JPS63219372A - イヌリンフラクトトランスフエラ−ゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産１上凶Ｍ」公団 本発明は、イヌリンよりシーＤ−７ラクトシルフラノー
ス１．２’：２．３’　ジアンハイドライドを生成させ
る酵素・イヌリンフラクトトランスフェラーゼの製造法
に関するものであ従来の技術　　　　　　　□ イヌリン７ラクトトンスフエラーゼは、多糖類・イヌリ
ンを分解して下記構造式のジーＤ−７ラクトシル７ラノ
ース１．２’：２．３’　シアンハイドライド（略称Ｄ
ＦＡＩＩＩ）を生成させる酵素である。

ＤＦＡＩ［［はフラクトースに似たされやかな甘味を有
する物質である。したがって、イヌリンからＤＦＡＩＩ
Ｉを安価に製造することができれば、この物質を甘味料
として利用することが可能になるが、それに必要なイヌ
リン７ラクトトランスフエ　。

ラーゼが、従来は入手困難であった。

従来、イヌリンフラクトトランスフェラーゼは、アース
ロバフタ−・ウレアファシェンスにより生産されること
が知られている（特公昭５６−２６４００号）。し、か
じながら、アースロバフタ−・ウレア７７シエンスのイ
ヌリンフラクトトランスフェラーゼ産生力は弱く、しか
もイヌリン７ラクトトランスフエラーゼと共に著量のβ
−７ラクトシグーゼ（イヌリンからフラクトースを生成
させＤＦＡＩＩ［製造の妨げとなるので、分離のための
精製が不可欠である）を生産するから、この菌を用いる
方法によって高品質のイヌリンフラクトトランスフェラ
ーゼを経済的に得ることは困難である。

発明が解決しようとする問題点 したがって本発明の目的は、イヌリンフラクトトランス
フェラーゼを安価に且つ豊富に生産し得る方法を提供す
ることにある。

ヴを　　するための　を 上記目的を達成するため、本発明者らは多くの全生物に
ついてイヌリン７ラク）トランス７ヱラーゼ産生能の観
点がらスクリーニングを行い、シュードモナス属に属す
る一細菌すなわちシュードモナス・フルオレッセンスＭ
ＺＮｏ、９４９（微工研菌寄第９２３５号）がすぐれた
性質を有することを知った。

本発明は上記知見に基づくものであって、フラクト−ス
のポリマーを含有する培地を用いてシュードモナス属に
属するイヌリンフラクトトランスフェラーゼ生産菌を培
養し、培養物からイヌリン７ラクＹトランスフエラーゼ
を採取することを特徴とするイヌリン７ラクトトランス
フエラーゼの製造法を提供するものである。

上記ＭＺＮｏ、９４９株は、広島県尾道市の土壌より分
離されたものであって、その菌学的性質は次のとおりで
ある。

（ａ）　　形態 ■細胞の形および大きさ二０．５〜０．７μｍＸ　２　
、　Ｏ〜３．５μｍの桿菌 ■運動性：あり。１本以上の極鞭毛を有する。

■胞子：なし ■ダラム染色性：陰性 ■抗酸性：なし くｂ）　　生育 ■肉汁寒天斜面培養：中程度の発育；透明；やや赤味を
帯びる。

■肉汁液体培１１：中程度の発育；表面に膜形成。

■肉汁ゼラチン穿刺培養：液化しない。

■リドマスミルクー変化しない。

■ＢＣＰミルク：変化しない。

（ｃ）　　生理的性質 ■硝酸塩の還元：する。

■脱窒：しない。

■ＭＲテスト　：陰性 ■ｖＰテスト　：陰性 ■インドールの生産：なし ■硫化水素の生成：なしくＴＳＩ寒天培地）■デン粉の
加水分解：なし ［Ｆ］クエン酸の利用：あり（クリ入テンセン培地）■
無機窒素源の利用：硝酸塩およびアンモニウム塩を利用
する。

［相］色素の生成：水溶性、蛍光性の色素を生成する。

■オキシグーゼ：陽性 ■カタラーゼ：陽性 ■生育の範囲：ｐ８４〜１０で生育する。４℃、２７℃
で生育する。３７℃で生育しない。

［相］酸素に対する態度：好気性 ■Ｏ−Ｆテスト　ニゲルコースを酸化する。

（Ｈｕｇｈ　Ｌｅｉｆｓｏｎ法） ［相］炭水化物の利用：Ｄ−グルコース、Ｌ−７ラビノ
ース、トレハロース、イ７シトール、Ｌ−バリペルーヒ
ドロキシ安息香酸を利用する。シェフロー人、ゲラニオ
ール、アセトアミド、エタノールを利用しない。

＠アルギニンの脱炭酸：陽性 ［相］プロトカテキン酸の分解二オルト型の開裂以上の
諸性状をパーツエイのマニュアル・オブ・デターミネイ
ティブ・バクテリオロジー、＄８版（１９７４）の記載
と照合することにより、重曹がシュードモナス・フルオ
レッセンスＩミグラ　１８９５１であることを確認した
。

本発明を実施する場合１三用いる培地としては、フラク
トースのポリマーを酵素誘導基質として含有させること
を除けば、特殊なものを必要としない。シュードモナス
属細菌の培養に通常使用される培地、すなわちグルコー
ス等の炭素源および酵母エキス、ペプトン等の有機窒素
源、その他硝酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化マ
ンガンなどの無機塩類等を基本成分として適宜組合せた
ｐＨ５〜８程度の培地を用いることができる。培地に含
有させるフラクトースのポリマーとしては、イヌリン、
レバン等を用いることができ、その好適濃度は０．０１
〜３０％、特に好ましくは１〜５％である。

培養は、シュードモナス属細菌培養の常法に従って行う
ことができる。目的とする酵素は菌体外に生産される。

生産は菌の対数増殖期に始まり、定常期にほぼ最大生産
量に達するので、通常は定常期に達したあと適当な時期
に培養を打切る。

培養終了後は直ちに遠心分離して菌体を除去する。シュ
ードモナス菌はβ・フラクトシグーゼを生産しないので
、菌体を除いただけの培養液でも粗酵素液として利用で
外るが、これを酵素精製の常法に従って精製すれば、よ
り活性が強く、利用し易いイヌリンフラクトトランスフ
ェラーゼを得ることができる。

得られるイヌリンフラクトトランスフェラーゼは安定で
、冷蔵庫で数カ月間保存可能であり、冷凍庫中ならば、
さらに長期間保存することがでざる。

発明の効果 後記実施例が実証するように、本発明の製法によればア
ースロバフタ−属細菌を用いる従来の製法よりもはるか
に高い収率で、且つ好ましくないβ−フラクトシダーゼ
を含まない状態でイヌリンフラクトトランスフェラーゼ
が得られ、この酵素を安価に且つ豊富に提供することが
可能になる。

天１例 以下、実施例を示して本発明を説明する。なお、各側に
おいて示した酵素活性は、次の方法により測定したもの
である。

酵素活性測定法：適当に希釈した酵素液１０ｍ１と２％
イヌリン溶液（ｐＨ６，０の０，１Ｍ酢酸緩衝液溶液）
１０ｍｌとを混合し、３７℃で３０分間反応させたのち
、長さ１０ｃｍのセルに入れ、ＤＦＡＩＩＩの生成にと
もなう旋光度変化を測定する。酵素液とイヌリン溶液を
混合した直後の旋光度を基準にして、旋光度を１分間に
プラスｏ、ｏｏｉ度だけ変化させる酵素量を１単位とす
る。

実施例　１ イヌリン　１％、ペプトン　１％、Ｋ２ＨＰ０．０．１
％、ＮａＮ０＝　０．５％、Ｍ８ＳＯ，−７８２００，
０５％、Ｍ　ｎ　Ｃ＋　２−４８２００．０２％を含む
ｐＨ７，０の培地１００ｍ１を５００ｍ１容坂ロフルペ
ンに分注し、１２０℃で１５分間加熱滅菌した。冷却後
、シュードモナス・フルオレッセンスＭＺ　Ｎｏ。

９４９を１白金耳植菌し、２７℃で４日間振とう培養し
た。

培養終了後、遠心分離して培養液から菌体を除き、粗酵
素液を得た。その酵素活性は１ｓｏｏｏ単位／１００ｍ
１であり、β−７ラクトシグーゼの混在は認められなか
った。

比較のためシュードモナス菌にかえてアースロバフタ−
・ウレアファシェンスを用い、他は同様にして得られた
粗酵素液の酵素活性は、５０単位／１００＠ｌであった
。

実施例　２ イヌリンにかえて同量のレバンを含有させた培地を用い
たほかは実施例１と同様にして、粗酵素液を得た。その
酵素活性は１８０００単位／１００ｍ１であり、β−７
ラクトシダーゼの混在は認められなかった。

比較のためシュードモナス菌にかえてアースロバフタ−
・ウレアファシェンスを用い、他は同様にして得られた
粗酵素液の酵素活性は、５０単位／１００ｍ１であった
。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）フラクトースのポリマーを含有する培地を用いて
   シュードモナス属に属するイヌリンフラクトトランスフ
   ェラーゼ生産菌を培養し、培養物からイヌリンフラクト
   トランスフェラーゼを採取することを特徴とするイヌリ
   ンフラクトトランスフェラーゼの製造法。
2. （２）イヌリンフラクトトランスフェラーゼ生産菌とし
   てシュードモナス・フルオレッセンスＭＺＮｏ．９４９
   （微工研菌寄第９２３５号）を用いる特許請求の範囲第
   １項記載の製造法。
3. （３）フラクトースのポリマーとしてイヌリンまたはレ
   バンを含有する培地を用いる特許請求の範囲第１項記載
   の製造法。