JPS6322192A - Ｃｍｖ−ｄｎａ構造、その発現ベクタ−およびｃｍｖたん白質 - Google Patents

Ｃｍｖ−ｄｎａ構造、その発現ベクタ−およびｃｍｖたん白質

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JPS6322192A
JPS6322192A JP62145414A JP14541487A JPS6322192A JP S6322192 A JPS6322192 A JP S6322192A JP 62145414 A JP62145414 A JP 62145414A JP 14541487 A JP14541487 A JP 14541487A JP S6322192 A JPS6322192 A JP S6322192A
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ヴエルナー・リンデンマイエル
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）−ＤＮＡ構造
、その発現ベクターならびにＣＭＶたん白質構造右よび
その用途に関するものである。
サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）はヒト病原性ウィルス
であって、非常に広く蔓延しているがこれは一般には無
害症状のみをひき起こすものである。中央ヨーロッパに
おいては１８〜３０才代の５０％はＣＭＶ感染していて
血清陽性である。又ＣＭＶは細胞中に潜在的に存在可能
であって再活性化し得る。衛生状態の悪い国においては
人口の１００％までが血清陽性である。−旦感染すると
その感染した人の免疫系が適当に機能していない場合に
は明らかな病原性を示すようになる。出生前又は周産期
において感染すると重篤となり、色々な脳障害をひきお
こすこともある。
ＣＭＶは大体幼年期の精神障害のほとんど大部分の原因
となっていると考えられている。成人（ならびに高含の
少年期）であって、特に免疫抑制患者（例えば臓器移植
、がん治療あるいは場合によってはエイズ等の）が感染
すると、このＣＭＶ感染症はかなり重篤であって場合に
よっては致命的である場合もある。
ＣＭＶ感染症に対しては現在のところ治療性もなく又ワ
クチンもない。例えば臓器移植患者の予防的手段として
高免疫血清による変動免疫産生を行うことができる。血
清陰性等の感染を防ぐためには、血清陰性者の血液を使
用することが大切である。
特に臓器移植患者、妊婦および血液供給者の免疫状態を
チェックするために適当な迅速な診断法が必要である。
ヘルペスの場合と同様に、無害ＣＭＶワクチンの開発に
はＣＭＶならびにＣＭＶ感染細胞の抗原構造を更に解明
することが重要であると思われる。
ＣＭＶ診断には基本的に次の２つの方法がある。
（１）ウィルスの検出。
（２）ＣＭＶに対する抗体の検出。
（１）としては少なくとも３つの変法がある。すなわち
、ＣＭＶの培養と、ＤＮＡサンプルとの交雑と、（モノ
クローナル）抗体での検出である。
その結果実際のＣＭＶ感染の有無の情報が得られる。培
養性は高感度であるが、細胞培養が必要であり又ＣＭＶ
だけをヒト第１次細胞上に生育させるので面倒であり又
長期間を必要とする。他の方法は多かれ少なかれ現在な
お実験段階である。
（２）についてはかなり感度および操作難易度の異なる
多くの技術的変法がある。しかしながらその原理は常に
同じであって、患者の血清中の抗原を予かしめ用意した
ＣＭＶ抗原マーカーで検出することである。これにより
患者の免疫状態についての情報が得られる。抗体型（Ｉ
ｇＧ／Ｉｇ’　）の分化およびそれに引き続く経時変異
により特に新しい感染情報が得られる。
これらの試験法はかなり高性能であってそして標準的で
ある場合がある。しかしこれらは困難を供ない、その理
由は方法自体が複雑であって又ＣＭＶ抗原（精製ウィル
ス又は普通は感染細胞からの抽出物）の産生に必ずしも
再現性がないことである。このためＣＭＶを細胞培養に
よって再度培養しなくてはならない。
Ｅ、コ！Ｊ　　（Ｅ、ｃｏｌｉ）の使用により安価に再
現性のあるＣＭＶ抗原を作りこれを使用するならばその
改良効果は著しいであろう。
問題点を解決するための手段 本発明の目的は、ＣＭＶから得られるＤＮＡ構造と、該
ＤＮＡ構造を有する発現ベクターと、該ＤＮＡ構造をコ
ードするたん白質構造とを提供し、そして更にＣＭＶた
ん白質又はＣＭＶに対するヒト抗体の検出用に該たん白
質構造を使用することにある。Ｅ、コリ中でＣＭＶの抗
原決定群を産生ずることが望ましく、これにより患者の
抗ＣＭＶ抗体による該抗原決定群の認識が可能であり、
そして感染細胞から回収された抗原を診断目的に使用す
ることができる。この産生法は安価であって再現性が高
い。そしてこれにより診断可能性が広範なものとなりか
つ改善されることが期待される。
本発明の特徴は又、フローン（単独で又は組合わせて）
から得られる融合たん白質又は変性した（例えば、プロ
テアーゼにより切断した）ペプチドを抗原として使用す
ることにある。
そして、本発明の要旨は前記特許請求の範囲に記載の通
りである。
次に本発明の詳細な説明する。
実施例 ペプチドの免疫学的検出が可能な場合には、オープン読
み枠（ＯＲＦ）、すなわちたん白質を潜在的にコードし
得る遺伝子フレームのクローニングは非常に効果的な遺
伝子単離法である。融合たん白質としてＯＲＦを発現さ
せる゛ことが通常行なわれている。
転写および翻訳用調節シグナルはＥ、コリの遺伝子又は
Ｅ、コリバクテリオファージ由来のものである。ＯＲＦ
を例えばＥ、コリ遺伝子（通常はβ−ガラクトシダーゼ
遺伝子）と、その生成物が融合たん白質となる様にカッ
プリングさせる。これによりペプチドの発現性と安定性
が増加する。
この方法はゲノムＤＮＡのＣＤＮＡ範囲およびエキソン
の両方を検出するのに使用できる。
○ＲＦクローニンクヘクターはλファージ（λｇｔｌｌ
）の誘導体としてそして種々のプラスミド上に存在する
。種々のクローニング位およびブ０％−ター（１ａｃ、
ｔａｃ、Ｐ＋　）と使用することができる。融合はβ−
ガラクトシダーゼのＮ−末端又はカルボキシ−末端のど
ちらかで起る。
Ｃ−末端付加の場合には、配列が正常な配向でありそし
て正常な読み枠となる統計的可能性は１／６である。Ｎ
末端挿入ではそれは１／１８であるが、この場合β−ガ
ラクトシダーゼの活性が通常保持されるので融合たん白
質は同時に酸素マーカーも保有する。
特異的ペプチド配列の免疫的検出は、融合たん白質を産
生ずるＥ、コリコロニーをニトロセルロースろ紙に移し
てから行う。細胞溶菌後にたん白質がこのろ紙に結合す
る。特異的抗血清で培養しそしてその特異結合を例えば
第２坑体マーカーで検出することにより、陽性コロニー
を同定することができ、このコロニーを以下に使用のた
めにマスタープレートから採取する。
（１）ＣＭＶの抗原決定群のクローニング（ａ）ベクタ
ー 本発明を実施するために、ＯＲＦ発現ベクターとして、
ρＥＸベクター、すなわち（１）ρＥｘ２と（２）ｐＥ
Ｘｌの変異株（ρＥＸＳｔｕ）を使用した。ρＥＸＳｔ
ｕには、プロテアーゼ（Ｘａ因子）により特異的に切断
され得るペプチドの配列を５ｔｕＩ切断部位の前に含有
する合成りＮＡクリンカを導入した。この構造において
は、融合たん白質の残部からＣＭＶペプチドを特異的プ
ロテアーゼ（Ｘａ因子）を使用して取り出すのが可能で
ある。５ｔｕＩできれいに切断した部位にインサー）Ｃ
ＭＶ−ＤＮＡを導入することが出来る。
これらρＥＸベクターには融合たん白質の発現用にＰＬ
プロモーターを使用する。後者は共存プラスミドのλ−
リプレッサー（ｃＩ）により制御される。温度感度性リ
プレッサー（ｃ　Ｉ　ｔ　ｓ）を使用して温度を上げる
ことによって発現を活性化することができる。本発明で
はこのリプレッサーをプラスミドρＲＫ２４８ｃｌｔｓ
８５７上に持つＥ、コリ株（５に、ＤＨＩ）を使用した
。２つのＯＲＦ遺伝子バンクを作った。その１つはテー
リング法（オリゴ−ｄＧＣテール持つＰｓｔＩでのベク
ター切断）によりρＥＸ２で作り、他の１つはρＥＸＳ
ｔｕの５ｔｕＩ部位中に平滑末端断片をクローニングす
ることにより作った。
（ｂ）インサートＤＮＡ ＣＭＶ−ＯＲＦ遺伝子バンクのインサー）ＤＮＡとして
クローニングＤＮＡすなわち、全ＣＭＶゲノムを保有す
るＣＭＶ　　Δｄ１６９のコスミドバンクのクローンを
使用した。Ｍｎ”の存在下でＤＮアーゼ■で処理するこ
とによりＤ　Ｎ　Ａを断片化して約３００〜６００ρｂ
の断片を単離した。
第１の遺伝子バンクに末端トランスフェラーゼを持つオ
リゴ−Ｃテールを付加した。これらの断片をハイブリダ
イズしてρＥＸ２ベクターの相補オリゴ−Ｃテールとし
た。５ｔｕＩ切断ρＥＸＳ　ｔＵの平滑末端クローニン
グのためにこれらの断片にＴ４−ボリナラーゼを付与し
た。
（Ｃ）遺伝子バンク 遺伝子バンク１：オリゴ−ＧｌＣ法でクローニングした
ρＥＸ２−ＣＭＶ ３４．０００の独立のコロニーを単離した。約５０％は
かなり大きなインサート　（約３００ｄρ）と有してい
た。
遺伝子バンク２　：５ｔｕＩ部位における平滑末端クロ
ーニングによるρＥＸＳｔｕ−ＣＭＶ３．２ＸＩＱ５の
独立のコロニー中の更に５０％は約３００ｂρのインサ
ートを有していた。
宿主株としてＥ、コリ５Ｋ（ρＲＫ２４８Ｃ１ｔｓ）又
はＤＨＩ（ρＲＫ２４８ｃｌｔｓ）を使用した。コロニ
ーを再けん濁しそして一７０℃で凍結した。
（ｄ）免疫スクリーニング Ｅ、コリクローンをニトロセルロース膜に移シ融合たん
白質の産生を誘導した。細胞溶菌後に非特異的結合部位
を飽和させ（Ｂ　ｉ　ｏ　ｒ　ａ　ｄ法）として抗ＣＭ
　Ｖ血清（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ社）で培養した。抗
体との特異結合をブタ／抗ヤギＩｇ血清で検出した。着
色はクロロナフトール／Ｈ２Ｏ２で行った。
（ｅ）免疫学的特性 スクリーニングで陽性を示したコロニーについて更に検
討した。たん白質を抽出してＳＤＳポリアクリルアミド
ゲル中で分析した。融合たん白質の抗原性はニトロセル
ロース膜に移してから調べた（ウェスタンブロッティン
グ法）。ヤギ抗ＣＭＶ血清（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ社
）、ヒト抗ＣＭＶ血清（Ｂｉｏｔｅｓｔ社の混合高免疫
血清）、ウサギまたＣＭＶ血清（Ｆｌｅｃｋｅｎｓｔｅ
ｉｎ社）および対照血清について実験した。いくつかの
クローンはヒト血清を明らかな陽性反応を示し個々のＣ
ＭＶ陽性血清の多くが反応した。
（ｆ）配列決定 陽性クローンの配列と読み枠を決定した。遺伝子バンク
（１）のクローンはＭａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法によ
って配列決定し、そして遺伝子バンク（２）のクローン
はＭ１３中のジデオキシ法により決定した。こうして発
見した配列は前記特許請求の範囲第１〜４項に記載のも
のである。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、サイトメガロウイルス（ＣＭＶから得られ、下記の
    塩基配列（ＣＭＶ−１；これに更に相当するアミノ酸配
    列が与えられる）を有するＤＮＡ構造： 【遺伝子配列があります】 ２、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）から得られ、下記
    の塩基配列（ＣＭＶ−２；これに更に相当するアミノ酸
    配列が与えられる）を有するＤＮＡ構造： 【遺伝子配列があります】 ３、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）から得られ、下記
    の塩基配列（ＣＭＶ−１３；これに更に相当するアミノ
    酸配列が与えられる）を有するＮＤＡ構造： 【遺伝子配列があります】 ４、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）から得られ、下記
    の塩基配列（ＣＭＶ−２１；更に相当するアミノ酸配列
    が与えられる）を有するＤＮＡ構造： 【遺伝子配列があります】 ５、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）から得られ、下記
    の塩基配列（ＣＭＶ−３８；これに更に相当するアミノ
    酸配列（読み枠３個）が与えられる）を有するＤＮＡ構
    造： 【遺伝子配列があります】 （ここで＊＊＊は停止コドンを意味する。）６、サイト
    メガロウイルス（ＣＭＶ）から得られ、下記の塩基配列
    （ＣＭＶ−６５；これに更に相当するアミノ酸配列が与
    えられる）を有するＤＮＡ構造： 【遺伝子配列があります】 ７、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）から得られ、下記
    の塩基配列（ＣＭＶ−７１；これに更に相当するアミノ
    酸配列が与えられる）を有するＤＮＡ構造： 【遺伝子配列があります】 ８、特許請求の範囲第１〜７項の何れかに記載のＤＮＡ
    構造の個々のストランド（Ｓｔｒａｎｄｓ）により、好
    ましくは少なくとも２０℃の温度で、特に１ＭＮａＣｌ
    の濃度かつ少なくとも２５℃の温度でハイブリダイズす
    ることのできるストランドを有するＤＮＡ構造。 ９、エシエリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃ
    ｏｌｉ）中のＤＮＡ構造を発現させるための、特許請求
    の範囲第１〜８項の何れかに記載のＤＮＡ構造からなる
    発現ベクター。 １０、下記のアミノ酸配列を有するたん白質構造：【遺
    伝子配列があります】 １１、下記のアミノ酸配列を有するたん白質構造：【遺
    伝子配列があります】 １２、下記のアミノ酸配列を有するたん白質構造：【遺
    伝子配列があります】 １３、下記のアミノ酸配列を有するたん白質構造：【遺
    伝子配列があります】 １４、下記のアミノ酸配列を有するたん白質構造：【遺
    伝子配列があります】 および 【遺伝子配列があります】 および 【遺伝子配列があります】 （ここで＊＊＊は停止コドンを意味する。）１５、下記
    のアミノ酸配列を有するたん白質構造：【遺伝子配列が
    あります】 １６、下記のアミノ酸配列を有するたん白質構造：【遺
    伝子配列があります】 １７、特許請求の範囲第１０〜第１６項の何れかに記載
    のたん白質構造のＣＭＶたん白質またはＣＭＶに対する
    ヒト抗体の換出への利用。 １８、特許請求の範囲第１０〜第１６項の何れかに記載
    のたん白質構造のＣＭＶワクチンの成分としての利用。 １９、特許請求の範囲第８項に記載のＤＮＡ構造をコー
    ドするたん白質構造のＣＭＶたん白質またはＣＭＶに対
    するヒト抗体の換出への利用。 ２０、特許請求の範囲第８項に記載のＤＮＡ構造をコー
    ドするたん白質構造のＣＭＶワクチンの成分としての利
    用。
JP62145414A 1986-06-13 1987-06-12 Ｃｍｖ−ｄｎａ構造、その発現ベクタ−およびｃｍｖたん白質 Pending JPS6322192A (ja)

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