KR100664582B1 - 키티나아제를 생산하는 트리코더마 비리데 ａｇｃｃ-ｍ41균주, 상기 균주로부터 분리된 키티나아제 및 이를 이용한ｎ-아세틸글루코사민의 생산방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 엑소-키티나아제(exo-chitinase)와 엔도-키티나아제(endo-chitinase)를 동시에 생산하는 트리코더마 비리데(Trichoderma viride) AGCC-M41 균주, 상기 균주로부터 분리·정제된 엑소-키티나아제 및 엔도-키티나아제, 및 상기 키티나아제를 이용하여 N-아세틸글루코사민(N-acetylgucosamine)을 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 트리코더마 비리데 AGCC-M41 균주로부터 생산된 키티나아제는 효소의 생산수율이 높고 효과적으로 키틴을 가수분해하여 대부분 N-아세틸글루코사민으로 전환시킬 수 있으므로, 키틴의 효소적 가수분해에 의한 N-아세틸글루코사민의 생산에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

키티나아제를 생산하는 트리코더마 비리데 ＡＧＣＣ-Ｍ41 균주, 상기 균주로부터 분리된 키티나아제 및 이를 이용한 Ｎ-아세틸글루코사민의 생산방법{CHITINASE-PRODUCING TRICHODERMA VIRIDE ＡＧＣＣ-Ｍ41 STRAIN, CHITINASES PURIFIED THEREFROM AND A METHOD FOR PRODUCING Ｎ-ACETYLGLUCOSAMINE USING THE CHITINASES}

도 1은 트리코더마 비리데 AGCC-M41 균주의 배양 시간에 따른 엑소-키티나아제의 생산성을 나타낸 것이고,

-■-: 엑소-키티나아제 활성(U/㎖), -▲-: 건조 세포중량(g/ℓ),

-◆-: pH

도 2는 트리코더마 비리데 AGCC-M41 균주 유래 키티나아제 효소제로부터 페닐-토요펄 컬럼 크로마토그라피를 이용하여 엔도-키티나아제와 엑소-키티나아제 활성을 나타내는 키티나아제 분획을 정제한 결과이고,

도 3은 도 2에서 페닐-토요펄 컬럼 크로마토그래피에 의해 트리코더마 비리데 AGCC-M41 균주로부터 정제된 엔도-키티나아제와 엑소-키티나아제 함유 키티나아제 활성분획을 Q-세파로스 컬럼 크로마토그라피로 정제하여 엑소-키티나아제 및 엔도-키티나아제를 분리한 결과이고,

도 4는 트리코더마 비리데 AGCC-M41 균주 유래 엑소-키티나아제와 엔도-키티나아제의 분자량을 SDS-PAGE로 측정한 결과이고,

M: 단백질 표준 분자량 사이즈 마커,

레인 1: 엔도-키티나아제 분획, 레인 2: 엑소-키티나아제 분획

도 5는 트리코더마 비리데 AGCC-M41 균주 유래 엑소-키티나아제 및 엔도-키티나아제에 의한 키틴의 가수분해 산물을 TLC로 분석한 결과이고 (이때 N1∼N4는 N-아세틸글루코사민의 단당체 내지 4당체를 각각 나타낸다),

도 6은 다양한 pH 조건에서 트리코더마 비리데 AGCC-M41 균주 유래 엑소-키티나아제의 상대활성(▼) 및 안정성(○)을 나타낸 것이고,

도 7은 다양한 온도 조건에서 트리코더마 비리데 AGCC-M41 균주 유래 엑소-키티나아제의 상대활성(▼) 및 안정성(○)을 나타낸 그래프이고,

도 8은 다양한 pH 조건에서 트리코더마 비리데 AGCC-M41 균주 유래 엔도-키티나아제의 상대활성(▼) 및 안정성(○)을 나타낸 것이고,

도 9은 다양한 온도 조건에서 트리코더마 비리데 AGCC-M41 균주 유래 엔도-키티나아제의 상대활성(▼) 및 안정성(○)을 나타낸 그래프이다.

본 발명은 엑소-키티나아제(exo-chitinase)와 엔도-키티나아제(endo- chitinase)를 동시에 생산하는 트리코더마 비리데(Trichoderma viride) AGCC-M41 균주, 상기 균주로부터 분리·정제된 엑소-키티나아제 및 엔도-키티나아제, 및 상기 키티나아제를 이용하여 N-아세틸글루코사민(N-acetylgucosamine)을 생산하는 방법에 관한 것이다.

섬유소 다음으로 풍부한 생물질(biomass)인 키틴은 N-아세틸글루코사민(N-acetylgucosamine, NAG)을 기본 단위로 하여 β-1,4 결합으로 연결된 다당류로서 분자량은 약 1×10⁶ Da 정도이다. 키틴은 게, 크릴새우, 보리새우 등과 같은 바다 갑각류들과 거미, 개미, 메뚜기 등과 같은 곤충의 외피를 구성하는 주성분이며, 미생물에서는 녹조류, 효모, 사상균 등의 세포벽 성분으로 발견된다.

이러한 키틴은 최근에 중요한 천연자원으로서 그 응용성이 점차 증가되고 있다. 특히, 키틴의 가수분해에 의해 생산되는 D-글루코사민(D-glucosamine, DGA)과 DGA의 아세틸화 형태인 NAG는 퇴행성 관절염에 뛰어난 효과를 나타낼 뿐만 아니라 항염증, 심장보호, 간장보호, 물질동화 촉진에도 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 키틴의 단량체인 NAG는 생체내 결합조직이나 힘줄, 연골조직 등의 당단백질을 만드는 주요성분으로 작용하는데, NAG를 포함하는 당단백질은 세포와 세포사이를 연결하는 결합물질로서 조직이나 기관의 완전한 유지에 필수적이다. 또한, NAG는 소화관의 점막을 구성하는 주요성분으로 소화관의 궤양치료에도 도움을 주며 체내에서 NAG가 DGA보다 점막세포에서 훨씬 빨리 이용되는 것으로 밝혀져 있다. 이러한 사실들로 미루어볼 때 NAG는 DGA보다 개량된 생물 신소재로서 그 효용가치가 매우 높 을 것으로 판단된다.

이와 같이 의약용 및 기능성 식품 소재로서의 효용가치가 큰 NAG는 대부분 키틴을 6∼12 N HCl, 60∼80℃ 조건에서 가수분해하는 산 가수분해법(acid hydrolysis)에 의해 생산되고 있다. 이러한 산 가수분해 과정에서는 키틴이 단당으로 분해되는 동시에 탈아세틸화가 일어나 DGA와 NAG가 동시에 생성되며, 산 가수분해 조건에 따라서 DGA와 NAG의 상대적인 비율이 달라질 수 있다. 그러나, 탈아세틸화를 줄이기 위해서 산의 농도와 온도를 낮추게 되면 키틴으로부터 얻어지는 NAG의 효율이 낮아지는 문제점이 있다. 게다가, 기존의 산 가수분해법에 의한 NAG 제조공정은 고농도 산을 사용하기 때문에 장치의 부식, 작업상의 위험, 인체에 유해한 불순물의 발생 및 이의 제거를 위한 복잡한 정제공정의 필요 등과 같은 문제점이 있다.

이러한 산 가수분해법의 문제점을 해결하기 위한 대안으로 효소를 사용하여 NAG를 생산하는 방법이 제시되고 있다. 효소 가수분해법은 키틴 가수분해 효소인 엔도-키티나아제와 엑소-키티나아제의 상승적인 가수분해작용에 의해 키틴을 단량체인 NAG로 전환시킨다. 이러한 효소 가수분해법은 키틴 분해산물인 NAG의 탈아세틸화가 일어나지 않고 불순물이 생기지 않기 때문에 정제공정이 매우 단순하고 높은 수율로 NAG를 생산할 수 있다는 장점이 있다. 그런데, 키틴으로부터 효소 가수분해법에 의해 NAG를 생산하기 위해서는 결정 상태의 딱딱한 키틴을 키틴올리고당으로 분해하는 엔도-키티나아제와 함께, 이렇게 생성된 키틴올리고당을 NAG로 완전 가수분해시키는 엑소-키티나아제가 필요하다. 그러나, 아직까지 이러한 효소들을 효율적으로 생산하고 이들을 이용하여 NAG를 경제적으로 생산하는 기술이 개발되지 않아 산업적으로 적용되지 못하고 있는 실정이다.

이에, 본 발명자들은 키틴을 효소적으로 가수분해하여 NAG를 효율적으로 생산하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 인공 돌연변이에 의해 효소활성이 개량된 신규한 돌연변이 균주로부터 기존에 보고된 다른 키티나아제보다 효소활성이 월등히 높고 NAG 생산능력이 뛰어난 키티나아제를 생산할 수 있음을 확인하고, 상기 균주로부터 생산된 키티나아제를 이용하여 고순도의 NAG를 생산하는 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 엑소-키티나아제와 엔도-키티나아제를 동시에 생산하는 트리코더마 비리데 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 트리코더마 비리데 균주로부터 분리·정제된 엑소-키티나아제 및 엔도-키티나아제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 엑소-키티나아제 및 엔도 키티나아제를 이용하여 NAG를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 엑소-키티나아제와 엔도-키티나아제를 동시에 생산하는 신규한 트리코더마 비리데 AGCC-M41 균주를 제공한다.

키틴을 분해하여 NAG를 생산하는데 관여하는 효소는 키틴을 키틴올리고당으로 분해하는 엔도-키티나아제와 상기 키틴올리고당을 NAG로 완전히 분해하는 엑소-키티나아제 두 가지이다. NAG의 생산에는 이 두 가지 효소가 모두 중요하나 이 중 NAG 생성속도를 결정하는 것은 후자인 엑소-키티나아제의 역가이기 때문에, 본 발명에서는 NAG 제조용 키티나아제 생산균주를 선발하고 개량하는데 있어서 기준이 되는 지표로 엑소-키티나아제의 역가를 사용한다.

국내외 균주보관소에서 입수한 미생물과 자연계에서 수집한 미생물 등 총 500여종의 미생물을 대상으로 엑소-키티나아제 효소활성이 높고, 키틴을 분해할 때 NAG를 다량 생성하는 균주를 선발한다. 이로부터 트리코더마 비리데(Trichoderma viride) AGCC-27 균주가 높은 엑소-키티나아제 활성과 NAG 생산성을 나타냄을 확인한다(표 1 참조).

그러나, 상기 트리코더마 비리데 AGCC-27 균주는 다른 균주에 비하여 엑소-키티나아제 활성이 상대적으로 높기는 하지만, 산업적 목적으로 사용하기에는 여전히 활성이 부족한 편이다. 본 발명에서는 NAG 생산용 키티나아제 생산균주로 선발된 트리코더마 비리데 AGCC-27 균주의 엑소-키티나아제 생산성을 증대시키고자 N-메틸-N'-나이트로-N''-나이트로소-구아니딘(N-methyl-N'-nitro-N''-nitroso-guanidine, NTG)을 이용한 무작위 돌연변이를 수행한다. 구체적으로, 트리코더마 비리데 AGCC-27에 NTG를 처리하여 키틴 한천배지에 도말한 후 콜로니들의 키틴 분해환의 크기를 관찰함으로써 엑소-키티나아제 생산성이 증가된 돌연변이 균주들을 1차로 선발한다. 그 후 이들 균주를 키틴 액체배지에 배양하여 엑소-키티나아제 생산성을 비교함으로써 트리코더마 비리데 AGCC-27 균주에서 유래된 1차 변이주들 중에서 가장 높은 엑소-키티나아제 생산성을 보이는 돌연변이 균주를 선발한다. 본 발명에서는 이와 같은 방법으로 약 8.3 U/㎖의 엑소-키티나아제 생산성을 나타내는 균주를 선발하여 AGCC-M8로 명명한다(표 2 참조).

효소활성 개량을 위하여 선발된 1차 균주를 대상으로 2차 NTG 돌연변이를 상기와 동일한 방법으로 수행한다. 트리코더마 비리데 AGCC-M8을 이용한 2차 돌연변이에 의해 엑소-키티나아제 생산성이 18.5 U/㎖로서 모균주인 트리코더마 비리데 AGCC-M8 보다 키티나아제 생산성이 약 2.2배 향상된 균주를 선발하고, 이를 AGCC-M41로 명명한다(표 3 참조).

상기와 같은 2차의 NTG 돌연변이 과정을 거쳐서 키티나아제 활성이 모균주인 트리코더마 비리데 AGCC-27(0.35 U/㎖)보다 약 53배 증가된 트리코더마 비리데 AGCC-M41 균주를 키티나아제 고생산성 균주로 최종 선발한다. 이러한 효소활성은 지금까지 보고된 바 없는 매우 높은 활성으로, 상기 균주를 2004년 12월 1일자로 한국생명공학연구원 부설 유전자은행에 기탁하였다(기탁번호: KCTC 10734BP).

상기와 같이 키티나아제 고생산성 균주로 선발된 트리코더마 비리데 AGCC-M41 균주를 배양하여 최대의 키티나아제 생산성을 얻기 위해서는, 상기 균주를 키틴 0.1∼5.0％, 옥수수 침지액 분말(corn-steeped powder) 0.1∼5.0％, 암모늄 설페이트 0.05∼2.0％, 인산칼륨 0.1∼3.0％, 염화칼슘 0.01∼1.0％, 황산마그네슘 0.01∼1.0％, 트라이톤 X-100 0.05∼3.0％ 및 포도당 0.01∼2.0％를 포함하는 배지에서 배양온도 20∼30℃, 초기 pH 2.5∼5.0, 통기조건 0.1∼2.0 vvm, 교반속도 100 ∼500 rpm, 종균 접종량 0.5∼10.0％, 배양시간 72∼168시간 동안 배양하는 것이 바람직하다. 상기 조건으로 트리코더마 비리데 AGCC-M41 균주를 배양하면 배양시간이 경과함에 따라서 균체량이 증가하며, 배양 132시간째에 엑소-키티나아제 생산량이 25 U/㎖로서 최대 생산성을 나타낸다(도 1 참조).

또한, 본 발명은 상기 트리코더마 비리데 AGCC-M41 균주로부터 엑소-키티나아제와 엔도-키티나아제를 제조하는 방법을 제공한다.

이를 위하여, 본 발명에서는 먼저 트리코더마 비리데 AGCC-M41 균주로부터 NAG를 생산할 수 있는 키티나아제 효소제를 제조하는데, 이를 단계별로 나누어 설명하면 하기와 같다.

먼저, 트리코더마 비리데 AGCC-M41 균주를 감자 덱스트로스 한천배지(포도당 2％, 감자 추출액 20％, 한천 1.5％, pH 7.0)에 접종하여 20∼30℃에서 1∼4일간 종균 배양한다. 배양된 균사체 블락(가로×세로=0.5×0.5 ㎝)을 상기에서 확립된 최적의 배지조성을 갖는 100∼500 ㎖의 키틴 액체배지에 접종하고, 20∼30℃, 100∼300 rpm으로 1∼4일간 진탕 배양하여 종배양액을 얻는다.

동일한 조성의 발효배지를 발효기에 넣고 멸균한 후 상기에서 배양한 종배양액을 0.5∼10.0％의 양으로 접종한다. 예를 들면, 500 ℓ 발효조(배양액 부피 300 ℓ)의 경우에는 배양온도 20∼30℃, 초기 pH 2.5∼5.0, 통기조건 0.1∼2.0 vvm, 교반속도 100∼500 rpm, 접종량 1.5∼30 ℓ의 조건을 유지하며 3∼7일간 배양한다. 이때, 발효조의 부피에 따라 교반속도 및 통기조건을 적절하게 조절하는 것이 바람 직하다. 정상적으로 배양된 엑소-키티나아제의 역가는 20∼30 U/㎖이다.

상기 방법으로 획득한 배양액으로부터 원심분리 혹은 막여과를 통하여 균사체를 제거한 후 한외여과(ultrafiltration)를 거쳐서 효소를 농축한다. 상기 막여과시 막의 세공(pore)의 크기는 0.45∼2.0 ㎛, 한외여과시 분자량 컷-오프(cut-off)치는 5,000∼30,000 Da인 것이 바람직하다. 얻어진 효소 농축액으로부터 투석여과(diafiltration)를 통해 배양액 중의 배지성분들을 제거하여 효소 농축액을 얻는다. 이때, 투석 완충용액으로는 인산나트륨, 구연산, 소듐 포스페이트 또는 초순수 증류수 등이 사용될 수 있다. 상기 효소 농축액을 희석하여 액상 효소제를 만들거나 동결건조하여 분말 효소제를 제조할 수 있다. 정상적으로 정제된 경우, 10∼15 U/㎎의 분말 효소제를 배양액 ℓ당 1.5∼2.0 g의 양으로 얻을 수 있다. 이와 같이 트리코더마 비리데 AGCC-M41 균주의 배양액으로부터 정제된 키티나아제 효소제는 엔도-키티나아제와 엑소-키티나아제를 포함하고, 효소제 중 엔도-키티나아제와 엑소-키티나아제의 함량은 각각 3.0∼15.0％ 및 85.0∼97.0％이다.

상기와 같이 제조된 키티나아제 효소제로부터 엑소-키티나아제 및 엔도-키티나아제를 분리·정제하는 방법은 다음과 같다.

전술한 방법으로 수득한 키티나아제 효소제를 페닐-토요펄(Phenyl-Toyopearl) 컬럼 크로마토그래피에 걸어 엑소-키티나아제 활성을 보이는 분획을 분리한 후 이 분획들을 모아 Q-세파로스 컬럼 크로마토그라피에 걸어 엔도-키티나아제 활성분획을 분리한다(도 2 및 3 참조). 이와 같이 분리된 엑소-키티나아제 및 엔도-키티나아제의 분자량을 SDS-PAGE로 측정하면 트리코더마 비리데 AGCC-M41 균 주 유래 엑소-키티나아제는 65,000 Da의 분자량을 가지며 엔도-키티나아제는 42,000 Da의 분자량을 갖는 것으로 확인된다(도 4 참조).

상기와 같이 분리·정제된 엑소-키티나아제 및 엔도 키티나아제의 효소학적 특성을 인산 처리에 의해 팽윤된 키틴을 효소반응의 기질로 사용하여 조사할 수 있다. 먼저, 트리코더마 비리데 AGCC-M41 균주 유래 엑소-키티나아제에 의한 키틴의 가수분해 산물을 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography, TLC)로 분석한 결과, 반응 초기와 말기 모두에서 NAG만이 검출되었는데, 이는 본 발명에 따른 트리코더마 비리데 AGCC-M41 균주 유래 엑소-키티나아제가 키틴을 엑소 타입(exo-type)으로 절단하여 NAG만을 생산하는 N-아세틸-β-D-글루코사미니다제(N-acetyl-β-D-glucosaminidase)임을 나타내는 것이다(도 5의 A참조). 상기와 동일한 방법으로 엔도-키티나아제에 의한 키틴의 가수분해 산물을 분석한 결과, 단당류뿐만 아니라 이당류 이상의 다당류도 검출되어 본 발명의 키티나아제 생산균주 트리코더마 비리데 AGCC-M41 균주 유래 엔도-키티나아제가 키틴을 무작위로 분해하여 키틴올리고당을 생산하는 엔도 타입의 엔도-키티나아제임을 확인하였다(도 5의 B 참조).

또한, 트리코더마 비리데 AGCC-M41 유래 엑소-키티나아제의 최적 pH는 5.0이고, pH 4.0∼6.0 범위에서 비교적 안정하며(도 6 참조), 최적 온도는 50℃이고, 40∼50℃ 범위에서 안정적으로 효소활성을 나타낸다(도 7 참조). 아울러, 트리코더마 비리데 AGCC-M41 유래 엔도-키티나아제의 최적 반응 pH는 5.0이고, pH 4.0∼7.0 범위에서 비교적 안정하며(도 8 참조), 최적 온도는 45℃이고, 40∼50℃ 범위에서 안정적으로 효소활성을 나타낸다(도 9 참조).

본 발명은 또한 상기 엑소-키티나아제 및 엔도 키티나아제를 이용하여 NAG를 생산하는 방법을 제공한다.

상기와 같이 확립된 최적의 발효조건에 따라 본 발명의 트리코더마 비리데 AGCC-M41 유래 엑소-키티나아제 및 엔도-키티나아제를 함유하는 키티나아제 효소제를 이용하여 NAG를 제조하는 방법은 하기 단계를 포함한다:

1) 키틴을 팽윤화하여 효소기질을 준비하는 단계;

2) 단계 1)에서 얻은 팽윤키틴을 키티나아제 효소제로 가수분해하는 단계;

3) 단계 2)에서 얻은 가수분해액을 진공농축하는 단계;

4) 단계 3)에서 얻은 농축액을 탈색 및 여과하는 단계;

5) 단계 4)에서 얻은 여과액으로부터 NAG를 결정화시키는 단계; 및

6) 단계 5)에서 얻은 NAG 결정을 건조시키는 단계.

먼저, 단계 1)은 키틴을 팽윤화시키는 공정으로 키틴에 2∼4배 부피의 50∼85％, 바람직하게는 85％ 인산을 첨가하고 잘 혼합한 후, 상온에서 4∼12시간 동안 10∼100 rpm으로 교반하면서 키틴을 팽윤시킨다. 팽윤된 키틴에 5∼20배 부피의 정제수를 첨가하면서 10∼100 rpm으로 교반시킨 후, 팽윤키틴을 정제수로 수차례 세척하여 pH를 3.0∼7.0으로 맞춘 다음 이를 효소반응의 기질로 사용한다.

단계 2)는 가수분해 공정으로, 먼저 상기 단계 1)에서 준비된 1∼10 ％(w/v)의 팽윤키틴, 바람직하게는 2∼5％의 팽윤키틴을 물에 용해하여 기질용액을 준비하 는데, 이때 pH를 3.0∼6.0, 바람직하게는 4.0∼5.0으로 조정하는 것이 바람직하다. 상기 기질용액을 교반장치와 항온장치가 갖추어진 반응기에 옮기고 키틴 g당 1∼100 U, 바람직하게는 5∼30 U의 트리코더마 비리데 AGCC-M41 균주 유래 키티나아제를 첨가한 후 온도를 30∼60℃로, 바람직하게는 40∼50℃로 유지하면서 24∼72시간 동안 가수분해시킨다. 이때, 사용되는 키티나아제는 트리코더마 비리데 AGCC-M41 균주의 배양액으로부터 정제된 엑소- 및 엔도-키티나아제를 함유하는 키티나아제 효소제이다. 가수분해반응 후 한외여과막(분자량 컷-오프치: 8∼30 kDa)을 이용하여 반응액으로부터 효소 및 단백질을 회수하고 가수분해액을 정제한다.

한편, 키틴은 제조과정에서 약 10％의 탈아세틸화가 일어나 키틴 분자내에 D-글루코사민 잔기들이 존재한다. 따라서, 산 가수분해 공정에서 키틴 분자내에 존재하는 D-글루코사민을 보다 효과적으로 분해하기 위해서는 키티나아제 외에 엑소-키토산아제를 1 g당 5∼30 U의 양으로 첨가하는 것이 바람직하다. 엑소-키토산아제를 부가적으로 첨가하면 NAG 생산성이 키티나아제만을 첨가한 경우보다 10∼20％ 정도 증가한다(표 10 참조).

단계 3)은 농축공정으로, 상기와 같이 정제된 가수분해액을 총 고형분 함량이 40∼60％에 도달할 때까지 진공농축한다. 진공농축은 가온에 의한 착색을 방지하기 위하여 가급적 낮은 온도에서 실시하거나 박막식 혹은 원심형 농축기 등을 사용하는 것이 바람직하다.

단계 4)는 탈색 및 여과공정으로, 단계 3)에서 얻은 농축액에 액량 대비 1∼10％, 바람직하게는 2∼5％의 활성탄을 첨가하여 30∼60℃의 온도에서 탈색을 실시 한다. 이때, 0.1∼1.0％, 바람직하게는 0.3∼0.5％의 규조토를 첨가하면 탈색효과가 더욱 좋아진다. 탈색이 완료된 후, 활성탄과 규조토는 적당한 여과기를 이용하여 제거한다.

단계 5)는 결정화공정으로, 탈색이 완료된 반응액의 온도를 10℃ 이하에서 12시간 이상 방치하여 NAG 결정을 생성시킨 후, 원심분리기나 여과기를 이용하여 결정을 회수한다. 결정회수 후 발생하는 모액을 고형분 농도 50％까지 농축한 후 10℃ 이하의 저온에서 12시간 이상 방치하여 2차 결정을 획득할 수 있다. 결정의 형성을 촉진하기 위하여 소량의 NAG 결정을 첨가하거나 농축액 대비 1∼2배 부피의 에탄올을 첨가할 수도 있다.

단계 6)은 건조공정으로, 상기 단계 5)에서 수득한 NAG 결정을 40℃ 이하의 온도로 유지되는 진공건조기에 넣고 12시간 이상 건조한다.

상기 단계를 통해 본 발명에 따른 트리코더마 비리데 AGCC-M41 균주 유래 키티나아제를 이용하여 NAG를 생산함으로써 순도 95％ 이상의 NAG 결정분말을 50∼90％ 수율로 얻을 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 키티나아제 생산균주의 선발

키티나아제 생산균주를 선발하기 위하여 국내외 균주보관소와 자연계에서 수집한 미생물을 대상으로 키티나아제 활성을 조사하였다. 이때, 엔도-키티나아제 활성은 팽윤키틴으로부터 생성되는 환원당의 양을 다이나이트로-살리실산(dinitro-salicylic acid, DNS) 방법(Miller. G.L., Anal. Chem. 31: 426-428, 1959)에 따라 하기와 같이 측정하였다. 먼저, 2 ％(w/v) 팽윤키틴(50 M 소듐 포스페이트 완충용액, pH 5.0) 0.3 ㎖에 550 ㎚ 파장의 범위(0.1 내지 0.9)에 들도록 적당히 희석한 엔도-키티나아제 효소액 0.3 ㎖을 첨가한 후 50℃에서 30분간 반응시켰다. 반응액을 12,000 rpm, 4℃에서 10분간 원심분리하여 상등액을 분리한 후, 상등액 0.3 ㎖을 DNS 1 ㎖에 잘 혼합하고 100℃에서 5분간 가열하였다. 반응액을 찬물에서 냉각시킨 후, 550 ㎚에서 흡광도를 측정하여 NAG로 정량한 표준 곡선을 이용하여 생성된 NAG 절대량을 결정하였고, 이로부터 효소역가를 산출하였다. 이때, 엔도-키티나아제 효소단위(1 U)는 1분 동안에 1 μmole의 NAG를 생산하는 효소의 양으로 정의하였다.

또한, 엑소-키티나아제 활성을 측정하기 위해서, ρ-나이트로-페닐-N-아세틸글루코사민(ρ-nitro-phenyl-N-acetylglucosamine) 용액(1 mM, 50 mM Na-인산염, pH 5.0) 0.2 ㎖에 420 ㎚ 파장의 범위(0.1 내지 0.5)에 들도록 적당히 희석한 엑소-키티나아제 효소액 0.2 ㎖을 첨가하여 50℃에서 30분간 반응시킨 후, 0.1 M 글리신-NaOH 완충용액(pH 10.5) 1 ㎖를 첨가하여 효소반응을 정지시켰다. 반응액의 흡광도를 420 ㎚에서 측정하여 표준곡선으로부터 유리되는 ρ-나이트로페놀(ρ-nitrophenol)의 양을 결정하였다. 엑소-키티나아제 효소단위(1 U)는 1분 동안에 1 μmole의 ρ-니트로페놀을 생산하는 효소의 양으로 정의하였다.

상기와 같이 측정된 효소 역가를 하기 표 1에 나타내었다.

상기 표 1에 나타난 바와 같이, 500여종의 대상 미생물로부터 키티나아제 활성이 높고, 키틴을 분해할 때 NAG를 대량으로 생성하는 7종의 균주를 선발하였다. 이 중에서 트리코더마 비리데(Trichoderma viride) AGCC-27 균주가 가장 높은 키티나아제 활성과 NAG 생산수율을 나타내어 이 균주를 키티나아제 생산균주로 선발하였다.

실시예 2: 트리코더마 비리데 AGCC-27 균주의 개량

NAG 생산용 키티나아제 생산균주로 선발된 트리코더마 비리데 AGCC-27 균주의 키티나아제 효소활성을 증대시키고자 NTG(N-methyl-N'-nitro-N''-nitroso-guanidine)를 이용한 무작위 돌연변이를 수행하였다. 트리코더마 비리데 AGCC-27 배양액에 NTG를 0.5 ㎎/㎖ 농도로 처리하여 키틴 한천배지(팽윤키틴 1.0％, 효모추출물 0.5％, 일인산칼륨 0.2％, 암모늄설페이트 0.2％, 한천 1.5％)에 도말한 후 25℃에서 5일간 배양하였다. 이로부터 형성된 콜로니들의 키틴 분해환의 크기를 관찰함으로써 1차로 키티나아제 효소활성이 증가된 돌연변이 균주들을 약 50여종 선발하였다. 그 후 이들 균주를 키틴 액체배지에 배양하여 키티나아제 효소활성을 비교하였다.

그 결과, 상기 표 2에 나타난 바와 같이, 트리코더마 비리데 AGCC-27 균주 에서 유래된 1차 변이주들 중에서 8번 변이주가 배양 7일째 약 8.3 U/㎖의 가장 높은 키티나아제 생산성을 보임을 확인하고, 이를 AGCC-M8로 명명하였다.

1차 균주 트리코더마 비리데 AGCC-M8을 이용하여 2차 NTG 돌연변이를 수행하였다. 2차 돌연변이와 스크리닝 방법은 1차 돌연변이 방법과 동일하게 수행하여 키틴 한천배지에서 키틴 분해환이 큰 균주를 약 50여종 선발하였고, 이들을 다시 키틴 액체배지에 배양하여 키티나아제 효소활성을 비교하였다.

그 결과, 상기 표 3에 나타난 바와 같이, 키티나아제 생산성이 18.5 U/㎖로서 모균주인 트리코더마 비리데 AGCC-M8보다 약 2.2배 향상된 균주를 선발하였고, 이를 AGCC-M41로 명명하였다. 상기와 같은 2차의 NTG 돌연변이 과정을 거쳐서 트리코더마 비리데 AGCC-27 보다 약 53배 키티나아제 활성이 증가된 트리코더마 비리 데 AGCC-M41 균주를 최종적으로 선발하였다. 상기 트리코더마 비리데 AGCC-M41 균주를 한국생명공학연구원 부설 유전자은행에 2004년 12월 1일자로 기탁하였다(기탁번호: KCTC 10734BP).

실시예 3: 키티나아제 고생산성 변이주의 발효조건 최적화 및 키티나아제 효소제의 제조

<3-1> 배지조성 최적화

키티나아제 생산균주로 최종 선발된 트리코더마 비리데 AGCC-M41 균주의 대량 발효를 위한 배지조성 최적화 연구를 수행하였다. 배지 중 탄소원, 질소원, 인산공급원, 미량원소 등을 종류별 및 농도별로 다양하게 변화시켜 배지를 이용한 배양실험을 수행하여, 키티나아제의 활성이 높고, 원료의 비용과 수급을 고려하여 산업화에 용이한 발효배지 조건을 결정하였다. 최종 확정된 배지의 조성은 하기 표 4와 같다.

<3-2> 발효조건 최적화

트리코더마 비리데 AGCC-M41 균주의 키티나아제 생산성을 증대시키기 위해서 표 4의 배지조성을 기본으로 하여 발효조건 최적화 연구를 수행하였다. 그 결과, 키티나아제 제조를 위한 최적 발효조건은 500 ℓ 발효기 규모(배양액 부피 300 ℓ)에서 배양온도 25℃, 초기 pH 3.2, 통기조건 0.5 vvm, 교반속도 120 rpm, 종균 접종량 15 ℓ였으며, 배양시간은 약 144시간으로 결정되었다. 상기 조건으로 트리코더마 비리데 AGCC-M41 균주를 배양한 결과, 도 1에서 보는 바와 같이 배양시간이 경과함에 따라서 균체량이 증가하였으며, 배양 132시간째에 엑소-키티나아제 생산성이 25 U/㎖에 이르러 최대 생산성을 나타내었다.

<3-3> 키티나아제 효소제의 제조

트리코더마 비리데 AGCC-M41 균주의 260 ℓ 배양액을 15,000 rpm에서 연속원심분리하여 균사체를 제거하고, 1차 막여과(막의 세공은 1.0 ㎛)와 한외여과(분자량 컷-오프치: 30 kDa)를 통해 배양 상등액을 농축하였다. 초순수 정제수를 이용하여 농축액의 약 25배 부피의 투석여과(diafiltration)를 통해 농축액으로부터 배지성분을 제거하였다. 이로부터 얻은 여과액을 2차 막여과(막의 세공은 0.45 ㎛)를 통하여 실시하여 제균한 후, 동결건조의 과정을 거쳐서 최종적으로 키티나아제 효소제를 제조하였다.

그 결과, 상기 표 5에 나타난 바와 같이, 260 ℓ의 배양액으로부터 410 g의 효소제를 제조할 수 있었으며, 배양액으로부터 효소제의 정제수율은 92％로 나타났다. 상기와 같이 트리코더마 비리데 AGCC-M41 균주의 배양액으로부터 정제된 키티 나아제 효소제는 엔도-키티나아제와 엑소-키티나아제가 혼합된 형태로 엑소-키티나아제 활성은 13.5 U/㎎ 분말이었고, 엔도-키티나아제 활성은 195.08 U/㎎ 분말이었다.

실시예 4: 키티나아제의 특성

상기 실시예 3에서 트리코더마 비리데 AGCC-M41 균주를 배양하여 획득한 키티나아제 효소제로부터 엑소-키티나아제와 엔도-키티나아제를 순수하게 정제하고, 이들의 효소학적 특성을 하기와 같이 조사하였다.

<4-1> 엑소-키티나아제 및 엔도-키티나아제의 정제

실시예 <3-3>에서 제조된 키티나아제 효소제를 페닐-토요펄(Phenyl-Toyopearl, Tocho사, 일본) 컬럼 크로마토그라피에 걸어 정제하였다. 먼저, 효소제 분말을 1％의 농도로 10 mM 인산나트륨 완충용액(pH 6.8) 15 ㎖에 용해시켰다. 컬럼에 페닐-토요펄 레진을 15 ㎖ 충진시킨 뒤 완충용액 A로는 1.5 M 황산암모늄을 포함한 10 mM 인산나트륨 완충용액을, 완충용액 B로는 10 mM 인산나트륨 완충용액을 사용하여 역농도구배 방식으로 용출시켰다. 용출속도는 시간당 60 ㎖로 4 ㎖씩 분획하였다. 도 2는 페닐-토요펄 컬럼 크로마토그라피에 의한 엑소-키티나아제와 엔도키티나아제의 정제 결과를 나타내는 것이다. 대부분의 키티나아제 활성은 분획 138 내지 152에서 관찰되었으며, 이 분획들에서 엔도-키티나아제 활성과 엑소-키티나아제 활성이 동시에 검출되었다.

페닐-토요펄 컬럼 크로마토그래피 방법으로는 엔도-키티나아제와 엑소-키티나아제를 분리할 수 없었기 때문에, 본 발명에서는 페닐-토요펄 컬럼 크로마토그래피에서 키티나아제 활성이 높은 분획 138 내지 152(엔도-키티나아제와 엑소-키티나아제 효소활성을 모두 가진 분획)를 모아 10 mM 인산나트륨 완충용액(pH 6.5)에 투석하여 여과하였다. 컬럼에 Q-세파로스(Q-Separose, Pharmacia사, 미국) 레진을 30 ㎖ 충진시킨 뒤, 동일한 완충용액으로 세척한 후 상기 분획 138 내지 152를 로딩하였다. 상기 컬럼에 0∼1 M 염화나트륨 용액으로 농도구배를 걸어주면서 Q-세파로스 컬럼에 흡착된 단백질을 용출시켰다. 이때, 용출속도는 분당 1 ㎖로 4 ㎖씩 분획하였다. 도 3은 Q-세파로스 컬럼 크로마토그라피에 의한 엔도-키티나아제와 엑소-키티나아제의 분리 결과를 나타내는 것이다. 분획 60 내지 67에서는 엔도-키티나아제 활성이 높게 나타났고, 분획 81 내지 85에서는 엑소-키티나아제 활성이 높게 나타났다. 도 3에 나타난 바와 같이, 엔도-키티나아제 분획에서 동시에 엑소-키티나아제 활성이 측정되었는데, 이는 트리코더마 비리데 AGCC-M41 균주로부터 생산되는 엔도-키티나아제가 엑소-키티나아제 활성을 동시에 가지고 있다는 것을 시사하는 것이다. 또한, 엑소-키티나아제 분획에서도 엔도-키티나아제 활성이 검출되었는데, 이는 엑소-키티나아제가 엔도-키티나아제의 기질인 팽윤키틴을 엑소-절단(exo-cleavage) 방법으로 분해하여 환원당을 생성하기 때문인 것으로 판단된다. 이러한 추정은 분리된 엔도-키티나아제와 엑소-키티나아제의 팽윤키틴 분해 결과에서 확인할 수 있는데(도 5), 엑소-키티나아제는 팽윤키틴을 분해하여 단당체를 만들었고, 엔도-키티나아제는 팽윤키틴을 분해하여 단당체를 포함하여 이당류 이상의 올리고당을 만들었다. 이로부터 Q-세파로스 컬럼의 분획 60 내지 67을 엔도-키티나아제 활성분획으로 분리하였고, 분획 81 내지 85를 엑소-키티나아제 활성분획으로 분리하여 이후의 실험에 사용하였다.

<4-2> 분자량 측정

상기 <4-1>에서 정제된 엑소-키티나아제(Q-세파로스 컬럼의 분획 81 내지 85)와 엔도-키티나아제 분획(Q 세파로스 컬럼의 분획 60 내지 67)을 12％ 폴리아크릴아마이드 겔(polyacrylamaide gel)에 로딩한 후 30 mA에서 다이(dye)가 다 빠질 때까지 전기영동하였다. 전기영동 겔을 0.05％ 쿠마시 브릴리언트 블루(coomassie brilliant blue) R-250으로 염색한 뒤 탈염색(destaining) 용액으로 탈색시켜 확인하였다. 이때, 97,400∼14,400 Da 범위를 갖는 단백질 사이즈 마커(protein size markers)를 사용하여 분자량을 측정하였다. 그 결과, 트리코더마 비리데 AGCC-M41 균주 유래 엑소-키티나아제는 65,000 Da의 분자량을 가지며 엔도-키티나아제는 42,000 Da의 분자량을 가짐을 알 수 있었다(도 4).

실시예 5: 키티나아제 효소제의 특성

<5-1> 팽윤키틴의 제조

엑소-키티나아제에 의한 효소처리를 위해서는 딱딱한 키틴을 전처리하여 팽윤(swollen) 상태의 키틴으로 만들어 주어야 한다. 이를 위해, 키틴 10 g에 85％ 인산 40 ㎖를 첨가하고 잘 혼합한 후, 상온에서 12시간 동안 40 rpm으로 교반시키 면서 키틴을 팽윤시켰다. 팽윤된 키틴에 400 ㎖의 증류수를 첨가하면서 40 rpm으로 교반시켰고, 팽윤키틴을 증류수로 수차례 세척하여 pH를 4.0으로 맞춘 후 이후의 실험에 사용하였다.

<5-2> 엑소-키티나아제의 가수분해반응 생성물

2％ 팽윤키틴용액 100 ㎖에 실시예 <4-1>에서 정제된 엑소-키티나아제 100 U를 가하여 40℃, pH 4.0의 조건에서 반응시켰다. 반응시작 후 0.5 및 15시간 이후의 반응용액을 채취하여 TLC로 반응생성물을 조사하였다. TLC는 아이소프로파놀:피리딘:초산:물(10:6:6:9)의 혼합용매를 사용하여 완전히 전개시킨 뒤 포화 뷰탄올에 1％ 닌하이드린(ninhydrin)을 녹인 용액을 분무한 다음 100℃에서 타지 않게 조심하면서 색깔이 나타날 때까지 발색시켰다. 그 결과, 0.5 및 15시간 모두에서 동일하게 NAG만이 검출되었는데, 이는 본 발명의 키티나아제 생산균주 트리코더마 비리데 AGCC-M41 균주 유래 엑소-키티나아제가 키틴을 엑소 타입으로 잘라서 NAG만을 생산하는 N-아세틸-β-글루코사미니다제(N-acetyl-β-glucosaminidase)임을 나타내는 것이다(도 5의 A).

<5-3> 엔도-키티나아제의 가수분해반응 생성물

2％ 팽윤키틴용액 100 ㎖에 실시예 <4-1>에서 정제된 엔도-키티나아제 100 U를 가하여 40℃, pH 4.0의 조건에서 반응시켰다. 반응시작 후 0.5 및 15시간 이후의 반응용액을 채취하여 TLC로 반응생성물을 조사하였다. 이후 상기 실시예 <5-2> 와 동일한 방법으로 발색반응을 유도한 결과, 단당류뿐만 아니라 이당류 이상의 다당류가 검출되었다. 이는 본 발명의 키티나아제 생산균주 트리코더마 비리데 AGCC-M41 균주 유래 엔도-키티나아제가 키틴을 무작위로 분해하여 키틴올리고당을 생산하는 엔도 타입의 엔도-키티나아제임을 나타내는 것이다(도 5의 B).

<5-4> 효소활성에 미치는 pH의 영향

트리코더마 비리데 AGCC-M41 균주로부터 생산된 엑소-키티나아제의 pH에 의한 영향을 조사하기 위하여, 기질인 팽윤키틴의 pH를 1 N 염산 혹은 1 N 가성소다로 다양하게 조절한 후 효소활성을 측정하여 최적 pH를 결정하였고, 100 mM 초산나트륨 완충용액(pH 3∼6), 말레이트 완충용액(pH 6∼7), 트리스 완충용액(pH 7∼9), 글리신 완충용액(pH 9∼11)으로 pH가 조절된 용액에 효소를 넣고 35℃에서 1시간 방치한 후 잔존 효소활성을 측정함으로써 pH 안정성을 조사하였다. 그 결과, 트리코더마 비리데 AGCC-M41 균주 유래 엑소-키티나아제의 최적 pH는 5.0이었고, pH 4∼6 범위에서 비교적 안정한 것으로 나타났다(도 6). 트리코더마 비리데 AGCC-M41 균주로부터 생산된 엔도-키티나아제의 pH에 의한 영향을 조사하기 위하여, 상기와 동일한 방법으로 팽윤키틴을 기질로 사용하여 효소활성을 측정한 결과, 트리코더마 비리데 AGCC-M41 균주 유래 엔도-키티나아제의 최적 pH는 5.0이었고, pH 4∼7 범위에서 비교적 안정한 것으로 나타났다(도 8).

<5-4> 효소활성에 미치는 온도의 영향

pH 5.0 조건에서 30, 40, 50, 60 및 70℃의 온도별로 효소활성을 측정하여 트리코더마 비리데 AGCC-M41 균주 유래 엑소- 및 엔도-키티나아제의 온도에 의한 영향을 조사하였다. 또한, 각 온도별로 1시간 처리시 효소의 잔존역가를 조사하였다. 그 결과, 트리코더마 비리데 AGCC-M41 균주 유래 엑소-키티나아제의 겉보기 최적 온도는 50℃이었고, 40℃ 이상의 온도에서는 효소의 안정성이 비교적 떨어지는 것으로 나타났다(도 7). 또한, 트리코더마 비리데 AGCC-M41 균주 유래 엔도-키티나아제의 겉보기 최적 온도는 45℃이었고, 50℃ 이상의 온도에서는 효소의 안정성이 비교적 떨어지는 것으로 나타났다(도 9).

실시예 6: 키티나아제 효소제를 이용한 NAG 생산조건의 최적화

<6-1> 효소 첨가량의 영향

1 N HCl을 이용하여 팽윤키틴의 반응 pH를 4.0으로 조정한 후 팽윤키틴 1 g에 대하여 각각 5, 10, 15, 20, 25 및 30 U에 해당하는 실시예 <3-3>에서 제조된 키티나아제 효소제를 첨가한 다음 42.5℃에서 48시간 동안 가수분해 반응을 수행하였다. 이때, 키티나아제 효소제는 약 1:9의 비율로 엔도-키티나아제와 엑소-키티나아제를 포함하고 있다. 그 후, 80℃에서 30분간 열처리하여 효소활성을 정지시킨 다음 NAG 생성량을 측정하여 NAG 전환수율을 결정하였다. 이때, NAG 함량을 측정하기 위하여 가수분해된 용액을 고형분의 함량이 약 10∼100 ㎍/㎖이 되도록 희석한 후 희석액 1 ㎖에 0.8 M 붕산 칼륨(potassium tetraborate) 0.2 ㎖을 첨가하여 3분간 끓는 물에서 가열하였다. 상기 반응액을 급냉한 후 여기에 ρ-다이메틸 아미노벤즈알데하이드(ρ-dimethylaminobenzaldehyde) 10 g을 아세트산 88 ㎖과 10 N HCl 12 ㎖에 용해한 용액 6.0 ㎖를 가하여 37℃에서 20분간 가열하였다. 상기 반응액을 다시 냉각시킨 후 585 ㎚에서 흡광도를 측정하고, 표준품 NAG를 이용하여 작성한 표준곡선과 비교하여 시험용액 중의 NAG 함량을 측정하였다. 본 실시예에서 전환수율(％)은 기질로 사용된 키틴과 이로부터 생성된 NAG의 무게비의 백분율(％)로 나타내었다.

그 결과, 상기 표 6에 나타난 바와 같이, 키티나아제 효소제의 첨가량이 증가함에 따라서 NAG 생성량이 증가하였고, 30 U의 키티나아제 효소제를 첨가하였을 때 키틴 1 g이 NAG로 100％ 전환되었다.

<6-2> 반응 pH의 영향

1 N HCl과 1 N NaOH를 사용하여 팽윤키틴용액의 반응 pH를 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5 및 7.0으로 각각 조정한 다음, 팽윤키틴 1 g에 대하여 30 U에 해당하는 키티나아제 효소제를 첨가하였다. 이를 42.5℃에서 48시간 동안 가수분해시킨 후 80℃에서 30분간 열처리를 하여 효소반응을 정지시키고 실시예 <6-1>에서와 같이 NAG 전환수율을 측정하였다.

그 결과, 표 7에서 보는 바와 같이, 본 발명의 트리코더마 비리데 AGCC-M41 유래 균주 키티나아제는 pH 3.5∼5.0 범위에서 가장 높은 전환수율(약 100％)을 보였다.

<6-3> 반응온도의 영향

1 N HCl을 이용하여 팽윤키틴용액의 반응 pH를 4.0으로 조정한 후 팽윤키틴 1 g에 대하여 30 U의 키티나아제 효소제를 첨가하고 반응온도를 35, 37.5, 40, 42.5 및 45℃로 각각 조절한 후에 48시간 동안 가수분해반응을 수행하였다. 그 후, 80℃에서 30분간 열처리하여 반응을 정지시킨 다음 실시예 <6-1>에서와 같이 NAG 전환수율을 측정하였다.

그 결과, 표 8에서 보는 바와 같이, 본 발명의 트리코더마 비리데 AGCC-M41 균주 유래 키티나아제는 40∼45℃ 사이에서 90％ 이상의 전환수율을 보였고, 특히 42.5℃에서 팽윤키틴을 거의 100％ NAG로 전환시킬 수 있었다.

<6-4> 기질농도의 영향

팽윤키틴의 농도를 1, 2, 3, 4, 5, 6 및 7％로 달리하여 키틴용액을 제조한 후 1 N HCl을 이용하여 반응 pH를 4.0으로 조정하였다. 상기 팽윤키틴용액에 팽윤키틴 1 g에 대하여 30 U의 키티나아제 효소제를 첨가하고 42.5℃에서 48시간 동안 효소반응를 수행하였다. 그 후, 80℃에서 30분간 열처리하여 효소반응을 정지시키 고 실시예 <6-1>에서와 같이 NAG 전환수율을 측정하였다.

그 결과, 표 9에서 보는 바와 같이, 본 발명의 트리코더마 비리데 AGCC-M41 균주 유래 키티나아제는 1∼5％ 농도의 팽윤키틴을 거의 100％ NAG로 전환시켰고, 7％ 농도의 팽윤키틴에서는 약 91％의 NAG 전환수율을 나타내었다.

<6-5> 효소반응에 대한 엑소-키토산아제 첨가 효과

키틴은 제조과정에서 약 10％의 탈아세틸화가 일어나 키틴 분자내에 D-글루코사민 잔기들이 존재한다. 키틴 분자내에 존재하는 D-글루코사민을 효과적으로 분해하기 위해서 키티나아제 외에 엑소-키토산아제를 첨가할 경우의 효과를 조사하였다. pH 4.0으로 조정된 팽윤키틴용액에 팽윤키틴 1 g에 대하여 엑소-키토산아제 3 U를 첨가하고 키티나아제 효소제를 5∼30 U까지 양을 달리하여 첨가한 후에 42.5℃에서 48시간 동안 효소반응을 수행하였다. 그 후, 80℃에서 30분간 열처리를 하여 효소반응을 정지시킨 다음 실시예 <6-1>에서와 같이 NAG 전환수율을 측정하였다.

그 결과, 표 10에 나타난 바와 같이, 키티나아제 효소제만을 첨가하여 반응을 수행한 경우보다 엑소-키토산아제를 부가적으로 첨가하였을 때 10∼20％ 정도 NAG 생산성이 증가하였다.

실시예 7: 키티나아제를 이용한 NAG 생산

5％ 팽윤키틴용액 200 ㎖에 키티나아제 효소제 30 U/g 키틴을 첨가하고 42.5℃, pH 4.0 반응조건에서 48시간 동안 가수분해시켰다. 가수분해반응 완료 후 활성탄 분말을 2 g 첨가하여 50℃에서 20분간 탈색시킨 다음, 여과처리를 통해 활성 탄 및 불순물을 제거하였다. 여과액을 약 60℃에서 50 브릭스(brix)까지 진공농축한 후 4℃에서 12시간 이상 방치하여 용해도 차이에 의해 NAG를 결정화시키고 40℃ 이하의 진공건조기에서 12시간 이상 건조하여 순도 95％ 이상의 NAG 결정분말 8.5 g을 얻었다.

실시예 8: 한외여과를 이용한 키티나아제 효소제의 회수

실시예 7과 같이 5％ 팽윤키틴용액 200 ㎖에 키티나아제 효소제 30 U/g 키틴을 첨가하고 42.5℃, pH 4.0 반응조건에서 48시간 동안 가수분해한 후, 한외여과막(cut-off: 5∼30 kDa)을 사용하여 키티나아제 효소를 회수하였다. NAG 제조에 사용된 총 키티나아제의 역가는 300 U였으며, 이로부터 키티나아제의 회수율은 표 11과 같았다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 트리코더마 비리데 AGCC-M41 균주로부터 생산된 키티나아제 효소제는 효소의 생산수율이 높고 효과적으로 키틴을 가수 분해하여 대부분 NAG로 전환시킬 수 있으므로, 키틴의 효소적 가수분해에 의한 NAG의 생산에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (23)

1. 엑소-키티나아제 및 엔도-키티나아제를 동시에 생산하는 트리코더마 비리데(Trichoderma viride) AGCC-M41(KCTC 10734BP).
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4. 1) 트리코더마 비리데 AGCC-M41(KCTC 10734BP)을 키틴 함유 배지에 접종하여 배양하는 단계;

   2) 상기 배양액으로부터 균사체를 제거하는 단계;

   3) 균사체가 제거된 여액을 한외여과(ultrafiltration)하여 효소를 농축하는 단계;

   4) 상기 농축액으로부터 투석여과(diafiltration)를 통해 배지성분을 제거하는 단계; 및

   5) 상기 여과액을 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 정제하는 단계를 포함하는, 엑소-키티나아제의 제조방법.
5. 제 4항에 있어서,

   단계 1)에서 키틴 함유 배지가 키틴 0.1∼5.0％, 옥수수 침지액 분말(corn-steeped powder) 0.1∼5.0％, 암모늄 설페이트 0.05∼2.0％, 인산칼륨 0.1∼3.0％, 염화칼슘 0.01∼1.0％, 황산마그네슘 0.01∼1.0％, 트라이톤 X-100 0.05∼3.0％ 및 포도당 0.01∼2.0％를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
6. 제 4항에 있어서,

   단계 1)에서 트리코더마 비리데 AGCC-M41(KCTC 10734BP)을 20∼30℃, pH 2.5∼5.0, 통기조건 0.1∼2.0 vvm 및 교반속도 100∼500 rpm으로 72∼168시간 동안 배양하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
7. 제 4항에 있어서,

   컬럼 크로마토그래피가 페닐-토요펄 컬럼 크로마토그래피와 Q-세파로스 컬럼 크로마토그래피를 순차적으로 수행하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
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10. 1) 트리코더마 비리데 AGCC-M41(KCTC 10734BP)을 키틴 함유 배지에 접종하여 배양하는 단계;

    2) 상기 배양액으로부터 균사체를 제거하는 단계;

    3) 균사체가 제거된 여액을 한외여과(ultrafiltration)하여 효소를 농축하는 단계;

    4) 상기 농축액으로부터 투석여과(diafiltration)를 통해 배지성분을 제거하는 단계; 및

    5) 상기 여과액을 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 정제하는 단계를 포함하는, 엔도-키티나아제의 제조방법.
11. 제 10항에 있어서,

    단계 1)에서 키틴 함유 배지가 키틴 0.1∼5.0％, 옥수수 침지액 분말(corn-steeped powder) 0.1∼5.0％, 암모늄 설페이트 0.05∼2.0％, 인산칼륨 0.1∼3.0％, 염화칼슘 0.01∼1.0％, 황산마그네슘 0.01∼1.0％, 트라이톤 X-100 0.05∼3.0％ 및 포도당 0.01∼2.0％를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
12. 제 10항에 있어서,

    단계 1)에서 트리코더마 비리데 AGCC-M41(KCTC 10734BP)을 20∼30℃, pH 2.5∼5.0, 통기조건 0.1∼2.0 vvm 및 교반속도 100∼500 rpm으로 72∼168시간 동안 배양하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
13. 제 10항에 있어서,

    컬럼 크로마토그래피가 페닐-토요펄 컬럼 크로마토그래피와 Q-세파로스 컬럼 크로마토그래피를 순차적으로 수행하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
14. 1) 키틴을 팽윤화하여 효소기질을 준비하는 단계;

    2) 단계 1)에서 얻은 팽윤키틴을 트리코더마 비리데 AGCC-M41 (KCTC 10734BP)로부터 얻은 키티아나제를 이용하여 가수분해하는 단계;

    3) 단계 2)에서 얻은 가수분해액을 진공농축하는 단계;

    4) 단계 3)에서 얻은 농축액을 탈색 및 여과하는 단계;

    5) 단계 4)에서 얻은 여과액으로부터 N-아세틸글루코사민을 결정화시키는 단계; 및

    6) 단계 5)에서 얻은 N-아세틸글루코사민 결정을 건조시키는 단계를 포함하는, 트리코더마 비리데 AGCC-M41(KCTC 10734BP) 유래 키티나아제를 이용한 N-아세틸글루코사민의 생산방법.
15. 제 14항에 있어서,

    단계 1)에서 키틴에 2∼4배 부피의 강산을 첨가하고 상온에서 4∼12시간 동안 교반하여 키틴을 팽윤시키는 것을 특징으로 하는 생산방법.
16. 제 15항에 있어서,

    팽윤된 키틴을 물에 1∼10 ％(w/v) 농도로 용해시켜 효소기질을 준비하는 것을 특징으로 하는 생산방법.
17. 제 14항에 있어서,

    단계 2)에서 키티나아제를 팽윤키틴 g당 1∼100 U의 양으로 사용하는 것을 특징으로 하는 생산방법.
18. 제 14항에 있어서,

    가수분해 반응을 30∼60℃, pH 3.0∼7.0에서 24∼72시간 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 생산방법.
19. 제 14항에 있어서,

    단계 2)에서 엑소-키토산아제가 추가로 첨가되는 것을 특징으로 하는 생산방법.
20. 제 19항에 있어서,

    엑소-키토산아제가 팽윤키틴 1 g당 5∼30 U의 양으로 첨가되는 것을 특징으로 하는 생산방법.
21. 제 14항에 있어서,

    가수분해 반응 후 한외여과(분자량 컷-오프치: 8∼30 kDa)를 통해 키티나아제를 회 수하고 가수분해액을 얻는 것을 특징으로 하는 생산방법.
22. 제 14항에 있어서,

    단계 4)에서 농축액의 액량 대비 1∼10％의 활성탄을 첨가하여 30∼60℃의 온도에서 탈색하는 것을 특징으로 하는 생산방법.
23. 제 22항에 있어서,

    0.1∼1.0％의 규조토를 추가로 첨가하는 것을 특징으로 하는 생산방법.

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