DK172647B1

DK172647B1 - Samling af polypeptider og samling af antistoffer, som er karakteristiske for papillomavirus, og diagnostiske metoder, hvor

Info

Publication number: DK172647B1
Application number: DK198702089A
Authority: DK
Inventors: Odile Croissant; Carol Ann Komly; Francoise Breitburd
Original assignee: Inst Nat Sante Rech Med; Pasteur Institut
Priority date: 1985-08-26
Filing date: 1987-04-24
Publication date: 1999-04-06
Also published as: JPH08308597A; FR2586428A1; JP3067734B2; ATE70280T1; ES2003339A6; GR862201B; US6010704A; JPH10114677A; JP2818745B2; JP3294787B2; DK208987D0; JP2755574B2; JPH1123577A; PT83255B; EP0235187A1; PT83255A; DE3682893D1; JPS63500662A; DK208987A; WO1987001375A1

Description

i DK 172647 B1

Opfindelsen angår ekspressionsprodukter af gener indeholdt i DNA'er af papillomavirus, antistoffer tilvejebragt mod de nævnte ekspressionsprodukter samt en fremgangsmåde, hvorved disse antistoffer anvendes til diagnostice-5 ring in vitro af papillomavirusinfektioner. Opfindelsen angår ligeledes en fremgangsmåde til klassifikation af et nyisole-ret papillomavirus.

Ifølge opfindelsen tilvejebringes især forbedrede metoder til identifikation af papillomavirus, f.eks. opnået 10 fra læsioner eller biopsi-snit, og opfindelsen gør det muligt at foretage en forbedret diagnosticering, hvad angår den mulige udvikling af de pågældende læsioner.

Udtrykket "papillomavirus" omfatter et stort antal vira, som har det tilfælles, at de anses for at være ansvar-15 lige for flere former for virusinfektioner, som går fra relativt godartede vorter på hud eller slimhinder til hyper-plasier, som kan degenerere til intra-epitheliale neoplasier og hudcancere. Blandt papillomavirus-infektioner skal der ligeledes især nævnes epidermodysplasia verruciformis, som 20 undertiden i det følgende betegnes "EV".

Et antal papillomavirus-typer er allerede blevet beskrevet, se især J. Virol, (december 1984), side 1013-1018.

Andre er identificeret i EP patentansøgning nr. 192 001. I den foreliggende beskrivelse henvises der til talrige typer 25 og undertyper af papillomavirus, herunder papillomavira beskrevet i de ovenfor anførte dokumenter. De er blevet isoleret fra vorter eller udbredte modermærke-læsioner og kan give anledning til tidlig udvikling af hudcancere hos en væsentlig del af patienterne, som er angrebet deraf.

30 Der henvises især til papillomavira, til hvilke der svarer de rekombinante DNA'er beskrevet i EP patentansøgning nr. 192 001, og hvis betegnelser er anført nedenfor. De er deponeret den 30. november 1994 hos C.N.C.M. (Collection Nationale des Cultures de Micro-Organismes de 1'INSTITUT 35 PASTEUR de Paris) under de nedenfor anførte numre: * 2 DK 172647 B1 pBR322/HPV2d................nr. 1-379 PBR322/HPVl0bA..............nr. 1-380 pBR322/HPVl0bB..............nr. 1-381 5 pBR3 2 2 / HPVl 4 a...............nr. 1-382 pBR322/HPVl4b...............nr. 1-383 PBR322/HPV15................nr. 1-384 PBR322/HPV17A...............nr. 1-385 pHPV5 HindIIIB/HPVl7b.......nr. 1-386 10 PBR322/HPV19......... nr. 1-387 PBR322/HPV20............... nr. 1-388 PBR322/HPV21............... nr. 1-389 pHV5 HindIIIB/HPV22........ nr. 1-390 PBR322/HPV23................nr. 1-391 15 pBR322/HPV24a...............nr. 1-392 pBR322/HPV24b...............nr. 1-393 pBR322/HPV28................nr. 1-394 PBR322/HPV29................nr. 1-395 PBR322/HPV31............... nr. 1-396 20 PSP64/HPV32........ nr. 1-397 pLI55/IP2...... nr. 1-450 pSP65/IP4.................. nr. 1-449 25 Restriktionskortene for disse HPV-DNA'er og andre HPV-DNA1 er findes i fig. 1-10.

I EP patentansøgning nr. 192 001 henvises ligeledes til DNA-fragmenter af de ovenfor anførte HPV-DNA'er og især til sådanne, som svarer til generne E6-E7, El, L2, LI og 30 deres intergeniske regioner. Positionerne og de relative længder af disse forskellige fragmenter i forhold til steder, der tages som udgangspunkter i figurerne, er anført i den følgende tabel.

35 DK 172647 B1 φ c 3 u Φ e _____________ _ o -------------—----Ι Ο' ·η il c* λ Λ λ £ „«§ , ~ ~ S-aSgS! Μ Q '* & ' Λ *Ί «I «Λ ^ Η1 ' Η1 ο ϊ-ι +J' οι ί£3βοϊ£'ν'·*'Λνη©-·«>οιοο»,ΛιΛ' Ί-· Φ Q) ·Η νηΛ_->Γ«*>Λ%ο η ν m οι π „' ££ > Τ3 C 0) Μ

C

Q> flj____ £ C '-—___ _________ __ O dj M £ vn ΙΛ hi ui οι ηι„ hi hi ^ "5 Φ 5ηΞί3!^'η£0'*β'β»-'0 O« ρ hi π -« r«. hi >ο r-i γη hi hi η hi <> OJ g' ~ 5 ΰ j Λ "l " Λ ^- 0 (0

Φ 0J

.* c 'z! φ " ' " ........—------- <q ..... '- -' —1— — 6 g “i Ul Hl> hi hi Hl Hl

® " «SSSCe’SiRSKfc’SSKS

•5 & f>J 1 1 1 ' I * »> i i I I i » I

^ ^ ^ ^ νΛ ιΛ (Λ \Π ΙΛ CO »O

1 J S S 5; S 3 ° 5 £ S 8 S; £ S S 3 Ό u-> ^51 c > o q__ M M - ** " ^ “ ” ------ "· ---- - iH (D tj - ' ’ - -- O C ϊί ^ Λ Φ ^ 'Λ 1Λ Hl «Λ Hl Hl Ul Hl 5 01 « I! Æ r? 2 ^ ° P ^ 'β·" H5 1-1 ^ 0 C —« O »V. «·! —< Ό δί r-, mm Ol _· Hl Hl O' TJ ,Ch 1 ' ' ' ' > 1 i I · < 1 1 I .

H Q *Λ Hl_ Hl_ Hl^ Hl Hl Hl c S nwS«2°!lSvo'OK'neoo

jj ~ ^1 Hl ro CO σι ro ri _· (—1 s CO

to w > ---- —- _ Φ r-7"r —----^— Ό _

Hl Hl^ Hl H} Hl H\

Il I __ * · <0 Γ" '^^^'Hini-ias— oini-i-^noao M ^ O' j .........I I i < i •5 pq Ό ‘P Hl^ H^ Hl Hl^ Hl Hl 1 ^ °E ro rn o ro ri ο'σι'νώιί·* <i om

W V Ό C V θ'» <S> Π ^ f\j w ao C

w •i-f iH __ \ O " 1-1 i φ

J, > (¾ « JS

λ! A >i _ _ ,,, _ O O rn «r m Γ» *r CO C71 — O ffi+j {SJ Csl r~)

TJ

o a.-1_n___ g —--—- ’ o

A

4 DK 172647 B1

Opfindelsen angår ekspressionsprodukterne af generne E6, E7 og især L2, af forskellige papillomavirus, som er omtalt ovenfor.

Disse ekspressionsprodukter kan selv anvendes 5 til påvisning af papillomavira eller disses ekspressionsprodukter i bestemte biologiske prøver og til identifikation af papillomavira efter de typer eller undertyper, som de kan tilhøre. Betingelserne, hvorunder disse ekspressionsprodukter kan fås, vil blive illustreret 10 senere i beskrivelsen, især med hensyn til ekspressionen af sekvensen L2 af papillomavirus HPVla, idet det vil forstås, at lignende metoder kan anvendes til fremkaldelse af ekspression af de genetiske sekvenser L2 (eller E6, E7 eller Li), der hidrører fra andre typer af papillomavirus.

15 I det følgende henvises der, medmindre andet er anført, især til sekvenserne eller generne L2, idet det dog vil forstås, at oplysningerne, som gives med hensyn til ekspressionsprodukterne af generne L2, eventuelt kan overføres til ekspressionsprodukter af de andre ovenfor nævnte gener.

20 Ekspressionsprodukterne af sekvenserne L2 har imidlertid ganske særlig interesse, idet de selv kan anvendes til produktion in vivo af antistoffer, som kan genkende ekspressionsprodukterne af genet L2 i biologiske prøver, der er påvirket af det tilsvarende papillomavirus og ikke 25 af et papillomavirus af anderledes type, og især når de omhandlede præparater i forvejen er fikserede.

Opfindelsen angår således en samling af materialer, hvoraf hvert er dannet af en gruppe omfattende mindst ét polypeptid svarende til ekspressionsproduktet af det hele 30 eller en del af et gen E6, E7 eller, fortrinsvis, L2 af et papillomavirus, hvor polypeptidet i disse grupper hver især er afledt af følgende papillomavira: 1) HPV 2d (C.N.C.M. nr. 1-379);

2) HPV 10b (C.N.C.M. nr. 1-380 og nr. 1-381), HPV

35 28 (C.N.C.M. nr. 1-395); 5 DK 172647 B1 3) HPV 24 (C.N.C.M. nr. 1-392 og 1-393); 4) HPV 14 (C.N.C.M. nr. 1-382 og 1-383), HPV 15 (C.N.C.M. nr. 1-384), HPV 17 (C.N.C.M. nr. 1-385 og nr.

5 1-386), HPV 19 (C.N.C.M. nr. 1-387), HPV 20 (C.N.C.M. nr.

1-388), HPV 21 (C.N.C.M. nr. 1-389), HPV 22 (C.N.C.M. nr.

1-390) og HPV 23 (C.N.C.M. nr. 1-391); 5) HPV 15 (C.N.C.M. nr. 1-384), HPV 17 (C.N.C.M. nr.

1-385 og nr. 1-386); 10 6) HPV 24 (C.N.C.M. nr. 1-392 og nr. 1-393); 7) HPV 14 (C.N.C.M. nr. 1-382 og nr. 1-383, HPV 32 (C.N.C.M. nr. 1-397) og HPV (C.N.C.M. nr. 1-449); 8) HPV 31 (C.N.C.M. nr. 1-396); 9) HPV 32 (C.N.C.M. nr. 1-397); 15 10) HPV 16, HPV 18 og HPV IP2 (C.N.C.M. nr. 1-450), hvilken samling er ejendommelig ved, at polypeptiderne af de ti sammensætninger hver især er valgt således, at de under alle omstændigheder er forskellige fra hinanden, idet enhver af de ti sammensætninger hver kun indeholdet ét poly-20 peptid afledt af kun ét af HPVerne i den tilsvarende gruppe.

Ifølge opfindelsen tilvejebringes også særlige midler, der muliggør bestemmelse af typerne af papillomavirus, som er til stede i en undersøgt læsion, med det formål at vurdere sværhedsgraden og vælge den terapi, der skal følges. Anti-25 stofferne, som dannes mod de forskellige typer af ekspressionsprodukter af generne L2, kan grupperes I blandinger svarende til de, der er anført ovenfor i sammenhæng med polypeptiderne.

Ifølge opfindelsen tilvejebringes således udstyr 30 eller "sæt1·, der omfatter flere særskilte antistoffer og muliggør successive forsøg til påvisning, dvs. identifikation eller klassifikation alt efter omstændighederne, af de ny-isolerede papillomavira.

Opfindelsen angår således også en samling af antistof-35 sammensætninger, hvoraf hvert er dannet af en gruppe omfattende mindst ét antistof rettet mod et materiale ifølge 6 DK 172647 B1 opfindelsen, hvilken samling er ejendommelig ved, at antistofferne af de ti sammensætninger hver især er valgt således, at de under alle omstændigheder er,forskellige fra hinanden, idet enhver af de ti sammensætninger hver kun 5 indeholder ét antistof, som er afledt af kun ét af antistofferne i den tilsvarende gruppe.

Antistofferne dannet mod ekspressionsprodukterne af generne L2 (eller mod rekombinante proteiner indeholdende disse ekspressionsprodukter fusioneret med 10 et supplerende polypeptid, især et stabiliserendé poly-peptid, som ikke medfører modificering af de immunogene egenskaber af ekspressionsproduktet af generne L2) er anvendelige til direkte påvisning af virus i histopatho-logiske snit hidrørende fra læsioner fremkaldt af 15 papillomavirus hos patienter angrebet deraf. Fordelagtigt gennemføres påvisningen på præparater, der i forvejen er fikseret under dissocierende betingelser, f.eks. med mediet eller blandingen ifølge CARNOY, der er nævnt ovenfor (ligeledes beskrevet af L. LISON i 20 "Histochimie et cytochimie animales".

De eventuelt fikserede anti-L2-antistoffer kan genkendes af andre antistoffer dannet mod de førstnævnte, idet disse andre antistoffer bærer passende mærkninger, fortrinsvis ikke-radioaktive. Disse 25 mærkninger er f.eks. af enzymatisk eller fluorescerende ' natur.

Opfindelsen angår s'om hævnt grupper af særskilte polypeptider, hvor disse polypeptider hver især kun svarer til en del af de fuldstændige L2-proteiner, som 30 : er nævnt ovenfor, idet det dog vil forstås, at polypep-tiderne af disse forskellige grupper hver gang indeholder de antigene steder, der er karakteristiske for L2-proteiner af den omhandlede type.

35 7 DK 172647 B1

De her omhandlede polypeptider kan ligeledes, når de er renset, anvendes ved metoder til rensning af antistoffer, som de svarer til, især fra serum af dyr, som er blevet ira-5 muniseret med disse polypeptider. Disse polypeptider kan især fikseres på affinitetssøjler. Processerne til rensning af antistofferne består da i at bringe serummet, som indeholder dem, i kontakt med affinitetssøjler, som bærer de nævnte polypeptider. Antistofferne, som fikseres selektivt 10 på disse søjler, kan derefter genvindes ved spaltning af antigen-antistof-komplekserne ved hjælp af en passende puffer, der udviser en passende ionstyrke, f.eks. en opløsning af et salt, såsom ammoniumacetat. Der kan ligeledes anvendes syrnede opløsninger.

15 opfindelsen angår især præparater, hvori disse poly peptider, eller grupper af polypeptider, og antistoffer (eller grupper af antistoffer) anvendes.

Opfindelsen angår især grupper indeholdende ét eller fortrinsvis en cocktail af antistoffer afledt af 20 grupper af papillomavirus, som alle er kendt for ofte at være tilstede i en given type af lidelse. Disse cocktails (indeholdende disse antistoffer eller grupper af antistoffer, serumblandinger eller præparater af rensede antistoffer i kombination med en passende farmaceutisk 25 bærer) kan derefter anvendes ved indgivelse, især parenteral, til den pågældende patient til behandling af den pågældende lidelse, når denne er diagnosticeret klinisk ved hjælp af et diagnosticeringsforsøg in vitro på en histologisk eller cytologisk prøve fra denne patient, eller når et diagnosti-30 ceringsforsøg in vitro har vist beslægtetheden af det infektiøse papillomavirus med en type, der ligner et af de papillomavira af den ovenfor nævnte gruppe.

Disse sera kan derefter fremkalde en tilbagegang af infektionerne fremkaldt af papillomavira af de til-35 svarende typer eller undertyper.

O

8 DK 172647 B1

Opfindelsen angår også især tilsvarende vaccinepræparater indeholdende et eller fortrinsvis flere L2-proteiner i kombination med et farmaceutisk acceptabelt bærestof, der er tilpasset til den valgte 5 indgivelsesmåde, især ad parenteral vej, og anvende ligt til beskyttelse af personer, som er udsat for høj risiko for at blive angrebet af den tilsvarende lidelse.

Der skal endelig henvises til de artikler, hvis bibliografiske referencer er anført i beskrivelsens 10 slutning, idet disse artikler for så vidt kompletterer behovet for beskrivelsen af teknikkens stade i det omfang, hvor dette kan vise sig nyttigt for fuldstændig forståelse af den foreliggende tekst. I denne henseende bør indholdet af disse artikler betragtes som udgørende 15 en del af beskrivelsen.

En foretrukken metode til fremstilling af et L2-protein (eller et fragment af dette protein), hvorved der anvendes et fragment af den åbne fase af L2-genet af et givet papillomavirus, illustreres i det følgende 20 i sammenhæng med beskrivelsen af konstruktionen af en vektor, som inkorporerer disse fragmenter af den åbne fase, og derefter betingelserne, hvorunder man kan fremkalde ekspression af L2-proteinet eller af dette polypeptid i E. coli. En fremgangsmåde til rensning af 25 proteinet eller dette polypeptid samt dets anvendelse ved fremstilling af serum indeholdende antistoffer rettet mod disse proteiner eller dette polypeptid beskrives ligeledes.

Det vil være klart for en fagmand, at det anvendte .

30 fragment af den åbne fase af L2 hver gang bør være fusioneret i fase i den anvendte vektor, i påkommende tilfælde med et gen, som koder for et protein, der sikrer stabiliteten eller letter den sluttelige rensning af det da dannede hybride protein.

35 Fremstillingsrækkefølgen er illustreret i fig. 11.

O

9 DK 172647 B1

Materialer og metoder 1) Behandling af DNA'er.

Med hensyn til rekombinering af DNA'er, fremstilling 5 af plasmider og fragmenter af DNA, dannelse af frie ender, nedbrydning med enzymet Bal 31 og endelig transfektion af celler er der anvendt metoderne ifølge T. Maniatis et al., (1982), beskrevet i kapitlet "Molecular cloning" i "A Laboratory Manual" fra Cold Spring Harbor Laboratory, 10 Cold Spring Harbor, New York, USA.

2) Bakterier, plasmider og vira.

Plasmid-DNA'er er fremstillet ud fra pHPVI.a (Danos et al., 1982 og FR-patentansøgning nr. 82/05887) 15 indeholdt i E. coli (C 600-celler), fra pCQV2, som findes i RRI-celler (Queen, 1983) og fra pMC1403, som findes i MClOOO-celler (Casadaban, 1983).

De konstruerede intermediære plasmider og plasmidet pHPL2 er blevet underkastet flere passager 20 i celler af E. coli MM 294, og pHPL2-8-galactosidase- -plasmider er underkastet flere passager i MClOOO-celler, som er defekte med hensyn til β-galactosidase. Lac+--stammer er påvist i form af røde kolonier på agarplader ifølge Mc Conkey indeholdende lactose (Silhavy et al, 25 1984, "Experiments with gene fusions", Cold Spring Harbor

Laboratory, Cold Spring Harbor, New York).

Plasmiderne pHPL2 og pHPL2-6-gal er derefter transficeret i en Ion--stamme, som er defekt med hensyn til protease, nemlig CAG1139 (Crossman et al., Cell 32, 30 151-159, 1983) .

3) Fremstilling af bakterielysater og analyse af disse på en polyacrylamidgel med natriumdodecylsulfat (PAGE-SDS) ._

Efter dyrkning natten over fortyndes CAG 1139-celler 35 indeholdende pHPL2 eller pHPL2-f5-gal 116 5-20 gange i LB- -medium. De dyrkes derefter ved 30°C indtil en optisk tæthed ved 600 nm på 0,5-0,9.

10 o DK 172647 B1

Lambda-PR-promotoren frigøres derefter ved at lade cellerne vokse ved 41°C i 90 minutter. Kulturerne recentrifugeres, og bundfaldene opsamles og suspenderes i et medium af 62 mM tris, pH-værdi 6,8, 5 indeholdende 2% SDS, 26% glycerol, 2 M mercaptoethanol og 0,03% bromphenolblåt. Et lysat af CAG 1139-celler, som ikke indeholder plasmid, anvendes til sammenligning.

Efter behandling ved 100°C i 10 minutter underkastes prøverne elektroforese i en 10%'s SDS-polyacrylamid-10 gel ved metoden ifølge Laemli, Nature, 227, 680-684, (1970).

Proteiner, som i forvejen er farvet med BRL, og som har kendte molekylvægte, underkastes ligeledes elektroforese.

Proteinbåndene gøres synlige ved farvning med farvestoffet, som er kendt under betegnelsen "amido black" 15 og overføres til en folie af nitrocellulose til analyse ved den såkaldte "Western blot"-metode.

4) Analyse

Analysen ved "Western blot"-metoden gennemføres som 20 beskrevet af Rosetto et al., J. Gen. Virol. 65, 1319-1324 (1984), idet der anvendes polyclonale papillomavirus-antistoffer (Orth et al.. Virology 91, 243-255 (1978), og Rosetto et al., se ovenfor) og anti-marsvin- og anti-kanin-IgG-immunoglobuliner kon-25 jugeret med peberrodsperoxidase.

5) Antistof'analyse

Der anvendes de tidligere beskrevne immunodiffusions-, immunofluorescens- og immunoperoxidasemetoder 30 (Orth et al., 1984, og Rosetto et al-, 1984), idet der anvendes rensede viruspartikler af HPVla eller fra snit af læsioner fremkaldt af særskilte typer af papillomavirus.

35 « o 11 DK 172647 B1 6) Rensning af L2-8-galactosidase-fusionsproteiner.

En kultur af CAG 1139 indeholdende pHPL2-8--galactosidase 116 fortyndes 200 gange i LB-medium og dyrkes indtil en ODg.« - værdi på 0,32. Kulturen opvarmes 5 derpå hurtigt til 41°C og dyrkes ved høj temperatur i 90 minutter.

Cellebundfaldet resuspenderes i et medium af 20 mM tris, pH-værdi 7,5, 10 mM MgC^ og underkastes en ultralydbehandling til brydning af cellerne.

10 Det opløselige fusionsprotein i præparatet renses ved affinitetschromatografi på en p-aminophenyl-8-D--thiogalactosid-(TPEG)-nSEPHAROSE"-søjle som beskrevet af Ullmann, Gene 29^, 27-31 (1984) .

Fusionsproteinet, der er renset som ovenfor anført, 15 anvendes til immunisering af Harley-marsvin af hunkøn.

Dyrene modtager tre subcutane injektioner på bestemte steder af ca. 150 Mg proteiner i nærværelse af komplet Freunds adjuvans (DIFCO) med mellemrum på 2-3 uger.

Serum udtages en uge efter den tredje injektion.

20

Resultater

Konstruktion af plasmider, som kan eksprimere den åbne læserammme L2 i Escherichia coli._ 25 Konstruktionerne er vist i fig. 1. Den åbne læseramme L2 er klonet med henblik på ekspression i Escherichia' coli. Plasmidet pHPVl.a indeholder hele genomet af HPVl.a klonet på BamHI-stedet af plasmidet pBR322 ifølge Danos et al. (EMBO J. 1, s. 231-236, 1982). Med det formål 30 at isolere de åbne læserammer fra den sene region af virus-genomet subklones et Hind III-Hpa Il-fragment af et plasmid pHPV l.a i et plasmid pBR322. Det fremkomne plasmid betegnes pHPL9. Dette plasmid forkortes ved fjernelse af et ikke-essentielt BamHI-PVu Il-fragment 35 i pBR322-regionen. Ud fra det fremkomne plasmid pHPL 9.3, isoleres et XhoII-Xmnl-fragment indeholdende de 1526 o 12 DK 172647 B1 basepar (b.p.) af den åbne læseramme minus de 318 5'-terminale par.

Stopkodonet af den åbne læseramme L2 bevares.

Det fremkomne L2-fragment indføjes derefter i 5 ekspressionsvektoren pCQV2 (Queen 1983) i stedet for et ikke-essentielt BamHI-PvuII-fragment. Den åbne læseramme L2 foreligger således direkte stødende op til start-ATG--kodonet og SD-sekvensen (Shine og Dalgarno, Proc. Natl.

Acad. Sci. USA 71, s. 1342-1346^1974) af cro-genet af 10 lambda-fag og under kontrol af lambda-PR-promotor.

Promotoren reguleres af den temperaturfølsomme repressor CI857, der muliggør kontrollering af produktionen af ekspressionsproduktet L2. Der fås således plasmidet pHPL2, hvori de 1206 basepar af den C-terminale del af den åbne 15 læseramme L2 er i fase med ATG-startkodonet af cro af lambda-fag. Aflæsnings-faseforholdet bekræftes af tilstedeværelsen af et XhoII-restriktionssted ved forbindelsen BamHI/Bgl II.

Med det formål at stabilisere det syntetiserede 20 L2-protein i E. coli og tilvejebringe en bekvem metode til rensning af dette besluttes det også at eksprimere det som et fusioneret hybridprotein med B-galactosidase af E. coli.

Til dette formål fjernes L2-slutkodonet efter 25 linearisering af plasmidet pHPL2 ved BstEII-stedet, efter fulgt af en nedbrydning med enzymet'Bal31.

Dette DNA, som indeholder L2-genet og sekvenserne, som giver transkriptions- og oversættelsessignalerne, forkortes ved nedbrydning med Pstl, før det indføjes i 30 plasmidet pMCl403 (Casadaban, Methods in enzymology 100, s. 293-308, 1983) i stedet for Pstl-Smal-fragmentet.

PMC1403 indeholder lac-operonet i sin promotor og de første 22 basepar af den åbne fase af 6-galactosidase--genet. Rekombinanten transficeres i MC 1000, lac”-celler.

35 Produktionen ved forhøjet temperatur af 8-galactosidase i de fremkomne kloner gør det muligt at foretage en selek-

O

13 DK 172647 B1 tionering på agar-lactose-plader Mc Conkey (Silhavez et al,

Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. 1984) af plasmider pHPL2-8-gal, hvori generne for L2 og 8-galactosidase er i fase.

5 pHPL2, Ø-gal-116-klonen, som er selektioneret ifølge en sådan metode, undersøges derefter.

Sekvensbestemmelsen af DNA (resultaterne er ikke vist her) har vist, at kun de to sidste C-terminale aminosyrer af den åbne læseramme L2 er gået tabt under ned-10 brydningen med Bal 31, og at produktet eksprimeret af den åbne læseramme L2 er bundet via en prolinrest til den niende aminosyre i 8-galactosidase.

Fremstilling af proteiner svarende til HPVl.a ved hjælp af 15 celler transficeret med pHPL2 og pHPL2-8-qal-116_

Plasmidet pHPL2 kan kode for et L2-protein på ca.

51.2 Kd, og plasmidet pHPL2-8-gal kan kode for et hybridprotein på ca. 167 Kd.

Til undersøgelse af produktionen af proteiner af 20 disse plasmider transficeres de først i E. coli stamme CAG 1139 Ion-, som er proteasedefekt. Cellerne dyrkes derefter ved 30°C, før de udsættes for en temperatur på 41°C med henblik på at fremkalde produktion af proteiner under kontrol af larnbda-PR-promotoren. De fremkomne 25 bakterielysater underkastes elektroforese på en SDS- -polyacrylamidgel.

Proteinerne svarende til HPVl.a påvises ved analyse ved den såkaldte "Western blot"-metode med anti-virus HPVl.a--antistof. For kulturerne dyrket ved 30°C er analyse-30 resultaterne de samme for celler, som indeholder et plasmid og ikke indeholder et plasmid, men for cellerne udsat for en temperatur på 41°C påvises der specifikke proteinbånd i de transficerede celler. Blandt proteinerne isoleret fra cellerne transficeret med rekombinanten 35 pHPL2-S-gal-116 isoleres et primært bånd med den forventede molekylvægt på ca. 167 Kd svarende til et

O

14 DK 172647 B1 fusionsprotein L2-8-galactosidase (L2-6-gal) og flere mindre bånd med molekylvægte på ca. 58 Kd, som formentlig hidrører fra en proteolytisk nedbrydning.

For konstruktionen pHPL2 har der vist sig et 5 proteinbånd på ca. 72 Kd. Denne molekylvægt er højere end den forventede på 51,2 Kd. Betydningen af denne forskel er endnu ikke opklaret.

Til derefter at undersøge antigeniteten af det fremstillede protein i E. coli renses L2-8-gal-produktet 10 fra bakterielysatet af en kultur udsat for varme ved affinitetschromatografi på en søjle af TPEG-"sepharose" (Ullman, Gene 29, s. 27-31, (1984). Proteinerne, som elueres fra søjlen, analyseres på en SDS-polyacrylamidgel. Farvning med et "amido-black" viser tre primære proteinbånd, et 15 med en høj molekylvægt, som formentlig svarer til hybridproteinet L2-8-gal, et andet, der vandrer sammen med renset (3-galactosidase, og et tredje med en molekylvægt på ca. 60 Kd.

Dette protein med lav molekylvægt kan svare til 20 en urenhed. Analyse ved "Western blot"-metoden med et specifikt antistof af typen HPVl.a har vist et primært bånd med en høj molekylvægt svarende til ekspressionsproduktet L2-S-gal og flere sekundære bånd (fig. 3b).

25 Immunocrenitet af L2-g-gal-produktet.

Til undersøgelse af immunogeniteten af fusionsproteinet injiceres det eluerede produkt i to marsvin. Der opsamles serum efter den tredje injektion. Ved en "Western blot"--analyse reagerer de fremkomne sera med båndene, der vand-30 rer som fusionsproteinet L2-$-gal eller som L2-produktet i bakterielysater fra kulturer udsat for varme, der henholdsvis indeholder plasmidet pHPL2-f}-gal-116 eller plas-midet pHPL2.

I de to typer af cellelysater genkender serummerne 35 proteiner (ca. 60 og 55 Kd), som ligeledes findes i lysatet af kontrollen CAG 1139. Mindst et af disse synes at svare til o DK 172647 B1 15 proteinet renset sammen med fusionsproteinet L2-$-gal og Ø-galactosidase.

Serummerne genkender proteiner på ca. 80 Kd i et dissocieret HPVl.a-viruspræparat (behandlet med en 5 detergent) og i en ekstrakt af vorter fremkaldt af HPVl.a.

Ved en immunodiffusionsprøve udfælder de fremkomne marsvinesera ikke intakte HPVl.a-viruspartikler anvendt som antigener, hvilket på ny viser, at virus-antigenerne, som genkendes af serum ved immunooverføringsmetoden, 10 ikke kan være tilgængelige ved overfladen af virionet, hvor serummerne ikke udfælder dem.

I frysesnit af HPVl.a-vorter, som er kendt for at bevare den native konformations-struktur af virioner og virale polypeptider, reagerer serummer fremkaldt af 15 L2-ekspressionsprodukterne ikke. Dette resultet vidner endnu engang om, at antistoffet ikke er rettet mod et konformations-antigen.

Serummerne reagerer kun lidt (ved en fortynding til 1/50) med snit af vorter inficeret med HPVl.a fikseret 20 i medium ifølge BOUIN. Dette resultat bekræfter den specifikke type-karakter af de pågældende antigener i modsætning til gruppe-antigenerne, som fører til kraftigere antigen--antistof-reaktioner med snit inficeret med et virus og fikseret med medium ifølge BOUIN.

25 I modsætning hertil har undersøgelser gennemført med snit dannet med medium ifølge CARNOY vist sig at give positive reaktioner med både type-antigener og gruppe-antigener. Det konstateres især, at marsvineserum giver meget kraftige antigen-antistof-reaktioner (indtil 30 en fortynding på 1/1000), når snittet indeholder et virus af samme type som det, der har dannet antigenet, ud fra hvilket antistoffet anvendt ved forsøget er dannet.

I modsætning hertil observeres der ingen immunologisk krydsreaktion, når det undersøgte serum bringes i kontakt 35 med snit indeholdende et virus, der tilhører en anden type.

16 DK 172647 B1

Det skal også præciseres, at de omhandlede typer for antigenerne ikke nødvendigvis altid falder sammen med typerne, således som de er defineret ovenfor, med hensyn 5 til evne til gensidig hybridisering af genomer af to forskellige papillomavirus.

Det skal især bemærkes, at der foreligger to slags antigener i papillomavirus: - typeantigener, som er karakteriseret ved fraværelse 10 af kryds-antigenreaktion mellem de forskellige slags papillomavirus under anvendelse af antistoffer, som er fremkommet efter injektion af hele virioner, og - gruppeantigener, som i det væsentlige er maskeret i virionet og påvises med antistoffer efter injektion af 15 dissocierede viruspartikler.

Papillomavira, der tilhører forskellige typer ved antistof-antigen-reaktionsforsøgene, er sådanne, hvori de kodende sekvenser L2, som fortrinsvis er fri for deres respektive homologe regioner, koder for polypeptider, 20 som ikke muliggør kryds-antigen-antistof-reaktioner med deres respktive antistoffer.

Antigener af foretrukne typer er sådanne, som kodes af de åbne læserammer af genet L2 uden den N-terminale region, især 1/4 af længden af de pågældende L2-regioner.

25 Opfindelsen angår især ligeledes en test til påvisning, i vira tilhørende forskellige typer, af sådanne af polypeptiderne, der kodes af L2-regionerne, som ikke giver krydsreaktioner. Disse polypeptider kan defineres som sådanne, hvis antistoffer reagerer effektivt 30 med virus indeholdt i histologiske eller cytologiske snit fikseret med medium ifølge Carnoy, men kun reagerer dårligt eller slet ikke med de samme snit, når disse er fikseret med medium ifølge Bouin.

Opfindelsen angår ligeledes en fremgangsmåde til 35 klassifikation af et nyisoleret papillomavirus. Denne fremgangsmåde er defineret i krav 8.

17 DK 172647 B1

Diagnosticeringsfremgangsmåden omfattende identifikation af typen af infektiøse vira, som eventuelt er til stede hos en patient, består i at omsætte antigener, som i forvejen 5 er dannet mod vira, der tilhorer forskellige typer, med en biologisk prøve, især serum, fra en patient, som prøven bør gennemføres for.

Det infektiøse virus formodes at tilhøre en bestemt type, når der observeres en antigen-antistof-reaktion mellem 10 en serumprøve og et antigen fra et papillomavirus, der tilhører den samme type. Disse diagnosticeringsforsøg kan f.eks. gennemføres under anvendelse af ELlSA-metoden.

Nærmere bestemt gennemføres fremgangsmåden til påvisning af, hvorvidt et infektiøst papillomavirus i en human 15 biologisk prøve, såsom væv eller væske, f.eks. serum, tilhører en given type af papillomavirus, ved at denne biologiske prøve bringes i kontakt med antistoffer, som i forvejen er dannet mod et ekspressionsprodukt af et DNA, der indeholder i det mindste en del af L2-regionen af genomet 20 af et virus, der tilhører denne type, idet denne kontak-tering gennemførs under sådanne betingelser og i et sådant tidsrum, at der muliggøres en immunologisk reaktion.

Påvisningen af dannelsen af et antistof-antigen-kompleks vidner da om tilstedeværelsen af et papillomavirus, som er 25 af samme type eller beslægtet type i forhold til det virus, hvorfra det nævnte ekspressionsprodukt hidrører.

Fortrinsvis klones DNA indeholdende L2-regionen eller den tilsvarende del i en kompetent cellevært, såsom en bakterie, f.eks. E. coli.

30 Fordelagtigt svarer delen af L2-regionen, der anvendes, til den åbne læseramme af genet L2 uden den N-terminale region, som ikke er typekarakteristisk.

Fortrinsvis svarer denne N-terminale region til den første fjerdedel af denne læseramme.

35 18 DK 172647 B1

Især er DNA indeholdende den nævnte del af L2-regionen (eller hele L2-regionen) et hybrid-DNA dannet ud fra en nucleinsyre, der koder for et protein, som normalt kan eks-primeres i den valgte kompetente cellevært, og hvori den 5 nævnte L2-region i forvejen er inkorporeret, især ved rekom-binering i vitro.

F.eks. svarer proteinet, som normalt kan eksprimeres i celleværten, til det hele eller en del af β-galactosidase, når denne cellevært er E. coli.

10 Påvisningsfremgangsmåden ifølge opfindelsen er anvendelig på ethvert fikseret histologisk snit, fortrinsvis fiLkseret i medium ifølge Carnoy, eller også direkte på et serum.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen omfatter I5 ligeledes kontaktering af den biologiske prøve under de ovenfor angivne betingelser med "cocktails" af antistoffer, som i forvejen er dannet mod ekspressionsprodukter af L2-regionerne - eller deres respektive tilsvarende dele - hidrørende fra flere vira af samme typer 20 eller beslægtede typer, især vira grupperet på samme måde som ovenfor anført i overensstemmelse med DNA-sonderne.

Anvendelsen af disse antistof-cocktails muliggør da, under lignende betingelser som beskrevet i sammenhæng med DNA-sonderne, bestemmelse af sammenhænge mellem 2^ slægtskabsforholdet påvist for en given kategori af papillomavirus og den sygdom, som den undersøgte patient lider af, eller som han muligvis udsættes for.

30 35 19 DK 172647 B1

LITTERATUR

(1) Derst, M. et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci.

U.S.A., 3812-3815.

(2) Coggin, J.R., Jr. et al., 1979, Cancer Res., 39.

5 545-546.

(3) Gissmann, L. et al., 1982, J. Virol. 44, 393-400.

(4) Green, M. et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci, U.S.A. Il, 4437-4441 .

(5) Heilman, C.A. et al., 1980, Virol. 395-407.

10 (6) Jablonska, s. et al., 1972, Cancer Res., 12, 583-589.

(7) Jablonska, S. et al., 1982, Springer Semin. Iramuno-pathol. 1, 33-62.

(8) Kremsdorf, D. et al., 1982, J. Virol. 42, 436-447.

15 (9) Kremsdorf, D. et al., 1983, J. Virol. 41, .340-351.

(10) Lutzner, M.A. et al., 1978, Bull. Cancer, H, 169-182.

(11) Lutzner, M.A. et al., 1983, Lancet ii, 422-424.

(12) Migozzi, M. et al., 1965, Bull. Soc. Franc. Derm.

20 Syph. 22, 747-748.

(13) Orth, G. et al., 1980, Cold Spring Harbor Conf.

Cell Proliferation, 2# 259-282.

(14) Orth, G. et al., 1981, J. Invest. Dermatol. 76 97-102.

25 (15) Orth, G. et al., 1979, Cancer Res. 22, 1074-1082.

(16) Ostrow, R.S. et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci.

U.S.A. 2!< 1634-1638.

(17) Ostrow, R.S. et al., 1983, Ann. Acad. Dermatol. 2, 398-404.

30 (18) Pfister, H. et al., 1983, Cancer Res. 43.

1436-1441.

(19) Pfister, H. et al., 1983, J. Virol. 42. 363-366.

(20) Pfister, H. et al., 1981, Int. J. Cancer, 22, 645-650.

35 (21) Rueda, L.A. et al., 1976, Med. Cut. I.L.A. 2, 20 DK 172647 B1 113-136.

(22) Ruiter, M. et al. J. Invest. Dermatol., 42ι 247-252 .

(23) Sutcliffe, J.G., 1978 , Nucleic Acids Res. .5, 5 2721-2728.

(24) Tsumori, T. et al., 1983, J. Gen. Virol. 64.

967-969 .

10 15 20 25 30 35

Claims

21 DK 172647 B1

1. HPV 2d (C.N.C.M. nr. 1-379);

1. Samling af materialer, hvoraf hvert er dannet af en gruppe omfattende mindst ét polypeptid svarende til ekspressionsproduktet af det hele eller en del af et gen E6,

2. Samling ifølge krav 1, kendetegnet ved, at de nævnte materialer hver især, i kombination med det nævnte polypeptid, indeholder et farmaceutisk acceptabelt bærestof, der muliggør anvendelse af et eller flere af disse materialer til en vaccination mod de tilsvarende 35 papillomavira.

2. HPV 10b (C.N.C.M. nr. 1-380 og nr. 1-381), HPV 10 28 (C.N.C.M. nr. 1-395);

3. Samling af antistofsammensætninger, hvoraf hvert 22 DK 172647 B1 er dannet af en gruppe omfattende mindst ét antistof rettet mod et materiale ifølge krav 1, kendetegnet ved, at antistofferne af de ti sammensætninger hver især er valgt således, at de under alle omstændigheder er forskellige 5 fra hinanden, idet enhver af de ti sammensætninger hver kun indeholder ét antistof, som er afledt af kun ét af antistofferne i den tilsvarende gruppe.

3. HPV 24 (C.N.C.M. nr. 1-392 og 1-393);

4. Samling ifølge krav 3, kendetegnet ved, at de nævnte sammensætninger hver især, i kombination 10 med det nævnte antistof, indeholder en farmaceutisk acceptabel bærer, der muliggør anvendelse af en eller flere af disse sammensætninger til, når de indgives til en patient, der bærer tilsvarende papillomavira, at bevirke en tilbagegang af infektioner fremkaldt af disse papillomavira.

4. HPV 14 (C.N.C.M. nr. 1-382 og 1-383), HPV 15 (C.N.C.M. nr. 1-384), HPV 17 (C.N.C.M. nr. 1-385 og nr. 1-386), HPV 19 (C.N.C.M. nr. 1-387), HPV 20 (C.N.C.M. nr. 15 1-388), HPV 21 (C.N.C.M. nr. 1-389), HPV 22 (C.N.C.M. nr. 1-390) og HPV 23 (C.N.C.M. nr. 1-391);

5. Fremgangsmåde til diagnosticering in vitro af naturen af et papillomavirus, som er indeholdt i en histologisk eller cytologisk prøve fra en patient, eller som kan isoleres fra denne prøve, kendetegnet ved, at prøven bringes i kontakt med samlingen ifølge krav 3, hvor-20 efter det bestemmes, hvilket eller hvilke antistoffer der forbliver fikseret til prøven.

5. HPV 15 (C.N.C.M. nr. 1-384), HPV 17 (C.N.C.M. nr. 1-385 og nr. 1-386);

5 E7 eller, fortrinsvis, L2 af et papillomavirus, hvor poly-peptidet i disse grupper hver især er afledt af følgende pa-pillomavira:

6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegnet ved, at prøven foreligger i form af et fikseret histologisk præparat eller snit.

6. HPV 24 (C.N.C.M. nr. 1-392 og nr. 1-393); 20 7) HPV 14 (C.N.C.M. nr. 1-382 og nr. 1-383, HPV 32 (C.N.C.M. nr. 1-397) og HPV (C.N.C.M. nr. 1-449);

8. HPV 31 (C.N.C.M. nr. 1-396);

9. HPV 32 (C.N.C.M. nr. 1-397);

10. HPV 16, HPV 18 og HPV IP2 (C.N.C.M. nr. 1-450), 25 kendetegnet ved, at polypeptiderne af de ti sammensætninger hver især er valgt således, at de under alle omstændigheder er forskellige fra hinanden, idet enhver af de ti sammensætninger hver kun indeholder ét polypeptid afledt af kun ét af HPVerne i den tilsvarende gruppe.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendeteg net ved, at det histologiske snit er fikseret med medium ifølge Carnoy.

8. Fremgangsmåde til klassifikation af et nyisoleret papillomavirus, kendetegnet ved, at man efter 30 hybridisering under ikke-strikte betingelser af dets genom med L2-regionen af et eller flere kendte papillomavirus-ge-nomer eller i påkommende tilfælde sekvensbestemmelse af dets genom og følgelig fastlæggelse af den åbne læseramme svarende til genet L2, fremstiller en rekombinant mod et 35 fragment bestående af det hele eller en del af dette gen L2, som i forvejen er udskåret af det nævnte genoro og en 23 DK 172647 B1 passende vektor, hvorefter man fremkalder ekspression af det nævnte fragment i en passende cellevært eller mikroorganisme, især E. coli, som i forvejen er transformeret med den opnåede modificerede vektor, at man i påkommende tilfælde 5 derefter in vivo frembringer antistoffer mod de fremkomne ekspressionsprodukter, idet fremgangsmåden til klassifikation omfatter forsøg med antigen-antistof-krydsreaktion - enten mellem ekspressionsprodukterne af L2-genet af det nyisolerede papillomavirus og de tilsvarende anti- 10 stoffer af samlingen ifølge krav 3, - eller mellem antistofferne dannet mod ekspressionsprodukterne af L2-genet af det nyisolerede papillomavirus og sammensætningerne af polypeptider af samlingen ifølge krav 1, 15 og at man undersøger, om den nyisolerede type af papillomavirus adskiller sig fra hvert af de kendte papil-lomavira svarende til papillomaviraene i de forskellige sammensætninger af samlingen ifølge, afhængigt af omstændighederne, krav 1 eller krav 3, afhængigt af, om antigen-20 -antistof-krydsreaktionerne fører til negative eller positive resultater. 25 30 35