JPH03505576A - 有機化合物に関する改良 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 有機化合物に関する改良 この発明は薬物送達システムの分野に関するものであって、より詳細にはホルモ ン、例えばサイト力イン類と結合させたリポソームに内包された標的志向性薬物 に関するものである。

動物細胞はその膜表面上に受容体分子が存在することを特徴とするが、これらの 受容体は、それに特異的なリガンドと結合することによって細胞の代謝反応を仲 介する。ヒトの体内でこれらの膜受容体の幾つかは、限られた数の細胞型で表さ れ、一定の細胞型に特異的ですらあり得る。特定の細胞型の生物学的機能が患者 の健康状態に不利であれば、それらの好ましくない細胞を遮断し、あるいは細胞 を溶解するための治療薬を送達することが望ましい、一般に特異的な薬物送達は 治療薬を受容体特異性リガンドへ結合させることにより達成される。

臓器移植手術では、手術後の移植片拒絶反応を起こす可能性を最小限にとどめる ため移植した宿主の免疫系を抑制する必要がある。

実際の臨床の際に、効果的に使用される免疫抑制剤はステロイド、アザチオプリ ンおよびシクロスポリンＡ等である。またある特定の′「細胞膜抗原に対する抗 体を単独もしくは細胞障害性薬物と接合させて使用することが提案された。同様 に自己免疫疾患のようにＴａｌ胞の不適切な働きが直接の原因となる免疫系の機 能不全も免疫抑制剤で処置し得る。

また幾つかの別の例では一定の細胞型に固有な膜受容体の存在が細胞の悪性状態 と相関している。事実、正常な状態では少量だけ存在していることが知られてい る幾つかの膜受容体が、腫瘍細胞でははるかに高密度で出現することが分かつて おり、したがって細胞障害性薬物の特異的な標的志向によってそれらを取り除き 得るかもしれない。

然し上記の処置の多くは、細胞障害効果が１通常開種移植片拒絶反応または疾病 の原因に関与している特定の細胞だけに限定されずに広がる事実のため、好まし くない副作用を伴う０例えばある種の既知の免疫抑制剤の使用により本質的に生 じる重要な問題は、正常な免疫系であれば調節できるはずの細菌またはウィルス による感染を患者に特に起こし易くすることである。抗体との接合体として細胞 障害性薬物の送達に伴うもう一つの間開は、抗体が細胞内へ取り込まれないこと があるということである。即ちトキシン−抗体接合体は特異的な結合を示すが、 ｌ・キシン３好ましくない細胞へ届は損なうことがある。インターナリゼーショ ンの頻度が低い結果、非実用的に高い濃度のトキシン−抗体接合体を使用しなけ ればならず、それに応じて全般にわたる毒性のリスクも増大する。

したがって高度の特異性および有効性をもって好ましくない細胞と阻止し、また は溶解する治療薬を提供する必要性が今日なお存在する。細胞障害佐薬７１７１ とリポソームｌ−内包させ、薬物含有リポソームをホルモンｌ−結合させること によってこれらの必要条件を充たし得ることが判明した。「ホルモン」の語は、 細胞受容体結合部位を有し、受容体と結合することによって標的細胞内の代謝反 応を誘導し得るタンパク質またはペプチドを意味する。例えばこれは生体内で一 臓器から他の臓器へ血液によって運搬される内分泌ホルモンおよび細胞−細胞間 メディエータ−であるバラ分泌ホルモンおよびサイ１−カイン等である。

したがってこの発明は、ホルモン受容体を膜表面にもつ細胞との相互作用に利用 できる生物学的活性細胞受容体−結合部位を有するホルモンｌ−結合させるリポ ソームを提供する。この発明のリポソームは診断用または医薬品活性物質、好ま しくは細胞障害性薬物の標的志向性送達のための送達運搬体として使用し得る。

このリポソームを、好ましくはサイト力イン類、例えばインターロイキン１〜７ 、インターフェロンα、βおよびλ、腫瘍壊死因子αおよびβ、Ｔ細胞代行因子 、マクロファージ　　阻止因子およびコロニー形成刺激因子（例えばＧ−ＣＳ　 ＦおよびＧＭ−Ｃ３Ｆ）のようなリンホカインおよびモノ力インと結合する。好 ましいサイトカインはＩ　Ｌ−２である。ＩＬ−２は抗原の刺激によって数時間 以内にＴｍ胞により産生される半減期の短い天然由来の***促進型サイト力イン である。ＩＬ−２は抗原による刺激によって活性化された］゛細胞膜上に一時的 に出現する受容体分子と結合することによって、活性化Ｔ細胞の増殖を誘発する 。

ヒトＩ　Ｌ−２の組換え体形態はこの発明における使用に特に好ましく、とりわ け突然変異によって安定化させたものが好ましい０例えば１またはそれ以上のア ミノ酸を欠失し、または他のアミノ酸で置き換えて修飾した半減期の一層長いヒ トＩＬ−２（例えば天然に由来する１２５位のシスティンをセリンまたはアラニ ンで置き換えたＩＬ−２＞を提供してもよい、また別法として短縮した分子形態 でもＩＬ−２断片が機能的に活性な結合部位を含んでいる限り、即ちアミノ酸配 列が天然ヒトＩＬ−２の２０〜３０残基の間を含んでいる限りリポソームと結合 する有用なリガンドを提供し得る。

低親和性および高親和性受容体と命名された２種の異なったＩＬ−２受容体があ ることが知られている。低親和性受容体は休止および活性化Ｔ細胞の双方に出現 するが、高親和性受容体は低親和性受容体に比べて少量で、活性化Ｔ細胞にのみ 存在する。高親和性受容体はＩ　Ｌ−２のインターナリゼーションに関与する唯 一の受容体であるから、ＩＬ−２の生物学的効果の大半はこの受容体によって仲 介される。抗（Ｉ　Ｌ−２受容体）ＭＡｂを生産し、治療的使用が期待される細 胞障害性薬物、例えばＩＬ−２によって誘発された活性化Ｔ細胞の増殖バースト に起因する同種移植片拒絶反応を予防しまたは処置する細胞障害性薬物と結合し た。抗（ＩＬ−２受容体）ＭＡｂ接合体は、正常な免疫監視、例えば感染と戦う ために絶えず必要である休止Ｔ細胞に有害な影響を与えることなく活性化Ｔ細胞 を有効に殺傷することができた。然しこれらのＭＡｂ＜普通抗ＴＡＣＭＡｂと呼 ばれる）は低親和性受容体しか認識せず、したがって細胞への取り込みは成功し なかった。

然しＩ　Ｌ−２分子またはその活性断片を標的志向に使用した場合、高親和性受 容体へ優先的に結合するはずである。したがって薬物含有リポソームをＩ　Ｌ− ２へ結合させる有利性は、薬物のインターナリゼーションおよび活性化Ｔ、１４ ｉｌ胞の極めて特異的な標的志向性の点で抗ＴＡＣＭＡｂ接合体より優れている 点である。

リポソームは内水相を内包する２層膜からなる閉鎖型球形の殻状の構造である。

２層膜の主要構成成分は天然または合成起源のリン脂質を含み得る両親媒性分子 である。この発明に使用するリポソームは、親水基がホスファチジルエタノール アミンであるリン脂質を含有する。また好ましくは親水基がホスファチジルコリ ンであるリン脂質を含有する。ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファ チジルコリンと組み合わせる疎水基は種々の飽和または不飽和の脂肪酸部分であ り得る。水溶液に分散させたリン脂質は炭化水素の尾部を内側へ向け、極性頭部 基を外側へ向けて水と相互作用し自然に２層膜を作る。

最も好ましくはこの発明に使用するリポソームは、部分的またはその全体が種々 の割合のジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ＞および／ またはジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）からなるものである、 またコレステロールのようなステロイドがリポソーム膜に存在することが好まし い、ステロイドに対する脂質の好適な重量比は６：１〜１：１である。

リポソームは小さい単層膜小胞体（ＳＵＶ）でも、同心円状の２相膜が水層によ って互いに分かれている玉葱のような形のオリゴ層膜または多層膜小胞体（ＭＬ Ｖ）でもよい、好ましくはこの発明に使用するリポソームは約３０〜約３００ナ ノメーターの外径のＳＵＶであり、最も好ましいＳＵＶは５０〜１００ナノメー ターの外径のものである。

ＭＬＶはリン脂質混合物を単にかき混ぜることによって得られる。

これらの構造を超音波照射（音波処理）するとＳＵｖが生成する。

ＭＬＶおよびＳＵＶは多数報告されている種々の標準的な方法、例えばＦ、ス′ ソ才力およびり、パパハドプロス、「リポソーム膜・アンド・ゼア・ユーシズ・ イン・バイオロジー・アンド・メジシンＪ、アナルズ・イン・ザ・ニューヨーク ・アカデミ−・イン・サイエンシズ、３０８巻、１〜４８２頁（１９７８年）− Ｒ，Ｌ、ジュリアーノおよびり、レイトン、「リポソーム膜・アズ・ア・ドラッ グ・デリバリ−・システム」、［ドラッグ・デリバリ−・システムズコ、１８９ 〜２３６頁、オックスフォード・ユニバージティー・プレス社、ニューヨーク（ １９８０年）またはＨ，Ｊ、バズナンスティおよびＲ，Ｌ、ジュリアーノ、ｒバ イオロジカル・７１０−チズ・ツー・ザ・コンドロールド・デリバリ−・イン・ ドラッグズ：ア・クリティカル、レビュー」、ファーマコロジカル・レビュー、 ３６巻、２７７〜３３６頁（１９８４年）に報告されているような方法によって 製造し得る。

当業者ならば、上記のように薬物を受動的に内包させるため、リポソームの製造 に使用する脂質混合物へ薬物を加えて薬物含有リポソームを簡単に製造し得るこ とが理解し得よう。

以下、「リポソーム」またはｒｓＵＶＪの語は何も入っていないリポソームまた はＳＵＶばかりでなく、薬物を含有しているリポソームまたはＳＵＶをも意味す る。

リポソームへ内包させる細胞障害性薬物は、細胞の代謝活性を遮断しまたは混乱 させることが可能な任意の化合物、例えばＤＮＡの複製またはタンパク質合成を 逆行的に干渉する化合物を含む、好ましい細胞障害性薬物はマイトマイシンＣ、 ダウノルビシン、ドキソルビシン、シスプラチン、６−メルカグトプリン、メツ アラン、アクチノマイシンＤ、フルオロデオキシウリジン、ＡＺＴ、シクロスポ リンＡおよびメトトレキセートであり、最後に挙げた薬物が特に好ましい。

シクロスポリンＡでは、臓器移植または移植片対宿主疾患の処置にこの医薬品化 合物（サンディミューン、商標）の静脈内投与を通常３〜５　ｍ　ｇ／ｋ　ｇ／ 日の投与量で行う。経口投与の場合はその約３倍高い、この発明の送達運搬体を 使用して投与する場合は、疾患状態の原因となっている免疫系細胞へ標的志向し て薬物を送達することができるため、一層低投与量でそれに匹敵した効果を達成 することが期待し得る。

メトトレキセートは脂質１ｍｇ当り２０〜２００μｇの量とし、ついで投与のた め水性リポソーム分散中、０．３ｍＭメトトレキセートとなるようその濃度を調 節することによってカプセル化に成功した。

この発明のもう一つの態様は、リポソームを生物学的活性細胞受容体−結合部位 を有するホルモンへ結合する方法を提供する。

そのような方法は ＜ａ）カップリング剤をリポソームへ固定し、ついでホルモンと反応させ、また は （ｂ）カップリング剤舎ホルモンへ固定し、ついでリポソームと反応させ、また は （ｃ）第１のカップリング剤をリボンームヘ固定し、第２のカップリング剤をホ ルモン結合部位し、ついでカップリング部分を互いに反応させる ことを包含し、特に別法（ｃ）が好ましい。

また立体障害を回避するため、リポソームとリガンドとの間に４〜６個の炭素原 子を有するリンカ−鎖を挿入することが望ましい。

このリンカ−鎖をリポソームまたはホルモンへ結合し、好ましくはリポソームへ 結合する。この場合、単一のカップリング剤を使用することが、リポソームまた はホルモンｌ風固定したリンカ−鎖を残りの成分Ｉ＼結合するのに好ましい。

カップリング剤をホスファチジルエタノールアミン、好ましくはジステアロイル ホスファチジルエタノールアミンへ共有結合的に結合することによってカップリ ング剤を有するリポソームを得てもよい、ついで修飾したリン脂質を単独または 他の脂質および／またはステロイドと組み合わせて上記のようなリポソームの製 造に使用する。

リン脂質へ共有結合的に結合させるカップリング剤は当技術上周知のものである 。都合よいものはスクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）−ブチル ー）　（ＳＭＰＢ）、またはスクシンイミジル−８−アセチルチオアセテート（ ＳＡＴＡ）またはＮ−ヒドロキシスクシンイミジル−３−く２−ピリジルジチオ ）−プロピオネ−）−（ＳＰＤＰ）等の含硫黄スクシンイミジル化合物のような ヘテロ２官能性試薬である。含硫黄スクシンイミジル化合物が好ましい、５ＡＴ Ａが特に好ましい。

カップリング剤はまた結合させるホルモンのアミ、ノ酸残基の官能基を含んだ共 有結合によってホルモンへ固定し得る。結合は、都合よくはホルモン上のりシン 、システィン、ヒスチジンおよびアルギニン残基からなる群から選ばれた残基で 起こる。リシン残基が特に好ましい。

ホルモンへ結合させる好適なカップリング剤はへテロ２官能性試薬である。都合 よくは、それらはスクシンイミジル−８−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ） ＋スクシンイミジルー４−（ｐ−マレイミドフェニル）−ブチレート（ＳＭＰＢ ）、スルホ−ＳＭＰＢ、Ｍ−＜４−カルボキシ−シクロへキシル−メチル）マレ イミド（ＳＭＣＣ）、スルホ−ＳＭＣＣ，Ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒド ロキスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、スルホ−ＭＢＳ、Ｎ−スクシンイミジ ル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾニー）　（ＳＩＡＢ）およびスルホ−８ ＩＡＢから選ばれる。最も好ましいカップリング剤はＳＭＰＨである。

好ましい一態様として、スクシンイミジル−８−アセチルチオアセテート−ホス ファチジルエタノールアミンを使用して５ＡＴＡを膜に組み込んだ活性化リポソ ームを製造し、ついでこれをＳＭＰＢ−ホルモン接合体、最も好ましくはＳＭＰ Ｂ−ＩＬ−２接合体へ共有結合的に結合させる。

結合に関与し得る１個または数個のアミノ酸残基がホルモン受容体部位に局在し ている場合は、カップリング剤をホルモンへ結合する前にこの領域を保護してお くことが極めて望ましい。

これは通常ホルモンのアミノＭ残基の官能基の無作為な部分的保護によって達成 し得る。そのような方法は、例えばジャンソンズら［アナリティカル・バイオケ ミストリー、１１１巻、５４頁（１９８１年）］によって、抗体をリポソームへ 結合する前に、抗体のりシン残基のεＮＨ，官能基をシトラコン酸無水物で無作 為に部分的保護することからなる抗体のリポソームへの結合方法として報告され た。結合が達成されたら封鎖剤を除去する。然し保護方法の無作為性のため、こ の方法によって得られる完全に有効な抗原結合部位を保有した抗体−リポソーム 接合体の割合は多少低い。

今回、ホルモン結合部位に対し特異的なモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を使用す ることによって結合部位の極めて有効な保護が達成されることが判明した。した がってこの発明はさらに、ホルモンの結合部位を、その結合部位に特異的な抗体 で可逆的に保護することを包含するリポソームをホルモンへカップリングする方 法を提供する。ホルモンをリポソームへ結合した後、または他の方法では結合部 位が干渉または封鎖される任意の反応段階を実施した後の任意の場合に抗体を結 合部位から取り除き、ホルモンに対する好適な細胞受容体との相互作用が可能な 部位を作成する。

より詳細にはＩＬ−２分子の２０〜３０アミノ酸残基の間に局在しているＩ　Ｌ −２の結合部位領域を、その領域を特異的に認識し得るＭＡｂによって保護する 。そのようなＭＡｂはＤＭＳ−１の名称のもとにゲンザイム社から商業的に入手 できる。このようにしてこの発明で使用するには、ＭＡｂを固定相、例えば樹脂 またはゲルへ結合する。ついでＩ　Ｌ−２をＭＡｂ含有相へ適用し、化学的に例 えばＳＭＰＢと５：１〜５０；１のモル比で修飾する。結合部位に対し特異的な ＭＡｂで保護したリンカ−修飾ｒＬ−２は、そのような保護をしていないリンカ −修飾ＩＬ−２と比較して、Ｉ　Ｌ−２受容体への結合に対し天然Ｉ　Ｌ−２と 競合する競合能の実質的な増大を示す。このように好適なＭＡｂで保護した後、 ＳＭＰＢへ結合したＩＬ−２はネズミのＨＴ２細胞受容体に対する１２５Ｉ−標 １１Ｌ−２との競合において、そのような保護をしていないＳＭＰＢと結合した Ｉ　Ｌ−２より約２）４倍有効である。

［図面の簡単な説明］ 第１図は線図によるＩ　Ｌ−２分子の説明、第２図はＩ　Ｌ−２の受容体結合部 位を保護する方法（ここで、ＰＡはプロティンＡアガロース、ａ　Ｉ　Ｌ−２は Ｔ　Ｌ−２の受容体結合部位に対する抗体、ＰＡＳＩ　Ｌ−２は樹脂へ結合した Ｉ　Ｌ−２を表す）、第３図はＰＡＳＩＬ−２の形のＩＬ−２を使用してＳＭＰ Ｂ″Ｃ′ＩＬ−２を修飾する方法、第４図はホスファチジルエタノールアミンの ５ＡＴＡとの反応、第５図はＳＭＰＢで修飾したＩＬ−２と５ＡＴＡで修飾した リポソームとの間に共有結合を生じる方法、第６図はカップリング部分に４〜６ 個の炭素リンカ−鎖を組み込んで活性化ホスファチジルアミノエタノールアミン を得る方法、第７図はＳ　Ａ　′ｒ　Ａヘカッグリングする前にシトラコン酸コ ハク酸無水物でリジン残基のεＮ８２基を部分的に保護する方法、第８図はホス ファチジルエタノールアミンをカンホキノン−１０−スルホン酸へカップリング する方法を示す。

［実施例１］ Ｉ　Ｌ−２の保護および修飾 プロティンＡアガロース樹脂をＰＢＳ緩衝液で洗浄し、Ｉ　Ｌ−２の受容体結合 部位に特異的なＭＡｂ　（ゲンザイム社から入手可能、カタログ名称ＤＭＳ−１ ）を樹脂へ適用し、ＰＢＳ中、１２．５％グルタルアルデヒドの存在でＭＡｂを ４℃で６０分間樹脂へ架橋し、最後に樹脂をもう一度緩衝液で洗浄することによ ってプロティンＡアガロース樹脂をＭＡｂと反応させる。

ついでＭＡｂを結合した樹脂へＩＬ−２（５０Ｍｇ）のＭ衝液溶液（１００μｌ ）を適用し、第３図に示したようにＳＭＰＢで修飾する。２５　：　１のモル比 でＳＭＰＢをＩ　Ｌ−２へ加える。ＳＭＰＢはリシン残基のεＮ８２基と特異的 に反応する。修飾したＩ　Ｌ−２をライで２Ｍ　Ｎａ５ＣＮの０．０５Ｍ）リス （ｐ　Ｈ８）溶液で樹脂から溶出し、さらに６％ベタインの０．２Ｎ酢酸溶液で 第２の溶出処理を行う〈温度はすべて４℃〉。

Ｉ　Ｌ−２受容体結合検定の結果、得られたＳＭＰＨは標的細胞のＩＬ−２受容 体へ結合し得ることが判明した。またＥＬＩＳＡ検定でＳＭＰＢ修飾ＩＬ−２は 、同一条件下でカラムから溶出した修飾していないＩ　Ｌ７２と同様に、ＩＬ− ２の受容体結合ドメインに対するモノクローナル抗体によって認識される。

また別法として、ＭＢＳ（マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ ドエステル、ＳＭＰＢの誘導体）をＩＬ−２の修飾に使用する。受容体結合検定 および抗Ｉ　Ｌ−２ＥＬＩＳＡで検定すると、この試薬を使用しても生物学的に 活性なＩＬ−２が得られる。

［実施例２］ ５ＡＴＡ−ＤＳＰＥの合成（第４図参照）丸底フラスコ中、新たに調製したスク シンイミジル−８−アセチルチオアセテ−）　（ＳＡＴＡ）１２５ｍｇをジステ アロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）７５ｍｇと混合する。つ いでＣＨＣｌ５　：ＭｅＯＨ（１：　１）混合液１５ｍ１を加え、さらにトリエ チルアミ＞′１００〜１３５μｍを加える。ついでフラスコに窒素を吹き込み、 撹拌しながら室温で２時間反応を実施する。

Ｃ）ｌｃＩ３：　ＭｅＯＨ（７：　３）を用いる薄層クロマトグラフィーにより 反応の進行をチェックする。ニンヒドリン陽性スポットがなく、Ｒｆ値０．５７ を示すリンモリブデン酸陽性スポットが存在すれば５ＡＴＡ−ＤＳＰＥが存在す ることを示している。また５ＡＴＡ、−ＤＳＰＥを部分酸化してＲｆ値が約０． ３７である５ＡＴＡ−ＤＳＰＥ−３ＡＴＡ−ＤＳＰＥのジスルフィドの形として もよい。

得られた物質をついで蒸発乾固して、これをＣＨＣｌ　ｓ　：　Ｍ　ｅ　ＯＨ（ １：　１）混合液］、ｍｌに再懸濁する。アセ１−二トリル１５ｍ１を添加した 後、混合物を一２０℃に約６０分間保ち、５ＡＴＡ−ＤＳＰＥを選択的に沈殿さ せる。未反応のＤＳＰＥは溶液中に残る。沈殿を１ｌＪＷ！ガラスフイルター濾 過によって採取し、アセトニトリルで洗浄する。洗浄した５ＡＴＡ−ＤＳ、ＰＥ にＣＨＣＩ　３　：　Ｍ　ｅ　ＯＨ＜　１＝１）を加えて再び溶解し、これをも う一つのン濾過フラスコに採集し、別のフラスコへ移して蒸発する。

上記の操作中、酸化を最小限に防ぐため、すべての段階をできるだけ手早〈実施 する。ただし調製品中、少量の酸化した５ＡＴＡ−ＤＳＰＥはシリカゲル６０プ レート（ＥＭサイエンス社）を用いる調製用薄層クロマトグラフィー・によって 除去する。　ＣＨＣＩ、＋　Ｍ　ｅＯＨ（７：３）を移動相とし、アルミニウム を裏当てしたシリカゲルくけい光指示薬を加えず）プレートを使用する。ヨード 染色により５ＡＴＡ−ＤＳＰＥの位置を確認する。５ＡＴＡ−ＤＳＰＥを含有す るストリップを切り出し、ＣＨｐｌｓ：　ＭｅＯＨ（１：　１　）で３０分間抽 出する。５ＡＴＡ−ＤＳＰＥを濃縮乾固し、ＣＨＣｈ　：　Ｍ　ｅＯＨ（１：１ ）に溶解し、バイアルへ充填する。各バイアルへ窒素を吹き込み、−２０℃で貯 蔵する。

［実施例３（ａ）］ 空のリポソームの調製 ＤＳＰＣ：コレステロール：　５ＡＴＡ−ＤＳＰＥ　（モル比１．５：］：０． ５）の組成を有するリポソームを下記の方法により調製するや 上記の割合のＤＳＰＣ、コレステロールおよびＳ　ＡＴＡ−Ｄ　Ｓ　ＰＥの混合 物１０ｍｇをＣＨＣ１３１ｍ　ｌに溶解し、窒素大気中で乾燥して薄い膜とし、 さらに真空下で一夜乾燥する。

脂質膜をＰＢＳｉｔｊｉ衝液（ｐＨ８，３）１ｍｌ中に分散し、６５℃で６０分 間放置し、６５℃で６分間ブローブソニゲーターで音波処理し、同一温度に保っ てＳＵＶを作成する。ついでＳＵＶを１３０００Ｘｇで１０分間遠心してソニケ ーター試料からチタン粒子を完全に除去する。

ついでＳＵＶ調製品０．９ｍｌ　　（脂質膜１０ｍｇ）をセファクリル８３００ カラムへ掛け、遊離の５ＡＴＡ−ＤＳＰＥ　（リポソームへ組み込まれなかった ）を除去する。カラムをまずＤＳＰＣ：コレステロール（２＋　１　）　５ＬＩ ＶのＰＢＳ、１ｍＭ　　ＥＤＴＡ、０．２ｍＭＰＭＳＦ溶液で飽和し、　カラム 漬液中の５ＡＴＡ−ＤＳＰＥ　ＳＵＶの回収率を最大とする。５ＡＴＡ−ＤＳＰ Ｅ　ＳＵＶは２．４ｍｌの容量で回収され、１ｍｌ当り約３．３ｍｇの脂質を含 有する。この方法で調製したＳＵＶは約５０ｎｍの直径を有する。

［実施例３（ｂ）］ 薬物含有リポソームの製造 実施例３（ａ）と全く同様に、ただしＰＢＳＭ衝液を使用してメトトレキセート （２０ｍｇ／ｍｌ）を含有する脂質膜を分散する。メトトレキセート含有５ＡＴ Ａ−ＤＳＰＥ　ＳＵＶが得られる。

［実施例４］ ＩＬ−２のリポソームへの結合 修飾した実施例１のＳＭＰＢ−ＩＬ−２を実施例３（ａ）または３（ｂ）のＳＵ Ｖへそのマレイミド基を介して共有結合的に結合させる。カップリングは下記の 通り実施する（第５図参照）。

まず５ＡＴＡ−ＤＳＰＥを含有す６ＳＵ’＃）ＳＡＴＡ残基を脱アセチル化する ことによりＳＭＰＢ−Ｉ　Ｌ−２と反応できるように活性化する。新たに調製し た０、５Ｍヒドロキシルアミン１０μｌを実施例１のＳＵＶ＊製品（ＰＢＳ溶液 、１０ｍｇ／ｍｌ）１ｍｌ　へ添加する。アルゴン大気中、２２℃で３０分間イ ンキュベーションを実施する。

ついで実施例１で得られたＳＭＰＢ−Ｉ　Ｌ−２調製品のｐＨをｐＨ６，５〜７ に調節する。脂質１２〜２４μｇに対しＳＭＰＢ−ＩＬ−２が１０〜２０μｇの 量となるよう脱アセチル化したＳＵｖへ試料を添加する。インキュベーションは アルゴン大気中、２２℃で２時間実施する。ついで未反応の−ＳＨ基をすべて封 鎖するため、最終濃度が２０ｍＭとなるまでＮＥＭを添加する。

小胞体＝Ｉ　Ｌ−２懸濁液のｐＨをｐＨ９に調節する。ＣＭ−セファロースカラ ム（５０ｍＭトリス、ｐＨ９，０＞を排液する。リポソームをカラムに適用し、 樹脂を撹拌し、１０分間インキュベーションし、もう一度排液する。緩衝液のア リコート（０゜５ｍ１）を加えて、画分を採取する。混濁または乳濁したすべて の両分を集めて検定する２ 回収したＳＵＶ調製品は、５ＵＶ１分子当りＩ　Ｌ−２を３６０〜５０４０分子 結合して有するＳＵｖを含有する（直径５０ｎｍ）。

同様に実施１’Ｎ５（ｂ）のメトトレキセ−１・含有リポソームで実施例４を反 復すると、外側表面に結合したＩ　Ｌ−２を有し、メトトレキセートを含有する リポソームが得られる。

［実施例５］ 立体障害を緩和する伸長したリンカ−鋳の合成全殻的に有用な活性化脂質を合成 する好ましい経路は下記の通りである（第６図）。

ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（Ａ＞およびスクシンイミジル −γ−ＢＯＣ−アミノ−ペンタノエート（Ｂ）のクロロホルム−メタノール（９ ：１）溶液へ１か過剰のトリエチルアミンを加える。溶媒を蒸発し、トリフルオ ロ酢酸のジクロロメタン溶液でＢＯＣ基を除去する。トリフルオロ酢酸の反応後 、残留物として残ったジステアロイルホスファチジルエチル−γ−７ミノベンタ ンアミド（Ｃ）とＳＭＰＢ（Ｄ）との反応を最初のカップリング反応条件と同一 の条件を用いて実施する。ジステアロイルホスファチジルエチル−４−（ｐ−マ レイミドフェニル−ブチルアミド）−ペンタンアミド（Ｅ）をシリカゲルクロマ トグラフィーを用いて精製する。

精製後、活性化した脂質をリポソームＩ＼組み込み、それによって薬物またはマ ーカーを標準的な方法で内包させる。そうするとリポソームは修飾していないタ ンパク質に存在する遊離タンパク質スルフヒドリル基または下記のようにして調 製した誘導体と反応し易くなる。

例えば限定した濃度で５ＡＴＡを使用し得る。即ち、５ＡＴＡのＤＭＦまたはジ オキサン溶液をＩＬ−２溶液へ約ｐＨ８で添加する。

試薬量を限定することによって置換量を調節し得る。ついでヒドロキシルアミン の添加によってスルフヒドリル基を脱封鎖し、ｒＬ−２を、表面にマレイミド基 を有するリポソームへ速やかにカップリングする。

［実施例６］ 選択された（限定された）リシン残基におけるＩ　Ｌ−２の修飾最も豊富で利用 し得るタンパク質反応部位はりシンεＮＨ，基である。リシン残基の幾つかは受 容体結合部位に局在しているから、リシン残基をカップリングに用いようとする 場合は、必ず実際反応に加わるリシン残基を制限することを含まなければならな い。

臨界的なりシン残基の反応性が他のりシン残基の大部分よりはるかに速いか、あ るいは少なくともそれに匹敵する場合、第７図に示した方法を用い得る。この方 法では、本質的にすべての（ただし数は少ない）リシン残基を最初に可逆的な封 鎖剤で誘導する。最も反応し易い、即ち影響され易いリシンを封鎖するに足るだ けの試薬を使用し２あるいは封鎖後、部分的な脱封Ｍｋ行い、ついで残っている リシン残基を大過剰のカップリング剤、例えば５ＡＴＡを用いて誘導する。ＩＮ 水酸化ナトリウム溶液の添加によりｐＨを維持しながら、ＩＬ−２のホウ！！ｉ ！Ｉ！衝液（ｐＨ８，８）溶液にシトラコン酸無水物を添加する。シトラコン酸 基はｐＨ２で除去することができ、この反応はｐＨを再び上昇することにより中 断することができる。

ｐ）７８．８で溶液へＳＡＴ、Ａを過剰に添加し、すべての遊離アミンを誘導す る。透析によって過剰の試薬を除去し、残っているシトラコン酸基をｐＨ２で除 去する。溶液を中性ｐＨとし、ヒドロキシルアミ〉′の添加によりスルフヒドリ ル基を生成させる。ＳＭＰＢリボンームを導入し、タンパク質Ｉ＼結合する。

［実施例７］ アルギニン残基におけるＩＬ−２の修飾インターロイキン−２には４個のアルギ ニンが存在するが、その１つだけが結合に影響すると思われる領域に存在してい るようである。したがって第８図に示したカンホキノン−１０−スルホン酸のよ うなアルギニンに特異的な試薬を使用してリポソームをＩ　Ｌ−２へ連結し得る 。

塩化チオニルを用いて調製したカンファースルホニルクロリドをピリジンの存在 でホスファチジルエタノールアミンへ加える。ついでカンファースルホニル−ホ スファチジルエタノールアミンＰＥをリボンームヘ組み込み、ホウ酸緩衝液（ｐ Ｈ８，８＞中でＩし−２と反応させる。小胞体へ連結したＩ　Ｌ−２をセファデ ックスＧ−１５０カラムにより未反応のタンパク質から分離する。

［実施例８コ リガント上のヒスチジン部位の修飾 ヒスチジンはブロモアセトアミド化合物のような試薬によって化学的に修飾し得 る。特にＩＬ−２のＨｉｓ−７０は結合活性に影響しない。ブロモアセトアミド に基づくヘテロ２官能性試薬を合成し、リポソームのための付着部位を提供し得 る。特にこれはである、この化合物はブロモアセチルプロミドをエチレンジアミ ン（１：１）へ付加し、ついで残りのアミンを５ＡＴＡと反応することによって 作成する。１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５，５）中、ＩＬ−２ヒスチジンとの反応によ り、ヒスチジンのイミダゾール基に３′−Ｎ−置換５ＡＴＡ誘導体を作成する。

ヒドロキシルアミンを添加すると５ＡＴＡ標識が脱アセチル化され、ＳＭＰＢリ ポソームとの反応に利用し得る遊離のスルフヒドリル基が得られる。

［実施例９］ リポソーム／Ｉ　Ｌ−２の受容体結合活性を測定する検定ａ、どのような形のイ ンターロイキン−２も存在しない培地、ｂ、遊離の静細胞因子の有効用量を添加 した培地。

Ｃ８実施例４のリポソーム／ＩＬ−２複合体の用量を添加した培地および ｄ、静細胞因子を含有する実施例４のリポソーム／ＩＬ−２複合体の用量を添加 した培地 で数日間培養し、高親和性インターロイキン−２受容体を備えた細胞の増殖によ り抗増殖性の測定を実施した。

以前の研究で決定した好適な処理期間の後、′Ｈ−チミジンで細胞をパルス標識 する。３〜４時間の標識期間の後、すべての培養をグラスファイバーフィルター ・ストリップに回収し、３Ｈ−チミジンの取り込みを細胞増殖の指標として測定 する。このようにどのような形の薬物も存在しない培養の細胞との比較により、 静細胞因子を含有するリポソーム／ＩＬ−２複合体の効果を測定する。既知の手 技を用いて確認し得たリポソーム／Ｉ　Ｌ−２複合体のイン・ビボにおける生体 内分布を実施例１０で報告する。

［実施例１０］ 生体内分布研究 生体内分布を測定する好ましい方法は放射性核種インジュームー１１１を使用す る。リポソームに内包したインジュームには１または２種のキレート複合体形態 がある。リポソーム／ＩＬ−２製剤の生体内運命を測定する生体内分布研究では 、キレート剤エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を好ましく使用する。標的細 胞による全体的なイン・ビボ取り込みでは、ニトリロトリ酸Ｍ　（ＮＴＡ）を好 ましく使用する。

通常の生体内分布研究では、インジウムを受動的にカプセル化するキレート剤お よびインジウム−１１１の存在で、あるいは前もって作成したリポソームへイン ジウム−１１１を後から能動的にカプセル化するイオノホアＡ２３１８７の存在 で、一定組成のＳＵＶを調製する。何れの場合でも、追加的ＥＤＴＡ処理をした 後、カラムクロマトグラフィーによってカプセル化されなかった物質からリポソ ームを分離する。

生体内分布測定は１１１１０−リポソーム／ＩＬ−２複合体を研究勤物に静脈内 注射することによって行う、注射後、数回に分Ｇｌて（例えば１．３．６．２４ 時間目に）動物を層殺し、ガンマ線カウントのため組織を採取する。”’Ｉ　ｎ −ＥＤＴＡを負荷したリポソームは初回生体内分布研究に有用であり得る。堅く 結合したこのキレート複合体によってリポソームの体内貯留時間の測定が可能で ある。この発明に関連して実施した実験で、”’Ｔ　ｎ−ＥＤＴＡ単独ではイン ビボで速やかに浄化される。したがって回収されたインジウム−１１１活性は何 れも　１ＩＩＩｎ−リポソーム／１１−２とみなし得る。

試験動物におけるリンパ球によるリポソーム／Ｉ　Ｌ−２の取り込みは目ｌＩ　 ｎ−ＮＴＡ複合体を用いて検討し得る。比較的弱いこのキレート複合体はリポソ ーム内水層ではインジウム−１１１を保持するが、キレ−１〜がタンパク質また は炭水化物の巨大分子近くにあるとたちまちインジウム−１１１を放出すること が判明した。したがって　”’Ｉ　ｒ＋−ＮＴＡ−リポソーム／Ｉ　Ｌ−２製剤 による研究動物の処置はリンパ球による累積取り込みを測定する手段を提供する 。

これは動物を”’Ｉ　ｎ−ＮＴ’Ａ製剤で処置することによって実施し得る。静 脈内または腹腔的投与経路の何れかにより”’Ｉｎ−Ｎ゛ｒＡリポソーム注射を １ないし数回（２〜３回）試験動物に投与する３処置後、時間を変えて動物を層 殺し、例えば血液、ひ臓、および腹膜から遠心またはフィコール濃度勾配法によ りリンパ球を＊−Ｕする。羊離したリンパ球をついて゛ガンマ計数管でインジウ ム−１１１についてカウントする。健康なラットにおける生体内分布研究により 、実施例４の１１１　ｉ　ｎ−リポソーム／ＩＬ−２複合体は血中半減期を延長 し、マクロファージまたは不活性Ｔ細胞に付着しないことが判明した。

またＴリンパ球とのリポソームの相互作用の直接測定に加えて、イン、ビボ生体 内分布研究は、特に肝臓、ひ臓およびリンパ節部位における網内系（ＲＥＳ＞に よるリポソーム／Ｉ　Ｌ−２製剤の取り込み程度を評価するのに使用し得る。さ まざまな形式のリン脂質小胞体が肝臓およびひ臓で急速に取り込まれ、血液から 除かれることは広く知られている１種々の炭水化物およびタンパク質群を付着し て備えている大型リポソームおよび小胞体は特に弱い二つの形式である。したが ってＲＥＳ取り込み特性はこの発明を実施する際に重要である。好適な用量は標 準的な方法を用いる試験によって確立し得る。

非特異的な特性および主にマクロファージを含むＲＥＳ取り込みを避けるため、 一定のリポソーム／インターロイキン−２製剤についてリポソーム／リンパ球相 互作用に妨害を与え得る程度まで、リポソームでＲＥＳ部位に対しあらかじめ処 置するＲＥＳブロックを採用し得る。別法として、例えば循環時間を延長するこ とにより、血液リンパ球とのリポソーム相互作用を促進するオプソニン化作用と 類似した処理を用い、リポソーム／インターロイキン−２製剤表面に追加的な修 飾を採用してもよい、またさらに移植片部位または自己免疫攻撃を受ける臓器の ような臨界部位ヘデボ体としてインターロイキン−２７リポソーム製剤を局所的 に投与することによりＲＥＳの取り込みを最小にすることもできる。

［実施例１１〕 活性化Ｔ細胞特異性 Ｔリンパ球が再生可能なように活性化された動物モデルを用いてリポソーム／Ｉ 　Ｌ−２製剤の効果を証明し得る。容易に入手し得る２つのモデルはラット皮膚 同種移植モデルおよびラット火傷（体表面の３０％）モデルである。何れかのモ デルを用い、動物群に免疫抑制薬含有リポソーム／ＩＬ−２もしくは単にリポソ ーム／Ｉ　Ｌ−２だけを投与する。ついで動物が受けるリポソーム＃　Ｌ−２処 置のプロトコールに従って同種移植片の保持を測定する。リポソームに組み込む 薬物を含有しないリポソーム／ＩＬ−２を投与した群では移植片領域における活 性化Ｔ細胞の存在および細胞溶解活性のため直ちに移植片を拒絶する。また別法 として、選ばれた薬物を含有するリポソーム／Ｉ　Ｌ−２をラットまたはマウス の白血病モデル過程に使用してもよい、これらの試験の結果、実施例４のリポソ ーム／ＩＬ−２複合体は試験管内で活性化Ｔ細胞を誘引することが判明した。

この送達運搬体は哺乳動物の疾患治療および生体内診断等を含む種々の治療域で 使用でき、また生体内分布研究で著しい利点があることが分かった。小さい羊層 膜リポソームを使用すると、固形腫瘍に対する標的志向性に有用であり、それと 同時に他の運搬体より一層長い循環時間を示すことが判明し、この送達運搬体は 医薬品または診断用マーカー（例えば放射性標識、螢光分子および磁鉄鉱のよう なＮＭＲ用造影剤）を新生物細胞または肝臓のような体の特定臓器へ送達するの に使用し得る。またここで想定し得るように興味ある細胞集団がインターロイキ ン−２受容体のような細胞性受容体によって特徴付けられる場合、この運搬体は 細胞障害性、調節性、診断性分子またはその他の分子を標的志向的な態様で送達 するのに利用し得る。したがってこの発明のリポソーム／Ｉ　Ｌ−２送達運搬体 の場合、免疫系の機能不全（慢性関節リウマチ、若年性糖尿病、全身性紅斑性狼 癒等のような遺伝性または非遺伝性自己免疫疾患および移植片対宿主疾病のよう な移植反応）、リンパ球関連がん（リンパ腫および成人または慢性骨髄性白血病 および毛様細胞性白血病のような白血病等）およびヘルパーＴ細胞疾患（ＨＩＶ 恣染Ｔ細胞に随伴する疾患のようなウィルス性疾患）と含む病状の処置、調節ま たは詐断のため活性物質をリンパ球へ送達し得る。

ＦＩＧＵＲＥ　１ ＦＩＧＵＲＥ　５ 二凪ユ」 Ｆ＋ｏｕｒｅ　８ ０゜ 国際調査報告 国際調査報告 ＥＰ　８９００５２１ ＳＡ　　　　２８５４６

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. （１）生物学的活性細胞受容体−結合部位を有するホルモンへ共有結合的に結合 したリボソーム。
2. （２）ホルモンがサイトカインである請求項１記載のリボソーム。
3. （３）サイトカインがインターロイキン−２（１し−２）である請求項２記載の リボソーム。
4. （４）少なくとも１つの細胞障害性薬物を内包している請求項１〜３の何れか１ 項記載のリボソーム。
5. （５）膜にホスファチジルエタノールアミンを含有している請求項１〜４の何れ か１項記載のリボソーム。
6. （６）ＳＡＴＡ残基をリボソームへ結合し、ＳＭＰＢ残基をホルモンへ結合して 、ＳＡＴＡおよびＳＭＰＢ残基を含んでいるカップリング部分によってホルモン へ結合する請求項１〜５の何れか１項記載のリボソーム。
7. （７）炭素原子４〜６個のリンカー鎖を含むカップリング部分によってホルモン へ結合している請求項１〜５の何れか１項記載のリボソーム。
8. （８）小さい単層膜小胞体である請求項１〜７の何れか１項記載のリボソーム。
9. （９）受容体結合部位に局在せず、リシン、システイン、アルキニンおよびヒス チジン残基から選ばれるホルモン上のアミノ酸残基でホルモンへ結合している請 求項１〜８の何れか１項記載のリボソーム。
10. （１０）（ａ）カップリング剤をリボソームへ固定し、ついでホルモンと反応さ せ、または （ｂ）カップリング剤をホルモンへ固定し、ついでリボソームと反応させ、また は （ｃ）第１のカップリング剤をリボソームへ固定し、第２のカップリング剤をホ ルモンへ固定し、ついでカップリング部分を互いに反応させる 何れかの方法を含むリボソームを生物学的活性受容体一芝合部位を有するホルモ ンへ結合する方法。
11. （１１）スクシンイミジル−４−（Ｐ−マレイミドフェニル）−ブチレート（Ｓ ＭＰＢ）および合硫黄スクシンイミジル化合物から選ばれたカップリング剤をリ ボソームへ固定することを含む請求項１０記載の方法。
12. （１２）スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）をリボソ ームへ固定することを含む請求項１１記載の方法。
13. （１３）スクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）−ブチレート（Ｓ ＭＰＢ）、スルホ−ＳＭＰＢ、Ｍ−（４−カルボキシーシクロヘキシルーメチル ）マレイミド（ＳＭＣＣ）、スルホ−ＳＭＣＣ、Ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ −ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、ルホ−ＭＢＳ、Ｎ−スクシン イミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）およびスルホ −ＳＩＡＢから選ばれたカップリング剤をホルモンへ固定することを含む請求項 １０記載の方法。
14. （１４）スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）−ブチレート（ＳＭ ＰＢ）をホルモンへ固定することを含む請求項１３記載の方法。
15. （１５）ＳＡＴＡをリボソームへ固定し、ＳＭＰＢをホルモンへ固定し、ついで カップリング部分を互いに反応させることからなる請求項１０記載の方法。
16. （１６）カップリング剤を固定する前にホルモンの細胞受容体結合部位を可逆的 に保護する請求項１０〜１５の何れか１項記載の方法。
17. （１７）細胞受容体結合部位へ結合するモノクローナル抗体によってホルモンの 細胞受容体結合部位を保護する請求項１６記載の方法。