JPS6318462B2 - - Google Patents

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JPS6318462B2
JPS6318462B2 JP59022415A JP2241584A JPS6318462B2 JP S6318462 B2 JPS6318462 B2 JP S6318462B2 JP 59022415 A JP59022415 A JP 59022415A JP 2241584 A JP2241584 A JP 2241584A JP S6318462 B2 JPS6318462 B2 JP S6318462B2
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JP
Japan
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nori
mannanase
xylanase
leaves
protoplasts
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JP59022415A
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JPS60168381A (ja
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Teruhiko Shibata
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KOASA SHOJI KK
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KOASA SHOJI KK
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Priority to DE8484114226T priority patent/DE3472683D1/de
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Priority to KR1019840007524A priority patent/KR920006878B1/ko
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • C12N5/14—Plant cells

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  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
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  • Wood Science & Technology (AREA)
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  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ノリ葉体のプロトプラストを調製す
る方法、更に詳しくは、細胞融合に有効に適用し
得る、ノリ葉体のプロトプラストを短時間で調製
する方法に関する。
元来、ノリ葉体は、細胞壁構成多糖類が主とし
てセルロースから成つている陸上植物とは異な
り、その細胞壁は主としてキシラン及びマンナン
から成る難消化性多糖類から構成されているた
め、ノリ葉体のプロトプラストの調製は困難とさ
れていた。
本発明者は、さきに、ノリ葉体を、難消化性多
糖類の加水分解能を有する微生物を、ノリ又はノ
リ由来の多糖類を誘導物質として含む培地中で培
養して得られる、マンナン加水分解酵素とキシラ
ン加水分解酵素とを含有する酵素液で処理するこ
とにより、ノリ葉体のプロトプラストを調製する
方法に係る発明をなした（特願昭58−149378号
（特開昭60−41485号））。
しかし、本発明者はその後更に研究を続けた結
果、ノリ葉体を予めプロテアーゼで処理した後、
特定なマンナン加水分解酵素とキシラン加水分解
酵素で処理すると、一層健全なノリ葉体のプロト
プラストを、しかも短時間で調製し得ることの知
見を得て本発明をなすに至つた。
すなわち、本発明は、細胞融合に有効に適用し
得る健全なノリ葉体のプロトプラストを短時間で
調製できる方法を提供することを目的とする。
以下本発明を詳しく説明する。
本発明は、ノリ葉体をプロテアーゼで処理した
のち、β−１，３キシラナーゼ及びβ−１，４マ
ンナナーゼで処理するか、もしくはβ−１，３キ
シラナーゼとβ−１，４マンナナーゼ及びポルフ
イラナーゼとで処理することを特徴とする。
ノリ葉体の細胞壁を構成する骨格多糖類は、前
述したように、キシラン及びマンナンであるが、
細胞間多糖類はポルフイランから成り、又細胞壁
の表層には或る種のタンパク質及び脂質が存在し
ているといわれている。しかし、これらの物質の
化学的性状については殆ど解明されていないのが
現状である。
本発明者は、ノリ葉体よりキシラン，マンナン
及びポルフイランを分離，精製してそれの構造を
過ヨウ素酸酸化法、またそれらの単糖組成を加水
分解物についての液体クロマトグラフイー分析法
により検討した結果、キシランはキシロースのβ
−１，３結合のモノポリマーであり、マンナンは
マンノースのβ−１，４結合のモノポリマーであ
り、また、ポルフイランはガラクトースのポリマ
ーであることがわかつた。更に、ノリ葉体のうち
でも幼葉（１〜２mm）ではポルフイランの含量が
僅少であるのに対し成葉（５cm程度）ではポルフ
イランの含量が比較的多いこともわかつた。
因に、陸生植物の中には細胞壁構成多糖類とし
てセルロースのほかに稀にキシランを少量含むも
のもみられるがその殆んどはβ−１，４結合のも
のであり、また、コンニヤクのようにマンナンを
主成な構成成分とするものではその単糖組成分は
β−１，４結合のグルコースとマンノースであ
る。
本発明では上述した知見に基づき、ノリ葉体を
予めプロテアーゼで処理して細胞壁の表層に存在
するタンパク質の一部を加水分解したのち、幼葉
の場合は、β−１，３キシラナーゼとβ−１，４
マンナナーゼを併用して作用させ、成葉の場合は
上記両酵素に加えてポルフイラナーゼを併用して
作用させることにより、細胞膜の損傷がない健全
なプロトプラストを短時間で調製することに成功
した。
すなわち、キシラン加水分解酵素は、β−１，
３キシラナーゼ及びβ−１，４キシラナーゼに、
マンナン加水分解酵素はβ−１，３マンナナーゼ
及びβ−１，４マンナナーゼにそれぞれ大別され
るが、β−１，４キシラナーゼとβ−１，３マン
ナナーゼをノリ葉体に作用させてもその細胞壁を
構成している多糖類を加水分解することは不可能
であつて、β−１，３キシラナーゼとβ−１，４
マンナナーゼを併用して作用させることによつて
上記多糖類を加水分解し得るのである。しかし、
ノリ葉体に直接β−１，３キシラナーゼとβ−
１，４マンナナーゼを作用させた場合、ノリ葉体
の縁辺部より徐々に分解が行われ、恰かも個々の
細胞がポロリポロリと分離されるようになつて酵
素処理に長時間を要し、そのために細胞膜自体が
損傷を受けるようになり、場合によつては細胞内
容物が流出することもあつて、必ずしも健全なプ
ロトプラストが得られなくなる。また、上述した
ようにポルフイラン含量の比較的多い成葉の場合
には上記両酵素を作用させても細胞壁の完全な分
解は不可能である。
叙上の理由から、本発明では、まず、ノリ葉体
をプロテアーゼで処理するものであるが、該処理
は常温（25℃程度）で10分程度行なうとよく、プ
ロテアーゼとしてパパインを用いるのが好まし
い。
このようにしてプロテアーゼ処理した葉体は、
ついで洗浄後、幼葉のときにはβ−１，３キシラ
ナーゼとβ−１，４マンナナーゼの混合酵素液で
常温下に20分程度処理し、成葉のときには上記両
酵素に加えてポルフイラナーゼを混合した酵素液
で同様に処理する。
本発明に従つて、ノリ葉体を上述のように酵素
処理すると、葉体の縁辺部からではなく、葉体全
体に亘つて分解が行なわれて葉体がバラバラに分
離され、しかも短時間（約30分程度）で健全なプ
ロトプラストが得られる。因に、前述した難消化
性多糖類の加水分解能を有する微生物を培養して
得られる、キシラン加水分解酵素とマンナン加水
分解酵素とを含有する酵素液で処理するときは葉
体のプロトプラスト化に３〜４時間の長時間を要
する。
なお、本発明の方法によつて調製されたノリ葉
体のプロトプラストをペトリ皿内で人工海水（藻
類用Asp.12）に懸濁させ、ペトリ皿の底部に着
生したプロトプラストの生育状況を観察したとこ
ろ、生育状況は非常に良好であつた。
以上述べたように、本発明によると、細胞融合
に適した健全なノリ葉体のプロトプラストが極め
て短時間で調製し得るので、今後のノリ葉体の細
胞融合技術の進展に寄与し得るものと考える。
以下に実施例を示して本発明を更に具体的に説
明する。
実施例 １ ノリ葉体の幼葉（長さ１〜２mm）の約0.1ｇ
（湿重）をＬ型試験管に収容し、これに0.5％パパ
イン液（Ｍ／15トリス塩酸バツフアー、PH7.4）
10mlを加えて25℃の温度で振盪下（100ストロー
ク／分）に10分間処理を行なつた。ついで得られ
た葉体を海水で十分洗浄し、更にＭ／15リン酸バ
ツフアー（PH7.0）で洗浄した後、別のＬ型試験
管に収容し、これにβ−１，３キシラナーゼ液５
ml及びβ−１，４マンナナーゼ液５mlを添加し、
25℃の温度で振盪下（100ストローク／分）で20
分間処理した。
このようにして得られた処理液を顕微鏡下に観
察したところ、5.9×104個の細胞のプロトプラス
トが確認された。
なお、本例で用いたβ−１，３キシラナーゼ及
びβ−１，４マンナナーゼは下記のようにして調
製した。
β−１，３キシラナーゼ： ペプトン ……1.0重量％ 酵母エキス ……0.1重量％ K2HPO4 ……0.01重量％ FeCl3 ……0.6mg／ｌ トリス緩衝液 ……0.1重量％ β−１，３キシラン ……1.0重量％ 上記組成のものを海水に添加してPH7.5に調整
したものを培地に用いた。
上記培地に、養殖中のノリ葉体に付着している
細菌のうちで寒天分解能を有する菌を釣菌し、純
粋分離したものを接種し、300rpmの撹拌下に通
気しながら（通気量2000ml／分）、25℃で４日間
培養を行つた。
得られた培養液を４℃の温度で30分間
10000rpmで遠心分離し、その上清液を85％飽和
硫安水溶液により精製した後、Ｍ／15リン酸緩衝
液（PH7.0）で透析した。得られたβ−１，３キ
シラナーゼは23units／mlであつた。
本調製方法に用いられる細菌としては、例え
ば、シユードモナス（Pseudomonas）sp.PT−
５微工研条寄第330号（日本水産学会、昭和57年
秋季講演要旨集、第23頁、213記載の公知のシユ
ードモナス（Pseudomonas）sp.の菌株（Ｐ−１
株）と実質的に同一のものを特許出願のために本
願出願前に寄託したもの）並びに特開昭57−
110175号公報記載のシユードモナス
（Pseudomonas）sp.2L1、2L2、2L3及び2L4（それ
ぞれ、微工研第5805号、第5806号、第5807号及び
第5808号）が挙げられる。
β−１，４マンナナーゼ： 上記培地においてβ−１，３キシランに代えて
β−１，４マンナンを１％になるように添加した
ものを用いるほかは上記同様にして行なつた。
得られたβ−１，４マンナナーゼは18units／
mlであつた。
また、パパインは和光純薬工業〓の製品
（10units／mg）を用いた。
実施例 ２ 実施例１において、ノリ葉体の幼葉の代りに成
葉（長さ約５cm）を用い、β−１，３キシラナー
ゼ液５ml及びβ−１，４マンナナーゼ液５mlに更
にポルフイラナーゼ液５mlを添下するほかは実施
例１に記載と同様の手順でプロトプラスト化を行
なつた。
得られた処理液を顕微鏡下に観察したところ、
4.0×104個の細胞のプロトプラストが確認され
た。
なお、本例で用いたポルフイラナーゼは、上記
β−１，３キシラナーゼの調製においてβ−１，
３キシランの１％に代えてポルフイランを１％に
なるように添加した培地を用いるほかは同様にし
て調製した。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ ノリ葉体をプロテアーゼで処理したのち、β
    −１，３キシラナーゼ及びβ−１，４マンナナー
    ゼで処理するか、もしくはβ−１，３キシラナー
    ゼとβ−１，４マンナナーゼ及びポルフイラナー
    ゼとで処理することを特徴とするノリ葉体のプロ
    トプラストを調製する方法。 ２ プロテアーゼがパパインである特許請求の範
    囲第１項に記載の方法。
JP59022415A 1984-02-09 1984-02-09 ノリ葉体のプロトプラストの調製法 Granted JPS60168381A (ja)

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JP59022415A JPS60168381A (ja) 1984-02-09 1984-02-09 ノリ葉体のプロトプラストの調製法
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AT84114226T ATE35694T1 (de) 1984-02-09 1984-11-24 Verfahren zur herstellung von seelattichthallusprotoplasten.
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AU (1) AU586614B2 (ja)
CA (1) CA1209937A (ja)
DE (1) DE3472683D1 (ja)
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ATE35694T1 (de) 1988-07-15
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