JPS63196299A - 融合蛋白質 - Google Patents
融合蛋白質Info
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- JPS63196299A JPS63196299A JP62052829A JP5282987A JPS63196299A JP S63196299 A JPS63196299 A JP S63196299A JP 62052829 A JP62052829 A JP 62052829A JP 5282987 A JP5282987 A JP 5282987A JP S63196299 A JPS63196299 A JP S63196299A
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Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は融合蛋白質の構築に関する。
Ｂ型肝炎ウィルスは、一部二本鎖の３２００ヌクレオチ
ドのゲノムを有するＤＮＡウィル′スである。このウィ
ルスＤＮＡはそのウィルス ゛コードされるコア抗原（
ＨＢｃＡｑ）によって囲まれ、このコア抗原は同様にコ
ードされる表面抗原によッテ包まれている（Ｒｏｂｉｎ
ｓｏｎ、 １９７７ ） 、界面活性剤で軽く処理して
表面抗原を除去すると、ＨＢｃＡｇとウィルスＤＮＡか
らなる直径２７ｎ１１のコア粒子が残る。これまでに、
ＨＢｃＡｑは天然のポリペプチドの形でまたβ−ガラク
トシダーゼの末端の８個の残基に融合した誘導体として
、微生物ｌｌＩ胞中で発現されている（ ｈｕｒｒａｙ
ほか、１９８４）。
ドのゲノムを有するＤＮＡウィル′スである。このウィ
ルスＤＮＡはそのウィルス ゛コードされるコア抗原（
ＨＢｃＡｑ）によって囲まれ、このコア抗原は同様にコ
ードされる表面抗原によッテ包まれている（Ｒｏｂｉｎ
ｓｏｎ、 １９７７ ） 、界面活性剤で軽く処理して
表面抗原を除去すると、ＨＢｃＡｇとウィルスＤＮＡか
らなる直径２７ｎ１１のコア粒子が残る。これまでに、
ＨＢｃＡｑは天然のポリペプチドの形でまたβ−ガラク
トシダーゼの末端の８個の残基に融合した誘導体として
、微生物ｌｌＩ胞中で発現されている（ ｈｕｒｒａｙ
ほか、１９８４）。
Ｅ、 ｃｏｌｉ中で合成させると、コア蛋白質は自分で
会合して２７ｎｉの粒子を形成し、これは電子顕微ａｔ
−ｉｕ察でき（Ｃｏｈｅｎ ＆ Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、
１９８２ ）、実験動物に対し免疫原性を示ず（５ｔａ
ｈｌほか、１９８２）。コア抗原のアミノ酸配列は、そ
のカルボキシ末端の近くに、プロタミン（ＤＮＡ結合蛋
白質）に見出される領域と相同性の領域を示す。
会合して２７ｎｉの粒子を形成し、これは電子顕微ａｔ
−ｉｕ察でき（Ｃｏｈｅｎ ＆ Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、
１９８２ ）、実験動物に対し免疫原性を示ず（５ｔａ
ｈｌほか、１９８２）。コア抗原のアミノ酸配列は、そ
のカルボキシ末端の近くに、プロタミン（ＤＮＡ結合蛋
白質）に見出される領域と相同性の領域を示す。
推論の結果、コア粒子の会合時にその分子の上記領域部
分がＤＮＡと相互作用するのではないかと考エラれてき
た（ Ｐａ５ｅｋほか、１９７９）。
分がＤＮＡと相互作用するのではないかと考エラれてき
た（ Ｐａ５ｅｋほか、１９７９）。
本発明者らは、以前に、***ウィルス（ＦＭＤＶ）の
免疫原性エピトープが、β−ガラクトシダーゼへの融合
蛋白質として、細菌系でまた組換えワクシニアウィルス
感染細胞中において、発現可能であることを示している
（ Ｗｉｎｔｈｅｒほか、１９８６ ； Ｎｅｗｔｏｎ
ほか、１９８６）、β−ガラクトシダーゼの活性型は四
ｍ体として存在するので、融合の形式は各複合体ごとに
ＦＭＤＶ配列の４個のコピーのみが存在するものであっ
たが、これらは融合蛋白質の重量の約２％であるにすぎ
ない。
免疫原性エピトープが、β−ガラクトシダーゼへの融合
蛋白質として、細菌系でまた組換えワクシニアウィルス
感染細胞中において、発現可能であることを示している
（ Ｗｉｎｔｈｅｒほか、１９８６ ； Ｎｅｗｔｏｎ
ほか、１９８６）、β−ガラクトシダーゼの活性型は四
ｍ体として存在するので、融合の形式は各複合体ごとに
ＦＭＤＶ配列の４個のコピーのみが存在するものであっ
たが、これらは融合蛋白質の重量の約２％であるにすぎ
ない。
さらに、組換えワクシニアウィルスを予防接種した動物
に中和抗体を産生ずることもできなかった（ Ｎｅｗｔ
ｏｎはか、１９８６）、この貧弱な応答の理由はβ−ガ
ラクトシダーゼが細胞質中に発現することにあると考え
られる。
に中和抗体を産生ずることもできなかった（ Ｎｅｗｔ
ｏｎはか、１９８６）、この貧弱な応答の理由はβ−ガ
ラクトシダーゼが細胞質中に発現することにあると考え
られる。
免疫系に封するＦＭＤＶエピトープの表出を改善するた
めに、本発明者らはＦＭ［）Ｖ配列をＨＢｃＡｇに融合
した。それぞれ）−Ｉ Ｂ ｃ Ａ ａのアミノ末端に
ＦＭＤＶ ＶＰ１残基１４１〜１６０を連結した融合
蛋白質をコードするＤＮＡ配列を構築した。融合遺伝子
配列をワクシニアウィルスゲノム中に導入した。この組
換えウィルスで感染させた細胞は上述の融合蛋白質を強
力に発現した。
めに、本発明者らはＦＭ［）Ｖ配列をＨＢｃＡｇに融合
した。それぞれ）−Ｉ Ｂ ｃ Ａ ａのアミノ末端に
ＦＭＤＶ ＶＰ１残基１４１〜１６０を連結した融合
蛋白質をコードするＤＮＡ配列を構築した。融合遺伝子
配列をワクシニアウィルスゲノム中に導入した。この組
換えウィルスで感染させた細胞は上述の融合蛋白質を強
力に発現した。
この組換え蛋白質は粒子構造に自己会合した。これらは
高密度の外部に露出したＦ Ｍ Ｄ Ｖエピトープを有
する。この方法でＦＭＤＶエピトープを発現することに
より、それをよりウィルス様の形態で提供することが可
能になる。
高密度の外部に露出したＦ Ｍ Ｄ Ｖエピトープを有
する。この方法でＦＭＤＶエピトープを発現することに
より、それをよりウィルス様の形態で提供することが可
能になる。
抗原エピトープを免疫系に表出させるためのこのアプロ
ーチは一般的適用性を有する。したがって、本発明は、
ＨＢＣＡＧのアミノ末端に非対応抗原エピトープが連結
されている融合蛋白質をコ−ドするＤＮＡ配列を提供す
るものである。
ーチは一般的適用性を有する。したがって、本発明は、
ＨＢＣＡＧのアミノ末端に非対応抗原エピトープが連結
されている融合蛋白質をコ−ドするＤＮＡ配列を提供す
るものである。
融合蛋白質の発現のためには、ＤＮＡ配列を発現ベクタ
ー中に導入する。ＤＮＡ配列は、適当な原核生物または
真核生物中に供給した場合、融合蛋白質を発現できるベ
クターを与えるようにベクター中に導入する。ベクター
はプラスミドであってもよい。また、ベクターはＤＮＡ
配列が組込まれたウィルスベクターで、そのベクターで
感染させた細胞によって融合蛋白質が発現されるように
することも可能である。融合蛋白質は粒子の形態で得ら
れる。融合蛋白質はワクチンとして使用される。すなわ
ら、ワクチンは、融合蛋白質と生理的に許容される担体
または希釈剤から構成される。
ー中に導入する。ＤＮＡ配列は、適当な原核生物または
真核生物中に供給した場合、融合蛋白質を発現できるベ
クターを与えるようにベクター中に導入する。ベクター
はプラスミドであってもよい。また、ベクターはＤＮＡ
配列が組込まれたウィルスベクターで、そのベクターで
感染させた細胞によって融合蛋白質が発現されるように
することも可能である。融合蛋白質は粒子の形態で得ら
れる。融合蛋白質はワクチンとして使用される。すなわ
ら、ワクチンは、融合蛋白質と生理的に許容される担体
または希釈剤から構成される。
Ｂ型肝炎ウィルスの中心でのＤＮＡ相互作用にお番プる
ＨＢＣ／’ｌのカルボキシ末端の明らかな関与から予想
されるように、非対応エピトープはＨＢｃΔｑのアミノ
末端に融合する。エピトープはＨＢ ＣＡ ｇに直接融
合してもよい。また別法として、非対応エピトープは中
間リンカ−を介してＨＢｃＡｇに融合させることもでき
る。このようなリンカ−は、１個または２個以上、たと
えば１０個までのアミノ酸残基で構成されるものであっ
てもよい。通常ＨＢｃＡｇのアミノ末端の直前に位置す
るブレコアＨＢＣＡＧＩシグナルアミノ酸配列は、した
がって融合蛋白質から除かれてもよいし、またその一部
がリンカ−を構成してもよい。
ＨＢＣ／’ｌのカルボキシ末端の明らかな関与から予想
されるように、非対応エピトープはＨＢｃΔｑのアミノ
末端に融合する。エピトープはＨＢ ＣＡ ｇに直接融
合してもよい。また別法として、非対応エピトープは中
間リンカ−を介してＨＢｃＡｇに融合させることもでき
る。このようなリンカ−は、１個または２個以上、たと
えば１０個までのアミノ酸残基で構成されるものであっ
てもよい。通常ＨＢｃＡｇのアミノ末端の直前に位置す
るブレコアＨＢＣＡＧＩシグナルアミノ酸配列は、した
がって融合蛋白質から除かれてもよいし、またその一部
がリンカ−を構成してもよい。
非対応エピトープのアミノ末端には、翻訳開始コドンに
相当するＭｅｔＴＡ基の前に１個または２個以上のアミ
ノ酸残基が存在してもよい。
相当するＭｅｔＴＡ基の前に１個または２個以上のアミ
ノ酸残基が存在してもよい。
任意の非対応抗原エピトープがＨＢｃＡｇに融合できる
。非対応の語は、それがＨ８ｃＡａのエピトープ以外の
エピトープであることを意味する。
。非対応の語は、それがＨ８ｃＡａのエピトープ以外の
エピトープであることを意味する。
エピトープの大きさは４個から２６個までのアミノ酸残
塁であってよ°い。２種またはそれ以上の非対応抗原エ
ピトープを付与することもできる。この方法で、多価ワ
クチンを得ることができる。
塁であってよ°い。２種またはそれ以上の非対応抗原エ
ピトープを付与することもできる。この方法で、多価ワ
クチンを得ることができる。
非対応エピトープにはウィルス、細菌または原生動物の
エピトープが使用できる。ウィルスエピトープの例とし
ては、ＦＭＤＶ、ポリオウィルス、ヒトライノウィルス
、インフルエンザウィルスおよびＢ型肝炎表面抗原（Ｈ
ＢｓＡｏ）を挙げることができる。エピトープを使用で
きる原生動物には、マラリア寄生虫Ｐｌａｓｇｉｏｄｉ
ｕｉ ｆａｌｃｉ ａｒｕｍが包含される。
エピトープが使用できる。ウィルスエピトープの例とし
ては、ＦＭＤＶ、ポリオウィルス、ヒトライノウィルス
、インフルエンザウィルスおよびＢ型肝炎表面抗原（Ｈ
ＢｓＡｏ）を挙げることができる。エピトープを使用で
きる原生動物には、マラリア寄生虫Ｐｌａｓｇｉｏｄｉ
ｕｉ ｆａｌｃｉ ａｒｕｍが包含される。
主要ＥＭＤＶ抗原部位は、ＶＰ１カプシド蛋白質のアミ
ノ酸残基１４１〜１６０および２００〜２１３に相当す
る。したがって、アミノ酸残基のこれらの配列のいずれ
かまたは置台で、非対応抗原エピトープを構成してもよ
い。これらの配列の部分、たとえば残基１４２〜１４５
．１４６〜１５１．１４２〜１５１または１４２〜１６
０もまた抗原部位とすることができる。ＥＭＤＶ Ｏ
１型（にａｕｆｂｅｕｒｅｎ）のＶＰ１アミノ酸残基１
４２〜１６０を導入する適当なりＮＡ構成体、およびそ
の相当するアミノ酸配列を一文字記号で以下に示す。
ノ酸残基１４１〜１６０および２００〜２１３に相当す
る。したがって、アミノ酸残基のこれらの配列のいずれ
かまたは置台で、非対応抗原エピトープを構成してもよ
い。これらの配列の部分、たとえば残基１４２〜１４５
．１４６〜１５１．１４２〜１５１または１４２〜１６
０もまた抗原部位とすることができる。ＥＭＤＶ Ｏ
１型（にａｕｆｂｅｕｒｅｎ）のＶＰ１アミノ酸残基１
４２〜１６０を導入する適当なりＮＡ構成体、およびそ
の相当するアミノ酸配列を一文字記号で以下に示す。
ＴＴＴＴＴＴＴＣＴ八ＴＧＣＴ＾ＴＡへＡＴＧＡＡＴＴ
ＣＡＧＣＴＰ１１にプロモーター
ＨＮＳＡＣＣＧ＾＾ＣＣＴＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＴ
ＧＣＡＧＧＴＴＣＴＧＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬ ［ＶＰＩ ＧＣＴＣＡＧＡＡＡＧＴＴＧＣＴＣＧＴＡＣＣＣＴＧＣ
ＣＧＧＧＡ八〇ＫＶＡＲ丁ＬＰＧ ＶＰ１］ ［ ＧＣＴＣＣＧＧＡＴＣＣＧへＧＣＧＣＣＣＴＴαＧＧＴ
ＧＧＣ丁■Ａ Ｐ Ｄ−Ｐ Ｒ八
ＬＧＷＬリンカ−］［ ＴＧＧＧＧＣ＾ＴＧＧＡＣ＾ＴＴＧ八ＣＣＣＴＴ＾■＾
＾八ＧＡＡＷへ１４ＯｒＯＰへＫＥ Ｂ型肝炎コア抗原 Ｔ Ｔ Ｔ −−−−− 融合蛋白質をコードするＤＮＡ配列は、ＨＢｃＡｇをコ
ードするＤＮＡ配列、たとえばＨＢｃＡｏｍ伝子が導入
されているプラスミドに出発して製造できる。融合蛋白
質に包含されるべき非対応抗原エピトープをコードする
ＤＮＡ配列は、ＨＢｃＡａの５′末端に正しい枠組みで
連結される。この融合蛋白質を発現できるベクターは、
融合蛋白質をコードするＤＮＡ配列をベクターの翻訳開
始および停止シグナルの間に導入し、その配列のための
プロモーターを供給することによって製造できる。この
ような発現ベクターで適当な宿主細胞を形質転換すると
、融合蛋白質が産生される。
ＣＡＧＣＴＰ１１にプロモーター
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ＣＧＧＧＡ八〇ＫＶＡＲ丁ＬＰＧ ＶＰ１］ ［ ＧＣＴＣＣＧＧＡＴＣＣＧへＧＣＧＣＣＣＴＴαＧＧＴ
ＧＧＣ丁■Ａ Ｐ Ｄ−Ｐ Ｒ八
ＬＧＷＬリンカ−］［ ＴＧＧＧＧＣ＾ＴＧＧＡＣ＾ＴＴＧ八ＣＣＣＴＴ＾■＾
＾八ＧＡＡＷへ１４ＯｒＯＰへＫＥ Ｂ型肝炎コア抗原 Ｔ Ｔ Ｔ −−−−− 融合蛋白質をコードするＤＮＡ配列は、ＨＢｃＡｇをコ
ードするＤＮＡ配列、たとえばＨＢｃＡｏｍ伝子が導入
されているプラスミドに出発して製造できる。融合蛋白
質に包含されるべき非対応抗原エピトープをコードする
ＤＮＡ配列は、ＨＢｃＡａの５′末端に正しい枠組みで
連結される。この融合蛋白質を発現できるベクターは、
融合蛋白質をコードするＤＮＡ配列をベクターの翻訳開
始および停止シグナルの間に導入し、その配列のための
プロモーターを供給することによって製造できる。この
ような発現ベクターで適当な宿主細胞を形質転換すると
、融合蛋白質が産生される。
したがって、融合蛋白質を発現できるウィルスベクター
は、融合蛋白質をコードするＤＮＡ配列をウィルスのゲ
ノム中の開始および停止シグナルの間に導入し、その配
列のためのプロモーターを供給することによって製造で
きる。通常、これは、（ｉ！ 融合蛋白質をコードす
るＤＮＡ配列を翻訳開始および停止シグナルの間に、プ
モーターの転写制御下に導入さゼたシャトルベクターを
構築し、（ｉｉｌ そのシャトルベクターでトランス
フェクションし、哺乳類細胞をウィルスで感染させ、Ｄ
ＮＡ配列とプロモーターをウィルスゲノムに導入させる
。
は、融合蛋白質をコードするＤＮＡ配列をウィルスのゲ
ノム中の開始および停止シグナルの間に導入し、その配
列のためのプロモーターを供給することによって製造で
きる。通常、これは、（ｉ！ 融合蛋白質をコードす
るＤＮＡ配列を翻訳開始および停止シグナルの間に、プ
モーターの転写制御下に導入さゼたシャトルベクターを
構築し、（ｉｉｌ そのシャトルベクターでトランス
フェクションし、哺乳類細胞をウィルスで感染させ、Ｄ
ＮＡ配列とプロモーターをウィルスゲノムに導入させる
。
ＤＮＡ配列は、ＨＢｃＡｇ遺伝子のすぐ上流に、それと
正しい枠組みで、非対応抗原エピトープをコードするＤ
ＮＡからなる。ＤＮＡ配列およびプロモーターは相同性
組換えによりＣクイルスゲツム中に導入される。したが
って、ウィルスＤＮＡの適当なフランキング配列がシャ
トルベクター中のＤＮＡ配列およびプロモーターのいず
れかの側に与えられる。得られた組換えウィルスによっ
て感染させた細胞により、融合蛋白質が発現する。
正しい枠組みで、非対応抗原エピトープをコードするＤ
ＮＡからなる。ＤＮＡ配列およびプロモーターは相同性
組換えによりＣクイルスゲツム中に導入される。したが
って、ウィルスＤＮＡの適当なフランキング配列がシャ
トルベクター中のＤＮＡ配列およびプロモーターのいず
れかの側に与えられる。得られた組換えウィルスによっ
て感染させた細胞により、融合蛋白質が発現する。
シャトルベクターは通常、プラスミドである。
それは、工程（ｉ）で要求される操作を細菌中、とくに
Ｅ、 ｃｏｌｉ中で実施することを可能にする、細菌起
源の複製からなる。プロモーターは通常ウィルスプロモ
ーターであり、融合蛋白質をコードするＤＮＡが挿入さ
れるゲノムのウィルスに内因性のプロモーターであるこ
とがさらに好ましい。非対応抗原エピトープは一般に、
化学合成および／またはクローニングによって製造され
る。リンカ−ＤＮＡ配列を非対応エピトープと１１Ｂ
ＣＡ Ｑの間に与えることもできる。
Ｅ、 ｃｏｌｉ中で実施することを可能にする、細菌起
源の複製からなる。プロモーターは通常ウィルスプロモ
ーターであり、融合蛋白質をコードするＤＮＡが挿入さ
れるゲノムのウィルスに内因性のプロモーターであるこ
とがさらに好ましい。非対応抗原エピトープは一般に、
化学合成および／またはクローニングによって製造され
る。リンカ−ＤＮＡ配列を非対応エピトープと１１Ｂ
ＣＡ Ｑの間に与えることもできる。
ワクシニアウィルスのシステムが使用できる。
シャトルベクターは、融合蛋白質遺伝子をワクシニアプ
ロモーターの転写制御下に導入することによって構築で
きる。適当なプロモーターはワクシニア１）１１にプロ
モーターである。プロモーターおよび融合蛋白質遺伝子
は、ウィルスの複製に必須ではないワクシニアウィルス
ＤＮＡの側面に位置させる。通常はチミジンキナーゼ（
ＴＫ）のワクシニア遺伝子の側部セグメントが用いられ
る。
ロモーターの転写制御下に導入することによって構築で
きる。適当なプロモーターはワクシニア１）１１にプロ
モーターである。プロモーターおよび融合蛋白質遺伝子
は、ウィルスの複製に必須ではないワクシニアウィルス
ＤＮＡの側面に位置させる。通常はチミジンキナーゼ（
ＴＫ）のワクシニア遺伝子の側部セグメントが用いられ
る。
融合蛋白質遺伝子は翻訳開始および停止シグナルをコー
ドするＤＮＡの間に存在する。
ドするＤＮＡの間に存在する。
ワクシニアプロモーターおよび融合蛋白質遺伝子は、つ
いで、相同性組換えにより、ワクシニアゲノムに挿入さ
れる。これは通常、哺乳類動物の細胞をワクシニアウィ
ルスたとえば−ｙｅｔｈ（ＬＩＳワクチン）株で感染さ
せ、また細胞をシャトルベクターでトランスフェクショ
ンすることにより行われる。挿入部位は、シャトルベク
ターの側部ワクシニアＤＮＡｔ７グメントによって決定
される。
いで、相同性組換えにより、ワクシニアゲノムに挿入さ
れる。これは通常、哺乳類動物の細胞をワクシニアウィ
ルスたとえば−ｙｅｔｈ（ＬＩＳワクチン）株で感染さ
せ、また細胞をシャトルベクターでトランスフェクショ
ンすることにより行われる。挿入部位は、シャトルベク
ターの側部ワクシニアＤＮＡｔ７グメントによって決定
される。
相同性組換えにより、野生型ウィルスの！！！能性ＴＫ
遺伝子は、その中に融合蛋白質遺伝子が包含される非機
能性ＴＫ遺伝子配列によって置換される。得られる組換
えウィルスはＴＫ−で、したがってそれにより選択でき
る。
遺伝子は、その中に融合蛋白質遺伝子が包含される非機
能性ＴＫ遺伝子配列によって置換される。得られる組換
えウィルスはＴＫ−で、したがってそれにより選択でき
る。
抗原エピトープが導入された融合蛋白質は通常、以下に
述べるように、組換えウィルスベクターで感染した細胞
、とくに哺乳類動物中′Ｃ発現させる。
述べるように、組換えウィルスベクターで感染した細胞
、とくに哺乳類動物中′Ｃ発現させる。
融合蛋白質は細胞から常法により、たとえば細胞を分解
しついで遠心分離することによって得られる。融合蛋白
質は細胞内で自己会合して粒子を形成する。これらの粒
子は、Ｂ型肝炎ウィルスを変性させて得られるウィルス
ＤＮＡとトＩＢＧ／’Ｑからなる２７ｎｍコア粒子に酷
似している。非対応エピトープは外側の粒子表面に露出
している。
しついで遠心分離することによって得られる。融合蛋白
質は細胞内で自己会合して粒子を形成する。これらの粒
子は、Ｂ型肝炎ウィルスを変性させて得られるウィルス
ＤＮＡとトＩＢＧ／’Ｑからなる２７ｎｍコア粒子に酷
似している。非対応エピトープは外側の粒子表面に露出
している。
融合蛋白質は他の発現システムを用いても得られる。発
現は他の適当な宿主、原核生物または真核生物中で行う
ことができる。そのためには、たとえば融合蛋白質が内
因性プロテアーゼで分解されず、宿主に対して毒性を示
さない等、適合性のある宿主を選択しなければならない
。このような宿主は、必要ならばルーチンの実験を行い
、本技術分野の熟練者によれば容易に選択できる。本発
明者らはＦＭＤＶ−ＨＢｃＡｇ融合蛋白質をＥ。
現は他の適当な宿主、原核生物または真核生物中で行う
ことができる。そのためには、たとえば融合蛋白質が内
因性プロテアーゼで分解されず、宿主に対して毒性を示
さない等、適合性のある宿主を選択しなければならない
。このような宿主は、必要ならばルーチンの実験を行い
、本技術分野の熟練者によれば容易に選択できる。本発
明者らはＦＭＤＶ−ＨＢｃＡｇ融合蛋白質をＥ。
ｃｏｌｉ中で製造することはできなかった。問題は、本
発明者らが用いたＦＭＤＶ配列の細菌に対する毒性であ
ることが明らかである。ＨＢｃＡｇ自身ばＥ、 ｃｏｌ
ｉ中で安定に発現できる。したがって、制御されるべき
ことは、非対応抗原エピトープからなる余分の配列のＥ
、 ｃｏｌｉに対する効采である。
発明者らが用いたＦＭＤＶ配列の細菌に対する毒性であ
ることが明らかである。ＨＢｃＡｇ自身ばＥ、 ｃｏｌ
ｉ中で安定に発現できる。したがって、制御されるべき
ことは、非対応抗原エピトープからなる余分の配列のＥ
、 ｃｏｌｉに対する効采である。
原生動物宿主としては、Ｅｉ ｃｏｌｉ株が使用できる
。他の使用できる微生物株は、ｂａｃ ｉ ｌ Ｉ ｉ
たとえｍａｒｃｅｓａｎｓである。各種のｐｓｅｕｄｏ
ｎ＋ｏｎａｓ種も使用できる。プラスミドベクターは通
常このような宿主の形質転換に使用できる。プラスミド
は一般に、宿主と適合性のある種から誘導される複製オ
リジンおよび制御配列を含有する。形質転換細胞の表現
型による選択を可能にする標識配列は本来、プラスミド
中に存在する。
。他の使用できる微生物株は、ｂａｃ ｉ ｌ Ｉ ｉ
たとえｍａｒｃｅｓａｎｓである。各種のｐｓｅｕｄｏ
ｎ＋ｏｎａｓ種も使用できる。プラスミドベクターは通
常このような宿主の形質転換に使用できる。プラスミド
は一般に、宿主と適合性のある種から誘導される複製オ
リジンおよび制御配列を含有する。形質転換細胞の表現
型による選択を可能にする標識配列は本来、プラスミド
中に存在する。
を椎動物または非を椎動物、好ましくは咄乳類動物の細
胞が、真核生物宿主細胞系として使用できる。たとえば
、ＶＥＲＯ，ＨｅＬａ、ＣＨＯ（チャイニーズハムスタ
ー卵巣） 、Ｗｌ ３８゜ＢＨＫ、Ｃ０８−７，ＭＤＣ
Ｋおよびｃｖ−ｉのような細胞系が使用できる。このよ
うな細胞の発現ベクターは、＊！ｌのオリジン、発現す
べき遺伝子の上流に位置するプロモーター、および任意
の。
胞が、真核生物宿主細胞系として使用できる。たとえば
、ＶＥＲＯ，ＨｅＬａ、ＣＨＯ（チャイニーズハムスタ
ー卵巣） 、Ｗｌ ３８゜ＢＨＫ、Ｃ０８−７，ＭＤＣ
Ｋおよびｃｖ−ｉのような細胞系が使用できる。このよ
うな細胞の発現ベクターは、＊！ｌのオリジン、発現す
べき遺伝子の上流に位置するプロモーター、および任意
の。
必要なリポソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポ
リアゾニレ−ジョン部位および転写ターミネータ−配列
を一般に含有する。ウィルスプロモーターを使用するの
が好ましい。上述のウィルスベクター、たとえばバクロ
ウィルス発現システムが使用できる。
リアゾニレ−ジョン部位および転写ターミネータ−配列
を一般に含有する。ウィルスプロモーターを使用するの
が好ましい。上述のウィルスベクター、たとえばバクロ
ウィルス発現システムが使用できる。
酵母培養物のような真核生物微生物も別法として宿主細
胞に使用できる。したがって、５ａｃｃｈａｒｏｌｃｅ
ｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株も使用できる。プラスミド
ＹＲｐ７のようなプラスミドベクターがこのような宿主
の形質転換に通常利用される。酵母適合性プロモーター
、複製オリジンおよび終結配列を含有する任意のプラス
ミドベクターが適当である。
胞に使用できる。したがって、５ａｃｃｈａｒｏｌｃｅ
ｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株も使用できる。プラスミド
ＹＲｐ７のようなプラスミドベクターがこのような宿主
の形質転換に通常利用される。酵母適合性プロモーター
、複製オリジンおよび終結配列を含有する任意のプラス
ミドベクターが適当である。
融合蛋白質はヒトまたは動物のワクチンとして使用でき
る。任意の適当な方式で投与できる。経口投与、または
皮下、静脈内もしくは筋肉内投与のような非経口投与が
任意に選択でき、用けは予防接種の目的、ヒトか動物か
の対象等によって変動する。ワクチンの製造に使用され
る生理的に許容される担体または希釈剤にも類似の基準
がある。
る。任意の適当な方式で投与できる。経口投与、または
皮下、静脈内もしくは筋肉内投与のような非経口投与が
任意に選択でき、用けは予防接種の目的、ヒトか動物か
の対象等によって変動する。ワクチンの製造に使用され
る生理的に許容される担体または希釈剤にも類似の基準
がある。
慣用される剤型では、担体または希釈剤が使用される。
しかしながら、通常は、融合蛋白質を１回１０〜１００
０μり、好ましくは１回１０〜１００μび、経口または
非経口いずれかの経路で投与する。
０μり、好ましくは１回１０〜１００μび、経口または
非経口いずれかの経路で投与する。
次に本発明を以下の実施例により、さらに例示する。
健
本発明者に記載の融合蛋白質を構築するために２種のク
ローンを使用した。Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）を
提供するクローンは、Ｐ。
ローンを使用した。Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）を
提供するクローンは、Ｐ。
旧ｇＭｉｅｌｄ博士から入手した（ｐＷＲＬ ３１２
３＝英国、ＮＧＩＢに寄託し、受託番号ＮＣｌＢ１２４
２３が付与されている）。このクローンはアミノ末端を
、それが細菌内でＥ、 ｃｏｌｉ蛋白質ＴＲＰ Ｅに
対する融合蛋白質として発現できるように修飾されてい
る。
３＝英国、ＮＧＩＢに寄託し、受託番号ＮＣｌＢ１２４
２３が付与されている）。このクローンはアミノ末端を
、それが細菌内でＥ、 ｃｏｌｉ蛋白質ＴＲＰ Ｅに
対する融合蛋白質として発現できるように修飾されてい
る。
０１ ＫａｕｒｂｅｕｒｅｎからのＦＭＤＶ １４２
〜１６０を提供し、それがβ−ガラクトシダーゼのアミ
ノ末端に連結している第二のクローンは、Ｈ０Ｗｉｎｔ
ｈｅｒｌ１士から入手用した（ｐＷＲＬ ２０１）（
ｗｉｎｔｈｅｒほか：１９８６）、各クローンの制限酵
素地図を第１図に示１゜第１図から明らかなように、Ｆ
ＭＤＶ配列とβ−ガラクトシダーゼの間の結合部は３ａ
ｍＨＩ制限酵素部位からなっている。したがって、この
Ｂ ａ ｍ ＨＩ部位によって、ＦＭＤＶ配列とＨＢｃ
Ａｇ配列を融合さぼる計画を採用することとした。
〜１６０を提供し、それがβ−ガラクトシダーゼのアミ
ノ末端に連結している第二のクローンは、Ｈ０Ｗｉｎｔ
ｈｅｒｌ１士から入手用した（ｐＷＲＬ ２０１）（
ｗｉｎｔｈｅｒほか：１９８６）、各クローンの制限酵
素地図を第１図に示１゜第１図から明らかなように、Ｆ
ＭＤＶ配列とβ−ガラクトシダーゼの間の結合部は３ａ
ｍＨＩ制限酵素部位からなっている。したがって、この
Ｂ ａ ｍ ＨＩ部位によって、ＦＭＤＶ配列とＨＢｃ
Ａｇ配列を融合さぼる計画を採用することとした。
したがって、構築の最初の段階は、ｐＷＲＬ３１２３の
ＨＢＣＡＧ遺伝子の５′末端にＢ ａ ｍ ｌ−Ｉ Ｉ
のための合成オリゴヌクレオチドリンカーを挿入するこ
とであった。このリンカ−の挿入に使用された部位は位
２ｆ２９０のＮａｒＩ部位であった。しかしながら、こ
のプラスミドには、位置１２３０に第二のＮａｒ工部位
も存在した。
ＨＢＣＡＧ遺伝子の５′末端にＢ ａ ｍ ｌ−Ｉ Ｉ
のための合成オリゴヌクレオチドリンカーを挿入するこ
とであった。このリンカ−の挿入に使用された部位は位
２ｆ２９０のＮａｒＩ部位であった。しかしながら、こ
のプラスミドには、位置１２３０に第二のＮａｒ工部位
も存在した。
したがって、このプラスミドをＮａｒＩで部分消化し、
一方のＮａｒＩ部位のみで切断されたプラスミド分子の
集団がアガロースゲル電気泳動で観察され、精製できる
ようにした。ＤＮＡポリメラーゼ■のクレノーフラグメ
ントを用いてＮａｒ■部位を平滑末端としたのち、Ｂａ
ｍＨＩ部位を供給する合成オリゴヌクレオチドリンカー
を部分ＮａｒＩ消化体にリゲートさせ、生成したプラス
ミドをＥ、 ｃｏｌｉの形質転換に使用した。ついで、
クローンについて、制限酵素地図の作成により、正しい
Ｎａｒ工部位におけるＢａｍＨＩリンカ−の存在につい
て解析した。
一方のＮａｒＩ部位のみで切断されたプラスミド分子の
集団がアガロースゲル電気泳動で観察され、精製できる
ようにした。ＤＮＡポリメラーゼ■のクレノーフラグメ
ントを用いてＮａｒ■部位を平滑末端としたのち、Ｂａ
ｍＨＩ部位を供給する合成オリゴヌクレオチドリンカー
を部分ＮａｒＩ消化体にリゲートさせ、生成したプラス
ミドをＥ、 ｃｏｌｉの形質転換に使用した。ついで、
クローンについて、制限酵素地図の作成により、正しい
Ｎａｒ工部位におけるＢａｍＨＩリンカ−の存在につい
て解析した。
ｐＥＢ ２０８と命名されたこのようなりローンを単
離し、ＤＮＡを調整した。３８ｍＨＩリンカーの長さは
、ｐＷＲＬ ２０１ （第１図）のＦＭＤＶ部分にリ
ゲートしたとき、翻訳読み取り枠が連続性であり、融合
蛋白質が産生されるように特異的に選択された。Ｂａｍ
ＨＩリンカ−の挿入に伴って、それが挿入されたＮａｒ
Ｉ部位は破壊された。したがって、ｐＥＢ ２０８か
らのＢａｍＨＩ−Ｎａｒ■消化によるＨＢｃＡｇ配列の
除去が可゛能であり、９４０塩基のＤＮＡフラグメント
が得られた。同様にして、ｐＷＲＬ ２０１からの約
３．５キロ塩基のＢａｍＨＩ−ＮａｒＩフラグメントを
精製した。これらの２個の７ラグメントをたがいに連結
し、正しいクローン（ＤＦＯＨｃ）を制限酵素地図法で
同定した。
離し、ＤＮＡを調整した。３８ｍＨＩリンカーの長さは
、ｐＷＲＬ ２０１ （第１図）のＦＭＤＶ部分にリ
ゲートしたとき、翻訳読み取り枠が連続性であり、融合
蛋白質が産生されるように特異的に選択された。Ｂａｍ
ＨＩリンカ−の挿入に伴って、それが挿入されたＮａｒ
Ｉ部位は破壊された。したがって、ｐＥＢ ２０８か
らのＢａｍＨＩ−Ｎａｒ■消化によるＨＢｃＡｇ配列の
除去が可゛能であり、９４０塩基のＤＮＡフラグメント
が得られた。同様にして、ｐＷＲＬ ２０１からの約
３．５キロ塩基のＢａｍＨＩ−ＮａｒＩフラグメントを
精製した。これらの２個の７ラグメントをたがいに連結
し、正しいクローン（ＤＦＯＨｃ）を制限酵素地図法で
同定した。
第１図から明らかなように、Ｄ Ｆ ＯＨＣは細菌細胞
中で、ｔａｃプロモーターの制御下に発現させることが
できる。ハイブリッド遺伝子のワタシニアウイルス（Ｖ
Ｖ）シャトルベクターへの輸送を容易にするためには、
プラスミド１）ＦＯｔ−１ｃを１個のＮａｒＩ部位で切
断し、合成リンカ−として第二のＥＣｏＲＩ部位を導入
した。これにより、完全なハイブリッド遺伝子がＥＣ０
ＲＩフラグメントとして単離可能になった。
中で、ｔａｃプロモーターの制御下に発現させることが
できる。ハイブリッド遺伝子のワタシニアウイルス（Ｖ
Ｖ）シャトルベクターへの輸送を容易にするためには、
プラスミド１）ＦＯｔ−１ｃを１個のＮａｒＩ部位で切
断し、合成リンカ−として第二のＥＣｏＲＩ部位を導入
した。これにより、完全なハイブリッド遺伝子がＥＣ０
ＲＩフラグメントとして単離可能になった。
ＶｖラシャルベクターはｖＶ配列の欠失によりベクター
ｐＨ３ＪΔＲ１Ａ （Ｎｅｗｔｏｎはか：１９８６）か
ら誘導したｐＶｐｌｌにとした。このシャトルベクター
はｖ■チミジンキナーゼ（ＴＫ）３Ｗ伝子内に挿入され
た■ｖプロモーター（この場合はｐｌｌｋ）を有する。
ｐＨ３ＪΔＲ１Ａ （Ｎｅｗｔｏｎはか：１９８６）か
ら誘導したｐＶｐｌｌにとした。このシャトルベクター
はｖ■チミジンキナーゼ（ＴＫ）３Ｗ伝子内に挿入され
た■ｖプロモーター（この場合はｐｌｌｋ）を有する。
このベクターはｖｖｐｌｌにプロモーターおよびＡＵＧ
のすぐ次に唯一のＥｃｏＲＩ部位を有する（ Ｂｅｒｔ
ｈｏｌｅｔほか：１９８５）。ＥＣｏＲＩ部位およびＡ
ＵＧはｐＦＯＨｃ中のハイブリッド遺伝子のアミノ末端
ＥＣ０ＲＩ部位として同じ翻訳読み取り枠内にある。し
たがッテ、ＦＭＤＶ−ＨＢｃＡＱ遺伝子ハ、ＥＣ０ＲＩ
切断脱ホスホリル化ｐｖｐ１１に中にＥＣ０ＲＩフラグ
メントとして挿入された。ｐｌｌにプロモーターに対し
て方向性の正しいハイブリッド遺伝子をもつクローンを
制限Ｗｊ累培地図法よって同定した。このクローンはｐ
ｖＦＯＨｃと命名された（第２図）。
のすぐ次に唯一のＥｃｏＲＩ部位を有する（ Ｂｅｒｔ
ｈｏｌｅｔほか：１９８５）。ＥＣｏＲＩ部位およびＡ
ＵＧはｐＦＯＨｃ中のハイブリッド遺伝子のアミノ末端
ＥＣ０ＲＩ部位として同じ翻訳読み取り枠内にある。し
たがッテ、ＦＭＤＶ−ＨＢｃＡＱ遺伝子ハ、ＥＣ０ＲＩ
切断脱ホスホリル化ｐｖｐ１１に中にＥＣ０ＲＩフラグ
メントとして挿入された。ｐｌｌにプロモーターに対し
て方向性の正しいハイブリッド遺伝子をもつクローンを
制限Ｗｊ累培地図法よって同定した。このクローンはｐ
ｖＦＯＨｃと命名された（第２図）。
このシャトルプラスミドをついで、ｐｌｌにプロモータ
ーの制御下に、隣接するＴＫ配列を用いた相同性組換え
により、ｖｖのＷｙｅｔｈ （ＬＪ Ｓワクチン）株
のゲノム中に挿入した（ Ｈａｃｋｅｔｔほか；１９８
５ ａおよびｂ）。ＴＫ−表現型を有する各プロゲ二
一ブラークをドツトプロットハイブリダイゼーションに
より、ＦＭＤ−ＨＢＣＡＧＩＤＮＡの存在についてスク
リーニングした。
ーの制御下に、隣接するＴＫ配列を用いた相同性組換え
により、ｖｖのＷｙｅｔｈ （ＬＪ Ｓワクチン）株
のゲノム中に挿入した（ Ｈａｃｋｅｔｔほか；１９８
５ ａおよびｂ）。ＴＫ−表現型を有する各プロゲ二
一ブラークをドツトプロットハイブリダイゼーションに
より、ＦＭＤ−ＨＢＣＡＧＩＤＮＡの存在についてスク
リーニングした。
野生型１ｙｅｔｈ ）および組換え体（ｖ Ｆ ＯＩ−
１ｃ ）感染細胞からのＣＶ−ＩＩＩ胞分解物を、サン
ドイッチＥＬＩＳＡにより、コア抗原およびＦＭＤＶ配
列の存在についてスクリーニングした。感染細胞からの
抗原を、ＦＭＤウィルス粒子（１４６８）またはウサギ
に誘発したＦＭＤ ＶＰｌ １４１〜１６０抗血清
のいずれかを用いてＥＬＩＳＡプレートに結合させた。
１ｃ ）感染細胞からのＣＶ−ＩＩＩ胞分解物を、サン
ドイッチＥＬＩＳＡにより、コア抗原およびＦＭＤＶ配
列の存在についてスクリーニングした。感染細胞からの
抗原を、ＦＭＤウィルス粒子（１４６８）またはウサギ
に誘発したＦＭＤ ＶＰｌ １４１〜１６０抗血清
のいずれかを用いてＥＬＩＳＡプレートに結合させた。
捕集された抗原のそれぞれについて、次に、それぞれの
モルモット抗血清との結合および抗モツトバーオキシダ
ーゼ抱合体による展開で、ＨＢＣ，ＦＭＤ １４６８
またはＦＭＤ ｖＰｌ １４２〜１６０エピトープの存
在を調べた。結果を第３図に示す。第３図から明らかな
ように、（ｖＦＯＨｃ）感染細胞分解物からの蛋白質組
換え体を、抗ＦＭＤＶ １４１〜１６０抗°血清で捕
集し、ついでこの蛋白質を抗ＨＢＧ、抗ＦＭＤｖ １４
１〜１６０およびＦＭＤＶ抗ピリオン血清と、サンドイ
ッチＥＬＩＳＡで反応させることができた。
モルモット抗血清との結合および抗モツトバーオキシダ
ーゼ抱合体による展開で、ＨＢＣ，ＦＭＤ １４６８
またはＦＭＤ ｖＰｌ １４２〜１６０エピトープの存
在を調べた。結果を第３図に示す。第３図から明らかな
ように、（ｖＦＯＨｃ）感染細胞分解物からの蛋白質組
換え体を、抗ＦＭＤＶ １４１〜１６０抗°血清で捕
集し、ついでこの蛋白質を抗ＨＢＧ、抗ＦＭＤｖ １４
１〜１６０およびＦＭＤＶ抗ピリオン血清と、サンドイ
ッチＥＬＩＳＡで反応させることができた。
さらに、この蛋白質が超遠心によって精製できたことは
、それが木質的に粒子であることを示唆した。これは遠
心分離生成物シュークロース密度勾配上に沈降させ、各
分画についてコア抗原の存在をＥＬＩＳＡで再試験する
とざらに明瞭に示された。天然コア抗原を発現する組換
え （ｖＦＯＨｃ）ワタシニアウイルス感染ＩＩｌ胞または
細菌からの細胞分解物を１５〜４５％シュクロース勾配
で分画した。各分画について、コア反応性物質の存在を
、捕集抗体としてヒト抗コア血清、検出用にモルモット
ＨＢＣ抗原抗血清を用いた間接サンドイッチＥＬＩＳＡ
によって調べた。結果を第４図に示す。ＦＭＤウィルス
が沈降した位置も示しである。第４図はＨＢＣＡ！；）
反応性物質のピークが、細菌中で発現したコア粒子を平
行して遠心分離したときに認められたのと同じ位置に観
察された。すなわち、ＦＭＤＶ ｖＰ１１４２〜１６０配列の存在はコア粒子の粒子形成
性を妨害しないことを示している。
、それが木質的に粒子であることを示唆した。これは遠
心分離生成物シュークロース密度勾配上に沈降させ、各
分画についてコア抗原の存在をＥＬＩＳＡで再試験する
とざらに明瞭に示された。天然コア抗原を発現する組換
え （ｖＦＯＨｃ）ワタシニアウイルス感染ＩＩｌ胞または
細菌からの細胞分解物を１５〜４５％シュクロース勾配
で分画した。各分画について、コア反応性物質の存在を
、捕集抗体としてヒト抗コア血清、検出用にモルモット
ＨＢＣ抗原抗血清を用いた間接サンドイッチＥＬＩＳＡ
によって調べた。結果を第４図に示す。ＦＭＤウィルス
が沈降した位置も示しである。第４図はＨＢＣＡ！；）
反応性物質のピークが、細菌中で発現したコア粒子を平
行して遠心分離したときに認められたのと同じ位置に観
察された。すなわち、ＦＭＤＶ ｖＰ１１４２〜１６０配列の存在はコア粒子の粒子形成
性を妨害しないことを示している。
融合蛋白質が、正規の２７ｎｍのコア様粒子に自己会合
する能力は、シュクロース勾配精製物質とで形成した免
疫複合体の電子顕微鏡による検査で確認された。
する能力は、シュクロース勾配精製物質とで形成した免
疫複合体の電子顕微鏡による検査で確認された。
この複合体は、ＦＭＤＶ−ＨＢｃＡａ粒子と、無傷の口
蹄疫ウィルスによって励起させた抗血清との反応よって
形成された。この複合体は吸着されて被覆されたグリッ
ドを形成し、リンタングステン酸で染色されなかった。
蹄疫ウィルスによって励起させた抗血清との反応よって
形成された。この複合体は吸着されて被覆されたグリッ
ドを形成し、リンタングステン酸で染色されなかった。
第３図に示したＥＬＩＳＡのデータから期待されたよう
に、粒子１：、 ＨＢ ｃ Ａ Ｑ ＊ タＬｔ合成１
ｅＭＤＶへ７チｔ’ １４１〜１６０に対する抗血清と
の反応後にも免疫複合体が認められた。
に、粒子１：、 ＨＢ ｃ Ａ Ｑ ＊ タＬｔ合成１
ｅＭＤＶへ７チｔ’ １４１〜１６０に対する抗血清と
の反応後にも免疫複合体が認められた。
最後に、野生型ワクシニアウィルスまたはｖＦＯＨＣで
感染したｃｖ−’ｒｍ胞中に合成されたポリペプチドの
性質を、細胞の３５ｓ−メチオニン標識で、また細胞上
澄液のＨＢｃＡａ反応性血清およびＰＡＧＥによる免疫
沈降で解析した。感染ａｍは３５Ｓ−メチオニンで１時
間パルスＩ？ｉ識を行い、総細胞分解物を調整した。標
識蛋白質の免疫沈降はワクシニアウィルス抗血清（Ａ、
Ｄ）、ヒトＨｅ ｌ）Ｂ抗血清（Ｂ、Ｅ）またはモルモ
ットＭＢＣ抗原抗血清（Ｃ，Ｆ）で実施した。ついで沈
殿した蛋白質をＰＡＧＥおよびフルオログラフィーで解
析した。結果を第５図に示す。ＦＭＤＶＶＰｌ １４２
〜１６ｏ−ＨＢｃＡｇ融合蛋白質の位置は矢印で示す。
感染したｃｖ−’ｒｍ胞中に合成されたポリペプチドの
性質を、細胞の３５ｓ−メチオニン標識で、また細胞上
澄液のＨＢｃＡａ反応性血清およびＰＡＧＥによる免疫
沈降で解析した。感染ａｍは３５Ｓ−メチオニンで１時
間パルスＩ？ｉ識を行い、総細胞分解物を調整した。標
識蛋白質の免疫沈降はワクシニアウィルス抗血清（Ａ、
Ｄ）、ヒトＨｅ ｌ）Ｂ抗血清（Ｂ、Ｅ）またはモルモ
ットＭＢＣ抗原抗血清（Ｃ，Ｆ）で実施した。ついで沈
殿した蛋白質をＰＡＧＥおよびフルオログラフィーで解
析した。結果を第５図に示す。ＦＭＤＶＶＰｌ １４２
〜１６ｏ−ＨＢｃＡｇ融合蛋白質の位置は矢印で示す。
第５図に示すように、数種の蛋白質が組換え（ＶＨＯＦ
ｃ）感染細胞の抽出液から、ＨＢＣＡにＪ抗血清により
特異的に沈殿した。これらの蛋白質の２種の（分子ｆｆ
１２５ＫＤおよび２０ＫＤ）は、完全融合蛋白質および
そのカルボキシ末端から蛋白分解消化により５ＫＤフラ
グメントが失われたＦＭＤｖ ｖＰｌ １４２〜１６ｏ
−ＨＢｃＡｇに相当する（ Ｍａｃｋａｙほか：１９８
１）。
ｃ）感染細胞の抽出液から、ＨＢＣＡにＪ抗血清により
特異的に沈殿した。これらの蛋白質の２種の（分子ｆｆ
１２５ＫＤおよび２０ＫＤ）は、完全融合蛋白質および
そのカルボキシ末端から蛋白分解消化により５ＫＤフラ
グメントが失われたＦＭＤｖ ｖＰｌ １４２〜１６ｏ
−ＨＢｃＡｇに相当する（ Ｍａｃｋａｙほか：１９８
１）。
文ｒ
Ｂｅｒｔｈｅｌｏｔ ｅｔ ａｌ （１９８５） ＰＮ
ＡＳ ８２２０９６Ｃｏｈｅｎ ａｎｄ Ｒｉｃｈｎ＋
ｏｎｄ （１９８２） Ｎａｔｕｒｅ ２９６６７７−
６７８Ｈａｃｋａｙ ｅｔ ａｌ （１９８１） Ｊ、
Ｈｅｄ、 Ｖｌｒｏｌ ８２３７Ｈａｃｋｅｔ ｅｔ
ａｌ （１９８５ａ） ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ、
ＡＰｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ （ｅｄ
、 ロ、 Ｈ，Ｇｌｏｖｅｒ） ２ １９１［Ｒ
Ｌ Ｐｒｅｓｓ ０ｘｆｏｒｄ Ｎａｃｋｅｔｔ ｅｔ ａｌ （１９８５ｂ） Ｔｅｃ
ｈｎｉＱｕｅｓ −ｉｎ ＧｅｎｅＣｌｏｎｉｎｇ Ｖ
ｏｌ、 ２ Ｈｕｒｒａｙ ｅｔ ａｌ （１９８４） ＥＨＢＯＪ
ｏｕｒｎａｌ ３６４５−６５ＯＮｅｗｔｏｎ ｅｔ
ａｌ （１９８６） Ｖａｃｃｉｎｅｓ ８６： Ｎｅ
ｗＡｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ Ｉ＋＋＋＋＋＋ｕｎｉ
ｚａｔｉｏｎ、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇｔｌａｒｂｏ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、 ３０３−３０９Ｐａｓｅ
ｋ ｅｔ ａｌ、（１９７９） Ｎａｔｕｒｅ ２８２
５７５−５７９Ｒｏｂｉｏｓｏｎ （１９７７） Ａｎ
ｎ、 Ｒｅｖ、 ）ｌｉｃｒｏｂｉａｌ ３１Ｓｔａｈ
ｌ ｅｔ ａｌ （１９８２） Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ
、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ。
ＡＳ ８２２０９６Ｃｏｈｅｎ ａｎｄ Ｒｉｃｈｎ＋
ｏｎｄ （１９８２） Ｎａｔｕｒｅ ２９６６７７−
６７８Ｈａｃｋａｙ ｅｔ ａｌ （１９８１） Ｊ、
Ｈｅｄ、 Ｖｌｒｏｌ ８２３７Ｈａｃｋｅｔ ｅｔ
ａｌ （１９８５ａ） ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ、
ＡＰｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ （ｅｄ
、 ロ、 Ｈ，Ｇｌｏｖｅｒ） ２ １９１［Ｒ
Ｌ Ｐｒｅｓｓ ０ｘｆｏｒｄ Ｎａｃｋｅｔｔ ｅｔ ａｌ （１９８５ｂ） Ｔｅｃ
ｈｎｉＱｕｅｓ −ｉｎ ＧｅｎｅＣｌｏｎｉｎｇ Ｖ
ｏｌ、 ２ Ｈｕｒｒａｙ ｅｔ ａｌ （１９８４） ＥＨＢＯＪ
ｏｕｒｎａｌ ３６４５−６５ＯＮｅｗｔｏｎ ｅｔ
ａｌ （１９８６） Ｖａｃｃｉｎｅｓ ８６： Ｎｅ
ｗＡｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ Ｉ＋＋＋＋＋＋ｕｎｉ
ｚａｔｉｏｎ、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇｔｌａｒｂｏ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、 ３０３−３０９Ｐａｓｅ
ｋ ｅｔ ａｌ、（１９７９） Ｎａｔｕｒｅ ２８２
５７５−５７９Ｒｏｂｉｏｓｏｎ （１９７７） Ａｎ
ｎ、 Ｒｅｖ、 ）ｌｉｃｒｏｂｉａｌ ３１Ｓｔａｈ
ｌ ｅｔ ａｌ （１９８２） Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ
、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ。
ｔｌｓＡ ７９ １６０６−１６１０Ｗｉｎｔｈｅｒ
ｅｔ ａｔ （１９８６） Ｊ、 Ｉｎ＋ｕ
ｎｏ１． １３６ １８３５
ｅｔ ａｔ （１９８６） Ｊ、 Ｉｎ＋ｕ
ｎｏ１． １３６ １８３５
第１図は、プラスミドｐＦＯＨｃの構築を示す図である
。第２図は、ＦＭＤＶ ｖＰ１１４２〜１６０配列および標品ＨＢスプレア配列
の６個のアミノ酸によって分離された２相開始コドンを
含有する配列を有するシャトルベクターｐ ｖ Ｆ Ｏ
ｉｔ Ｃを示す図である。第３図は、野生型（Ｗｙｅｔ
ｈ）または組換え体（ｖＦＯＨｃ）感染細胞からの細胞
分解物のサンドイッチＥＬＩＳＡの結果を示す。第４図
はコア反応性物質のシュクロース勾配プロフィルを示す
。ｊＮ５図は、野生型ワクシニアウィルスおよび組換え
体（ＶＦＯＨＣ）感染細胞の３５ｓ−メチオニンでの標
識、細胞上澄液のＨＢｃＡｇ反応性抗血清による免疫沈
降、およびポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ
の結果を示す。
。第２図は、ＦＭＤＶ ｖＰ１１４２〜１６０配列および標品ＨＢスプレア配列
の６個のアミノ酸によって分離された２相開始コドンを
含有する配列を有するシャトルベクターｐ ｖ Ｆ Ｏ
ｉｔ Ｃを示す図である。第３図は、野生型（Ｗｙｅｔ
ｈ）または組換え体（ｖＦＯＨｃ）感染細胞からの細胞
分解物のサンドイッチＥＬＩＳＡの結果を示す。第４図
はコア反応性物質のシュクロース勾配プロフィルを示す
。ｊＮ５図は、野生型ワクシニアウィルスおよび組換え
体（ＶＦＯＨＣ）感染細胞の３５ｓ−メチオニンでの標
識、細胞上澄液のＨＢｃＡｇ反応性抗血清による免疫沈
降、およびポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ
の結果を示す。
Claims (19)
- （１）ＨＢｃＡｇのアミノ末端に非対応抗原エピトープ
が連結されている融合蛋白質。 - （２）非対応抗原エピトープは直接ＨＢｃＡｇに融合し
ている特許請求の範囲第１項に記載の融合蛋白質。 - （３）非対応抗原エピトープは１個から１０個までのア
ミノ酸残基を有するリンカーを介してＨＢｃＡｇに融合
している特許請求の範囲第１項に記載の融合蛋白質。 - （４）非対応抗原エピトープは、ウィルス、細菌または
原生動物のエピトープである特許請求の範囲第１項に記
載の融合蛋白質。 - （５）抗原エピトープは***ウィルス、ポリオウィル
ス、ヒトライノウィルス、インフルエンザウィルスまた
はＢ型肝炎ウィルス表面抗原のエピトープである特許請
求の範囲第４項記載の融合蛋白質。 - （６）抗原エピトープは￥Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａ
ｌｃｉｐａｒｕｍ￥のエピトープである特許請求の範囲
第４項記載の融合蛋白質。 - （７）特許請求の範囲第１項に記載の融合蛋白質の有効
量と生理学的に許容される担体または希釈剤からなるワ
クチン。 - （８）ＨＢｃＡｇのアミノ末端に非対応抗原エピトープ
が連結されている融合蛋白質をコードするＤＮＡ配列。 - （９）被対応抗原エピトープは直接ＨＢｃＡｇに融合し
ている特許請求の範囲第８項に記載のＤＮＡ配列。 - （１０）非対応抗原エピトープは１個から１０個までの
アミノ酸残基を有するリンカーを介してＨＢｃＡｇに融
合している特許請求の範囲第８項に記載のＤＮＡ配列。 - （１１）非対応抗原エピトープは、ウィルス、細菌また
は原生動物のエピトープである特許請求の範囲第８項に
記載のＤＮＡ配列。 - （１２）抗原エピトープは***ウィルス、ポリオウィ
ルス、ヒトライノウィルス、インフルエンザウィルスま
たはＢ型肝炎ウィルス表面抗原のエピトープである特許
請求の範囲第１１項に記載のＤＮＡ配列。 - （１３）抗原エピトープは￥Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆ
ａｌｃｉｐａｒｕｍ￥のエピトープである特許請求の範
囲第１２項に記載のＤＮＡ配列。 - （１４）特許請求の範囲第８項に記載のＤＮＡ配列が組
込まれ、適当な宿主に導入したときその融合蛋白質を発
現することができるベクター。 - （１５）ウィルスベクターである特許請求の範囲第１４
項に記載のベクター。 - （１６）そのＤＮＡ配列が組込まれている組換えワクシ
ニアウィルスである特許請求の範囲第１５項に記載のベ
クター。 - （１７）プラスミドである特許請求の範囲第１５項に記
載のベクター。 - （１８）特許請求の範囲第１４項に記載のベクターを導
入された宿主。 - （１９）ベクターはウィルスベクターであり、宿主は哺
乳類動物細胞系である特許請求の範囲第１８項に記載の
宿主。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US1294887A | 1987-02-10 | 1987-02-10 | |
| US012948 | 1998-01-23 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63196299A true JPS63196299A (ja) | 1988-08-15 |
Family
ID=21757520
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62052829A Pending JPS63196299A (ja) | 1987-02-10 | 1987-03-07 | 融合蛋白質 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS63196299A (ja) |
| AU (2) | AU596154B2 (ja) |
| CA (1) | CA1319628C (ja) |
| NZ (1) | NZ219516A (ja) |
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| JP2001512748A (ja) * | 1997-08-05 | 2001-08-28 | フラームス・インテルウニフェルシタイル・インスティチュート・フォール・ビオテヒノロヒー | 新しい免疫防御性インフルエンザ抗原及びそのワクチン接種への使用 |
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| CN106480070A (zh) * | 2015-08-25 | 2017-03-08 | 厦门大学 | 一种用于展示目的多肽的多肽载体及其用途 |
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- 1987-03-05 NZ NZ219516A patent/NZ219516A/xx unknown
- 1987-03-06 AU AU69792/87A patent/AU596154B2/en not_active Ceased
- 1987-03-07 JP JP62052829A patent/JPS63196299A/ja active Pending
- 1987-04-08 CA CA000534146A patent/CA1319628C/en not_active Expired - Fee Related
-
1990
- 1990-02-08 AU AU49273/90A patent/AU642859B2/en not_active Ceased
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| JP5568017B2 (ja) * | 2008-12-25 | 2014-08-06 | 一般財団法人化学及血清療法研究所 | 組換え鶏伝染性コリーザワクチン及びその製造方法 |
| CN106480070A (zh) * | 2015-08-25 | 2017-03-08 | 厦门大学 | 一种用于展示目的多肽的多肽载体及其用途 |
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