合物を封入す
ることを目的とするいくつかの技術は。

文献（３）に記載されている。これらは多くの欠点を示
している：すなわち、極めて低いＭ人歩留り、アポタン
パク賀Ｂの生物作用の随拌変化を伴なう有機溶剤への依
存、活性転移現象への依存である。

これらの欠点は、その大部分は、リポタンパク質を細胞
間ベクターとして使用することを不可能にしている。こ
のように、たとえば、アポタンパク￥［Ｂは、ＬＤＬｍ
ｌ！！受容体による認識の特定部位を構成するＬＤＬの
成分プロティンである。このタンパク質の修飾あるいは
その生物作用の変化は、明らかに細胞受容体による非認
識を生じ、したがって、細胞によるＬＤＬの非吸収を生
じる。

［課題を解決するための手段１ 本発明は、いかなるタイプの脂質または油溶性化合物に
も適用することができ、リポタンパク質の生物学的性質
を変えることのない対人方法を開発するものである。

本発明による方法は、本質的には、任意の洗浄剤によっ
て、ｌまたは複数の親油性の有効成分をリポタンパク質
中に取り込むことから成る。

その本質的な特徴によれば１本方法はっぎのステップか
ら成る： ａ）　リポタンパク質を洗浄剤の存在下に置く、ｂ）つ
ぎに、得られた混合物を有効成分の存在下に置く、 Ｃ）最後に、洗浄剤を除去する。

本プロセスは、油溶性の治療剤または化学的修飾により
油溶性としたものを、リポタンパク質の生物学的性質に
影響を与えることなくリポタンパク質に取り込むことを
可能とするものである。さらに、治療剤はいったん取り
込まれると、その作用を保持する。

本方法に使用される洗浄剤の量としては、リポタンパク
質１膳ｇ当り０．００１ｍｇから１ｍｇを挙げることが
でき、有効成分の量としては、リポタンパク質１ｍｇに
つき０．００１　ｍｇから５ｓｔｇを挙げることができ
る。

しかしながら、これらの値は例示のためだけに示された
ものであって、低使用量で極めて有効な洗浄剤を見つけ
出すことがいつも可能であるという程度まで限定するも
のではない、これは、有効成分についても同じである。

逆に、経済的要請から離れると、本方法を実施する間に
洗ｎ１剤を除去するので、最終的結果に変化を！ｊえる
ことなくより大驕の洗浄剤を使用することも可能である
。

本発明によれば、つぎのことを挙げることができる： ・本技術を容易に工業的に利用することを可能とする単
純さ。

・化学的合成の複雑なステップにたよることなく、任意
の疎水性の有効成分に適用可能である。という事実、 ・先行方法とは違って、有機溶剤を使用せず、また遠心
分離または凍結乾燥操作を使用せず、したがって、得ら
れた調整物は人間の治療への使用により好適なものとな
っている。

取り込みのメカニズムは複雑である。明らかに、洗浄剤
の２つの異なる機能が識別される。実際、後者はリポタ
ンパク質の解離あるいは膜を透過性とする機能を有して
いる。

一方で使用する洗浄剤の濃度、したがって臨界的ミセル
の濃度が低くあるいは高くなるにつれて、他方で洗浄剤
とリポタンパク質の間のモル比が大きくあるいは小さく
なるにつれて、選択的にあれやこれやのメカニズムが働
く。

実際、洗浄剤分子がミセルを形成すると、リポタンパク
質の膜を介して取り込みは困難となり。

解離が生じる。

さらに、リポタンパク質に対する洗浄剤の重量比が大き
くなると、解離がさらに確実に生じるのは明らかである
。

したがって、特に洗浄剤のミセル濃度に対する特別の実
施例によれば、ｌまたは複数の親油性有効成分をリポタ
ンパク質へ取り込む方法は、つぎのような連続ステップ
から成ることを特徴とする： （ａ）リポタンパク質を洗浄剤の存在下に置くことによ
って、その要素に解離する。

（ｂ）解離後、ステップ（ａ）で得た要素を、取り込む
べき有効成分の存在下に置く、 （ｃ）ついで、アポタンパク質の変化または修飾の後リ
ポタンパク質を再構成し、洗浄剤を除去することによっ
て有効成分を封入する。

サブミセルの濃度については、上記したように、リポタ
ンパク質の解離は生じず、あるいは少なく、取り込みが
リポタンパク質の膜を通して行なわれる。

未発ＩＪＩによる薬剤ベクターとして特に有用なリポタ
ンパク質はＬＤＬであるが、本発明の方法は、乳び脂質
、極く低密度リポタンパク質（Ｖ　Ｌ　Ｄ　Ｌ）および
高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）のような他のリポタン
パク質にも適用することができる。

ＬＤＬの要素は、本質的にはコレスチロール・エステル
、リン脂質および遊離コレスチロールさらにタンパク質
ニアボタンバクＷＢである。

本方法のステップａ）は、好ましくは、脱酸コール酸ナ
トリウムのようなスチロール酸（ｓｔｅｒｏｌ　１−ｃ
ａｃｉｄ）の塩のような洗浄剤により行なわれる。この
洗浄剤は本明細書の他の箇所ではＮａＤＯＣと命名され
る。コレスチロールに近い構造を有する洗浄剤を使用す
ることによって、リポタンパク質において安定化作用を
働かせることができる。

しかしながら、任意のイオン系または非イオン系洗浄剤
、特により低価格の洗浄剤であってもよい。

実際、洗浄剤成分は、本発明によれば、イオン系、非イ
オン系、両性または双極特性を有するもの、あるいはこ
れらのタイプの混合物であってもよい、双極性および両
性を有するこのようなイオン系、非イオン系の表面活性
剤のリストは多数文献に見ることができる。

リポタンパク質に取り込まれる有効成分は任、αのもの
でよいが、好ましくは抗寄生虫剤、抗菌剤、抗バクテリ
ア剤および抗ガン剤の中から選ばれる。この親油性の有
効成分は直接または親油性鎖をその構造に結合した後取
り込まれる。

アポタンパク質Ｂは、その向性あるいはその作用を変え
るために、たとえばアセチル化により化学的に修飾して
もよく、あるいは他の７ボタンパク質に変えてもよい。

好ましくは、アセチル化したＬＤＬが用いられる：後者
は、実際、大食細胞のような細網内皮系の細胞に対する
極めて顕著な向性を有している。

ステップｂ）においては、ＬＤＬ！素の存在下に有効成
分を置くことは、得られた要素と洗浄剤を有効成分と接
触させることにより行なう。

最後に、ステップＣ）において、洗浄剤の除去は任意の
適宜方法、特に透析により行なうことができる。

本発明は、ｌまたは複数の有効成分を取り込んだ後のリ
ポタンパク質にも及ぶものである。

薬剤ベクターとして有用なリポタンパク質は、出発時に
、つぎの化学的組成を有している。

本発明は特にＬＤＬに関する。

ＬＤＬ（低密度リポタンパク質）は１人間の血しょう中
に存在し、コレスチロールの輸送に関するリポタンパク
質である。これらは、約１５００のコレスチロールの長
鎖エステル分子から成る中央の脂質部分を含む直径２２
０Ａの球状粒子である。この中央脂質空間は、約５００
の遊離コレスチロール分子と、８００のリン脂質分子と
、タンパク質ニアボタンバク賀Ｂ−１００から成る極性
球状層の内側に閉じ込められる。

人間の細胞は、その表面にＬＤＬに対する受容体を有し
ている。いったん受容体に接合されると、ＬＤＬは細胞
内に入り（ｅｎｄｏｃｙｔｅｄ）　、リソソームに分解
する。

ＬＤＬ細胞受容体により特定的に認識され、したがって
ＬＤＬを特定の細胞に差し向けるのは。

このアポタンパクｆｆＢである。このアポタンパク質は
１本発明による方法によりｌまたは複数の有効成分をＬ
ＤＬに取り込んだ後も、生物学的特性を完全に保持する
。

しかしながら、罹病細胞をさらに特定的に標的とするた
め特にガン細胞に到達させるために、上記アポタンパク
質を化学的に修履することができる。これは、場合によ
っては、リポタンパク質の再構成のステップＣ）の前に
行なわれる。

実際、ｆ質＜べきことに、リポタンパク質の解離のステ
ップの過程において、アポタンパク質はＬＤＬの他の脂
質成分から分離されて、洗浄剤に緊密に結合される。

本発明によれば、このタンパク質を取り込んだ洗浄剤を
除去し、当業者に公知の技術によりアポタンパク質を収
集し、たとえばこれに特定の細胞、特にガン細胞の受容
体による認識の部位をさらに与えるように化学的に修飾
することができる。

いったん修飾されたアポタンパク質は、洗浄剤により、
ｌまたは複数の有効成分を取り込んでい′　　　る可能
性のあるＬＤＬの再構成のための他のリポタンパク質成
分とともに、再導入することができる。

これは１本発明が何故、アポタンパク質Ｂを意図的に修
飾したリポタンパク質にも関するものとしているかの理
由である。

ＮａＤＯＣの場合には、臨界ミセル濃度は２■義のオー
ダである。

１０対３０のリポタンパク賀に対する洗浄剤の重に比に
ついて、解離メカニズムが観察され、透過性メカニズム
は１対３のオーダの重量比について、よりヤ〈間に生じ
てくる。

最後に、本発明は、ｌまたは複数の油溶性の有効成分を
輸送するようにされ、本発明による方法によって上記有
効成分を取り込んだリポタンパク質から成る医薬組成物
にも関する。輸送された有効成分は任意のものであって
よい：特には、抗菌あるいは抗ガン化合物である。たと
えば、これは、フランス国特許願第８８０１４９８　、
第８８００３６４４および第８８１７４１２号に記載さ
れているケトコナゾール（ｋｅｔｏｃｏｎａｚｏｌｅ）
またはゲインカアルカロイドの誘導性に関するものであ
ってもよい。

■アセチルＬＤＬマクロファージ相互作用の研究１）Ｌ
ＤＬの特徴 ＬＤＬは電子顕微鏡で見ると直径が約２００オングスト
ロームの球状で且つ均質な分子に見える０例えば年が経
つことによって生じるＬＤＬの変質は凝集現象を引起し
、ＬＤＬは積層板状に凝集する。

ここにおいて述べられているＬＤＬの生体活生研究は、
マクロファージＪ７７４Ｇ８について連続的に行われて
おり、これはアセチル化によって化学的に変化させたＬ
ＤＬのための排他的受容体を有している。この化学的変
化は形態的変化として表わされる。電子顕微鏡の下では
、アセチル化されたＬＤＬはもはや球状の分子としてで
はなく、楕円状の形状を有するものとなっている。この
現象は全体的にＬＤＬの変化プロセスとは異なっている
。

２）マクロファージの特徴 アセチルＬＤＬ受容体の研究のためのモデルとして用い
られている細胞は、マウスの細胞のもので、子宮のリン
パ腫から一本の線状を保って取出されたもので、即ちＪ
７７４Ｇ８である。この線は腹１ｇ！のマクロファージ
と同様多くの特徴を有するものである。このＪ７７４０
８は、とりわけアセチル−ＬＤＬとそれを新陳代謝させ
たものとして考えることができる。得られた結果のすべ
ては、この新陳代謝プロセスがすべての点でブラウンが
彼の１１Ｍ膜のマクロファージにおける研究（文Ｍｔ％
号４）において述べていることと同じである。

３）Ｌ且旦立１±±亜進 文献番号５のバス及びコールの技術によれば、ＬＤＬの
７０％以上の不可逆的沈降が導かれるが、この沈降を１
７％にまで下るもっとおだやかな変化方法が発明された
。

ａ）卯 酢酸無水物はＬＤＬのアセチル化を誘発することができ
るもので、アポタンパク質Ｂの溶解素機能のｅ−ＮＨ２
残留物のレベルにより生ずるものである。

ＬＤＬの調製物ｌ■Ｌ（５層ｇ）を、飽和ナトリウムア
セテート溶液１ａＬに対して加える。そして全体を４℃
に保ちつつ常に攪拌する。それから２ル１の無水物を等
分して１５分毎に加える。このときｐｈを常にチェック
して、０．１ＭのＮａＯＨを加えてｐｈａに保つ、変化
した溶解素のパーセンテージはフルオルスキャミンの反
応に従う（フルオルスキャミンは第一級アミン官能基と
反応して蛍光化合物を形成する。）もので、アセチル化
プロセスは反応した溶解素残留物の割合が４５％を示し
たときに停止される。

Ｃ）トリチムムによるアセチル化 １ｍＬの飽和ナトリウムアセテート溶液を１ｍＬのＬＤ
ＬＪＩ製物（５騰ｇ）に加える。トリチウム化した酢酸
無水物（１００ｍＣｉ）をそれから更に加え、調製物に
標識を付け、攪拌しながら４℃に保つ、アセチル化は冷
たい酢酸無水物を加えることによって上述のように続け
られる。

アセチル化に続いて、ＬＤＬは球状の形状を失い楕円状
の形状を取るにいたる、この減少はＬＤＬ減虞減口プロ
セス全く異なるものであり、“積層板”への凝集によっ
てそれ自体明白なことである。

放射性元素を使って識別したアセチル−ＬＤＬを得るこ
とは、酢酸無水物のトリチウム化によって得られる０反
応の終了時点において、調製物は溶解性トリクロ酢酸の
放射能をパーセンテージを１％に回復させるために緩衝
薬Ｂ（ＮａＣ１０，１５Ｍ、Ｋ）ｌ　　ＰＯ１０ｍＭ、
ｐＨ７，４）に対して透析される。

トリチウム化したアセチル−ＬＤＬ（１０ｇ／量１）の
存在の下でマクロファージＪ７７４Ｇ８ｅ培養するとき
は、細胞に付帯した放射能は時間の経過に従って増加し
２時間後には安定する。３０分後には培養組織中に消化
生成物が存在し、５時間後まで直線的に増加する。

クロロキンの存在の下では、消化プロセスはブロックさ
れ、未消化のアセチル−ＬＤＬの細胞内での濃度は増加
する。クロロキン中の濃度が働いても捕獲（消化と蓄積
によって生じる。）は変わらずに残る。このことは、消
化プロセス中でのりソソームの役目を証明する。

５）主ヱ７４Ｇ８ｆ７ｅ２７　−’；Ｋｔ６’乙−ｔ４
−）Ｌｒアセチル−ＬＤＬ受容体の特徴付けのために、
トリチウム化したアセチル−ＬＤＬが蓄積研究の対象と
される。スキャチャードの結果を解析すれば、二つのタ
イプの凝固の存在が示される。高親油力位置とある特定
の低親油力位置とである。

６）トリチウム化したアセチル−ＬＤＬの置　の砥六 Ｊ７７４Ｇ８マクロファージの存在の下でアセチル−Ｌ
ＤＬ受容体に対して純粋のＬＤＬがどこまで相互作用を
及ぼすことができるかという点を観察するのは非常に興
味深いものである。この目的のために、比較試験が行な
われ、アセチル−ＬＤＬ及びＪ７７４Ｇ８によってトリ
チウム化したアセチル−ＬＤＬの代謝におけるＬＤＬの
影響が研究された。

トリチウム化したアセチル−ＬＤＬの蓄積を８６％減少
させるのに十分な２０程度のアセチル−ＬＤＬのモル当
り過多が見られた。他方、ＬＤＬはこのような競争効果
は発揮していない。

事実、モル当り２０の過多の存在は、単にトリチウム化
したアセチル−ＬＤＬの蓄積を１０％減少させる結果を
生むだけである。トリチウム化したアセチル−ＬＤＬの
消化におけるアセチル−ＬＤＬの効果についても同じ観
察をすることができる。

７）級論 上記全ての結果は、アセチル−ＬＤＬがＪ７７４Ｇ８マ
クロファージの表面にある特定の受容体に対して固定さ
れていることを示している。これらの受容体は、比較試
験によって示されるように、排他的にアセチル化したＬ
ＤＬを認識するものである。

固定されたアセチル−ＬＤＬはそれからりソソームに運
ばれて消化される。事実、もしリソソーム酵素がコロロ
キンによって抑制されたなら、消化生成物はもはや細胞
外の媒体中には見られなくなるであろう（文献６）。

リソソームのレベルにおいて、アポタンパク質Ｂはアミ
ノ酸に分解される。脂肪酸及びコレスチロールは遊離さ
れ、続いて細胞膜中に取り込まれる。

セファローズ（ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）　ＣＬ　−４Ｂに
よッテ分離さｈたＬＤＬを、緩衝剤Ｃ（ＮａＣＯ５０ｓ
Ｍ；Ｎａｃｌ　　　　５０＋Ｎ；　　　　ｐＨ１０）　
　　に　対して４℃で２４時間透析する。この調整物に
ＮａＤＯＣをＬＤＬの１ｍｇあたり２．５ｍｇｃ７）比
率で添加する。

室温での３０分間の培養の後に、標本を。

１０ｓ＋ＭのＮａＤＯＣを含む緩衝剤（Ｎａ　　Ｃ０５
０ｍＮ；ＮａＣＪｌ　　　５０ｍＮ；ＮａＤＯＣ１０ｍ
Ｍｐｈｌｏ）で予め平衝させたセファデックスＧ２００
のクロマトグラフにかけた（第２図）。

タンパク賀組成がカラムの死空間（ｄｅａｄ　５ｐａｃ
ｅ）に溶出し、一方脂質は全容積に溶出する。アポタン
パクｌ１１（ａｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）Ｈの回収率は９２
％である。

ＮａＤＯＣの添加の前後にわたって、１％アガローズ（
ａｇａｒｏａｅ）上の電気泳動によってＬＤＬをテスト
した。ＮａＤＯＣでのＬＤＬの処置によって、混合ミセ
ルの形成がもたらされる。この解離は、もはやＬＤＬの
特徴的移動には対応しないぼやけバンド（ｄｉｆｆｕｓ
ｅｄ　ｂａｎｄ）の表出によって、電気泳動中で実証さ
れる。

もし解離が中性ｐＨで行なわれるならば、あるいはＮａ
ＤＯＣの添加量がＬＤＬＩ膳ｇあたり１ｍｇに低下する
ならば、アポタンパクＷＢはコレスチロール・エステル
およびトリグリセリド（ｔｒｉｇｌｙ−ｃｅｒｉｄｅｓ
）に結合したままである。

上述の方法により回収したアポタンパク質Ｂは、ヒトの
抗アポタンパク賀抗血清に関する抗原活性を保存する（
第４図）。

アポタンパク？ｊＢの変質の口ｆ能性を実証するために
、アポタンパク質ＢＩ：５Ｄｓ−ＰＡＧＥでテストした
。染色後に、３１６，２００の分子量に対応する単一バ
ンドが観測される。これは、ＧｈａｐｍａｎｎおよびＣ
ａ１ｌの結果に一致する（第５．７図）。

集めたアポタンパク質ＢがＮａＤＯＣで複雑化されるこ
とに注意されたい、セファデックスＧ２００のクロトマ
グラフのみによってこのＮａＤＯＣを除去することが可
滝である（洗浄剤の不存在下で）。

アポタンパク質を含む両分は目に見える沈殿を示さない
が、毎分４０．０００回転（ｒｐｍ）の遠心分離を１時
間行なうことによって、アポタンパク質Ｂの沈殿がもた
らされれる。

２）洗浄剤除去による再構成ＬＤＬの獲得ここでの方法
は、１）で上述した混合ミセルへのＬＤＬの解離に基ず
く、第２の段階においてこれらのミセルから洗浄剤を除
去するのが十分であり、それにより異なるＷ１質および
アポタンパク質が均一粒子へと再結合される。ＬＤＬは
ＮａＤＯＣの存在下で解離される（１参照）。

１リツトルの緩衝剤Ｃに対して５回透析することにより
、ＮａＤＯＣを除去する。ＮａＤＯＣ−［１４Ｃ］の同
時使用によって、これらの条件下で９９％以上の洗浄剤
が除去される０次に調整物を緩衝剤Ｂに対して再透析す
る。

３）匹椹處互旦１五丑並 再構成ＬＤＬを、！ｌ衝剤Ｃの存在下でセファデックス
　Ｇ２００のクロトマグラフにかける。

タンパク質組成が、安定な巨大分子錯体を形成する異な
る成分と同時に溶出することが観測される（第６図）。

１％アガローズｔの電気泳動において、この錯体が天然
ＬＤＬの移動に類似するβ型の移動を示す（第７図）、
同様にして、免疫電子泳動において、再構成ＬＤＬの振
舞は、天然ＬＤＬのそれに全く類似する（第８図）、電
気顕微鏡解析によって再構成ＬＤＬの調整物の均一性が
明らかにされる。それらの平均直径は２００オングスト
ロームである。

４）再構成ＬＤＬ　７−作用〜ＪＥＧ 解離−再結合過程がセルレセプター（ｃｅ　ｌ　１ｒｅ
ｃｅｐｔｏｒｓ）によるリポタンパク質の認識を妨げな
いことをチェックするために、ＪＥＧ型の絢毛癌（ｃｈ
ｏｒｉｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）細胞で再構Ｉ＆ＬＤ　Ｌ
を培養する。これらの細胞はその表面において、天然Ｌ
ＤＬのためのレセプターをポす、テストは、培養時間の
関数としての３７℃の研究に任意に制限され、３０分後
に消火作用が表われ、２０時間線形のままである。

５）再構成　術によるＬＤＬ　　の　射　　１１℃見の
ＬＤＬ（ｍｇ／層ｌ）を１リットルの緩衝剤Ｃに対して
４℃で２４時間透析する。この調整物に対シテ、２０ｉ
ｔｇ／ｍ１（７）Ｎ　ａＤＯｃ溶液４００ＪＬｌと４１
Ｌｌのトリチウム化コレスチロール溶液（メタノール１
ｍｇあたり４．６４ｓ＋ｇ）とを添加する０周囲温度に
おける２時間の攪拌の後に、標本を緩衝剤Ｃに対して透
析する。

再結合過程にトリチウム化コレスチロールがどの程度関
与するのかを測定するために、標本を、緩衝剤Ｃの存在
下でセファデックス　Ｇ２００のクロマトグラフにかけ
た（第９図）、再構成中に印加した放射能の９０％が死
空間で７ボタンパク質Ｂおよびコレスチロールに関連し
て見出されることが観測される。こうして得た再構ｔＬ
ＤＬが、天然ＬＤＬの物理化学的および生物学的特性の
全てを示す。

ｂ）コレスチロール１　　の　番゛み ■−５ａ）で述べたのと同笠な方法をコレスチロール油
酸塩（ｏｌｅａｔｅ）　［ｌ’Ｃ］の取り込みに適用す
る（第１θ図）、取り込みの後に、標本を２つの両分に
分割する。第１の両分を冷間アセチル化し、次に緩衝剤
Ｂ　（Ａｃ−ＬＤＬ　　ｒｅｃ、　　Ｏ。

ＣＨＯＬ　［口Ｃ１）に対して４℃で２４時間透析する
。

第２の両分は変形（ＬＤＬ　ｒｅｃ、Ｏ，ＣＨＯＬ［１
４Ｇ］）を受けない。

１％アガローズ上の電気泳動において、再構成されたＬ
ＤＬコレスチロール油酸塩酸塩Ｄ　Ｌｒｅｃ、　　Ｏ、
ＣＨＯＬ　［”Ｃｌ　）が天然ＬＤＬと回答に移動する
。

Ａｃ−再構成ＬＤＬコレスチロール油酸塩酸塩色彩によ
って検出できるほど十分に濃縮されないので、アガロー
ズ・ゲルを２層層片に切断する。その後に各片は［１４
Ｃ］をカウントする対象となる。このようにして、アセ
チル化の場合において移動の増大を確かめることが可能
である。

マクロファージおよびとりわけＪ７７４Ｇ８ＳがＬＤＬ
内の存するコレスチロール・エステルを蓄積し、「泡状
」セルに変形されることが、知られている。この現象が
観測されるが、わずかなＬＤＬが化学的に、たとえばア
セチル化によって変形される。Ｊ７７４　　Ｇ８マクロ
ファージが、再構成ＬＤＬコレスチロール油酸塩酸塩在
下で３７℃で培養される（第１１図）。

アセチル化調整物の場合には、細胞（セル）に関連する
放射能が時間経過により線形に増大し、コレスチロール
・エステルの細胞蓄積を実証する。レセプターによって
認識されない非アセチル化調整物は、この特性を示さな
い、いずれの場合にも、綱胞外媒体の中で可溶性トリク
ロル酢酸の放射能を検出することは不可能である。ゆえ
に、消化はコレスチロール−エステルには関係しないこ
と、およびコレスチロール・エステムは細胞質内で蓄積
することを結論できる。

６）敲迩 導入部で述べたように、ＬＤＬは、約８０％のＩｌｌ、
なかでもコレスチロール−エステル、フリー・コレスチ
ロール、リン脂質およびトリグリセリドを含む、たとえ
ばＮａＤＯＣなどのような洗浄剤がＬＤＬの構造を破壊
し得ることを実証した。この過程の間に、ＮａＤＯＣ（
比較的弱いイオン性洗浄剤）が、アポタンパク質Ｂにお
よび混合ミセルを形成するＬＤＬの他の脂質化合物に結
合する。この作用中にアポタンパク質Ｂは減成しない。

加えて、この四元構造は全く変形しない、何故ならば、
この処置の後にアポタンパク質Ｂがその生物学的活性を
維持するからである。コレスチロールに近似する構造の
ＮａＤＯＣがアポタンパク質Ｂの直接の環境内に存する
コレスチロールの代わりに用いられるという仮説を進め
ることが可能である。ゆえにこの技術は、可溶形式にお
いてかつ顕著な変形無しにアポタンパク質Ｂの精製を可
能にする。

この解離の可逆性を実証することもできた。事実、洗浄
剤の除去のみによって、無償のＬＤＬが回収され、出発
用ＬＤＬの全ての特徴を示す、このことは、ＬＤＬが熱
力学的に好適な構造に相当するという事実を保証する。

ゆえに外来性脂質を珈り込むための再構成方法は利する
ところ大である。

用いた化合物は以下のとおりである。

抗菌剤であるＣＴＯ４０ＯＡ、及び化合物ＣＴ０４００
１の脂肪酸誘導体（油酸塩） ｌ）抗菌剤ＬＤＬのとり込み Ｅ述したとり込み過程を以ドの抗菌剤へと応用する。

ＣＴＯ４００Ａ　（ケトコナゾール（ｋｅｔｏｃｏｎａ
ｚ。

１ｅ）：シスー４−　（４−（２。

４−ジクロロフェニル）−２− （ＬＨ−イミダゾール−１−イ ルーメチル）−１，３ジオクツ ラン−４−イル　メトキシ）フ ェニル）−１−（アセチル）ピ ペラジン） 「とり込み可能」の程度に対する薬剤の親油性の影響を
評価するために、ＣＴＯ４００Ａをその脂肪酸誘導体（
以下のとおり）と比較する。

ＣＴＯ４００Ｉ３　（ケトコナゾール串油酸塩）（ｏｌ
ｅａｔｅ）　　：シスー４− （４−（２，４−ジクロロ フェニル）−２−（ＩＨ− イミダゾール−１−イルーメ チル）−１，３ジオクツ ラン−４−イル　メトキシ） フェニル）−１−（オレオイ ル）ピペラジン） 緩衝剤Ｃに対して先に透析したＬＤＬの１．８　ｍｇに
対して、１０履ｇの固体ＮａＤＯＣを添加し、室温で３
０分間反応させた。この調整物に対して、４８２ルｇの
ＣＴＯ４００ＯＡまたは４８２絡ｇのＣＴＯ４００Ｉ３
を含有するｐｎｔｏ。

Ｎａ７ＣＯ３５０ｓＭ、Ｎａｃｌ　　５　０　　ｍＷの
ＮａＤＯＣ溶液を添加した。この試薬を１リツトルの緩
衝液Ｂの３倍に対して４℃で透析した。

ＣＴＯ４０００Ａ（７）及びＮａＤＯＣｃｙ）回収の百
分率は、再構成過程の終りで決定した（第１３図）、Ｌ
ＤＬ１モルあたりにとり込まれた物質の重量を報告する
ことも可能である。ＣＴＯ４００ＯＡ及びＣＴＯ４００
Ｉ３について、ＬＤＬ１モルあたりにそれぞれ０．４及
び２０８モルがとり込まれたという結果が得られた。

再構成されたＬＤＬの場合において、！ｔ１療用他用化
合物ポタンパク質と関連することを示す興味があった。

その調整物をセファデックスＧ２００のクロマトグラフ
にかけた（第１４図）、化合物ＣＴＯ４００Ｉ３がＬＤ
Ｌの異なる成分と同時に溶離されることを示すことがｎ
（能である。加えて、再構成されたＬＤＬの化合物がと
り込み過程中に変形されなかったことも観測された（テ
ーブルｌ）。

１％アガロース（ａｇａｒｏｓｅ）上の電気泳動による
及び０ｕｃｈｔｅｒ　Ｉｏｗｎｙによるこれらの再構成
されたＬＤＬの分析の結果、電気泳動特性及び抗原反応
性が保存された。

３）血しょう存在下における再構成されたＬＤＬＬ支定
性座菫力 血しょうなどのように複雑な生物学的媒体においては、
多くの構を要素が先天的に再構成されたＬＤＬと相互作
用し、それらの非安定性をもたらし得る。あるいは、と
り込んだ活性素の解放という結果になる。さらに、ＣＴ
Ｏ４００Ｉ３が血しよう存在下に位置されるときの、再
構成されたＬＤＬの振舞いを特徴づける試みのための第
１の研究も行なった。

２種の調整物、再構成されたＬＤＬ油酸塩酸塩ＤＬ　　
ｒｅｃ、ｏ、ｃＨＯＬ［Ｉ’ｃ］）及び再構成されたＬ
ＤＬ５についてテストを行なった。これらの種々の調整
物５００μ皇をヒトの血しょうとともに３７℃で３時間
培養した。この培養の終りに、標本を不連続ＫＢｒ勾配
上での超遠心分離によって分画した。吸引によって、異
なる密度に対応する両分を回収した。異なる密度の各々
について、コレスチロール、リン脂質、コレスチロール
油酸塩［＋４（：］を決定した（第１５図）、総コレス
チロールの外形及びリン脂質の外形の勾配は同等である
。これらのピークは。

３種のリポタンパク質（密度の減少する順に。

ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ）に対応して目立っている。

再構成されたＬＤＬ油酸塩酸塩合には、放射能の完全な
再分布がある。事実、コレスチロール油酸塩がＬＤＬか
らＨＤＬｓ及びＶＬＤＬへと転移することが観測された
。このことは、パットナイフ（Ｐａｔｔｎａｉｋ）　　
（文献８）の研究とも一致した。

その研究においては、リポタンパク質がその脂質を交換
し、その交換は転移タンパク質によって触媒作用を受け
ていることが示されている。

一方、化合物ＣＴＯ４００Ｉ３は、これらの転移タンパ
ク質によっては影響されない、セリツク・アルブミン（
ｓｅｒｉｃ　ａｌｂｕ腸ｉｎ）が、吸収用油溶性化合物
の特性を示す、この研究において、ＣＴＯ４００Ｉ３及
びアルブミンの関連を示すことは不可能であった。ゆえ
に、薬剤がＬＤＬのアボラー・コア（ａｐｏｌａｒ　ｃ
ｏｒｅ）内に良く局限されたアルブミンへと接触し得な
いと仮定することができる。

４）塗討 以上の結果から、治療用物質のＬＤＬへのとり込みに影
響を及ぼし得るパラメターの中で、該物質の親油特性が
主要な役割を演じていることがわかった。事実、脂肪酸
の鎖をＣＴＯ４０００Ａ分子へと単純に結合することに
よって、その百分率とり込みを５００のファクターだけ
増大することが可能である。

活性素の潜在的ベクターとして生体内でＬＤＬを使用す
るためには、ターゲットセルに達する前に構造的安全性
が生体流体に接触して保存されることが必要となる。

以上のテストの結果、血しょうの存在下では、ＬＤＬに
とり込まれた活性素は解放されないことがわかった。ゆ
えに、活性素がＬＤＬのコア内に局在して、他の血しょ
うタンパク質の影響から遮蔽されて保たれるというモデ
ルの仮説を進めることが可能である。

しかしながら、上記の説明及び仮説は本発明の範囲を制
限するものではない０本発明は、親油性活性素が対象た
るターゲットセルまで運ばれることを可能ならしめる新
規な医薬ベクターの製造を可能にした。この活性素は、
リポタンパク質膜で直接にあるいは親油類の接合の後に
とり込むことができる。

ｌ）友拮 セフ７０−ズ（ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）　ＣＬ　−４Ｂ　
テ分離したＬＤＬを緩衝剤Ｃに対して４℃で２４時間透
析する。

治療剤は、ｍ文あたり１ｍｇの比率で有機溶剤内に可溶
にされる。この溶液１００ｇＭを試験管内のアルゴン下
で蒸発させる。乾燥残香に対して２１のＬＤＬ溶液及び
ＮａＤＯＣを添加して、問題とする治療剤に従って１対
５１にの最終濃度に達する。この調整物をゆっくりを攪
拌しながら２５℃で６時間培養する。

培養の後に、この標本をミリボア・フィルター（旧＋１
ｉｐｏｒｅ　質ｌｔｅｒ）０．４５　ｇｍで濾過する０
次に、ｉｌ衝剤Ｃで予め平衡させたＰ６ゲル（Ｂｉｏｒ
ａｒｄＲ）上のクロマトグラフによって、ＮａＤＯＣを
除去する。

ＡｐｏＢ内の濃度及び治療剤の濃度を各両分について決
定する。ＬＤＬに対応する両分を共通位ｔに置き、Ｔｒ
　ｉ　５Ｈｃｌ緩衝剤１０ｍＮＮ　ａ　ｃ　ｌ　　Ｏ，
１５Ｍ　　Ｅ　ＰＴＡｏ、３　ｍＨｐＨ７，４に対して
４℃で２４時間透析する。

２）細　毒剤のとり゛みへの・用 ＶＩ−１で上記した全ての方法を以下の油溶性ビンカΦ
アルカロイドＶＩＮＣＡ　ＡＬＫＡＬＯＩＤ）誘導体に
応用した。

“Ｃ”ｌｌベース”＝４−デスアセチル（ｄｅａｃｅｔ
ｙｌ）−ビンプラスチ４　ｙ（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ
）　Ｃ−３Ｎ−ドデシル（ｄｏｄｅｃｙ　ｌ）−カルボ
キサミド（ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）項五中に用いたＮ
ａＤＯＣの濃度は、最締的に２騰にに調節した。

第１６図の実験の結果、洗浄剤プラスＬＤＬの組合わせ
のみが治療剤の可溶性を可能にすることが明らかになっ
た。事実、ＮａＤＯＣが存在しないときには、ＬＤＬは
不可逆的に凝集する傾向がある。洗浄剤はリポタンパク
質膜を透過にして、治療剤の進入を容易にする。

この方法の進行中に、ＬＤＬは、１％アガローズ（ａｇ
ａｒｏｓｅ）上の電気泳動分析により実証されたままそ
の完全性を保存する。

この方法は、何れの場合にも、洗浄剤が吸収されたとし
ても、上述のとり込みの方法とは基本的に相違する。

もしＬＤＬが選択的に調整されるならば、９９％以上の
ベーシックＣ９１がペレット内で見出される。このよう
にして、治療剤がＬＤＬと本当に関連することが確かめ
られる。この調整物をＬＤＬ−Ｃｑ＋と呼ぶ。

ＬＤＬの１分子あたりにとり込まれる薬剤分子の数は、
培養時間、プロセス中に用いるＮ　ａＤＯＣの濃度及び
予定する薬剤に従って変化する。

ベーシックＣ９１の場合は、ＮａＤＯＣの濃度２ｍＭ及
び６０時間の培養時間２５℃で３時間プラス４℃で５７
時間）について、この比率は７０である。

Ｖ　　ＬＤＬの組織分布に対するとり゛みの影響一般的
な文献に記載されたとり込み技術によって、ＬＤＬの生
物学的特性の変化がもたらされる（Ｍａｓｑｕｅｌｉｅ
ｒ　Ｎ、　ｅｔ　Ｇｏｌｌ’、（１０））、このことは
、血しょう半減期の減少によって、ならびに肝臓及び牌
臓内の蓄積増大によって生体内で明らかになる。

１）ＪＴ拮 ＩＶ−１）で上記したとり込み技術を評価するために、
＋２５　Ｉ　　ＬＤＬ−Ｃ９，の生体分布を天然１１２
５　ＬＤＬのそれと比較した。

ＬＤＬ及びＬＤＬ−Ｃｑ＋ＳをＬａｎｇｅｒ　ｅｔ　Ｃ
ａ１ｌの技術によって分類づけする０組織分布の研究を
、２０ｇのＢａ１ｂ／Ｃマウスについて行なった。

０．９０％Ｎａｃｌ溶液０−２　ｍｌ内（７）　２５　
ＪＬｇ　（７）　１１２５ＬＤＬ０．５〜Ｉｇｃｌ）を
各動物の尾に静脈注射した。１時間後に腿の静脈から血
液を採堆して、動物の首を斬る。器官を取り出し、ＰＢ
Ｓでリンスし重量を測る。器官１グラムあたりの放射能
を犠牲時における血しょうの全放射能で割ることによっ
て、相対的組織捕獲を計算する第１８図）、血しょう体
積が動物の全体重の４％に対応すると判断される。

２）績釆 第１７図は、血しようの消滅と２種の調整物の肝臓蓄積
を示す、このレベルでは、テストした２ＮのＬＤＬの間
には著しい差が無い、血しょう濃度は最初の１時間の間
に急速に降下し、その後５〜６時間の半減期をもってオ
ーダーｌの運動に従って減少する。血しょう放射能の９
５％以上が、トロクロル酢酸の存在下で消滅し得る。こ
れに平行して、肝臓内でＬＤＬが蓄積し、注射ドーズ量
の最大値１０％に達する。第１８図は、分布パターンが
２種の調整物について同等であることを明瞭に示してい
る。とり込みはＬＤＬの肝１１及び肺臓蓄積に波及しな
いことが観測される。

ＶＩ　　ＬＤＬ−Ｃ９１の細胞毒　の試験　内テストｌ
）雄 皮膚バイオプシー（ｂｉｏｐｓｙ）から得たヒトの繊維
芽細胞を、１０００セル／カツプの比率で９６カツプ・
プレート内に培養のため位置する第０１１）。培養媒体
は以下の通り。

ＤＭＥＭ　　１０％　牛胎児の血清、グルタミン、抗生
物質セルを３７℃の培養器５％Ｃ（ｈ／９５％空気）内
に保存する。第１日日に、媒体を除去し、異なる希釈度
における新鮮な媒体プラス細胞１２に剤でｌ検する。

第２１Ｈ１に、媒体を除去し、セルを洗浄して新鮮な媒
体中で再培養する。第５日日に、生きているセルの数を
、モスマンＭｏｓｍａｎｎ）技術によりＭＴＴテトラソ
゛リウムｔｅｔｒａｚｏｌｉｕ層）テストによって決定
する。この結果を、細胞毒剤濃度の対数の関数としてコ
ントロールセルに対する生存セルの百分率のロジッ）　
Ｉｏｇｉｔ）で表現する第１９図）。

２）し ＬＤＬ−Ｃ９１塩についてのＬＤ５Ｇセル５０％の致死
ドーズ量）は、それぞれ３７８及び９７９ｎｇ・■１−
１である。ＬＤＬ内にとり込まれた形式のＣ９１がその
細胞毒活性を保存することが観測される、これらの条件
のｆで、天然ＬＤＬはセル成長に影響しない。

リーシュマニア型の寄生虫が口を通じて伝染されｐｒｏ
ｍｏｇｉｇｏｔｅ　ｆｏ＋ｖ）　、ホストの中でもっば
らアマステイゴート形（ａｓａｇｔｉｇｏｔｅ　ｆｏｒ
ｍ）で組織マクロファージ園ａｃｒｏｐｈａｇｅｓ）内
で発育する。寄生中は、感染の位ｔで増殖する皮膚のリ
ーシュマニア症：　Ｌ　、　ｔｒｏｐｉｃａ　＆　　Ｌ
　、　ｍｅｘｉｃａｎａ）　、　　Ｌ＞）し。

顔面粘膜ｍｏｃｏｃｕｔａｎｅｏｕｓリーシュマニア症
：Ｌ。

Ｂｒａｚｉ　ｌ１ｅｎｓｉｓ）またはある器官内蔵リー
シュマニア症：　Ｌ　、　ｄｃｎｏマａｎｉ）のレベル
において循環するマクロファージを介しても移動する。

ホストのマクロファージは、寄生中の発育及び伝搬を確
保する。加えて、変形したＬＤＬが組織マクロファージ
によって優先的に取り出げられる。こうして脂質小胞マ
ｅｓｉｃｌｅｓ）が、リーシュマニア症治療における薬
剤の潜在ベクターを意味する。

ヒトのリーシュマニア症の実験モデルを用いて以ドのこ
とが示された。

■治療剤の活性は、変形ＬＤＬのとり込みによって明ら
かに増大する。

■マクロファージによる変形ＬＤＬの蓄積は、感染によ
り刺激される。

１）試験管内モデルの実験 用いた試験管内モデルは、プロモスティボートｐｒｏｍ
ｏｇｔｉｇｏｔｅ）形で初期的に注射したＢａ　ｌ　ｂ
／Ｃマウスの１復１佼マクロフアージにおいてリーシュ
マニア症１ｅｉｓｈｍａｎｉａ　ｍｅｘｉｃａｎａ　ａ
ｍａｚｏｎｅｎｔｉｓ）の細胞内形式ａｓａｓｔｉｇｏ
ｔｅ＋）を発展させることから成る。

マクロファージの培養は、１復膜空洞のセルから得られ
る。

要するに、ペニシリン１００Ｕ／■ｌ）ならびにグルタ
ミン２１Ｍ）と熱で不完全化された２０％の牛胎児血清
とが補充されたストレプトマイシン１１００１Ｌ／ｍｌ
）を含むＲＰＭＩ媒体で、　ａＷＪ、空洞を数回洗浄す
る。この媒体は、完全な培養媒体を構成する。そうして
得たセル懸濁物質の遠心分離の後、セルを同じ媒体内に
再度分散させ、５％ＣＯの存在下でペトリ皿内で３７℃
で１時間培養する０次に、粘着性マクロファージを数回
洗浄し、それらの支持体から離してカウントする。

２．５　Ｘ　１０のマクロファージを含むセル体積を、
各々ガラススライドを有する培養皿の各カップ１６ｍｍ
直径）に加える。こうしてセルを３７℃で３日間培養す
る。使用前に、培養物を２回洗詐して、非粘着性セルを
除去する。これらの条件の下で、培養物は、１．５〜２
．０Ｘ１０５のマクロファージを含む。

１１００ｐ／ｍｌのゲンタマイシイ、２層舅のグルタミ
ン及び５ＩＬｇ／膳ｌのヘミンを含有し２０％の不完全
化牛胎児血清を補充したシュナイダー・ドロソフィア５
ｃｈｎｅｉｄｅｒ　Ｄｏｒｏｓｏｐｈｉａ）の媒体中に
連続的に通過することによって、Ｌ、履ｅｘｉｃａｎａ
　ａ履ａｚｏｎｅｎｔｉｓの種が２７℃におけるプロマ
スティボートｐｒｏｍａｓｔｉｇｏｔｅ）形内に含まれ
る。

固定相のプロマスティボートｐｒａｍａｓｔ　ｉｇｏｔ
ｅｓ）の懸濁物質を、セルあたり４つの寄生虫の比率で
各マクロファージ培養物に加える。この培養物を３４．
５℃〜３５℃５％ＣＯ２−９５％空気）で７時間項五す
る。この感染した培養物を、２０のマクロファージあた
り寄生虫が１以下になるまで、血清無しの媒体で洗浄す
る。１つの培養物４つのカップを有する皿）を決定し、
メイ・グルンバルト・ギエムサＭａｙ−Ｇｒｕｎｗａｌ
ｄ　Ｇｉｅｍｓａ）で染色して感染をチェックした第０
日）、もしｌＯＯのマクロファージあたりの細胞内生体
が５０以下の場合には、結果を正確に解釈するためには
感染度が低すぎると考えられる。感染の２４時間後に５
培養媒体を、治療を含んでも良いし含まなくても良い新
鮮な奴体で置換する。オレオイル−ケトコナゾールｏｌ
ｅｏｙｌ−ｋｅｔｏｅｏｎａｚｏｌｅ）＋ｉｎ導体のみ
または天然もしくはアセチル化ＬＤＬでとり込んだもの
を使用することを選んだ、第３日日に媒体上治療剤）を
新しくする。第６］］目に、感染したマクロファージ培
養物を決定し、染色し乾燥させ、そのガラススライドを
顕＊ＳＵｔ察のためにガラススライド上に・埃せる。

１００〜２００のマクロファージ内に含まれるアマステ
イボ−）　ａｍａＳｔｉｇｏｔｅｓ）の数を各培養物に
ついて決定する。処理した培養物内の第６日日における
ｌＯＯマクロファージあたりの生体の平均数が、第６日
日におけるコントロール培養物内のｌＯＯマクロファー
ジあたりの生体の平均数の百分率生存％）として表現さ
れる。コントロール培養物は、１００マクロフアージた
り平均して３００〜４００の寄生虫を含む、平均して６
０％のマクロファージが感染され、５〜７のアマステイ
ボ−）　ａｍａＳｔｉｇｏｔｅｓ）を含む。

２）級里 才しオイル・ケトコナゾールｏｌｅｏｙｌ−ｋｅｔｏｃ
ｏｎａｚａｌｅ）、ｌ導体ＣＴ４００Ｉ３またはＫＯり
ならびに天然ＬＤＬＬＤＬ−ＫＯ１）またはアセチル化
ＬＤＬＡｃＬＤＬ−ＫＯＬ）　でとり込まれたコノ：Ａ
導体の抗す−シュアニア活性すなわち、細胞内形７Ｅの
阻止百分率）をテーブル２に示す。

オレオイル・ケトコナゾール誘導体が良好な抗リーシュ
マニア活性を示す、５０％阻止ＥＤ）ｓｇが１．４　ル
ｇＫ０１／履ｇのドーズ量において得られ、９０％活性
がｌｌｐｇ／ｍｌのドーズ帽において得られる。ケトコ
ナゾールｋｅｔｏｅｏｎａｚｏｌｅ）との比較によって
、ＫＯＩの治療指数ＥＤ５ｏＫＯ１に対するＥＤｓｏｋ
ｅｔｏの比として定義される）が９となる寄生虫の５０
％減少のための効果的なドーズ量）。

この化合物は天然ＬＤＬでとり込まれるときに、その活
性の全てを失うコントロールに類似する）。

一方、もしＬＤＬが例えばアセチル化によって変形され
るならば、治療活性が維持され、ＫＯｌに関して増大す
るファクターＬ、Ｓ　）　、寄生虫成長の９０％近くが
、２膳ｇＫＯ１／■１のドーズＩよにおいて阻止される
。

ゆえに、マクロファージにより優先的に取られた脂質小
胞マｅｓｉｃｕｌｅ）内の活性化合物のとり込みが、試
験管内モデルの細胞内リーシュマニア症に対する活性に
確実に影響を及ぼす。

別表　テーブル２） （ａ）：化合物は、メキシカーナ・アマゾネンティスの
リーシュマニアＬ　、　ｇＢｉ（Ｈａｎａ　ａｍａｚｏ
ｎｅｎｔｉＳ）に感染したマクロファージの存在のドで
、上述した方法により３５°で６日間培養する。ＫＯＩ
Ｍ導体は、２２５：１のモル比でＬＤＬにとり込まれ、
１６４：１のモル比でＡｃＬＤＬアセチル化ＬＤＬ）に
とり込まれる。

（ｂ）：結果は、１００マクロフアージあたりの寄生虫
の数を意味する。この結果は、第６０１１のコントロー
ル内の寄生虫の数の百分率生存％）として表現されてい
る乎均値土４の値の標準偏差）。

（ｃ）：抗リーシュマニア症活性は、寄生虫の阻止百分
率で表現されている。

ヒトに対する数種の病原菌は、セル内、主として食細胞
内で生存及び増殖することによってホストまたは細胞外
空間に影響を及ぼす、これらの選択的細胞内寄生虫は、
ヒトにキャリア状態を引き起こし、反復感染性エピソー
ド（ｅｐｉｓｏｄｅｓ）を生ずる。そのような微生物カ
ンジダ菌：酵母状不完全菌類（ｃｒマｐｔｏｃｏｃｃｕ
ｓ）、コクシジウム（ｃａｃｃ　ｉｏ　１ｄｅｓ）９０
．に罹患した患者の処置において、ＬＤＬまたはＡｃＬ
ＤＬアセチル化ＬＤＬ）に包まれた抗菌剤を効果的に用
いることができる。これらの治療上の利点毒性及び活性
の２点からの利点）を、イミダゾール１ｍ１ｄａｚｏｌ
ｅｓ）　ｐ導体として、ＬＤＬ又はＡｃＬＤＬ内に含ま
れるケトコナゾールφアラニンーアラニン番オレイクｋ
ｅｔｏｃｏｎａｚｏｌｅ−ａｌａｎｉｆＩｅ−ａｌａｎ
ｉｎｅ　ｏｌｅｉｑｕｅ　、　Ｋ　Ａ　Ａ　Ｏｎ）化合
物及びケト・オレイクｋｅｔｏ　ｏｌｅｉｑｕｅ　、　
Ｋ　Ｏｌ　）化合物を用いることによって、以下に実証
する。

ネズミ起源鵬ｕｒｉｎｅ　ｏｒｉｇｉｎ）のマクロファ
ージＪ７７４６８の連続ラインが、種Ｊ７７４　　ＡＴ
ＣＣのクローニングａｔｏｎｉｎｓ）から生じ、グルタ
ミツ２層腫、１０％の牛胎児血清５６°における不完全
化６０分間）及び１０鳳昶のへペスＨｅｐｓｓ）　（ｐ
Ｈ７，２）を補充したＲＰＭＩ　　１６４０媒体で培養
する。

５゜１０６　セル／１の懸濁物質を、カシトンｃａｓｉ
ｔ、。

ｎｅ）内の夜間培養から生じたカンシタ・トロピカリス
Ｃａｎｄｉｄａ　ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）のｊ８養物で
感染させる。用いた感染媒体は、２％の牛新生児の血清
及び１０ｍＭヘペスｐＨ７，２）を含むＲＰＩＶＩＩで
ある。

空気と１０％ＣＯ７の混合物内で３７°の３時間項五の
後に、イース）　７ｅａｓｔｓ）の食菌作用が完了する
。セル懸濁物質マクロファージカンジダを遠心分離し、
十分に洗炸し、ガラススライド直径１４ｍ５）を含む２
４のカップを有する皿の中で、１．０５の感染したマク
ロファージ／空洞の比率で分散させる。

３時間の食菌作用の後Ｔｏ）、１００のマクロファージ
のうち、３２が１〜６のカンジダ／マクロファージを含
む、平均感染は２カンジダ／マクロフアージである。

全てのイーストが食菌されたが、わずかな例外があった
メイーグルンバルト・ギエスマＭａｙ−Ｇｒｕｎｗａｌ
ｄ　Ｇｉｅｍｓａ）で染色した後に光学顕微鏡で評価で
きる）、基準薬剤及びＬＤＬに包まれた薬剤の１２種の
異なった濃度を、感染したマクロファージを含む皿に分
配する。薬剤の有効性の評価を各濃度において行なった
。１８時間の培養３７°、空気−１０％ＣＯ２の混合物
内）の後にテストした結果、イーストは最初ホストセル
内で、次に細胞外媒体内で成長した。感染したマクロフ
ァージの比率は、コントロール内で７５％だった。ある
セルは１〜２０以上のカンジダ／セルを含み得る。

大部分は２〜６イースト／セルを含んでいた。培養媒体
は１０８の細胞外カンジダ／層１を含んでいたバーカー
セルＢｕｒｋｅｒ　ｃｅｌｌ）内でのカウント）。

抗菌剤に関するカンジダの感度は、実験条件に大いに依
存する。薬剤の評価は種々の条件の下で行なわなければ
ならない、ＬＤＬ又はＡｃ−ＬＤＬ内に包まれ又は包ま
れない薬剤の基準抗菌剤ｋｅｔｏｃｏｎａｚｏｌｅ（Ｋ
））に関する活性は、カンジダ＝Ｃ１５０）に感染した
マクロファージの数を５０％減少させる薬剤のミクロモ
ル濃度によって決定された。処ｔの途中における感染セ
ルの比率の減少とともに、感染したマクロファージあた
りのカンジダの数が著しく減少する１〜３イースト／セ
ルの減少）。

■、３　級釆 ＬＤＬ又はＡｃ−ＬＤＬに包まれたＫＯＩの活性牛胎児
血清又はヒトの血しよう２％を含む媒体内で測定した）
をテーブル３及び４に示す。

ＬＤＬに包まれた他の抗菌剤ＫＡＡＯ１の活性をテーブ
ル４に示す。

ここで示した薬剤の濃度は、包まれたケトコナゾールｋ
ｅｔａｃｏｎａｚａｌｅ）誘導体のそれである０モル比
は、ＬＤＬ又はＡｃ−ＬＤＬのアポタンパク質Ｂと誘導
体にとの間で大体ｌである。

別表テーブル３） 別表テーブル４） ＬＤＬに包まれた又は包まれない抗菌剤を含む媒体中に
培養されたマクロファージＪ７７４６８の生存力をテー
ブル５に示す、Ｋ及びＫＯＩは、細胞内感染ｃｉｓｏ）
を５０％だけ減少させるのに必要な濃度において有毒で
ある。これに対し、ＬＤＩ；−ＫＯｌについては毒性は
検出されなかった。

別表テーブル５） 培養条件をテーブル３に示す、マクロファージのセル生
存率は、フォルモザンｆｏｒｍｏｚａｎ）沈殿物内ノト
レトラゾリウムｔｒｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ）　Ｍ　、　
Ｔ　。

Ｔ、の塩の減少によって、ＡＦの存在下で１８時間の培
養後に測定した。

コントロールｌＯＯ％）に関するＭＴＴの百分−（り減
少 未処理 未定 （■、細胞外感染に対する包まれたＡＦ誘導体の駐 細胞外感染に対する包まれたＡＦの活性は、２つの方法
で評価できる。１つの方法は、細胞内感染モデル■の１
．１セクシヨン参照）内の細胞外カンジダ菌の数を決定
することによるものである。他の方法は、複数のカップ
皿ＲＰＭＩ媒体）内の連続希釈の方法によって、これら
の化合物の最小阻止密度ＭＩＣ）を測定することによる
ものである。

■、ｌ　感染マクロファージのモデル内の細胞庄嫂象 結果をテーブル６に示す。

別表テーブル６） 実験条件は、テーブル３及び■のΦｌセクションに記載
した条件と類似する。

ａ：ｃＩｅｘｔ５０＝外部媒体内のカンジダ菌数の成長
を５０％だけ阻 止する濃度 ｂ＝Ｐ見、Ｈｏ　　＝ヒトの血しょう ｃ　：　ＳＶＦ　　　　　＝牛胎児の血清ｆｅｔａｌ　
ｃａＩｆ　ｓｅｒｕｍ） ＭＩＣ） ＬＤＬ−ＫＯＩ及びＡｃＬＤＬ−ＫＯＩは、シー・トロ
ピカリスＣ、ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）に対して、特に牛
胎児血清の無い媒体内でシー・アルビカンズＣ、ａｌｂ
ｉｃａｎｓ）（１〜６倍の７７クター）に対して、ＫＯ
Ｉよりも高い活性を示す、この活性は、ヒトの血しょう
の存在下でシー・アルビカンズに対してもつと大きい。

用いた化合物は以下のとおりである。

抗菌剤であるＣＴＯ４０ＯＡ、及び化合物ＣＴＯ４００
１の脂肪酸誘導体（油酸塩）１）抗菌剤ＬＤＬのとも込
み 上述したとり込み過程を以下の抗菌剤へと応用する。

ＣＴＯ４０ＯＡ　（ケトコナゾール（ｋｅｔｏｃｏｎａ
ｚ。

ｌｅ）　　：シスー４−　（４−（２。

４−ジクロロフェニル）−２− （１Ｂ−イミダゾール−１−イ ルーメチル）−１，３ジオクツ ラン−４−イル　メトキシ）フ ェニル’）−１−（アセチル）ピ ペラジン） 「とり込みｉｌ　俺Ｊの程度に対する薬剤の親油性の影
響を評価するために、ＣＴＯ４０ＯＡをその脂肪酸誘導
体（以下のとおり）と比較する。

ＣＴＯ４００Ｉ３　（ケトコナゾールφ油酸塩）（ｏｌ
ｅａｔｅ）　　：シスー４−（４−（２，４−ジグロロ
フェニ ル）−２−（ＩＨ−イミダゾ ールー１−イルーメチル）− １，３ジオクツラン−４− イル　メトキシ）フェニル） −１−（オレオイル）ピペラ ジン） 緩衝剤Ｃに対して先に透析したＬＤＬの１．８　ｍｇに
対して、１０層ｇの固体ＮａＤＯＣを添加し、室温で３
０分間反応させた。この調整物に対して、４８２ＪＬｇ
のＣＴＯ４００ＯＡまたは４８２ｇｇのＣＴＯ４００Ｉ
３を含有するｐＨ１Ｏ，Ｎａ２ＣＯ３５０ｍＭ、Ｎａｃ
ｌ　　５０ｍＭのＮａＤＯＣ溶液を添加した。この試薬
を１リツトルの緩衝液Ｂの３倍に対して４℃で透析した
。ＣＴＯ４０００Ａの及びＮａＤＯＣの回収の百分率は
、再構成過程の終りで決定した（第１３図）、ＬＤＬＩ
モルあたりにとり込まれた物質の重量を報告することも
ｒＩｒｆＥテある。ＣＴＯ４００ＯＡ及びＣＴＯ４００
Ｉ３について、ＬＤＬＩモルあたりにそれぞれ０．４及
び２０８モルがとり込まれたという結果が得られた。

再構成されたＬＤＬ　（ＬＤＬ　　ｒ　ｅ　ｃ　、　Ｃ
ＴＯ４００Ｉ３）の場合において、治療用化合物がリポ
タンパク質と関連することを示す興味があった。その調
整物をセファデックスＧ２００のクロマトグラフにかけ
た（第１４図）、化合物ＣＴＯ４００Ｉ３がＬＤＬｓの
異なる成分と同時に溶離されることを示すことが可能で
ある。加えて、再構成されたＬＤＬの化合物がとり込み
過程中に変形されなかったことも観測された（テーブル
１）。

１％アガロース（ａｇａｒｏｇｅ）上の電気泳動による
及びオフタラオニ−（Ｏｕｃｈｔｅｒ　ｌｏｗｎｙ）に
よるこれらの再構成されたＬＤＬの分析の結果、電気泳
動特性及び抗原反応性が保存された。

血しょうなどのように複雑な生物学的媒体においては、
多くの構成要素が先天的に再構成されたＬＤＬと相互作
用し、それらの非安定性をもたらし得る。あるいは、と
り込んだ活性素の解放という結果になる。さらに、ＣＴ
Ｏ４００Ｉ３が血しょう存在下に位置されるときの、再
構成されたＬＤＬの振舞いを特徴づける試みのための第
１の研究も行なった。

２種の調整物、再構成されたＬＤＬコレスチロール油酸
塩酸塩ＤＬ　　ｒｅｃ、ｏ、ｃＨＯＬ［目Ｃ］）及び再
構成されたＬＤＬ５についてテストを行なった。これら
の種々の調整物５００ル立をヒトの血しょうとともに３
７℃で３時間培養した。この培養の終りに、標本を不連
続ＫＢｒ勾配りでの超遠心分離によって分画した。吸引
によって、異なる密度に対応する両分を回収した。異な
る密度の各々について、コレスチロール、リン脂質、コ
レスチロール油酸塩［１４Ｃ］を決定した（第１５図）
、総コレスチロールの外形及びリン脂質の外形の勾配は
同等である。これらのピークは、３種のリポタンパク質
（密度の減少する順に、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ）　
に対応して目立っている。

再構成されたＬＤＬコレスチロール油酸塩酸塩合には、
放射能の完全な再分４ｊがある。７１Ｇ実、コレスチロ
ール油酸塩がＬＤＬからＨＤＬ及びＶＬＤＬへと転移す
ることが観測された。このことは、Ｐａｔｔｎａｉｋ　
（文献８）の研究とも一致した。

Ｐａｔｔｎａｉｋの研究においては、リポタンパク質が
その脂質を交換し、その交換は転移タンパク質によって
触媒作用を受けていることが示されている。

一方、化合物ＣＴＯ４００Ｉ３は、これらの転移タンパ
ク質によっては影響されない、セリ−２り争アルブミン
（ｓｅｒｉｃ　ａｌｂｕｍｉｎ）が、吸収用油溶性化合
物の特性を示す、この研究において、ＣＴＯ４００Ｉ３
及びアルブミンの関連を示すことは不可能であった。ゆ
えに、薬剤がＬＤＬのアボラー０コア（ａｐｏｌａｒ　
ｃｏｒｅ）内に良く局限されたアルブミンへと接触し得
ないと仮定することができる。

４）級釆 以Ｅの結果から、治療用物質のＬＤＬへのとり込みは影
響を及ぼし得るパラメターの中で、該物質の親油特性が
主要な役割を演じていることがわかった。°１ν実、脂
肪酸の鎖をＣＴＯ４００ＯＡ分子へと単純に結合するこ
とによって、その百分率とり込みを５００のファクター
だけ増大することが１旧七である。

活性２にの潜在的ベクターとして生体内でＬＤＬを使用
するためには、ターゲットセルに達する前に構造的安全
性が生体流体に接触して保存されることが必要となるう 以上のテストの結果、血しょうの存在下では。

ＬＤＬにとり込まれた活性素は解放されないことがわか
った。ゆえに、活性素がＬＤＬのコア内に局在して、他
の血しょうタンパク賀の影響から遮蔽されて保たれると
いうモデルの仮説を進めること力輸ｆ能である。

しかしながら、上記の説明及び仮説は本発明の範囲を制
限するものではない０本発明は、親油性活性素が対象た
るターゲットセルまで運ばれることを可ｆｌｔらしめる
新規な医薬ベクターの製造を可能にした。この活性素は
、リポタンパク質膜で直接にあるいは親油類の接合の後
にとり込むことができる。

１）万拮 セファローズ（ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）　ＣＬ　−４Ｂ　
テ分離したＬＤＬを緩衝剤Ｃに対して４℃で２４時間透
析する。

治療剤は、ｍｌあたり１ｍｇの比率で有機溶剤内に可溶
にされる。この溶液１００ｐｕを試験管内のアルゴン下
で蒸発させる。乾燥残香に対して２１のＬＤＬ溶液及び
ＮａＤＯＣを添加して１問題とする治療剤に従って１対
５ｍＭの最終濃度に達する。この調整物をゆっくりを攪
拌しながら２５℃で６時間培養する。

培養の後に、この標本をミリボア・フィルター（Ｍｉｌ
ｌｉｐｏｒｅ　質ｌｔｅｒ）０．４５　ｇｍで濾過する
０次に、緩衝剤Ｃで予めｆ［させたＰ６ゲル（Ｂｉｏｒ
ａｒｄ　Ｒ）上のクロマトグラフによって、ＮａＤＯＣ
を除去する。

ＡｐｏＢ内の濃度及び治療剤の濃度を各両分について決
定する。ＬＤＬに対応する両分を共通位置に置き、Ｔｒ
ｉ　５Ｈｃｌ＠衝剤１０ｍＭＮａｃ１　０．１５Ｍ　Ｅ
ＰＴＡｏ、３ｍＭｐＨ７，４に対して４℃で２４時間透
析する。

２）細胞与剤のとり゛みへの応用 Ｖｌ−１で上記した全ての方法を以下の油溶性ビンカ・
アルカロイド（ＧＩＮＣＡ　ＡＬＫＡＬＯＩＤ）誘導体
に応用した。

“Ｃ９１ベース”：　（４−デスアセチル（ｄｅａｃｅ
ｔｙｌ）−ビンプラスチ４　ン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎ
ｅ）　Ｃ−３Ｎ−ドデシル（ｄｏｄｅｃｙｌ）−力ルポ
キサミド（ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）培養中に用いたＮ
ａＤＯＣ（７）濃度は、最終的に２鳳圓に調節した。

第１６図の実験の結果、洗浄剤プラスＬＤＬの組合わせ
のみが治療剤の可溶性をｕ（能にすることが明らかにな
った。事実、ＮａＤＯＣが存在しないときには、ＬＤＬ
は不可逆的に凝集する傾向がある。洗浄剤はリポタンパ
ク質膜を透過にして、治療剤の進入を容易にする。

この方法の進行中に、ＬＤＬは、１％アガローズ（ａｇ
ａｒｏｓｅ）上の電気泳動分析により実証されたままそ
の完全性を保存する。

この方法は、何れの場合にも、洗浄剤が吸収されたとし
ても、上述のとり込みの方法とは基本的に相違する。

もしＬＤＬが選択的に調整されるならば、９９％以上の
ベーシックＣ９＋がペレット内で見出される。このよう
にして、治療剤がＬＤＬと本当に関連することが確かめ
られる。この調整物をＬＤＬ　　Ｃｑｉと呼ぶ。

ＬＤＬの１分子あたりにとり込まれる薬剤分子の数は、
培養時間、プロセス中に用いるＮａＤＯＣの濃度及び予
定する薬剤に従って変化する。ベーシックＣｑ＋Ｌ７）
場合は、ＮａＤＯＣ（７）ｅｌｉ　２　ｍ片及び６０時
間の培養時間（２５℃で３時間プラス４℃で５７時間）
について、この比率は７０である。

Ｖ　　ＬＤＬの組織分布に対するとり込みの影響一般的
な文献に記載されたとり込み技術によって、ＬＤＬの生
物学的特性の変化がもたらされる（Ｍａｓｑｕｅｌｉｅ
ｒ　Ｍ、　ｅｔ　Ｃｏ１１．（１０））、このことは、
血しょう半減期の減少によって、ならびに肝臓及び牌臓
内の蓄積増大によって生体内で明らかになる。

１）方法 ■−ｉ）で上記したとり込み技術を評価するために、＋
＋５　Ｉ　　ＬＤＬ−ＣＱＩの生体分布を天然１１２５
　ＬＤＬのそれと比較した。

ＬＤＬ及びＬＤＬ−ＣｇｌｓをＬａｎｇｅｒ　ａｔ　Ｃ
ａ１ｌの技術によって分類づけする０組織分布の研究を
、２０ｇのＢａ１ｂ／Ｃマウスについて行なった。

０．９０％Ｎａｃｉ溶液０．２　ｍｌ内の２５＃Ｌｇの
１１２５　ＬＤＬ　（０，５〜ｌ　ｇｃＪＬ）を各動物
の尾に静脈注射した。１時間後に腿の静脈から血液を採
取して、動物の首を斬る。器官を堆り出し。

ＰＢＳでリンスし重量を測る。器官１グラムあたりの放
射能を犠牲時における血しょうの全放射能で割ることに
よって、相対的組織捕獲を計算する（第１８図）、血し
ょう体積が動物の全体重の４％に対応すると判断される
。

２）ｖ 第１７図は、血しょうの消滅と２種の調整物の肝臓蓄積
を示す、このレベルでは、テストした２種のＬＤＬの間
には著しい差が無い、血しょう濃度は最初の１時間の間
に急速に降下し、その後５〜６時間の半減期をもってオ
ーダー１の運動に従って減少する。血しょう放射能の９
５％以上が、トロクロル酢酸の存在下で消滅し得る。こ
れに平行して、肝臓内でＬＤＬが蓄積し、注射ドーズ；
、にの最大値ｌＯ％に達する。第１８図は１分布パター
ンが２種の調整物について同等であることを明瞭に示し
ている。とり込みはＬＤＬの肝１藏及び肺臓蓄積に波及
しないことが観測される。

ＶＩ　　ＬＤＬ−Ｃｑｉの細ＫｆＪ性の試験管内テスト
ｌ）友拮 皮膚バイオプシー（ｂｉｏｐｓｙ）から得たヒトの繊維
芽細胞を、１０００セル／カツプの比率で９６カツプ・
プレート内に培養のだ−め位置する（第［＋）、培養媒
体は以下の通り。

ＤＭＥＭ　　１０％　／１；Ｊめ先の血清、グルタミン
、抗生物質セルを３７℃の培養器（５％００２／９５％
空気）内に保存する。第１　ＩＩ口に、媒体を除去し、
異なる希釈度における新鮮な媒体プラス細胞？７５剤で
置換する。

第２１１目に、媒体を除去し、セルを洗浄して新鮮な媒
体中で再培養する。第５日日に、生きているセルの数を
、モスマン（Ｍｏｓｍａｎｎ）技術によりＭＴＴ　（テ
トラソ゛リウム（ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ））テストに
よって決定する。この結果を、細胞毒剤濃度の対数の関
数としてコントロールセルに対する生存セルの百分率の
ロジッ）　（Ｉｏｇｉｔ）で表現する（第１９図）。

２）績釆 ＬＤＬ−Ｃｑ＋塩についてのＬＤ５ｏ（セル５０％の致
死ドーズ沿）は、それぞれ３７８及び９７９ｎｇ番■１
．−１である。ＬＤＬ内にとり込まれた形式のＣ９１が
その細胞毒活性を保存することが観測される。これらの
条件の下で、天然ＬＤＬはセル成長に影響しない。

リーシュマニア型の寄生虫が口を通じて伝染され（ｐｒ
ｏｍｏｓｉｇｏｔｅ　ｆｏｒｍ）　、ホストの中でもっ
ばらアマスティゴート形（ａｍａｓｔｉｇｏｔｅ　ｆｏ
ｒ＋ｓ）で組織マクロ７７−ジ（＋ｓａｃｒｏｐｈａｇ
ｅｓ）内で発育する。寄生中は、感染の位置で増殖する
（皮膚のり一シュマニア症：　Ｌ　、　ｔｒｏｐｉｃａ
　＆　　Ｌ　、　ｍｅｘｉｃａｎａ）　、　　シかし、
顔面粘膜（ｍｏｃｏｃｕｔａｎｅｏｕｓリーシュマニア
症：　Ｌ　、　Ｂｒａｚｉｌｉｅｎｓｉｓ）またはある
器官（内蔵リーシュマニア症＋　Ｌ　、　ｄｏｎｏマａ
ｎｉ）のレベルにおいて循環するマクロファージを介し
ても移動する。

ホストのマクロファージは、寄生中の発育及び伝搬を確
保する。加えて、変形したＬＤＬが組織マクロファージ
によって優先的に取り出げられる。こうして脂質小胞（
マｅｓｉｃｌｅｓ）が、リーシュマニア症治療における
薬剤の潜在ベクターを意味する。

ヒトのリーシュマニア症の実験モデルを用いて以ドのこ
とが示された。

１、治療剤の活性は、変形ＬＤＬのとり込みによって明
らかに増大する。

２、マクロファージによる変形ＬＤＬの蓄積は、感染に
より刺激される。

１）試験管　モデルのＥ−験 用いた試験管内モデルは、プロモスティボート（ｐｒａ
ｍｏｓｔｉｇｏｔｅ）形で初期的に注射したＢａ１ｂ／
Ｃマウスの腹膜マクロファージにおいてリーシュマニア
症（Ｉｅｉｓｈｍａｎｉａ　ｍｅｘｉｃａｎａ　ａｍａ
ｚｏｎｅｎｔｉｓ）の細胞内形式（ａ酊ｓｔ　ｉｇｏｔ
ｅｇ）を発展させることから成る。

マクロファージの培養は、腹膜空洞のセルから得られる
。

要するに、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）ならびにグル
タミン（２層Ｍ）と熱で不完全化された２０％の牛胎児
血清とが補充されたストレプトマイシン（１００ルｇ／
■Ｉ）を含むＲＰＭＩ媒体で、腹膜空洞を数回洗浄する
。この媒体は、完全な培養媒体を構成する。そうして得
たセル懸濁物質の遠心分離の後、セルを同じ媒体内に１
ｑ度分散させ、５％ＣＯの存在下でペトリ皿内で３７℃
で１時間培養する０次に、粘着性マクロファージを数回
洗浄し、それらの支持体から離してカウントする。

２．５　Ｘ　Ｉ　Ｏのマクロファージを含むセル体積を
、各々ガラススライドを有する培養皿の各カップ（１６
ｍｍ直径）に加える。こうしてセルを３７℃で３日間培
養する。使用前に、培養物を２回洗浄して、非粘着性セ
ルを除去する。これらの条件の°ドで、培養物は、１．
５〜２．０Ｘ１０５のマクロファージを含む。

１００ｇｇ／ｍｌのゲンタマイシイ、２腸にのグルタミ
ン及び５ｐｇ／層ｌのヘミンを含有し２０％の不完全化
牛胎児血清を補充したシュナイダー・ドロラフ４ア（Ｓ
ｃｈｎｅｉｄｅｒ　Ｄｏｒｏｓａｐｈｉａ）の媒体中に
連続的に通過することによって、Ｌ　、　ｍｅｘｉｃａ
ｎａａｍａｚａｎｅｎｔｉｓの種が２７℃におけるプロ
マスティボート（ｐｒｏｍａｓｔｉｇｏｔｅ）形内に含
まれる。

固定相のプロマスティボート（ｐ、ｒｏｍａｓｔｉｇｏ
ｔｅｓ）の懸濁物質を、セルあたり４つの寄生虫の比率
で各マクロファージ培養物に加える。この培養物を３４
．５℃〜３５℃（５％ＣＯ２−９５％空気）で７時間培
養する。この感染した培養物を、２０のマクロファージ
あたり寄生虫が１以下になるまで、血清無しの媒体で洗
浄する。１つのｊ８養物（４つのカップを有する皿）を
決定し、メイ・グルンバルト轡ギエムサ（Ｍａｙ−Ｇｒ
ｕｎｗａｌｄ　Ｇｉｅｍｇａ）で染色して感染をチェッ
クした（第０日）、もしｌＯＯのマクロファージあたり
の細胞内生体が５０以下の場合には、結果を正確に解釈
するためには感染度が低すぎると考えられる。感染の２
４時間後に、培養媒体を、治療を含んでも良いし含まな
くても良い新鮮な媒体で置換する。オレオイル・ケトコ
ナゾール（ｏｌｅｏ７Ｌ−ｋｅｔｏｅｏｎａｚｏｌｅ）
誘導体のみまたは天然もしくはアセチル化ＬＤＬでとり
込んだものを使用することを選んだ、第３日日に媒体（
±治療剤）を新しくする。第６日日に、感染したマクロ
ファージ培養物を決定し、染色し乾燥させ、そのガラス
スライドを顧ＷＲ鏡観察のためにガラススライド−Ｌに
・匪せる。

１００〜２００のマクロ７アージ内に含まれるアマステ
ィゴート（ａｉＩａＳｔｉｇｏｔｅｓ）の数を各培養物
について決定する。処理した１８養物内の第６１ｊ［１
における１００マクロフアージあたりの生体のｆ均数が
、第６８　ｌ’、Ｉにおけるコントロール培養物内の１
００マクロフアージあたりの生体の平均数の百分率（生
存％）として表現される。コントロール培養物は、ｌＯ
Ｏマクロファージたり平均して３００〜４００の寄生虫
を含む、平均して６０％のマクロファージが感染され、
５〜７のアマステイボ−）　（ａｍａｓｔｉｇｏｔｅｓ
）を含む。

２）精迷 才しオイルｅケトコナゾール（ｏｌｅｏｙｌ−ｋｅｔｏ
ｃｏｎａｚｏｌｅ）Ｍ導体ＣＴ４００Ｉ３または（ＫＯ
Ｉ）ならびに天然ＬＤＬ　（ＬＤＬ−ＫＯＩ）またはア
セチル化ＬＤＬ　（ＡｃＬＤＬ−ＫＯＩ）でとり込まれ
たこの誘導体の抗す−シュアニア活性（すなわち、細胞
内形態の阻止百分率）をテーブル２に示す。

オレオイル・ケトコナゾール誘導体が良好な抗リーシュ
マニア活性を示す、５０％ｌ！ＪＩ止（ＥＤ）ｓｏが１
．４　ｘｇＫＯ１／ｍｇのドーズＩ逢において得られ、
９０％活性がｍｇｇ／層１のドーズ量において得られる
。ケトコナゾール（ｋｅｔｏｃｏｎａｚｏｌｅ）との比
較によって、ＫＯＩの治療指数（ＥＤ５６ＫＯ１に対す
るＥＤｓｏｋｅ　ｔ　ｏｔｒ）比として定義される）が
９となる（寄生虫の５０％減少のための効果的なドーズ
量）。

この化合物は天然ＬＤＬでとり込まれるときに、その活
性の全てを失う（コントロールに類似する）。

一方、もしＬＤＬが例えばアセチル化によって変形され
るならば、治療活性が維持され、ＫＯＩに関して増大す
る（ファクターｔ、ａ　）　、寄生虫成長の９０％近く
が、２ルｇＫＯ１／層ｌのドーズ量において阻止される
。

ゆえに、マクロファージにより優先的に取られた脂質小
胞（マｅｓｉｃｕｌｅ）内の活性化合物のとり込みが、
試験管内モデルの細胞内リーシュマニア症に対する活性
に確実に影響を及ぼす。

（別表　テーブル２） （ａ）：化合物は、メギシカーナ・アマゾネンティス・
リーシュマニア（Ｌ　、　ｍｅｘｉｃａｎａ　ａｍａｚ
。

ｎｅｎｔｉｓ）に感染したマクロファージの存在の下で
、上述した方法により３５°で６日間培養する。ＫＯ１
誘導体は、２２５：１のモル比でＬＤＬにとり込まれ、
１６４：ｌのモル比でＡｃＬＤＬ　（アセチル化ＬＤＬ
）にとり込まれる。

（ｂ）：結果は、１００マクロフアージあたりの寄生虫
の数を、α味する。この結果は、第６１１０のコントロ
ール内の寄生虫の数の百分率（生存％）として表現され
ている（平均値±４の値の標準偏差）。

（ｃ）：抗リーシュマニア症活性は、寄生虫のｊｌＪ、
　Ｉｔ百分率で表現されている。

ヒトに対する数種の病原菌は、セル内、主として食細胞
内で生存及び増殖することによってホストまたは細胞外
空間に影響を及ぼす、これらの選択的細胞内寄生虫は、
ヒトにキャリア状態を引き起こし、反復感染性エピソー
ド（ｅｐｉｓｏｄｅｓ）を生ずる。そのような微生物（
カンジダ菌：酵母状不完全菌類（ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃ
ｕｓ）　、コクシジウム（ｃｏｃｃｉｏｉｄｅｓ）　　
、　、　、）に罹患した患者の処置において、ＬＤＬま
たはＡｃＬＤＬ（アセチル化ＬＤＬ）に包まれた抗菌剤
を効果的に用いることができる。これらの治療上の利点
（毒性及び活性の２点からの利点）を、イミダゾール（
ｉｍｉｄａｚｏｌｅｓ）話導体として、ＬＤＬ又はＡｃ
ＬＤＬ内に含まれるケトコナゾール・アラニン−アラニ
ン・オレイク（ｋｅｔａｃｏｎａｚｏｌｅ−ａｌａｎｉ
ｎｅ−ａｌａｎｉｎｅ　ｏｌｅｉｑｕｅ、ＫＡＡＯ文）
化合物及びケトφオレイク（ｋｅｔｏ　ｏｌｅｉｑｕｅ
　、　Ｋ　Ｏｌ　）化合物を用いることによって、以下
に実証する。

ネズミ起源（■ｕｒｉｎｅ　ｏｒｉｇｉｎ）のマクロフ
ァージＪ７７４６８の連続ラインが１種Ｊ７７４ＡＴＣ
Ｃのクローニング（ｃｌｏｎｉｎｇ）から生じ、グルタ
ミン２ｍＮ、１０％の牛胎児血清（５６°における不完
全化６０分間）及び１０層Ｎのヘペス（Ｈｅｐｅｓ）（
ｐＨ７，２）を補充したＲＰＭＩ　　１６４０媒体で培
養する。　５．１０６セル／■ｌの懸濁物質を、カシト
ン（ｃａｓｉｔｏｎｅ）内の夜間培養から生じたカンシ
タ・トロピカリス（ｃａｎｄｉｄａ　ｔｒｏｐｉｃａｌ
ｉｓ）の培養物で感染させる。用いた感染媒体は、２％
の生新生先の血清及び１０１踵ヘペス（ｐＨ７，２）を
含むＲＰＭＩである。

空気と１０％ＣＯ２の混合物内で３７℃の３時間培養の
後に、イース）　（ｙｅａｓｔ＋）の食菌作用が完了す
る。セル懸濁物質マクロファージカンジダを遠心分離し
、十分に洗沙し、ガラススライド（直径１４ｍｍ）を含
む２４のカップを有する皿の中で、１０５の感染したマ
クロファージ／空洞の比率で分散させる。

３時間の食菌作用の後（Ｔｏ）、１００のマクロファー
ジのうち、３２が１〜６のカンジダ／マクロファージを
含む、平均感染は２カンジダ／マクロフアージである。

全てのイーストが食菌されたが、わずかな例外があった
（メイーグルンバルトｅギエスマ（Ｍａ７−Ｇｒｕｎｗ
ａｌｄ　Ｇｉｅｍｓａ）で染色した後に光学顕微鏡で評
価できる）、基準薬剤及びＬＤＬに包まれた薬剤の１２
種の異なった濃度を、感染したマクロファージを含む皿
に分配する。薬剤の有効性の評価を各濃度において行な
った。１８時間の培養（３７°、空気−１Ｏ％ＣＯ２の
混合物内）の後にテストした結果、イーストは最初ホス
トセル内で、次に細胞外媒体内で成長した。感染したマ
クロファージの比率は、コントロール内で７５％だった
。あるセルは１〜２０以上のカンジダ／セルを含み得る
。大部分は２〜６イースト／セルを含んでいた。培養媒
体は１０８の細胞外カンジダ／ｍｌを含んでいた（バー
カーセル（Ｂｕｒｋｅｒ　ｃｅｌｌ）内でのカウント）
。

抗菌剤に関するカンジダの感度は、実験条件に大いに依
存する。薬剤の評価は種々の条件の下で行なわなければ
ならない、ＬＤＬ又はＡｃ−ＬＤＬ内に包まれ又は包ま
れない薬剤の基準抗菌剤（ｋｅｔｏｃｏｎａｚｏｌｅ（
Ｋ））に関する活性は、カンジダ（＝Ｃ１５０）に感染
したマクロファージの数を５０％減少させる薬剤のミク
ロモル濃度によって決定された。処置の途中における感
染セルの比率の減少とともに、感染したマクロファージ
あたりのカンジダの数が著しく減少する（１〜３イース
ト／セルの減少）。

１．３　　級里 ＬＤＬ又はＡｃ−ＬＤＬに包まれたＫＯＩ（７）活性（
牛脂児血清又はヒトの血しょう２％を含む媒体内で測定
した）をテーブル３及び４に示す。

ＬＤＬに包まれた他の抗菌剤ＫＡＡＯ１の活性をテーブ
ル４に示す。

ここで示した薬剤の濃度は、包まれたケトコナゾール（
ｋｅｔｏｃｏｎａｚｏｌｅ）　ａ導体のそれである０モ
ル比は、ＬＤＬ又はＡｃ−ＬＤＬのアポタンパク質Ｂと
誘導体にとの間で大体ｌである。

（別表テーブル３） （別表テーブル４） ２　、ＬＤＬに包まれた又は包まれない抗菌剤ＬＤＬに
包まれた又は包まれない抗菌剤を含む媒体中に培養され
たマクロファージＪ７７４６８の生存力をテーブル５に
示す。Ｋ及びＫＯＩは、細胞内感染（ｃ１５０）を５０
％だけ減少させるのに必要な濃度において有ｉＩｉであ
る。これに対し、ＬＤＬ−ＫＯＩについては毒性は検出
されなかった。

（別表テーブル５） 培養条件をテーブル３に示す、マクロファージのセル生
存率は、フォルモザン（ｆｏｒ■ｏｚａｎ）沈殿物内の
トレトラゾリウム（ｔｒｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ）　Ｍ　
。

Ｔ、Ｔ、の塩の減少によって、ＡＦの存在下で１８時間
の培養後に測定した。

コントロール（１００％）に関するＭＴＴの百分率減少 未処理 未定 ３、細胞外　染に対する包まれたＡＦ誘導体の盾社 鳩胞外感染に対する包まれたＡＦの活性は、２つの方法
で評価できる。１つの方法は、細胞内感染モデル（ｖＩ
の１．１セクシヨン参照）内の細胞外カンジダ菌の数を
決定することによるものである。他の方法は、複数のカ
ップ皿（ＲＰＭＩ媒体）内の連続希釈の方法によって、
これらの化合物の最小阻止密度（ＭＩＣ）を測定するこ
とによるものである。

結果をテーブル６に示す。

（別表テーブル６） 実験条件は、テーブル３及び■の１．１セクシヨンに記
載した条件と類似する。

ａ：ｃＩｅｘｔ５０＝外部媒体内のカ外部媒体数の成長
を５０％だけ阻 止する濃度 す二Ｐ交、Ｈ０：ヒトの血しょう ｃ　：　ＳＶＦ　　　　　＝牛胎児の血清（ｆｅｔａｌ
　ｃａＨｓｅｒｕｍ） ＬＤＬ−ＫＯＩ及びＡｃＬＤＬ−ＫＯＩは、シー・トロ
ピカリス（ｃ、ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）に対して、特に
牛脂児血清の無い媒体内でシー・アルビカンズ（ｃ、ａ
ｌｂｉｃａｎ＋）（１〜６倍のファクター）に対して、
ＫＯＩよりも高い活性を示す、この活性は、ヒトの血し
ょうの存在下でシー・アルビカンズに対してもっと大き
い。

［参考文＃］ （１）アルブリング（Ａｌｖｒｉｎｇ、Ｃ，Ｒ，）　、
　スフ−）　り（Ｓｔｅｃｋ、Ｅ、Ａ、）　、　ハ７ソ
ン（Ｈａｎｓｏｎ、Ｗ、１．　）　、ロイゼ−７クス（
Ｌｏｉｚｅａｕｘ、Ｐ、Ｓ、　）　、チ＋−／ブマン（
ｃｈａｐｍａｎ、Ｎ、Ｌ、）　、ウェイツ（Ｗａｉｔｓ
、［Ｊ、Ｂ、）　　；リボゾームに包まれたアンチモン
に基づく薬剤の使用による、実験的リーシュマニア症に
対する改良治療法（Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｔｈｅｒａｐｙ
　ａｇａｒｎｓｔ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎ−ｔａｌ　　ｌ
ｅｉｓｈｍａｎｉａｓｉｓ　　ｂ７　　ｕｓｅ　　ｏｆ
　　ａ　　ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔｂａｓｅｄ　　ｏｎ　
　ａｎｔｉｍｏｎ７　　ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ　　
ｉｎ　　ａ　　ｌ１ｐｏ−ｓｏｙｓｅ）　　、　　Ｌｉ
ｆｅ　　Ｓｃｉ、、　　２２：１０２１−１０２８（１
９７Ｂ）（２）カランセル（ｃａｕｎｓｅｌｌ　Ｒ，Ｅ
、　）　、ボーランド（Ｐａｈｌａｎｄ　Ｒ，Ｃ，）　
　：診断および治療剤としテノ、特定部位のレベルにお
ける放出のためのリポタンパク質、ポテンシャルシステ
ム（Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｎｓ。

ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　　ｓｉｓｔｅｍ　　ｆｏｒ　　ｄ
ｅｌｉｖｅｒｙ　　ａｔ　　ｔｈｅ　　１ｅｖｅｌｏｆ
　ａ　５ｐｅｃｉ質ｃ　５ｉｔｅ、　ａｓ　ｄｉａｇｎ
ｏｓｔｉｃ　ａｎｄ　ｔｈｅｒａ−ｐｅｕｔｉｃ　　ａ
ｇｅｎｔｓ　　）　　、　　にＷｅｄ；ｃｈｅｗ、、　
　２５：１１１５−１１２０（３）クリーガー（Ｋｒｉ
ｅｇｅｒ　Ｍ、）　、ブラウン（ＢｒｏｗｎＭ、Ｓ、）
　、　７７ウスト（Ｆａｕｓｔ　Ｊ、Ｒ，）　、ゴール
ド　スタイン（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ　Ｊル、）：外因性
コレスチロール・リノール酸塩による、ＬＤＬの内因性
コレスチロール・エステルの置’ｌｌ　（Ｒｅｐｌａｃ
ｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ　ｃｈｏｌｅ
ｓｔｅｒｏｌ　ｅｓｔｅｒｓ　ｏｆ　ＬＤ　Ｌｂｙ　ｅ
ｘａｇｅｎａｕｓ　ｃｈｏｌｅｃｔｅｔｏｌ　ｌ１ｎｏ
ｌｅａｔｅ）、Ｊ、　ｏｆ　Ｂｉｏｌ、ｃｈｅｓ、、　
２５３：４０９３−４１０１（１９７Ｂ）（４）ゴール
ドスタイ７　（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ　Ｊ、Ｌ、）　、ホ
ー（Ｈａ　Ｙ、に、　）　、バス（Ｂａｓｕ　Ｓ、に、
　）　、ブラウン（Ｂｒｏｗｎ　Ｍ、Ｓ、）　　：マク
ロファージへの固定およびアセチル化ＬＤＬの減成によ
るリエゾン位置、コレスチロール堆積の大量生産（Ｌｉ
ａｉｓｏｎ　５ｉｔｅｂ７　　質ｘａｔｉｏｎ　　ｔｏ
　　ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ　　ａｎｄ　　ｄｅｇｒａｔ
ｉｏｎ　　ｏｖａｃｅｔツ１ａｔｅｄ　　Ｌ　Ｄ　　Ｌ
　　、　　ｍａｓｓｉｖｅ　　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　
　ｏｆｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ　ｄｅｐｏｓｉｔ　）　
、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、、　７６：３３３−３３７（１
９７９）（５）バス（Ｂａｓｕ　Ｓ、に、　）　、ゴー
ルドスタイン（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ　Ｊル、）、アンダ
ーツ７　（ＡｎｄｅｒｓｏｎＲ，Ｃ，Ｗ、）　、ブラウ
ン（Ｂｒｏｗｎ　Ｎ、Ｓ、）　　：カチオン化の減成お
よびコレスチロール過剰群の固形接合体ａｍ芽細胞内の
コレスチロールの代謝の調箇（Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ
　ｏｆ　ｃａｔｉｏｎｉｚｅｄ　　Ｌ　Ｄ　Ｌ　　ａ　
　ｎ　　ｄｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　　ｏｆ　　ｔｈｅ　
　ｍｅｔａｂａｌｉｓｓ　　ｔｈｅ　　ｃｈｏｌｅｓｔ
ｅｒｏｌｉｎ　ｔｈｅ　ｈｏｍｏｚｙｇｏｔｉｃ　質ｂ
ｒｏｂｌａｓｔｓ　ａｔ　ｈｙｐｅｒｃｈｏ−１ｅｓｔ
ｅｒｏｌｅｍｉｃ　　ｆａｍｉｌｉｅｓ　　）　　、　
　Ｐｒｅｃ、　　Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、、　７３；３１７８−３１８２（
１９７Ｂ）（６）ブラウン（Ｂｒｏｖｎ　Ｍ、Ｓ、）、
スザンヌ（ＳｕｚａｎｎｅＥ、　Ｄｏｎａ）、ゴールド
スタイｙ（Ｊ、Ｌ、　Ｇｏｌｄａｔｅｉｎ）：血しょう
ＬＤＬに含まれるコレスチロール・エステルのレセプタ
ー依存加水分解（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｄｅｐｅｎｄｅｎ
ｔ−ｈｙｄｒｏｌｙｓｉＳｏｆ　ｃｈｏｌｅＳｔｅｒｏ
ｌ　ｅｓｔｅｒｓｃｏｎｔａｉｎｅｄ　ｉｎ　ｐｌａｇ
ｍａｔｉｃ　　ＬＤＬ）、Ｐｒａｃ、　Ｎａｔ、Ｓｃｉ
、　ｕ、ｓ、ａ、、　７２：　２９２５−２９２９　（
１９７５）（７）チ＋ｙプマ７　（ｃｈａｐｍａｎ　Ｎ
、Ｊ、）、ケイン（Ｋａｎｅ　Ｊ、ＰＪ　　：ヒト血清
ＬＤＬのアポタンパク賀の安定性、内因性ニドペプチダ
ーゼ活性の不存在（Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ　　ｏｆ　　ｔ
ｈｅ　　ａｐｏｐｒｏｔｅｉｎ　　ｏｆ　　ｔｈｅ　　
ｈｕｍａｎｓｅｒｕｍ　　Ｌ　Ｄ　Ｌ　、　　Ａｂｓｅ
ｎｃｅ　　ｏｆ　　ｅｎｃｏｇｅｎｏｕｓ　　ｅｎｄｏ
ｐｅｐ−１ｉｄａｇｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ）、Ｂ、Ｂ、
Ｒ，Ｃ，、Ｈ：　　１０３０−１０３８（８）パットナ
イフ（Ｐａｔｔｎａｉｋ　Ｎ、Ｍ、）　、モンテス（Ｍ
ｏｎｔｅｓ　Ａ、）　、　　ヒユーズ（Ｈｕｇｈｅｓ　
Ｌ、Ｂ、）　、ジルバースミツト（Ｚｉｌｖｅｒｓｍｉ
ｔ　Ｄ、Ｂ、）　、　　ヒト血しょう中コレスチロール
・エステルの交換タンパク質（Ｅｘｃｈａｎ−ｇｅ　　
ｐｒｏｔｅｉｎ　　ｏｆ　　ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ　
　ｅｓｔｅｒ　　ｉｎｈｕｍａｎｐｌａｓｍａ）、Ｂ、
Ｂ、Ａ、、　５３：　４２８−４３８　（１９７Ｂ）（
９）ウォルターズ（ｗａｔｔＥＲｓ　Ｋ、Ａ、）、７　
ｅｒ　−Ｌ／　７　ス（ＦＬＯＲＥＮＣＥ　Ａ、↑、）
、ダガード（ＤＵＧＡＲ［ｌ　Ｄ、Ｈ，）　　。

Ｉｎｔ、　Ｊ、　ｏｒ　Ｐｂａｒｍａｃｅｕｔｉｃｇ　
１０　（１９８２）、　１５３−１８３（ｌＯ）マスケ
リール（ＮＡＳＱＵＩＥＬＩＥＲＭ、）　、　　ビトル
ス（ＶＩＴＯＬＳ　Ｓ、）　、　　ピー））　−スフ　
（ＰＥＴＥＲ９ＯＮ　Ｇ、）ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒ
ｃｂ　４Ｂ　（１９８Ｂ）、　３８４２−３８４７［効
果］ 未発ｔＪｌは以上説明してきたようなものなので、いか
なるタイプの脂質または油溶性化合物にも適用すること
ができ、リポタンパク質の生物学的性質を変えることの
ない封入方法を提供することができる。

また、本プロセスは、油溶性の治療剤または化学的修飾
により油溶性としたものを、リポタンパク質の生物学的
性質に影うを与えることなくリポタンパク質に取り込む
ことを可能とするものである。

更に本発明の効果として、つぎのことを挙げることがで
きる： ・本技術を容易に工業的に利用することを可能とする単
純さ。

・化学的合成の複雑なステップにたよることなく、任意
の疎水性の有効成分に適用可能であるという事実。

・先行方法とは違って、有機溶剤を使用せず、また遠心
分離または凍結乾燥操作を使用せず、したかって、（す
られた調整物は人間の治療への使用により好適なものと
なっていること。

（以下余白） 別表 別表 別表 別表 別表 別表

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＬＤＬの解離−再構成プロセスについて最も
予想されうると思われるものを図式的に■は、アボタ、
パ、質Ｂ、 口は、リン脂質及び遊離コレスチロールロは、コレスチ
ロール−ステルとトリグリセリド を示す。 第２図は、ＬＤＬ−ＮａＤｏｃ調整物（流量０．１ｍ１
Ｈ画分に２ｍ１）の緩衝剤りによって平衡させたセファ
デックス（ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ２００でのクロマトグ
ラフィーを示し、アポタンパクＷＢ（・）、コレスチロ
ール（ＩＩ）　、　及ヒリン脂質（ム）は夫々の両分に
よって定まる。 第３図は、ＬＤＬ　（Ａ）及びＮａＤｏｃ（Ｂ）によっ
て調製したＬＤＬの１％アガロースでの電気泳動を示す
。 第４図は、抗アポタンパク質Ｂ血清についてのアポタン
パク質Ｂ（６，８，１０，１２）のオクタ口＝−（Ｏｕ
ｃｈｔ　ｅ　ｒ　ｌ　ｏｗｎｙ）図を示す。 第５図は、５Ｏ３−ＦＡＡ　　ファーマチア（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ）ＰＡＡ　　４／３０を示し、グラディエン
ドは０．２％ＳＯ３であり、図中１．２，３はＬＤＬ、
４．５．６はアポタンパク質Ｂである。 第６図中Ａは、再構成されたＬＤＬ（流量０　、　ｌ　
ｍ　ｌ　／　ｍ　ｉ　ｎ　；画分１２ｍ１）の緩衝剤Ｃ
によって平衡させたセファデックス（ｓｅｐｈａｄｅｘ
）Ｇ２００でのクロマトグラフィーを示し、コレスチロ
ール（ｅ）、リン脂質（１）及びアポタンパクＷＢ（ム
）は夫々の両分によって定まる。第６図中Ｂは、アポタ
ンパク質Ｂの決定用グラフを示す。 第７図は、自然のＬＤＬ（Ａ）及び再構成したＬＤＬ　
（Ｂ）の１％アガロースでの電気泳動を示す。 第８図は、未変成のＬＤＬ　（Ａ）、再構成したＬＤＬ
（Ｂ）及び抗アポタンパク質Ｂ血清についてのＬＤＬの
１％アガロースでの免疫電気泳動を示す。 第９図は、再構成されたＬＤＬコレスチロール［３Ｈ］
（流量０　、１　ｍ　ｌ　／　ｍ　ｉ　ｎ　；画分量２
ｍ　ｌ）の緩衝剤Ｃによって平衡させたセフ７デツクス
（ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ２００でのクロマトグラフィー
を示し、コレスチロール（Ｏ）、アポタンパクＷＢ（・
）、及び放射能（Δ）は夫々の両分によって定まる。 第１θ図は、再構成されたＬＤＬコレスチロール油酸塩
酸塩４Ｃ］　　（流量０．１ｍｌ／ｍｉｎ；画分子質２
ｍｌ）の緩衝剤Ｃによって平衡させたセフ７デツクス（
ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ２００でのクロマトグラフィーを
示し、コレスチロール（・）、放射能（ム）、及びアポ
タンパク質Ｂ（φ）は夫々の両分によって定まる。 第１１図は、再構成されたＬＤＬコレスチロール油酸塩
酸塩４Ｃ］　　（流星０．１ｍｌ／ｍｉｎ；画分量２ｍ
１）（０）及びＡＣ−ＬＤＬ油酸塩酸塩４Ｃ］　　（・
）のマクロファージ　Ｊ７４４Ｇ８による蓄桔を示し、
細胞は培養基ＲＰＭＩによってリンスされ、ＬＤＬコレ
スチロール油酸塩酸塩４Ｃ］またはＡＣ−ＬＤＬ油酸塩
酸塩４Ｃ］を１０ｍｇ／ｍｌ含む同じ培養基中において
３７℃の温度で培養され、所定時間の培養後、上清中の
溶けやすいトリクロ酢酸塩放射１組が決定され、また細
胞に結合した放射能も決定される。 第１２図は、ＬＤＬの解離再構成プロセスによる治療剤
の結合を示し、図中： ■は、アポタンパク質Ｂ、 口は、リン脂質及び遊離コレスチロールロは、コレスチ
ロール−ステルとトリグリセリド 凶は、洗浄剤、 口は、治療剤 を示す。 第１３図Ａは、ＣＴＯ４０ＯＡ剤の結合のための再構成
プロセスの終了時点において得られる回収率を示し、第
１３図Ｂは、ＣＴＯ４００１３剤の結合のための再構成
プロセスの終了時点において得られる回収率を示す。 第１４図は、ＣＴＯ４００１３によって再構成されたＬ
ＤＬＣ流１０．１ｍｌ／ｍｉ　ｎ；両分量２ｍ　ｌ）の
緩衝剤Ｂによって平衡させたセファデックス（ｓｅｐｈ
ａｄｅｘ）Ｇ２００でのクロマトグラフィーを示し、コ
レスチロール（・）、アポタンパク質Ｂ（Δ）及びリン
脂質（０）は、ＣＴＯ４００１３化合物（・）と同様に
、夫々の両分によって定まる。 第１５図は、結合された分子の解放における血しょうの
影響を示し、再構成されたＬＤＬコレスチロール油酸塩
酸塩４Ｃ］及びＣＴＯ４００１３（Ｂ）によって再構成
されたＬＤＬは、血しょうの存在の下で３７℃の温度で
３時間培養され、見本は不連続のＫＢｒグラディエンド
上に分別され、該分別は密度の減少度合によってリカバ
ーされる。 第１６図は、異なる培養剤の存在のもとでのＣ９１基の
可溶化を示し、Ｃｑ＋　（３Ｈ）のエタノール溶液（規
定活性度１１０２６ｄｐ、ｇｒ−＋１　　ｍｇｒｓｍＬ
−１）１００Ｌはアルボ７（ｒ）存在下で蒸発させられ
、乾残留物は、緩衝剤Ｃ＋ＬＤＬ　　（５００４ｇｒｌ
ＩｍＬ−１）＋ＮａＤＯＣ（２ｍＭ）２ｍＬ　（・）、
または緩衝剤Ｃ＋ＬＤＬ　（５００ｇｒ−ｍＬ−’）２
ｍＬ　（０）、または２ｍＬの緩衝剤Ｃ＋ＮａＤＯＣ（
２ｍＭ）　　（ＩＩ）及び２ｍＬの緩衝剤Ｃ（ロ）の存
在下に置かれ、標本剤はおだやかに攪拌されつつ２５℃
の温度の下で培養され、主情中の放射能は異なる培養時
間の後で決定される。 第１７図は、１２５Ｉ　　未変成ＬＤＬ（０）及び＋２
５　　Ｉ　　ＬＤＬ−Ｃｑ＋　（・）の血しょう性の消
滅及び暗褐色状の蓄積を示す。 第１８図は、１２５Ｉ　　未変成ＬＤＬ（ｃＩ）及び＋
２５　Ｉ　　ＬＤＬ−Ｃ９１（−）の生体分布を示し、
関連組織捕獲は１時間の注射の後に定められ、該注射は
Ｂ　ａ　ｌ　ｂ　／　ｃマウスの尾の静脈に２５ｇｒ＋
／−２０ｇｒのＬＤＬを注射することによって行われる
。 第１９図は、人間の繊維芽細胞へのＬＤＬ−ＣＩＩ　（
Ａ）及びＣ９１塩（Ｂ）の細胞毒性を示す。 、代理人弁理士　村田幹雄 図面の浄書（内容に変更なし） Ｆｉｇ、　３ Ｆｉｇ、　４ 図面の浄書（内容に変更なし） Ｆｉｇ、　５ 図面の浄書（内容に変更なし） 溶出体積（ｍｌ） 時　　　間　０祁の 培餐時間（ト）卸 ０．５　１　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
４時　　　間　０頴の 生存セル　　σＯ 手続補ＩＩ三書（方幻 昭和６３年４月６日 特願昭６３−５６５８号 ？０発明の名称 親油性有効成分のリポタンパク質への取り込み方法、そ
のリポタンパク質および医薬組成物 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 住　所　ベルギー国　６２２０　フロールス　（番地な
し）名　称　イールーセルターフ　ソシエテ　アノニム
４．４ＵＩＡ　　　〒１　０７１Ｍｒｒ＆５８６−９２
８７ｍ住　所　東京都港区赤坂４−３−１共同ビル赤坂
４０１号６、補正の内容 （１）明細書の第１０８頁２行に「示す。」とあるを「
示すグラフ図である。」と訂正する。 （２）同第１０８頁５行〜６行に１図を示す。」とある
を「を示すグラフ図である。」と訂正する。 （３）同第１０８頁９行に「し、グラディエンドは０．
２％ＳＤＳであり、」とあるを［すグラフ図であり、グ
ラディエンドは０．２％ＳＤＳ、」と訂ｉ［する。 （４）図面の第３図〜５図、第７図及び第８図を浄古す
る（内容に変更なし）。 以上

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. （１）１または複数の親油性有効成分をリポタンパク質
   に取り込む方法であって、この方法は、つぎのステップ
   から成る： （ａ）リポタンパク質を洗浄剤の存在下に置くこと； （ｂ）このようにして得た混合物を、取り込むべき有効
   成分の存在下に置くこと； （ｃ）洗浄剤を除去すること。
2. （２）請求項１に記載する１または複数の親油性有効成
   分をリポタンパク質に取り込む方法であって、つぎの連
   続ステップから成るもの。 （ａ）リポタンパク質を洗浄剤の存在下に置くことによ
   って、リポタンパク質をその要素に解離すること； （ｂ）解離の後、ステップ（ａ）で得た要素を、取り込
   むべき有効成分の存在下に置くこと； （ｃ）ついで、アポタンパク質の変化または変位のリポ
   タンパク質を再構成し、洗浄剤を除去することによって
   有効成分を取り込むこと。
3. （３）請求項１に記載の方法であって、リポタンパク質
   がＬＤＬであるもの。
4. （４）請求項２に記載の方法であって、リポタンパク質
   がＬＤＬであるもの。
5. （５）請求項１に記載の方法であって、使用する洗浄剤
   の量がリポタンパク質１ｍｇにつき０．００１ｍｇと１
   ｍｇの間にあり、使用する有効成分の量がリポタンパク
   質１ｍｇにつき０．００１ｍｇと５ｍｇとの間にあるも
   の。
6. （６）請求項１に記載の方法であって、リポタンパク質
   が、アポタンパク質Ｂが化学的に修飾されているＬＤＬ
   であるもの。
7. （７）請求項６に記載の方法であって、リポタンパク質
   がアセチル化ＬＤＬであるもの。
8. （８）請求項７に記載の方法であって、ＬＤＬのアセチ
   ル化を無水酢酸により行なうもの。
9. （９）請求項１に記載の方法であって、洗浄剤をイオン
   系および非イオン系洗浄剤から選ぶもの。
10. （１０）請求項１に記載の方法であって、洗浄剤がスチ
    ロール酸（ｓｔｅｒｏｌｉｃ　ａｃｉｄ）の塩であるも
    の。
11. （１１）請求項１０に記載の方法であって、洗浄剤がＮ
    ａＤＯＣであるもの。
12. （１２）請求項１に記載の方法であって、親油性有効成
    分が抗菌剤、抗寄生虫剤および／または抗バクテリア剤
    であるもの。
13. （１３）請求項１に記載の方法であって、有効成分が抗
    ガン剤であるもの。
14. （１４）請求項１２に記載の方法であって、有効成分が
    ケトコナゾール（ｋｅｔｏｃｏｎａｚｏｌｅ）誘導体で
    あるもの。
15. （１５）請求項１３に記載の方法であって、有効成分が
    ヴィンカアルカロイド（Ｖｉｎｃａａｌｃａｌｏｉｄ）
    誘導体であるもの。
16. （１６）請求項１に記載の方法であって、親油性鎖が、
    有効成分のリポタンパク質への取り込み前に有効成分に
    結合されているもの。
17. （１７）請求項１の方法により、１または複数の有効成
    分を取り込んだリポタンパク質。
18. （１８）請求項１７により１または複数の有効成分を取
    り込んだリポタンパク質であって、該リポタンパク質が
    修飾を受けたアポタンパク質Ｂをさらに含むもの。
19. （１９）少なくとも１つの有効成分を輸送するための医
    薬組成物であって、請求項１の方法により上記有効成分
    を取り込んだリポタンパク質を有するもの。
20. （２０）請求項１９に記載の組成物であって、有効成分
    が抗菌剤、抗寄生虫剤および／または抗バクテリア剤で
    あるもの。
21. （２１）請求項１９に記載の組成物であって、有効成分
    が抗ガン剤であるもの。