JP2000116376A - 新規なκ−カラゲナーゼ、その産生微生物、その製造方法及びその用途 - Google Patents
新規なκ−カラゲナーゼ、その産生微生物、その製造方法及びその用途Info
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- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 κ−カラゲナンに対する分解活性を有する新
規なκ−カラゲナーゼを得る。 【解決手段】 κ−カラゲナーゼは、主にネオカラビオ
ース（２糖類）とネオカラテトラオース（４糖類）とに
まで低分子化する反応を触媒する酵素であって、次の理
化学的性質を有する。(a)分子量は35,000。(b)等電点は
9.2。(c)溶解性は水溶性。(d)作用は３，６−アンヒド
ロ−Ｄ−ガラクトースとＤ−ガラクトースとがα−１，
３−結合した２糖であるカラビオースを基本構造とし、
このカラビオースがβ−１，４−結合で多数重合し、更
にＤ−ガラクトース残基のＣ−４位水酸基に硫酸基がエ
ステル結合した多糖であるκ−カラゲナンに特異的に作
用し、ネオカラビオース、パラニトロフェニル−β−ガ
ラクトピラノシド、寒天並びにポルフィランには作用し
ない。(e) 至適温度；４０℃。(f) 至適ｐＨ；ｐＨ8.
0。(g) ｐＨ安定性；ｐＨ 3.0〜11.0。(h) 熱安定性；
４０℃まで安定。
規なκ−カラゲナーゼを得る。 【解決手段】 κ−カラゲナーゼは、主にネオカラビオ
ース（２糖類）とネオカラテトラオース（４糖類）とに
まで低分子化する反応を触媒する酵素であって、次の理
化学的性質を有する。(a)分子量は35,000。(b)等電点は
9.2。(c)溶解性は水溶性。(d)作用は３，６−アンヒド
ロ−Ｄ−ガラクトースとＤ−ガラクトースとがα−１，
３−結合した２糖であるカラビオースを基本構造とし、
このカラビオースがβ−１，４−結合で多数重合し、更
にＤ−ガラクトース残基のＣ−４位水酸基に硫酸基がエ
ステル結合した多糖であるκ−カラゲナンに特異的に作
用し、ネオカラビオース、パラニトロフェニル−β−ガ
ラクトピラノシド、寒天並びにポルフィランには作用し
ない。(e) 至適温度；４０℃。(f) 至適ｐＨ；ｐＨ8.
0。(g) ｐＨ安定性；ｐＨ 3.0〜11.0。(h) 熱安定性；
４０℃まで安定。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、κ−カラゲナーゼ
活性を有する新規酵素、この酵素を産生する新規微生
物、この酵素の製造方法、及びこの酵素を用いたオリゴ
糖、プロトプラストの製造方法に関するものである。
活性を有する新規酵素、この酵素を産生する新規微生
物、この酵素の製造方法、及びこの酵素を用いたオリゴ
糖、プロトプラストの製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】κ−カラゲナンはある種の紅藻の細胞壁
に含まれる海藻特有の多糖類であり、セルロースやデン
プンなどの多糖と比べて、研究が立ち後れている。κ−
カラゲナーゼは、κ−カラゲナンを含む海藻細胞壁多糖
の構造解明に大きく寄与し、また、κ−カラゲナンから
のネオカラオリゴ糖の調製にも有用な酵素である。
に含まれる海藻特有の多糖類であり、セルロースやデン
プンなどの多糖と比べて、研究が立ち後れている。κ−
カラゲナーゼは、κ−カラゲナンを含む海藻細胞壁多糖
の構造解明に大きく寄与し、また、κ−カラゲナンから
のネオカラオリゴ糖の調製にも有用な酵素である。
【０００３】図１はκ−カラゲナンの化学構造を示す説
明図である。図に示す通り、κ−カラゲナンは、可溶性
の酸性多糖類であり、硫酸基をもち、３，６−アンヒド
ロ−Ｄ−ガラクトースとＤ−ガラクトースとがα−１，
３−結合したカラビオース（3,6-anhydro-D-galactose-
α-1,3-D-galactose-4-O-sulfate）がβ−１，４−結合
で直線状に繋がって形成されている。
明図である。図に示す通り、κ−カラゲナンは、可溶性
の酸性多糖類であり、硫酸基をもち、３，６−アンヒド
ロ−Ｄ−ガラクトースとＤ−ガラクトースとがα−１，
３−結合したカラビオース（3,6-anhydro-D-galactose-
α-1,3-D-galactose-4-O-sulfate）がβ−１，４−結合
で直線状に繋がって形成されている。
【０００４】近年、海洋生物資源としての海藻類の有効
利用の観点から、また、新規素材物質としてのネオカラ
オリゴ糖の製造方法の観点から、強力な分解力を有する
κ−カラゲナン分解酵素やκ−カラゲナーゼ産生能を有
する新規な微生物の探索が行われているが、本酵素につ
いての知見は非常に乏しいのが現状である。
利用の観点から、また、新規素材物質としてのネオカラ
オリゴ糖の製造方法の観点から、強力な分解力を有する
κ−カラゲナン分解酵素やκ−カラゲナーゼ産生能を有
する新規な微生物の探索が行われているが、本酵素につ
いての知見は非常に乏しいのが現状である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、上記事
情に鑑み、鋭意研究の結果、海底泥中より分離した海洋
性細菌が海藻多糖の成分であるκ−カラゲナンを効率よ
く分解し、κ−カラゲナンから大量のネオカラオリゴ糖
を調製する上で優れた酵素を生産する細菌であることを
発見し、更に、本細菌からκ−カラゲナーゼを単離精製
することにより、本発明を完成するに至った。
情に鑑み、鋭意研究の結果、海底泥中より分離した海洋
性細菌が海藻多糖の成分であるκ−カラゲナンを効率よ
く分解し、κ−カラゲナンから大量のネオカラオリゴ糖
を調製する上で優れた酵素を生産する細菌であることを
発見し、更に、本細菌からκ−カラゲナーゼを単離精製
することにより、本発明を完成するに至った。
【０００６】即ち、本発明は、κ−カラゲナンに対する
分解活性を有する新規なκ−カラゲナーゼを得ることを
目的とする。また、このκ−カラゲナーゼを産生する新
規な微生物を得ることを別の目的とする。更に、このκ
−カラゲナーゼを産生する微生物を用いたκ−カラゲナ
ーゼの製造方法を得ることを別の目的とする。また、こ
のκ−カラゲナーゼを用いる用途として、ネオカラオリ
ゴ糖の製造方法及び海藻細胞のプロトプラストの製造方
法を得ることを目的とする。
分解活性を有する新規なκ−カラゲナーゼを得ることを
目的とする。また、このκ−カラゲナーゼを産生する新
規な微生物を得ることを別の目的とする。更に、このκ
−カラゲナーゼを産生する微生物を用いたκ−カラゲナ
ーゼの製造方法を得ることを別の目的とする。また、こ
のκ−カラゲナーゼを用いる用途として、ネオカラオリ
ゴ糖の製造方法及び海藻細胞のプロトプラストの製造方
法を得ることを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本請求項１に記載された
発明に係るκ−カラゲナーゼは、κ−カラゲナンを分解
し、主にネオカラビオース（２糖類）とネオカラテトラ
オース（４糖類）とにまで低分子化する反応を触媒する
酵素である。具体的な理化学的性質は後に詳述する。
発明に係るκ−カラゲナーゼは、κ−カラゲナンを分解
し、主にネオカラビオース（２糖類）とネオカラテトラ
オース（４糖類）とにまで低分子化する反応を触媒する
酵素である。具体的な理化学的性質は後に詳述する。
【０００８】本請求項２に記載された発明に係るκ−カ
ラゲナーゼ産生微生物は、請求項１に記載されたκ−カ
ラゲナーゼを産生する新規な海洋性細菌であるビブリオ
属菌株CA-1004（Vibrio sp. CA-1004）を開示するもの
である。
ラゲナーゼ産生微生物は、請求項１に記載されたκ−カ
ラゲナーゼを産生する新規な海洋性細菌であるビブリオ
属菌株CA-1004（Vibrio sp. CA-1004）を開示するもの
である。
【０００９】本請求項３に記載された発明に係るκ−カ
ラゲナーゼの製造方法は、請求項１に記載されたκ−カ
ラゲナーゼを製造する方法であって、κ−カラゲナーゼ
を産生する能力を有するビブリオ属に属する微生物をκ
−カラゲナンを炭素源として培養し、その培養上清液か
ら分離・採取するものである。
ラゲナーゼの製造方法は、請求項１に記載されたκ−カ
ラゲナーゼを製造する方法であって、κ−カラゲナーゼ
を産生する能力を有するビブリオ属に属する微生物をκ
−カラゲナンを炭素源として培養し、その培養上清液か
ら分離・採取するものである。
【００１０】本請求項４に記載された発明に係るネオカ
ラオリゴ糖の製造方法は、請求項１に記載されたκ−カ
ラゲナーゼで、κ−カラゲナンを基質として作用させる
ものである。
ラオリゴ糖の製造方法は、請求項１に記載されたκ−カ
ラゲナーゼで、κ−カラゲナンを基質として作用させる
ものである。
【００１１】本請求項５に記載された発明に係る海藻細
胞のプロトプラストの製造方法は、請求項１に記載され
たκ−カラゲナーゼを海藻に作用させるものである。
胞のプロトプラストの製造方法は、請求項１に記載され
たκ−カラゲナーゼを海藻に作用させるものである。
【００１２】
【発明の実施の形態】本発明におけるκ−カラゲナーゼ
は、主にネオカラビオース（２糖類）とネオカラテトラ
オース（４糖類）とにまで低分子化する反応を触媒する
特徴を有する酵素であって、下記の理化学的性質を有す
る。
は、主にネオカラビオース（２糖類）とネオカラテトラ
オース（４糖類）とにまで低分子化する反応を触媒する
特徴を有する酵素であって、下記の理化学的性質を有す
る。
【００１３】(a) 分子量 SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）によ
る測定の結果は、35,000である。 (b) 等電点 等電点電気泳動の結果は、9.2 である。 (c) 溶解性 水溶性である。 (d) 作用 3,6-アンヒドロ−Ｄ−ガラクトースとＤ−ガラクトース
とがα−１，３−結合した２糖、カラビオースを基本構
造とし、このカラビオースが β−１，４−結合で多数
重合し、さらにＤ−ガラクトース残基のＣ−４位水酸基
に硫酸基がエステル結合した多糖であるκ−カラゲナン
に特異的に作用する。ネオカラビオースやパラニトロフ
ェニル−β−ガラクトピラノシドならびに寒天やポルフ
ィランには作用しない。 (e) 至適温度 ４０℃ (f) 至適ｐＨ ｐＨ 8.0 (g) ｐＨ安定性 ｐＨ 3.0〜11.0 (h) 熱安定性 ４０℃まで安定
る測定の結果は、35,000である。 (b) 等電点 等電点電気泳動の結果は、9.2 である。 (c) 溶解性 水溶性である。 (d) 作用 3,6-アンヒドロ−Ｄ−ガラクトースとＤ−ガラクトース
とがα−１，３−結合した２糖、カラビオースを基本構
造とし、このカラビオースが β−１，４−結合で多数
重合し、さらにＤ−ガラクトース残基のＣ−４位水酸基
に硫酸基がエステル結合した多糖であるκ−カラゲナン
に特異的に作用する。ネオカラビオースやパラニトロフ
ェニル−β−ガラクトピラノシドならびに寒天やポルフ
ィランには作用しない。 (e) 至適温度 ４０℃ (f) 至適ｐＨ ｐＨ 8.0 (g) ｐＨ安定性 ｐＨ 3.0〜11.0 (h) 熱安定性 ４０℃まで安定
【００１４】本発明のκ−カラゲナーゼは微生物を用い
て生産される。この酵素の生産方法としては、酵素を生
産する微生物を培養して微生物の内部又は培養上清から
分離・採取することから生成することができる。この酵
素を生産する微生物としては、例えば、本発明では新た
に海底泥中から分離されたビブリオ属菌株 CA-1004（Vi
brio sp. CA-1004）を用いることができる。本菌株は生
工研菌寄第１７０１７号（平成１０年１０月０５日寄
託）として既に寄託されている。
て生産される。この酵素の生産方法としては、酵素を生
産する微生物を培養して微生物の内部又は培養上清から
分離・採取することから生成することができる。この酵
素を生産する微生物としては、例えば、本発明では新た
に海底泥中から分離されたビブリオ属菌株 CA-1004（Vi
brio sp. CA-1004）を用いることができる。本菌株は生
工研菌寄第１７０１７号（平成１０年１０月０５日寄
託）として既に寄託されている。
【００１５】尚、本発明のκ−カラゲナーゼを製造する
方法及びその用途に用いる微生物としては、前記ビブリ
オ属菌株 CA-1004（Vibrio sp. CA-1004）とその変種、
変異株に限定されるものではなく、前記κ−カラゲナー
ゼ生産能を有するものであれば良い。
方法及びその用途に用いる微生物としては、前記ビブリ
オ属菌株 CA-1004（Vibrio sp. CA-1004）とその変種、
変異株に限定されるものではなく、前記κ−カラゲナー
ゼ生産能を有するものであれば良い。
【００１６】具体的なκ−カラゲナーゼの製造方法とし
ては、このκ−カラゲナーゼ生産能を有する微生物をκ
−カラゲナンを炭素源として培養し、その培養上清液か
ら分離して精製するものである。この培地は、炭素源と
してκ−カラゲナンを含む他に、窒素源、無機化合物等
の栄養素を適当量含有するものであれば、天然培地、合
成培地の何れも使用することができる。
ては、このκ−カラゲナーゼ生産能を有する微生物をκ
−カラゲナンを炭素源として培養し、その培養上清液か
ら分離して精製するものである。この培地は、炭素源と
してκ−カラゲナンを含む他に、窒素源、無機化合物等
の栄養素を適当量含有するものであれば、天然培地、合
成培地の何れも使用することができる。
【００１７】具体的なκ−カラゲナンを含む炭素源とし
ては、紅藻ツノマタ属などから分離したκ−カラゲナン
を用いることもできる。
ては、紅藻ツノマタ属などから分離したκ−カラゲナン
を用いることもできる。
【００１８】また、窒素源としては、通常の培地の組成
で用いるものが使用できる。例えば、肉エキス、ペプト
ン、酵母エキス、乾燥酵母、カザミノ酸、各種アミノ
酸、尿素等の動植物等の加水分解物や各種無機アンモニ
ウム塩、硝酸塩等の有機又は無機窒素源を、１種又は２
種以上を用いることができる。
で用いるものが使用できる。例えば、肉エキス、ペプト
ン、酵母エキス、乾燥酵母、カザミノ酸、各種アミノ
酸、尿素等の動植物等の加水分解物や各種無機アンモニ
ウム塩、硝酸塩等の有機又は無機窒素源を、１種又は２
種以上を用いることができる。
【００１９】更に、無機化合物としては、培養される微
生物の必須無機塩として、ナトリウム、マグネシウム、
カルシウム、鉄、マンガン等のリン酸塩、塩酸塩、硫酸
塩、炭酸塩、酢酸塩等を１種以上用いることができる。
生物の必須無機塩として、ナトリウム、マグネシウム、
カルシウム、鉄、マンガン等のリン酸塩、塩酸塩、硫酸
塩、炭酸塩、酢酸塩等を１種以上用いることができる。
【００２０】培養は、目的のκ−カラゲナーゼを産生す
る微生物の培養に応じた培養方法及び条件が選択され
る。例えば、好気性微生物であれば、振盪培養、通気撹
拌培養等により大量に培養することができ、良好であ
る。
る微生物の培養に応じた培養方法及び条件が選択され
る。例えば、好気性微生物であれば、振盪培養、通気撹
拌培養等により大量に培養することができ、良好であ
る。
【００２１】微生物の培養によって産生されたκ−カラ
ゲナーゼは、通常の方法によって、分離・精製される。
例えば、菌体中に酵素を保有する場合には、菌体を通常
用いられている手段によって破砕してκ−カラゲナーゼ
を抽出して精製される。また、培養液中に産生されたκ
−カラゲナーゼは、微生物を濾過・遠心分離等の方法で
除去して精製される。
ゲナーゼは、通常の方法によって、分離・精製される。
例えば、菌体中に酵素を保有する場合には、菌体を通常
用いられている手段によって破砕してκ−カラゲナーゼ
を抽出して精製される。また、培養液中に産生されたκ
−カラゲナーゼは、微生物を濾過・遠心分離等の方法で
除去して精製される。
【００２２】精製方法としては、通常用いられる精製方
法を利用することができる。例えば、塩析、溶媒沈殿に
より、κ−カラゲナーゼを沈殿させて培養液中から分離
して、精製することができる。また、沈殿させたものを
更にイオン交換クロマトグラフィや吸着クロマトグラフ
ィ，等電点電気泳動等により、更に精製することもでき
る。
法を利用することができる。例えば、塩析、溶媒沈殿に
より、κ−カラゲナーゼを沈殿させて培養液中から分離
して、精製することができる。また、沈殿させたものを
更にイオン交換クロマトグラフィや吸着クロマトグラフ
ィ，等電点電気泳動等により、更に精製することもでき
る。
【００２３】得られたκ−カラゲナーゼの用途として
は、オリゴ糖の生産や研究試薬として利用することがで
きる。例えば、κ−カラゲナンを基質として作用させる
ことにより、ネオカラオリゴ糖を製造することができ
る。このκ−カラゲナンから得られるネオカラオリゴ糖
は、海藻細胞壁の構造研究やκ−カラゲナーゼの酵素学
的性質を解明する上での研究用試薬として利用できる。
は、オリゴ糖の生産や研究試薬として利用することがで
きる。例えば、κ−カラゲナンを基質として作用させる
ことにより、ネオカラオリゴ糖を製造することができ
る。このκ−カラゲナンから得られるネオカラオリゴ糖
は、海藻細胞壁の構造研究やκ−カラゲナーゼの酵素学
的性質を解明する上での研究用試薬として利用できる。
【００２４】また、得られたκ−カラゲナーゼの研究試
薬の用途としては、例えば、紅藻ツノマタ（Chondrus o
cellatus）等の海藻に作用させることにより、容易に海
藻からプロトプラストを単離することができる。
薬の用途としては、例えば、紅藻ツノマタ（Chondrus o
cellatus）等の海藻に作用させることにより、容易に海
藻からプロトプラストを単離することができる。
【００２５】
【実施例】１．海底泥中よりのビブリオ属（Vibrio s
p.）菌の採取 海底泥中に生息する微生物からκ−カラゲナーゼ活性の
高い微生物を分離選択した。具体的には、海底泥中に棲
息する海洋性微生物を単離し、個々の微生物をκ−カラ
ゲナンを炭素源とする培地中で培養し、κ−カラゲナー
ゼ活性を測定したところ、κ−カラゲナーゼ活性の最も
高い微生物（Strain no. CA-1004）を得た。
p.）菌の採取 海底泥中に生息する微生物からκ−カラゲナーゼ活性の
高い微生物を分離選択した。具体的には、海底泥中に棲
息する海洋性微生物を単離し、個々の微生物をκ−カラ
ゲナンを炭素源とする培地中で培養し、κ−カラゲナー
ゼ活性を測定したところ、κ−カラゲナーゼ活性の最も
高い微生物（Strain no. CA-1004）を得た。
【００２６】尚、本実施例におけるκ−カラゲナーゼ活
性の測定は次のように行われた。０．５％のκ−カラゲ
ナンを含む100mM ＭＥＳ緩衝液，ｐＨ 8.0，の０．９ｍ
ｌに酵素液０．１ｍｌを加え、３７℃で１０分間反応さ
せ、生じた還元糖の増加をソモジ・ネルソン（Somogyi-
Nelson）法（Somogyi, M. (1952) Notes on sugar dete
rmination. J. Biol. Chem., 195, 19-23.）で測定し
た。酵素活性の１unitは上記反応条件で、１分間に１μ
mol のＤ−ガラクトースに相当する還元力を生ずる酵素
量と定義した。
性の測定は次のように行われた。０．５％のκ−カラゲ
ナンを含む100mM ＭＥＳ緩衝液，ｐＨ 8.0，の０．９ｍ
ｌに酵素液０．１ｍｌを加え、３７℃で１０分間反応さ
せ、生じた還元糖の増加をソモジ・ネルソン（Somogyi-
Nelson）法（Somogyi, M. (1952) Notes on sugar dete
rmination. J. Biol. Chem., 195, 19-23.）で測定し
た。酵素活性の１unitは上記反応条件で、１分間に１μ
mol のＤ−ガラクトースに相当する還元力を生ずる酵素
量と定義した。
【００２７】２．菌学的性質 このκ−カラゲナーゼ活性の最も高い微生物は、Bergey
s' Manual SystematicBacteriologyの記載に準拠して同
定を行ったところ、次に示す結果から Vibrioに属して
いることが判明した。この微生物の形態は、次の表１に
示すものである。また、表２に生理学的試験結果を示
す。この表１及び表２の結果より、本微生物は海洋性細
菌 Vibrio sp.であることが確認された。尚、本細菌を
Vibrio sp.CA-1004と命名した。
s' Manual SystematicBacteriologyの記載に準拠して同
定を行ったところ、次に示す結果から Vibrioに属して
いることが判明した。この微生物の形態は、次の表１に
示すものである。また、表２に生理学的試験結果を示
す。この表１及び表２の結果より、本微生物は海洋性細
菌 Vibrio sp.であることが確認された。尚、本細菌を
Vibrio sp.CA-1004と命名した。
【００２８】
【表１】
【００２９】
【表２】
【００３０】即ち、グラム陰性で極毛を有し、ＯＦテス
トでは発酵性で、カタラーゼならびにオキシダーゼテス
ト陽性、グルコース培地から酸を産生するが、ガスは産
生せず、Vibrio static agentに感受性があった。
トでは発酵性で、カタラーゼならびにオキシダーゼテス
ト陽性、グルコース培地から酸を産生するが、ガスは産
生せず、Vibrio static agentに感受性があった。
【００３１】ビブリオ属（Vibrio sp.） CA-1004の酵素
生成と炭素源としての糖やアミノ酸の利用性等を調べ
た。結果を次の表３と表４に示す。
生成と炭素源としての糖やアミノ酸の利用性等を調べ
た。結果を次の表３と表４に示す。
【００３２】
【表３】
【００３３】
【表４】
【００３４】本細菌（Vibrio sp. CA-1004）は、酵素産
生のための誘導物質として、κ−カラゲナンを必要と
し、その濃度を０．３％とし、その他、０．１％ポリペ
プトン、０．１％酵母エキス、５％塩化ナトリウム、
０．０５％硫酸マグネシウム、０．２％リン酸水素二カ
リウム、０．０４％リン酸水素一カリウムの組成からな
る培地を用いて、２５℃、２日間、振盪培養した場合、
1,000ｍｌの培地から560unitsのκ−カラゲナーゼを得
ることができた。
生のための誘導物質として、κ−カラゲナンを必要と
し、その濃度を０．３％とし、その他、０．１％ポリペ
プトン、０．１％酵母エキス、５％塩化ナトリウム、
０．０５％硫酸マグネシウム、０．２％リン酸水素二カ
リウム、０．０４％リン酸水素一カリウムの組成からな
る培地を用いて、２５℃、２日間、振盪培養した場合、
1,000ｍｌの培地から560unitsのκ−カラゲナーゼを得
ることができた。
【００３５】３．κ−カラゲナーゼの精製 産生されたκ−カラゲナーゼを精製した。即ち、本細菌
を上記の条件で大量培養し、遠心分離して得られた培養
上清液に７５％飽和になるように硫酸アンモニウムを加
えた。４℃で１日放置後、遠心分離し、生じた沈殿を少
量の５０ｍＭＭＥＳ緩衝液ｐＨ７．５に溶解し、同緩衝
液で透析後、透析内液を塩析酵素液として用いた。
を上記の条件で大量培養し、遠心分離して得られた培養
上清液に７５％飽和になるように硫酸アンモニウムを加
えた。４℃で１日放置後、遠心分離し、生じた沈殿を少
量の５０ｍＭＭＥＳ緩衝液ｐＨ７．５に溶解し、同緩衝
液で透析後、透析内液を塩析酵素液として用いた。
【００３６】塩析酵素液を陰イオン交換クロマトグラフ
ィー（Q-Sepharose FF）、吸着クロマトグラフィー（Gi
gapite）、陰イオン交換クロマトグラフィー（Mono QHR
5/5）で分画したところ、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド
電気泳動で均一に精製されていることが判明した。
ィー（Q-Sepharose FF）、吸着クロマトグラフィー（Gi
gapite）、陰イオン交換クロマトグラフィー（Mono QHR
5/5）で分画したところ、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド
電気泳動で均一に精製されていることが判明した。
【００３７】４．κ−カラゲナーゼの酵素学的性質 得られたκ−カラゲナーゼの分子量、等電点、溶解性、
至適ｐＨ，ｐＨ安定性、至適温度を測定した。結果を次
の表５に示す。
至適ｐＨ，ｐＨ安定性、至適温度を測定した。結果を次
の表５に示す。
【００３８】
【表５】
【００３９】また、精製κ−カラゲナーゼのκ−カラゲ
ナン、寒天、ＰＮＰ−β−ガラクトシド、ネオカラビオ
ース、ネオカラテトラオース、ネオカラヘキサオース、
ネオカラオクタオース、ネオカラデカオース及びネオカ
ラドデカオースに対する作用様式を調べた。その結果を
表６に示す。
ナン、寒天、ＰＮＰ−β−ガラクトシド、ネオカラビオ
ース、ネオカラテトラオース、ネオカラヘキサオース、
ネオカラオクタオース、ネオカラデカオース及びネオカ
ラドデカオースに対する作用様式を調べた。その結果を
表６に示す。
【００４０】
【表６】
【００４１】５．κ−カラゲナーゼの用途 ５．１ κ−カラゲナンからのネオカラオリゴ糖の精製 κ−カラゲナンからオリゴ糖を調製する方法として酸に
よる加水分解がある。しかしながら、酸加水分解法は１
００℃での加熱を要し、また、反応時間が長いと、オリ
ゴ糖が更に単糖に分解されてしまうため、効率よくオリ
ゴ糖を調製することが困難である。
よる加水分解がある。しかしながら、酸加水分解法は１
００℃での加熱を要し、また、反応時間が長いと、オリ
ゴ糖が更に単糖に分解されてしまうため、効率よくオリ
ゴ糖を調製することが困難である。
【００４２】それに対して、前記κ−カラゲナーゼを用
いる方法では室温で効率よくオリゴ糖を調製することが
可能である。すなわち、１００ｍｌ容三角フラスコに１
％κ−カラゲナンを含む２０ｍＭ酢酸緩衝液を２０ｍｌ
注入しVibrio sp. CA-1004のκ−カラゲナーゼ溶液（１
unit／ｍｌ）を２ｍｌ加え、３７℃、２０時間反応させ
た。反応フラスコを沸騰水浴中に１５分間浸漬して反応
を停止し、冷却後遠心分離し、上澄液を集めた。この上
澄液を凍結乾燥することにより、ネオカラオリゴ糖を得
た。このネオカラオリゴ糖は、ネオカラビオース以外に
も、４糖、６糖等も含んでおり、ゲル濾過法により精製
することにより、それぞれ単離することができた。
いる方法では室温で効率よくオリゴ糖を調製することが
可能である。すなわち、１００ｍｌ容三角フラスコに１
％κ−カラゲナンを含む２０ｍＭ酢酸緩衝液を２０ｍｌ
注入しVibrio sp. CA-1004のκ−カラゲナーゼ溶液（１
unit／ｍｌ）を２ｍｌ加え、３７℃、２０時間反応させ
た。反応フラスコを沸騰水浴中に１５分間浸漬して反応
を停止し、冷却後遠心分離し、上澄液を集めた。この上
澄液を凍結乾燥することにより、ネオカラオリゴ糖を得
た。このネオカラオリゴ糖は、ネオカラビオース以外に
も、４糖、６糖等も含んでおり、ゲル濾過法により精製
することにより、それぞれ単離することができた。
【００４３】５．２ ツノマタからのプロトプラストの
調製 カラゲナンの原料藻であるツノマタの優良産業品種の開
発を行う上で、細胞融合や遺伝子操作によるバイオテク
ノロジーは優れた手法である。バイオテクノロジーを行
うためには酵素で細胞壁を溶解し、プロトプラストを作
出する方法の開発が必要とされている。前記、κ−カラ
ゲナーゼと市販のセルラーゼならびにマセロチームを用
いることにより、ツノマタから多量のプロトプラストを
作出することが可能である。
調製 カラゲナンの原料藻であるツノマタの優良産業品種の開
発を行う上で、細胞融合や遺伝子操作によるバイオテク
ノロジーは優れた手法である。バイオテクノロジーを行
うためには酵素で細胞壁を溶解し、プロトプラストを作
出する方法の開発が必要とされている。前記、κ−カラ
ゲナーゼと市販のセルラーゼならびにマセロチームを用
いることにより、ツノマタから多量のプロトプラストを
作出することが可能である。
【００４４】具体的にはツノマタ１ｇを、５％パパイン
と０．８Ｍマンニトール含有２０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液
（ｐＨ７．０）の３０ｍｌとを入れた１００ｍｌ容ビー
カーに加え、２２℃、３０分間振盪した。葉状体を０．
７Ｍマンニトール、２％ＮａＣ１を含む２０ｍＭ ＭＥ
Ｓ緩衝液（ｐＨ７．０）で５回洗浄後、メスで数mm片に
切断した。次いで、２０ｍｌ容三角フラスコに分注した
８．０ｍｌの細胞壁溶解酵素液（２ｕｎｉｔｓ 本発明
のκ−カラゲナーゼ、２％セルラーゼ（ヤクルト薬品工
業社製）、１％マセロチーム（ヤクルト薬品工業社
製））に葉状体断片を投入し、２２℃で振盪した。
と０．８Ｍマンニトール含有２０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液
（ｐＨ７．０）の３０ｍｌとを入れた１００ｍｌ容ビー
カーに加え、２２℃、３０分間振盪した。葉状体を０．
７Ｍマンニトール、２％ＮａＣ１を含む２０ｍＭ ＭＥ
Ｓ緩衝液（ｐＨ７．０）で５回洗浄後、メスで数mm片に
切断した。次いで、２０ｍｌ容三角フラスコに分注した
８．０ｍｌの細胞壁溶解酵素液（２ｕｎｉｔｓ 本発明
のκ−カラゲナーゼ、２％セルラーゼ（ヤクルト薬品工
業社製）、１％マセロチーム（ヤクルト薬品工業社
製））に葉状体断片を投入し、２２℃で振盪した。
【００４５】未分解の葉状体断片を取り除くために４０
μｍのナイロンネットで濾別し、ネットを通過したプロ
トプラストを遠心分離（ＴＯＭＹ ＬＣ−１２１，７０
×ｇ５分間）して集め、次いで、０．７Ｍマンニトール
を含む各ＡＳＰ１２（ＮＴＡ）培地で遠心洗浄した。
μｍのナイロンネットで濾別し、ネットを通過したプロ
トプラストを遠心分離（ＴＯＭＹ ＬＣ−１２１，７０
×ｇ５分間）して集め、次いで、０．７Ｍマンニトール
を含む各ＡＳＰ１２（ＮＴＡ）培地で遠心洗浄した。
【００４６】以上説明した通り、本発明のVibrio sp. C
A-1004から得られるκ−カラゲナーゼはκ−カラゲナン
を分解してネオカラビオースやネオカラテトラオースな
どへの低分子化反応を触媒する特徴を有する酵素であ
る。更に、本発明のκ−カラゲナーゼは微生物を用いて
生産され、また、酵素は微生物の内部又は培養上清から
生成することができる。κ−カラゲナーゼの製造方法と
しては、この酵素生産能を有する微生物をκ−カラゲナ
ンを炭素源にして培養し、その培養上清液から分離して
精製するものである。
A-1004から得られるκ−カラゲナーゼはκ−カラゲナン
を分解してネオカラビオースやネオカラテトラオースな
どへの低分子化反応を触媒する特徴を有する酵素であ
る。更に、本発明のκ−カラゲナーゼは微生物を用いて
生産され、また、酵素は微生物の内部又は培養上清から
生成することができる。κ−カラゲナーゼの製造方法と
しては、この酵素生産能を有する微生物をκ−カラゲナ
ンを炭素源にして培養し、その培養上清液から分離して
精製するものである。
【００４７】更に、本発明のκ−カラゲナーゼは、κ−
カラゲナンを基質として作用させることにより、ネオカ
ラオリゴ糖を製造することができる。このκ−カラゲナ
ンから得られるオリゴ糖は海藻細胞壁多糖の研究用試薬
として有用である。本発明のκ−カラゲナーゼは、紅藻
ツノマタに作用させることにより、容易にツノマタ細胞
壁を溶解し、プロトプラストを作製することができると
いう効果がある。
カラゲナンを基質として作用させることにより、ネオカ
ラオリゴ糖を製造することができる。このκ−カラゲナ
ンから得られるオリゴ糖は海藻細胞壁多糖の研究用試薬
として有用である。本発明のκ−カラゲナーゼは、紅藻
ツノマタに作用させることにより、容易にツノマタ細胞
壁を溶解し、プロトプラストを作製することができると
いう効果がある。
【００４８】
【発明の効果】本発明は以上説明した通り、κ−カラゲ
ナンに対する分解活性を有する新規なκ−カラゲナーゼ
を得ることができる。また、このκ−カラゲナーゼを産
生する新規な微生物を得ることができる。更に、このκ
−カラゲナーゼを産生する微生物を用いたκ−カラゲナ
ーゼの製造方法を得ることができる。また、このκ−カ
ラゲナーゼを用いる用途として、ネオカラオリゴ糖の製
造方法及び海藻細胞のプロトプラストの製造方法を得る
ことができるという効果がある。
ナンに対する分解活性を有する新規なκ−カラゲナーゼ
を得ることができる。また、このκ−カラゲナーゼを産
生する新規な微生物を得ることができる。更に、このκ
−カラゲナーゼを産生する微生物を用いたκ−カラゲナ
ーゼの製造方法を得ることができる。また、このκ−カ
ラゲナーゼを用いる用途として、ネオカラオリゴ糖の製
造方法及び海藻細胞のプロトプラストの製造方法を得る
ことができるという効果がある。
【図１】κ−カラゲナンの化学構造を示す説明図であ
る。
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｎ 9/24 Ｃ１２Ｒ 1:63） (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:63） Ｆターム(参考） 4B050 CC01 DD02 FF03E FF04E FF05E FF10E FF13E LL05 LL10 4B064 AF04 AG01 CA02 CC01 CC03 CD19 CE03 CE04 CE06 CE11 CE14 DA10 DA11 DA13 DA16 4B065 AA55X AC12 AC14 AC15 BB01 BB18 BC01 BC26 BD14 BD15 BD17 BD50 CA31 CA41 CA46 CA53
Claims (5)
- 【請求項１】 κ−カラゲナンを分解し、主にネオカラ
ビオース（２糖類）とネオカラテトラオース（４糖類）
にまで低分子化する反応を触媒する酵素であって、下記
の理化学的性質を有する新規なκ−カラゲナーゼ。 (a) 分子量；35,000 (b) 等電点；9.2 (c) 溶解性；水溶性 (d) 作用；３，６−アンヒドロ−Ｄ−ガラクトースとＤ
−ガラクトースとがα−１，３−結合した２糖であるカ
ラビオースを基本構造とし、このカラビオースがβ−
１，４−結合で多数重合し、更にＤ−ガラクトース残基
のＣ−４位水酸基に硫酸基がエステル結合した多糖であ
るκ−カラゲナンに特異的に作用し、ネオカラビオー
ス、パラニトロフェニル−β−ガラクトピラノシド、寒
天並びにポルフィランには作用しない。 (e) 至適温度；４０℃ (f) 至適ｐＨ；ｐＨ 8.0 (g) ｐＨ安定性；ｐＨ 3.0〜11.0 (h) 熱安定性；４０℃まで安定 - 【請求項２】 請求項１に記載されたκ−カラゲナーゼ
を産生する新規な海洋性細菌であるビブリオ属菌株CA-1
004（Vibrio sp. CA-1004）。 - 【請求項３】 請求項１に記載されたκ−カラゲナーゼ
を製造する方法であって、 κ−カラゲナーゼを産生する能力を有するビブリオ属に
属する微生物をκ−カラゲナンを炭素源として培養し、
その培養上清液から分離・採取することを特徴とするκ
−カラゲナーゼの製造方法。 - 【請求項４】 請求項１に記載されたκ−カラゲナーゼ
で、κ−カラゲナンを基質として作用させることを特徴
とするネオカラオリゴ糖の製造方法。 - 【請求項５】 請求項１に記載されたκ−カラゲナーゼ
を海藻に作用させることを特徴とする海藻細胞のプロト
プラストの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10287700A JP2000116376A (ja) | 1998-10-09 | 1998-10-09 | 新規なκ−カラゲナーゼ、その産生微生物、その製造方法及びその用途 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10287700A JP2000116376A (ja) | 1998-10-09 | 1998-10-09 | 新規なκ−カラゲナーゼ、その産生微生物、その製造方法及びその用途 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000116376A true JP2000116376A (ja) | 2000-04-25 |
Family
ID=17720617
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10287700A Pending JP2000116376A (ja) | 1998-10-09 | 1998-10-09 | 新規なκ−カラゲナーゼ、その産生微生物、その製造方法及びその用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000116376A (ja) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100365008C (zh) * | 2006-07-21 | 2008-01-30 | 宁波大学 | 一种红藻寡糖的制备方法 |
| CN100413509C (zh) * | 2006-07-21 | 2008-08-27 | 宁波大学 | 一种λ-卡拉胶寡糖在制备血管增生的抑制剂中的应用 |
| CN103114113A (zh) * | 2013-01-06 | 2013-05-22 | 威海康博尔生物药业有限公司 | 一种低聚合度κ-卡拉胶寡糖的制备 |
| CN103555753A (zh) * | 2013-10-29 | 2014-02-05 | 中国海洋大学 | 一种胞外分泌表达κ-卡拉胶酶的重组菌构建方法及其应用 |
| CN109706201A (zh) * | 2019-01-08 | 2019-05-03 | 中国海洋大学 | 一种酶解制备低分子量κ-卡拉胶钾的方法及应用 |
| CN110205312A (zh) * | 2019-05-09 | 2019-09-06 | 自然资源部第三海洋研究所 | 一种κ-卡拉胶酶及其基因与应用 |
| CN115725548A (zh) * | 2022-10-26 | 2023-03-03 | 集美大学 | 一种κ-卡拉胶酶Pcar16突变体及其制备方法 |
-
1998
- 1998-10-09 JP JP10287700A patent/JP2000116376A/ja active Pending
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100365008C (zh) * | 2006-07-21 | 2008-01-30 | 宁波大学 | 一种红藻寡糖的制备方法 |
| CN100413509C (zh) * | 2006-07-21 | 2008-08-27 | 宁波大学 | 一种λ-卡拉胶寡糖在制备血管增生的抑制剂中的应用 |
| CN103114113A (zh) * | 2013-01-06 | 2013-05-22 | 威海康博尔生物药业有限公司 | 一种低聚合度κ-卡拉胶寡糖的制备 |
| CN103555753A (zh) * | 2013-10-29 | 2014-02-05 | 中国海洋大学 | 一种胞外分泌表达κ-卡拉胶酶的重组菌构建方法及其应用 |
| CN109706201A (zh) * | 2019-01-08 | 2019-05-03 | 中国海洋大学 | 一种酶解制备低分子量κ-卡拉胶钾的方法及应用 |
| CN109706201B (zh) * | 2019-01-08 | 2021-06-11 | 尚好科技有限公司 | 一种酶解制备低分子量κ-卡拉胶钾的方法及应用 |
| CN110205312A (zh) * | 2019-05-09 | 2019-09-06 | 自然资源部第三海洋研究所 | 一种κ-卡拉胶酶及其基因与应用 |
| CN115725548A (zh) * | 2022-10-26 | 2023-03-03 | 集美大学 | 一种κ-卡拉胶酶Pcar16突变体及其制备方法 |
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