JPS6318254A - 第一アミノ化合物の測定方法 - Google Patents
第一アミノ化合物の測定方法Info
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- FHNFHKCVQCLJFQ-UHFFFAOYSA-N xenon atom Chemical compound [Xe] FHNFHKCVQCLJFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
この発明は一般に、第一アミノ基を含有する化合物の測
定方法に関し、さらに詳しくは化学ルミネッセンス法に
関し、この方法においては第一アミノ基を含有するフル
オレッサー分析対象を化学的に励起することにより容易
に検出できそして定量できる分子種を生じさせる。
定方法に関し、さらに詳しくは化学ルミネッセンス法に
関し、この方法においては第一アミノ基を含有するフル
オレッサー分析対象を化学的に励起することにより容易
に検出できそして定量できる分子種を生じさせる。
螢光検出技法は分析化学の分野において広範囲の用途を
有する。この様な技法は典型的には注目の1又は複数の
成分を含むサンプルを所定の波長の光に暴露し、これK
よって特徴的な発光を各成分について観察することを含
む。従って、サンプルの定性的及び定量的測定を行うこ
とができる。
有する。この様な技法は典型的には注目の1又は複数の
成分を含むサンプルを所定の波長の光に暴露し、これK
よって特徴的な発光を各成分について観察することを含
む。従って、サンプルの定性的及び定量的測定を行うこ
とができる。
しかしながら、この様な吸収検出技法の問題点は、これ
らがしばしば高いパックグラウンドシグナルをもたらし
、これが検出感度を低下せしめることである。さらに詳
しくは、−量励起状態からの光誘導発光により特徴付け
られる螢光検出技法においては、迷光、及び他の散乱現
象、すなわちレイ9(Ralelgh )及びラマン(
Raman )散乱がパックグラウンドシグナルの増加
をもたらし、これによって螢光検出技法の感度が低下す
る。迷光及びレイリ散乱の両者からの妨害は適切に設計
されたセル室を用いることにより、又は発光フィルター
及びモノクロメータ−を用いることによって除去され得
る。ラマン散乱からの妨害を除去することもできるが、
これは非常に複雑な技術を必要とする。従って、螢光分
析技法におけるパックグラウンド妨害を実質的に除去す
ることは可能であるが、これは非常な追加の時間及び出
費によってのみ達成される。
らがしばしば高いパックグラウンドシグナルをもたらし
、これが検出感度を低下せしめることである。さらに詳
しくは、−量励起状態からの光誘導発光により特徴付け
られる螢光検出技法においては、迷光、及び他の散乱現
象、すなわちレイ9(Ralelgh )及びラマン(
Raman )散乱がパックグラウンドシグナルの増加
をもたらし、これによって螢光検出技法の感度が低下す
る。迷光及びレイリ散乱の両者からの妨害は適切に設計
されたセル室を用いることにより、又は発光フィルター
及びモノクロメータ−を用いることによって除去され得
る。ラマン散乱からの妨害を除去することもできるが、
これは非常に複雑な技術を必要とする。従って、螢光分
析技法におけるパックグラウンド妨害を実質的に除去す
ることは可能であるが、これは非常な追加の時間及び出
費によってのみ達成される。
高感度螢光検出技法に関し、従来技術において遭遇され
る困難のため化学ルミネッセンスを用いる技法が求めら
れている。
る困難のため化学ルミネッセンスを用いる技法が求めら
れている。
紫外線又は可視光線の吸収により注目の化合物が一景励
起状態になる螢光技法とは異シ、化学ルミネッセンス技
法は化学反応によって注目の化合物の励起を行う。従っ
て、これらは吸光法に関して観察されるのと同じ光散乱
現象を生じさせない。
起状態になる螢光技法とは異シ、化学ルミネッセンス技
法は化学反応によって注目の化合物の励起を行う。従っ
て、これらは吸光法に関して観察されるのと同じ光散乱
現象を生じさせない。
化学ルミネッセンス技法を行うためKは、フルオレ、サ
ー(又はエネルギー受容体)にエネルギーを移送する化
学反応が起こシ、これKよってフルオレッサーが励起状
態にされる。次に、励起されたフルオレ、サーは光子を
放出することにより又は他の非放射過程により自ら基底
状態にもどる。
ー(又はエネルギー受容体)にエネルギーを移送する化
学反応が起こシ、これKよってフルオレッサーが励起状
態にされる。次に、励起されたフルオレ、サーは光子を
放出することにより又は他の非放射過程により自ら基底
状態にもどる。
言うまでもなく、光子の放出は適当な検出装置によって
記録される。
記録される。
螢光技法に対する化学ルミネッセンス技法の明白な利点
にもかかわらず、化学ルミネッセンス技法の実施は普及
していない。この理由は化合物を化学ルミネッセンスを
示す様にすることが非常に困難であったためである。さ
らに具体的には、まず第1に、螢光を示す、ナな光によ
る励起の後に光子を放出する化合物の数は非常に限られ
ている。
にもかかわらず、化学ルミネッセンス技法の実施は普及
していない。この理由は化合物を化学ルミネッセンスを
示す様にすることが非常に困難であったためである。さ
らに具体的には、まず第1に、螢光を示す、ナな光によ
る励起の後に光子を放出する化合物の数は非常に限られ
ている。
この限られた数の螢光物質の内、さらに少数の化合物が
化学ルミネッセンスを示す、すなわち化学反応による励
起の後に光子を放出するであろう。
化学ルミネッセンスを示す、すなわち化学反応による励
起の後に光子を放出するであろう。
これに加えて、測定技法への化学ルミネッセンスの適用
のためには注目の化合物(この発明の場合には第一アミ
ノ化合物)から化学ルミネッセンスを示す化合物が誘導
され得ることが必要であり、そして利用可能な化学ルミ
ネッセンスを用いる効果的な測定法はほとんど知られて
いない。
のためには注目の化合物(この発明の場合には第一アミ
ノ化合物)から化学ルミネッセンスを示す化合物が誘導
され得ることが必要であり、そして利用可能な化学ルミ
ネッセンスを用いる効果的な測定法はほとんど知られて
いない。
1つの化学ルミネッセンス技法においては、オレイン酸
アリルと過酸化水素との混合物を使用して、ダンシル化
(danaylated )アミノ酸、すなわち5−ジ
メチルアミノナフタレン−スルホニルクロリドと反応し
次に酸加水分解されたアミノ酸、から生成したフルオレ
、サーが活性化される。個個のダンシル化アミノ酸がま
ず高速液体りpマドグラフィーにより分画される。単一
光子計数光電子増倍管に面するらせん流セルを用いる特
別に設計された検出器により検出を行う場合、この様な
活性化されたアミノ酸フルオレ、サーの検出限界は2〜
3フ工ムトモルである。
アリルと過酸化水素との混合物を使用して、ダンシル化
(danaylated )アミノ酸、すなわち5−ジ
メチルアミノナフタレン−スルホニルクロリドと反応し
次に酸加水分解されたアミノ酸、から生成したフルオレ
、サーが活性化される。個個のダンシル化アミノ酸がま
ず高速液体りpマドグラフィーにより分画される。単一
光子計数光電子増倍管に面するらせん流セルを用いる特
別に設計された検出器により検出を行う場合、この様な
活性化されたアミノ酸フルオレ、サーの検出限界は2〜
3フ工ムトモルである。
アミノ酸及び第一アミンをダンシル化することにより形
成されるフルオレ、サーは、種々の脂肪族第一アミンに
ついて最も低い検出限界、すなわち0.8〜14フ工ム
トモル〔fモル)を与えることが示された。脂肪族アミ
ンと4−クロロ−7−二トロヘン/−1,2,5−オキ
サジアゾール(NBD−CI)及び0−7pk7にデヒ
ド(OPA)との反応により生成するフルオレッサーは
それぞれ19〜240フ工ムトモル、及び94〜580
フ工ムトモルの検出限界を与える。
成されるフルオレ、サーは、種々の脂肪族第一アミンに
ついて最も低い検出限界、すなわち0.8〜14フ工ム
トモル〔fモル)を与えることが示された。脂肪族アミ
ンと4−クロロ−7−二トロヘン/−1,2,5−オキ
サジアゾール(NBD−CI)及び0−7pk7にデヒ
ド(OPA)との反応により生成するフルオレッサーは
それぞれ19〜240フ工ムトモル、及び94〜580
フ工ムトモルの検出限界を与える。
化学ルミネッセンス測定技法におけるフルオレッサーと
してダンシル化誘導体を用いることKよシ得られる上に
報告された検出限界は非常に良好であるが、高速液体ク
ロマトグラフィー技法により分画されるサンプルへのこ
れらの適用は是分限定される。逆相高速液体クロマトグ
ラフィー技法。
してダンシル化誘導体を用いることKよシ得られる上に
報告された検出限界は非常に良好であるが、高速液体ク
ロマトグラフィー技法により分画されるサンプルへのこ
れらの適用は是分限定される。逆相高速液体クロマトグ
ラフィー技法。
すなわち固定相が水性でありそして移動相が有機性であ
る技法は、実質的カフつ非常に可変的々濃度の水の存在
を必要とする。しかしながら、ダンシル化されたアミノ
酸の螢光収量はこのような溶剤の変化により非常に影響
される。すなわち、有機溶剤中で0.3〜0.7の値を
有するダンシル化アミノ酸は水中では0.053〜0.
091の値を有することが見出された。従って、高速液
体クロマトグラフィーにより分画されたダンシル化アミ
ノ酸の螢光収量は、しばしば、非常に少量のこれらのア
ミノ酸を検出しそして定量するには許容されない程低い
レベルにある。
る技法は、実質的カフつ非常に可変的々濃度の水の存在
を必要とする。しかしながら、ダンシル化されたアミノ
酸の螢光収量はこのような溶剤の変化により非常に影響
される。すなわち、有機溶剤中で0.3〜0.7の値を
有するダンシル化アミノ酸は水中では0.053〜0.
091の値を有することが見出された。従って、高速液
体クロマトグラフィーにより分画されたダンシル化アミ
ノ酸の螢光収量は、しばしば、非常に少量のこれらのア
ミノ酸を検出しそして定量するには許容されない程低い
レベルにある。
従来技術の化学ルミネッセンス技法の前記の限界及び欠
点並びに上に具体的に記載しなかった欠点の観点から、
第一アミノ基を含有する非常に少量(フェムトモル)の
分析対象を測定するための、HPLC分離又は他の分離
技法において典型的に遭遇され悪条件によりネ都合な影
響を受けない化学ルミネッセンス技法の必要性が当業界
において存在する。従って、第一アミノ基を含有する化
合物から形成されそして変化する溶剤環境においてさえ
強い化学ルミネッセンスを示すように活性化され得る新
規なフルオレタサーを提供することによυ前記の要請を
満足せしめることが、本発明の第一の目的である。
点並びに上に具体的に記載しなかった欠点の観点から、
第一アミノ基を含有する非常に少量(フェムトモル)の
分析対象を測定するための、HPLC分離又は他の分離
技法において典型的に遭遇され悪条件によりネ都合な影
響を受けない化学ルミネッセンス技法の必要性が当業界
において存在する。従って、第一アミノ基を含有する化
合物から形成されそして変化する溶剤環境においてさえ
強い化学ルミネッセンスを示すように活性化され得る新
規なフルオレタサーを提供することによυ前記の要請を
満足せしめることが、本発明の第一の目的である。
第一アミノ基を含有する化合物を測定するための、これ
らの化合物をヘムトモル量以下の量で検出することがで
きる方法を提供することが本発明の他の目的である。
らの化合物をヘムトモル量以下の量で検出することがで
きる方法を提供することが本発明の他の目的である。
第一アミノ基を含有する化合物を化学ルミネ。
センスによυ測定するための一層高感度の方法を提供す
ることが本発明の他の目的である。
ることが本発明の他の目的である。
本発明の他の目的は、化学ルミネッセンス収率を増強す
る新しい種類の蓚酸エステルを用いて化学ルミネッセン
スにより第−アミノ基を含有する化合物を測定する方法
を提供することである。
る新しい種類の蓚酸エステルを用いて化学ルミネッセン
スにより第−アミノ基を含有する化合物を測定する方法
を提供することである。
本発明の他の目的は、化学ルミネッセンス法においてN
DA−第一アミン又はADA−第一アミンフルオレッサ
ーを用いてシアン及び過酸化水素を測定するための方法
を提供少ることである。
DA−第一アミン又はADA−第一アミンフルオレッサ
ーを用いてシアン及び過酸化水素を測定するための方法
を提供少ることである。
要約すれば、前記の目的及び他の目的は、第一アミノ基
を含有する化合物の測定方法であって、(I)次の反応
式: に従りて、第一アミノ基を含有する化合物をシアンイオ
ンの存在下でナフタレン−2,3−ジカル〆キシアルデ
ヒド(NDA)又はアントラセン−2,3−ジカル?キ
シアルデヒド(ADA)と反応せしめることによりュー
シアノ−2−置換一ペンズIff)イソインドール又は
1−シアノ−2−置換−ナフス〔f)イノインドールを
生成せしめ;(II) 蓚酸エステル又は過酸化水素
を前記1−シアノ−2−fil換ベンズ〔filイソイ
ンドール・フルオレッサー又は1−シアノ−2−置換す
7ス〔f〕イソインドール・フルオレッサーと反応せし
めることによ)化学ルミえ、センス分析対象を生成せし
め;そして (Ill)この化学ルミネッセンス分析対象からの化学
ルミネッセンス発光を検出手段により検出する;ことを
含んで成る方法により達成される。
を含有する化合物の測定方法であって、(I)次の反応
式: に従りて、第一アミノ基を含有する化合物をシアンイオ
ンの存在下でナフタレン−2,3−ジカル〆キシアルデ
ヒド(NDA)又はアントラセン−2,3−ジカル?キ
シアルデヒド(ADA)と反応せしめることによりュー
シアノ−2−置換一ペンズIff)イソインドール又は
1−シアノ−2−置換−ナフス〔f)イノインドールを
生成せしめ;(II) 蓚酸エステル又は過酸化水素
を前記1−シアノ−2−fil換ベンズ〔filイソイ
ンドール・フルオレッサー又は1−シアノ−2−置換す
7ス〔f〕イソインドール・フルオレッサーと反応せし
めることによ)化学ルミえ、センス分析対象を生成せし
め;そして (Ill)この化学ルミネッセンス分析対象からの化学
ルミネッセンス発光を検出手段により検出する;ことを
含んで成る方法により達成される。
好ましくは、第一アミノ基を含有する化合物の混合物を
NDA又はADAと反応せしめることによってアダクト
を生成せしめた後、これを高速液体クロマトグラフィー
により分画し、モして糧々のアダクト画分を蓚酸エステ
ル及び過酸化水素と反応せしめ、次に化学ルミネッ七ン
ス分析を行う。この方法に代えて、NDA又はADAと
の反応に先立つて混合物を分画することができる。
NDA又はADAと反応せしめることによってアダクト
を生成せしめた後、これを高速液体クロマトグラフィー
により分画し、モして糧々のアダクト画分を蓚酸エステ
ル及び過酸化水素と反応せしめ、次に化学ルミネッ七ン
ス分析を行う。この方法に代えて、NDA又はADAと
の反応に先立つて混合物を分画することができる。
この発明の前記の、及q後の記載で明らかにする他の目
的、利点及び特徴により、さらに後に記載する具体的な
説明によ)1本発明は一層よく理解されよう。
的、利点及び特徴により、さらに後に記載する具体的な
説明によ)1本発明は一層よく理解されよう。
この発明の好ましい態様の全体的方法を第1図に流れ図
として示す。第一アミノ基を含有するサンプル(流れ■
)がまずシアンイオンの存在下においてナフタレン−2
,3−ジカルボキシアルデヒド(NDA)又はアントラ
セン−2,3−ジカルボキシアルデヒド(ADA)(流
れII)と反応し、誘導体フルオレッサーCBI及びC
NIがそれぞれ生成する(流れ■)。次に、CBI又は
CNI誘導体を含有するサンプルが高速液体クロマトグ
ラフィーのごとき技法により分画され、第一アミノ化合
物の分画されたCBI又はCNI誘導体を含有する流出
液が得られる。酢酸エチル溶剤中の蓚酸エステル(流れ
■)、及びテトラヒドロフラン又は適当な溶剤中のH2
O2(流れ■)がCBI又はCNIフルオレッサーの流
れ■と一緒にされ化学ルミボッセンス(流れ■)が生じ
、次にこれが分析のための検出装置に送られる。
として示す。第一アミノ基を含有するサンプル(流れ■
)がまずシアンイオンの存在下においてナフタレン−2
,3−ジカルボキシアルデヒド(NDA)又はアントラ
セン−2,3−ジカルボキシアルデヒド(ADA)(流
れII)と反応し、誘導体フルオレッサーCBI及びC
NIがそれぞれ生成する(流れ■)。次に、CBI又は
CNI誘導体を含有するサンプルが高速液体クロマトグ
ラフィーのごとき技法により分画され、第一アミノ化合
物の分画されたCBI又はCNI誘導体を含有する流出
液が得られる。酢酸エチル溶剤中の蓚酸エステル(流れ
■)、及びテトラヒドロフラン又は適当な溶剤中のH2
O2(流れ■)がCBI又はCNIフルオレッサーの流
れ■と一緒にされ化学ルミボッセンス(流れ■)が生じ
、次にこれが分析のための検出装置に送られる。
物質
この発明は、第一アミノ基を含有する単一化合物又は化
合物の混合物を与える。第一アミノ基を含有する化合物
にはアミノ酸類、第一アミン類、ペプチド類及びカテコ
ール類が含まれる。
合物の混合物を与える。第一アミノ基を含有する化合物
にはアミノ酸類、第一アミン類、ペプチド類及びカテコ
ール類が含まれる。
第一アミノ基を含有する1又は複数の化合物を含むと信
じられる任意のサンプルをこの発明に従って測定するこ
とができる。水性溶剤及び有機溶剤の両者から効果的な
測定結果が得られる。さらに、1ナノモルという少量の
第一アミノ化合物及び1ミリモルという多くの第一アミ
ノ化合物を含有するサンプルを測定することができる。
じられる任意のサンプルをこの発明に従って測定するこ
とができる。水性溶剤及び有機溶剤の両者から効果的な
測定結果が得られる。さらに、1ナノモルという少量の
第一アミノ化合物及び1ミリモルという多くの第一アミ
ノ化合物を含有するサンプルを測定することができる。
−層高濃度の第一アミノ化合物を測定することもできる
が、この様な高い濃度レベルにおいてはさらに簡単な技
法が一般に適当である。
が、この様な高い濃度レベルにおいてはさらに簡単な技
法が一般に適当である。
典型的には、測定される材料は生物学的液体。
例えば尿、全血、血漿、血清及び投与形態の医薬に由来
する。
する。
ダクトの生成
単一の第一アミノ化合物又は第一アミノ化合物の混合物
を含有するサンプルをシアン化物の存在下でNDAと反
応せしめることにより−シアノー2−置換ベンズ〔f)
イソインドール(CBI)を生成せしめるか、又はシア
ンの存在下でADAと反応せしめることにより−シアノ
ー2−置換ナフス〔f〕イソインドール(CNI)を生
成せしめる。
を含有するサンプルをシアン化物の存在下でNDAと反
応せしめることにより−シアノー2−置換ベンズ〔f)
イソインドール(CBI)を生成せしめるか、又はシア
ンの存在下でADAと反応せしめることにより−シアノ
ー2−置換ナフス〔f〕イソインドール(CNI)を生
成せしめる。
これらの反応は次の反応式で表わされる。
アントラセン−2,3−ジカルボキシアルデヒド1−シ
アノ−2−置換ナフス〔f)イソインドール第一アミン
とグイアルデヒドとからイソインドールを生成せしめる
ための上記の2つの反応の内、NDAを使用する反応が
明らかに好ましい。
アノ−2−置換ナフス〔f)イソインドール第一アミン
とグイアルデヒドとからイソインドールを生成せしめる
ための上記の2つの反応の内、NDAを使用する反応が
明らかに好ましい。
NDA及びADAはいずれも従来技術において既知の化
合物である。従って、これらの製造についてはこの明細
書には記載しない。
合物である。従って、これらの製造についてはこの明細
書には記載しない。
第一アミノ基を有する化合物からのCBIの生成は19
85年3月4日に出願された米国特許出願ム707.6
76に詳細に記載されている。一般K、第一アミノ基を
含有する化合物を、ややアルカリ性の条件下、例えば9
〜10の一レベルにおいてN D A及びシアンイオン
と反応せしめにとによりCBIが生成する。なお、CB
Iば420nmの波長の光に暴露された場合螢光奮発す
る。螢光技法に内在する欠点のため、本発明はCBI及
びCNIを化学ルミネッセンスにすることができる方法
を提供する。
85年3月4日に出願された米国特許出願ム707.6
76に詳細に記載されている。一般K、第一アミノ基を
含有する化合物を、ややアルカリ性の条件下、例えば9
〜10の一レベルにおいてN D A及びシアンイオン
と反応せしめにとによりCBIが生成する。なお、CB
Iば420nmの波長の光に暴露された場合螢光奮発す
る。螢光技法に内在する欠点のため、本発明はCBI及
びCNIを化学ルミネッセンスにすることができる方法
を提供する。
第一アミノ基を含有する2種類以上の化合物を出発材料
が含む場合、これを一般番で分画段階にかける。分画は
第一アミンのCBI又はCNIアダクトの形成前又は後
において行うことができる。最も好ましい分画技法は高
速液体クロマトグラフィー(HPLC) であシ、これ
は良く知られた分画技法である。言うまでもなく、第一
アミノ基を含有する化合物が1種類のみ測定サンプル中
に存在する場合、分画することは必要で彦い。
が含む場合、これを一般番で分画段階にかける。分画は
第一アミンのCBI又はCNIアダクトの形成前又は後
において行うことができる。最も好ましい分画技法は高
速液体クロマトグラフィー(HPLC) であシ、これ
は良く知られた分画技法である。言うまでもなく、第一
アミノ基を含有する化合物が1種類のみ測定サンプル中
に存在する場合、分画することは必要で彦い。
本発明のサンプルの高速液体クロマトグラフィーはウォ
ーターズ製プログラム可能な溶剤供給系、20μLルー
プを有するレオダイン7125注大器、及び25σX
4.6 vm又は15α×46xmの寸法ヲ有するス被
ルコシルLC−18カラムを用いて行った。一般に、H
PLCグレードのア七トニトリル/イミダゾール綴衝液
(水中0. OO25M 。
ーターズ製プログラム可能な溶剤供給系、20μLルー
プを有するレオダイン7125注大器、及び25σX
4.6 vm又は15α×46xmの寸法ヲ有するス被
ルコシルLC−18カラムを用いて行った。一般に、H
PLCグレードのア七トニトリル/イミダゾール綴衝液
(水中0. OO25M 。
pJ47.2 )の70二3o(v/w)混合物を1m
/分の流速で移動相として用いた。言うまでもなく、他
の)(PLC系及び他の分画技法を本発明に従って効果
的に用いることもできる。
/分の流速で移動相として用いた。言うまでもなく、他
の)(PLC系及び他の分画技法を本発明に従って効果
的に用いることもできる。
(Iv) CBI又はCNI フルオレッサーの化学
ルミネッセンス活性化 CBI又はCNIアタ゛クトを生成せしめ、そして所望
により分画した後、これらを蓚酸エステル及び過酸化水
素(このものはCBI又はCNIのごときフルオレ、サ
ーを基底状態から励起状態にする)の添加により活性化
する。この発明に従って使用することができる蓚酸エス
テルには新規な蓚酸エステルでsる蓚酸ビス−(2,4
−ジフルオロフェニル) (2、4−DFPO)及び8
酸ビス−(2,6−ジフルオロフェニル)(2,6−D
FPO)、並びに既知の蓚酸エステルである蓚酸ビス−
(2,4−ジニトロフェニル)(2,4−DNPO)、
蓚酸ビス−(2,4,6−トリクロロフェニル)(TC
PO)、及ヒ蓚酸ビス−(ペンタフルオロフェニル)(
PFPO)が含1 h 6−蓚酸エステル2 、4−
DNPO,TCPO及びPFPOの合成は従来技術にお
いて知られている。
ルミネッセンス活性化 CBI又はCNIアタ゛クトを生成せしめ、そして所望
により分画した後、これらを蓚酸エステル及び過酸化水
素(このものはCBI又はCNIのごときフルオレ、サ
ーを基底状態から励起状態にする)の添加により活性化
する。この発明に従って使用することができる蓚酸エス
テルには新規な蓚酸エステルでsる蓚酸ビス−(2,4
−ジフルオロフェニル) (2、4−DFPO)及び8
酸ビス−(2,6−ジフルオロフェニル)(2,6−D
FPO)、並びに既知の蓚酸エステルである蓚酸ビス−
(2,4−ジニトロフェニル)(2,4−DNPO)、
蓚酸ビス−(2,4,6−トリクロロフェニル)(TC
PO)、及ヒ蓚酸ビス−(ペンタフルオロフェニル)(
PFPO)が含1 h 6−蓚酸エステル2 、4−
DNPO,TCPO及びPFPOの合成は従来技術にお
いて知られている。
例えば、DNP Oの製造方法はM 、 M # Ra
uhu t 。
uhu t 。
L 、 J 、 Bollyky、 B 、G 、Ro
bsrts 、 M、Loy。
bsrts 、 M、Loy。
R,H,Whltman、 A tV* Iannot
ta、 ARM、 S@m−gel及びR,A、C1a
rke、 ”Chernilumlneseaneef
rom Reactions oi E1ectron
七蓚酸tlvelySubstituted Aryl
0xalates with HydrogenPe
roxide and Fluoregcance C
ompounds ’ 。
ta、 ARM、 S@m−gel及びR,A、C1a
rke、 ”Chernilumlneseaneef
rom Reactions oi E1ectron
七蓚酸tlvelySubstituted Aryl
0xalates with HydrogenPe
roxide and Fluoregcance C
ompounds ’ 。
5oclaty、89,25.1967年12月6日。
6515−6522頁に¥載されている。DNPOの製
造においてはまず、5tの試薬グレードのベンゼン中3
68.2g(2モル)の2.4−ジニトロフェノールの
溶液を1tの溶剤の共沸蒸留により乾燥した。乾燥した
溶液を窒素のもとて10℃に冷却し、そして202.4
9C2モル)の新たと蒸留したトリエチルアミンを添加
した。次に塩化オキサリル(I39,6,p、x、1モ
ル)を30分間にわたって攪拌し、水浴を用いて反応温
度を10〜25℃に維持しながら加えた。
造においてはまず、5tの試薬グレードのベンゼン中3
68.2g(2モル)の2.4−ジニトロフェノールの
溶液を1tの溶剤の共沸蒸留により乾燥した。乾燥した
溶液を窒素のもとて10℃に冷却し、そして202.4
9C2モル)の新たと蒸留したトリエチルアミンを添加
した。次に塩化オキサリル(I39,6,p、x、1モ
ル)を30分間にわたって攪拌し、水浴を用いて反応温
度を10〜25℃に維持しながら加えた。
生ずる黄色スラリーを3時間攪拌し、そして減圧下で蒸
発乾燥した。固形物を1tのクロロホルムと共に十分に
攪拌してトリエチルアミン塩酸塩を溶解し、そして生成
物を焼結ガラス漏斗上に集め、クロロホルムで洗浄し、
そして真空乾燥した。
発乾燥した。固形物を1tのクロロホルムと共に十分に
攪拌してトリエチルアミン塩酸塩を溶解し、そして生成
物を焼結ガラス漏斗上に集め、クロロホルムで洗浄し、
そして真空乾燥した。
100℃より低温でのニトロベンゼンからのMl晶化に
より151.3F(35,8%)の淡黄色結果を得た。
より151.3F(35,8%)の淡黄色結果を得た。
融点189℃〜192℃。
PFPOの製造も記載されている。他の既知の蓚酸エス
テルTCPOは一般的に上記の方法に従って、轟業者に
より容易に行われるわずかな変更を伴って製造すること
ができる。
テルTCPOは一般的に上記の方法に従って、轟業者に
より容易に行われるわずかな変更を伴って製造すること
ができる。
新規化合物2.4−及び2 、6−DFPOの合成方法
は次の通りである。まず、トリエチルアミン(Et、N
)を蒸留し、そして2,4−又は2,6−フルオロフェ
ニル化合物ト乾燥ヘンゼン溶液中。
は次の通りである。まず、トリエチルアミン(Et、N
)を蒸留し、そして2,4−又は2,6−フルオロフェ
ニル化合物ト乾燥ヘンゼン溶液中。
℃にて混合する。次に、窒素雰囲気下で攪拌された溶液
中に塩化オキサリルを滴加し、そして室温にて一夜反応
を進行せしめる。一般に、約2重量部の(Et)3N、
5重量部のフェノール化合物、及び1.3重量部の塩化
オキサリルを過剰量の乾燥ベンゼン中で用いる。
中に塩化オキサリルを滴加し、そして室温にて一夜反応
を進行せしめる。一般に、約2重量部の(Et)3N、
5重量部のフェノール化合物、及び1.3重量部の塩化
オキサリルを過剰量の乾燥ベンゼン中で用いる。
2 、4−DFPOの場合、合成の後に得られたトリエ
チルアンモニウム壇酸塩(ET3N HCl )と蓚酸
エステルとの固体混合物を温ベンゼンにより処理して蓚
酸塩を溶解せしめ、こうして未溶解のEt3N HCl
を蓚酸塩及びベンゼン部分から分離する。溶剤の除去、
及び同じ溶剤からの再結晶化の後、2.4−DFPOの
針状結晶を58チの収率で得た。
チルアンモニウム壇酸塩(ET3N HCl )と蓚酸
エステルとの固体混合物を温ベンゼンにより処理して蓚
酸塩を溶解せしめ、こうして未溶解のEt3N HCl
を蓚酸塩及びベンゼン部分から分離する。溶剤の除去、
及び同じ溶剤からの再結晶化の後、2.4−DFPOの
針状結晶を58チの収率で得た。
2 、6−DFPOの場合、Et3N HClを蓚酸エ
ステルから除去する試みを、前者を石油エーテルに溶解
することKよって行った。しかしながら、この方法は非
常圧効果的でなかった。従って、蓚酸エステルを温ベン
ゼンに溶解し、そして2,4−DFPOについて前に記
載した様にして、大部分の目的2.6−DFPOを得た
。残シの固体物質(主としてEt3NHCt)を石油エ
ーテル洗浄液と混合し、そして混合物を水で洗浄した。
ステルから除去する試みを、前者を石油エーテルに溶解
することKよって行った。しかしながら、この方法は非
常圧効果的でなかった。従って、蓚酸エステルを温ベン
ゼンに溶解し、そして2,4−DFPOについて前に記
載した様にして、大部分の目的2.6−DFPOを得た
。残シの固体物質(主としてEt3NHCt)を石油エ
ーテル洗浄液と混合し、そして混合物を水で洗浄した。
有機相をMg5O,で乾燥し、そして溶剤を除去した後
、追加の2.6−DFPOを得た。−緒にした2、6−
DFPO画分を酢酸エチル−石油エーテルから再結晶化
し、2 、6− DFPOの無色結晶を78%の収率で
得た。
、追加の2.6−DFPOを得た。−緒にした2、6−
DFPO画分を酢酸エチル−石油エーテルから再結晶化
し、2 、6− DFPOの無色結晶を78%の収率で
得た。
新規な蓚酸塩2.6−DFPOは試験された条件下での
CBI誘導体の検出についてTCPOに卓越しておシ、
静的系において測定した場合−暦高い全化学ルミネッセ
ンス強度を与え、そしてI(PLO−化学ルミネッセン
ス系において一層低い検出限界を与えることが見出され
た。最近、TCPOは報告されたHPLC−化学ルミネ
ッセンス研究においてほとんど排他的に使用されている
。TCPOに対する2 、6−DFPOを用いる他の利
点はこのエステルの酢酸エチル中での7倍高い溶解性で
あり、これにより系における化学ルミネッセンス試薬の
濃度を増加せしめ、そしてさらにCBI誘導体の検出の
感度を上昇せしめることができることである。
CBI誘導体の検出についてTCPOに卓越しておシ、
静的系において測定した場合−暦高い全化学ルミネッセ
ンス強度を与え、そしてI(PLO−化学ルミネッセン
ス系において一層低い検出限界を与えることが見出され
た。最近、TCPOは報告されたHPLC−化学ルミネ
ッセンス研究においてほとんど排他的に使用されている
。TCPOに対する2 、6−DFPOを用いる他の利
点はこのエステルの酢酸エチル中での7倍高い溶解性で
あり、これにより系における化学ルミネッセンス試薬の
濃度を増加せしめ、そしてさらにCBI誘導体の検出の
感度を上昇せしめることができることである。
一般に、酢酸エチル又はTHFのととぎ適幽な溶剤中で
0.01〜1、OMの過酸化水素溶液を0.005〜0
.05Mの蓚酸エステル溶液と反応せしめることKよシ
蓚酸エチル/ H2O2反応生成物が生成する。
0.01〜1、OMの過酸化水素溶液を0.005〜0
.05Mの蓚酸エステル溶液と反応せしめることKよシ
蓚酸エチル/ H2O2反応生成物が生成する。
前記のHPLC系を用いる場合、蓚酸エステル/H2O
2反応生成物を次の様にして調製した。まず、酢酸エチ
ル溶剤中5.0 mMの蓚酸エステル溶液とTHF中I
MのH2O2溶液を1:2の北軍で混合する。TCPO
は酢酸エチル中で長時間にわたって非常に安定であるた
め、蓚酸エステルの溶剤として酢酸エチルを選択した。
2反応生成物を次の様にして調製した。まず、酢酸エチ
ル溶剤中5.0 mMの蓚酸エステル溶液とTHF中I
MのH2O2溶液を1:2の北軍で混合する。TCPO
は酢酸エチル中で長時間にわたって非常に安定であるた
め、蓚酸エステルの溶剤として酢酸エチルを選択した。
HPLC流出液との混合の後TCPOの沈澱を防止する
ため、HPLC移動相中の水分含量及び流速を最小に維
持し、この結果としてHPLC分離法のだめの二元溶剤
の選択が幾分制限される。具体的には、移動相の流速を
0.3〜0.5d/分に制限し、そして水含量を50−
未満に制限した。THF中H2O2のみをHPLC系に
おいて酢酸エチル中蓚酸エステルと組合わせて使用した
。THFはTCPOの沈澱の問題を最小にするからであ
る。
ため、HPLC移動相中の水分含量及び流速を最小に維
持し、この結果としてHPLC分離法のだめの二元溶剤
の選択が幾分制限される。具体的には、移動相の流速を
0.3〜0.5d/分に制限し、そして水含量を50−
未満に制限した。THF中H2O2のみをHPLC系に
おいて酢酸エチル中蓚酸エステルと組合わせて使用した
。THFはTCPOの沈澱の問題を最小にするからであ
る。
各500耐容量の2個のシリン・ゾポンプ(ネステル/
ファウスト)を使用して蓚酸エステル/酢酸エチル及び
H2O2/THF溶液を混合機に供給し、ここで2つの
溶液を機械的攪拌機により混合した。
ファウスト)を使用して蓚酸エステル/酢酸エチル及び
H2O2/THF溶液を混合機に供給し、ここで2つの
溶液を機械的攪拌機により混合した。
この化学ルミネッセンス試薬を、0.25mxステンレ
ス鋼チューブを有する第2インターフエース混合機に供
給した。蓚酸エステル及び過酸物試薬の流速をそれぞれ
1.0m//分及び2.0rnt/分に維持した。第2
インターフエース混合機は約25μLのデッドボリウム
を有していた。次に、化学ルミネッセンス試薬をI(P
LOからの流出液と混合し、そして下記の様にして検出
器に送った。
ス鋼チューブを有する第2インターフエース混合機に供
給した。蓚酸エステル及び過酸物試薬の流速をそれぞれ
1.0m//分及び2.0rnt/分に維持した。第2
インターフエース混合機は約25μLのデッドボリウム
を有していた。次に、化学ルミネッセンス試薬をI(P
LOからの流出液と混合し、そして下記の様にして検出
器に送った。
蓚酸エステルをH2O2と混合した後、得られる溶液を
第一アミノ基から生成したCBI又はCNIアダクトと
混合する。
第一アミノ基から生成したCBI又はCNIアダクトと
混合する。
一般に、上記の様にして調製されたb酸エステル/過酵
化物混合物を、CBI又はCNIを含有する分画された
HPLC流出液と直接混合する。添加された蓚酸エステ
ル/過酸化物の量は、0.1 mPJ朱満の濃度で存在
するCBI又はCNIアダクトのそれに比べて約10倍
以上であるべきである。
化物混合物を、CBI又はCNIを含有する分画された
HPLC流出液と直接混合する。添加された蓚酸エステ
ル/過酸化物の量は、0.1 mPJ朱満の濃度で存在
するCBI又はCNIアダクトのそれに比べて約10倍
以上であるべきである。
新しく導入された1−シアノ−2−置換ベンズ〔f〕イ
ソインドール誘導体の化学ルミネッセンス性を静的流検
出系及び特(で設計されたHPLC/化学ルミネッセン
ス流検出系の百方において試験した。
ソインドール誘導体の化学ルミネッセンス性を静的流検
出系及び特(で設計されたHPLC/化学ルミネッセン
ス流検出系の百方において試験した。
静的系を使用して、種々のざ酸エステル並び:てCBI
及びCNI誘導体にっbで、時間の関数として化学ルミ
ネッセンス収量を決定した。
及びCNI誘導体にっbで、時間の関数として化学ルミ
ネッセンス収量を決定した。
静的検出系は改変されたアミコンーデウマン分光螢光計
SPF 4−8940 SPであった。第2図に示す
ようよ、この系はキセノンランプ、励起モノクロメータ
−及び発光モノクロメータ−1光電子増信管、4個のス
リッ)S、−34(0,5〜4、0 ms )及び1.
OX 1. Ocmの寸法を有し3.0ゴの容量を有
する化学ルミネッセンス反応セルを含む。
SPF 4−8940 SPであった。第2図に示す
ようよ、この系はキセノンランプ、励起モノクロメータ
−及び発光モノクロメータ−1光電子増信管、4個のス
リッ)S、−34(0,5〜4、0 ms )及び1.
OX 1. Ocmの寸法を有し3.0ゴの容量を有
する化学ルミネッセンス反応セルを含む。
上記の系のセル室は、セルの内容物を定礎攪拌できる様
に改良されている。各蓚酸エステル/酢酸エチル溶液を
まず酢酸エチル中に溶解したフルオレッサーと混合した
。発光モノクロメータ−を所与の分析対照の最大発光設
定した。次:て、H2O2/THFの溶液をセルに加え
、光電子増倍管のシャッターを開き、そして化学ルミネ
ッセンス強度のプロットを時間の関数としてストリップ
チャートレコーダーを用いて記録した。軌跡の下の積分
された面積を、所与の系において発生した全化学ルミネ
ッセンス収率の相対測定値として採用した。
に改良されている。各蓚酸エステル/酢酸エチル溶液を
まず酢酸エチル中に溶解したフルオレッサーと混合した
。発光モノクロメータ−を所与の分析対照の最大発光設
定した。次:て、H2O2/THFの溶液をセルに加え
、光電子増倍管のシャッターを開き、そして化学ルミネ
ッセンス強度のプロットを時間の関数としてストリップ
チャートレコーダーを用いて記録した。軌跡の下の積分
された面積を、所与の系において発生した全化学ルミネ
ッセンス収率の相対測定値として採用した。
蓚酸エステル、過酸化水素及びフルオレッサー濃度を各
試行について一定に維持し、所与のエネルギー受容体を
用いる一連の蓚酸エステルからの相対化学ルミネッセン
ス収量の直接比較を可能にした。
試行について一定に維持し、所与のエネルギー受容体を
用いる一連の蓚酸エステルからの相対化学ルミネッセン
ス収量の直接比較を可能にした。
第2図に示す静的系の装置は、化学ルミネッセンス反応
の前後の螢光発光スペクトルの測定を可能にし、従って
化学ルミネッセンス反応条件下で■種々のエネルギー受
容体の研究及び比較を可能にする。これらの研究におい
て、励起ラングを作動させ、モしてX−Yレコーダー(
螢光強度対発光波長)により螢光スペクトルを記録した
。
の前後の螢光発光スペクトルの測定を可能にし、従って
化学ルミネッセンス反応条件下で■種々のエネルギー受
容体の研究及び比較を可能にする。これらの研究におい
て、励起ラングを作動させ、モしてX−Yレコーダー(
螢光強度対発光波長)により螢光スペクトルを記録した
。
特に設計された)(PLC/化学ルミネッセンス流れ検
出系を第3図に示す。この系は、5μt70−セルヲ有
f :E=クラトス/ショエフェルFS970螢光検出
器を含む。418 nmの放射波長を有するカットオフ
発光フィルターを使用Uた。検出器は5μtフローセル
を有する。光電子増倍管の電圧及びフルスケール出力は
腫々の実験モードに調整することができる。
出系を第3図に示す。この系は、5μt70−セルヲ有
f :E=クラトス/ショエフェルFS970螢光検出
器を含む。418 nmの放射波長を有するカットオフ
発光フィルターを使用Uた。検出器は5μtフローセル
を有する。光電子増倍管の電圧及びフルスケール出力は
腫々の実験モードに調整することができる。
第3図にさらに示す様に、音光検出器DETはレオゲイ
ンインジェクターR,タイプ7125に連結され、今度
はこれが混合器M2に連結され、ここでHPLCカラム
からの流出液と蓚酸エステル/過酸化物反応生成物が混
合される。この系は、混合器已1.及び検出器DETの
間に置かれた上記のレオダイ77125パルプによる試
薬の停止−流れ測定のため及び試薬の流れを転するため
に適合されている。こうして、サンプルを検出器セル中
に保持することができ、化学ルミネッセンスシグナルの
減少を時間の関数としてモニターすることができる。
ンインジェクターR,タイプ7125に連結され、今度
はこれが混合器M2に連結され、ここでHPLCカラム
からの流出液と蓚酸エステル/過酸化物反応生成物が混
合される。この系は、混合器已1.及び検出器DETの
間に置かれた上記のレオダイ77125パルプによる試
薬の停止−流れ測定のため及び試薬の流れを転するため
に適合されている。こうして、サンプルを検出器セル中
に保持することができ、化学ルミネッセンスシグナルの
減少を時間の関数としてモニターすることができる。
CBI及びCNIアダクトを用いるこの発明の化学ルミ
ネッセンス法はまた、痕跡量のシアン化物及び過酸化水
素の測定のためにも有用でちる。痕跡量の過酸化水素を
測定するため、啓酸エステル及び既知量のあらかじめ調
製されたCBI又はCNIアダクトを、過歳化物を含有
するサンプルに添加する。混合物の化学ルミネッセンス
が過酸化物の存在を必要とするため、及び前記の系にお
けるすべての変量が既知であるため、生ずる化学ルミネ
ッ七ンスの強度を用いて系に存在するH2O2の量を確
定することができる。
ネッセンス法はまた、痕跡量のシアン化物及び過酸化水
素の測定のためにも有用でちる。痕跡量の過酸化水素を
測定するため、啓酸エステル及び既知量のあらかじめ調
製されたCBI又はCNIアダクトを、過歳化物を含有
するサンプルに添加する。混合物の化学ルミネッセンス
が過酸化物の存在を必要とするため、及び前記の系にお
けるすべての変量が既知であるため、生ずる化学ルミネ
ッ七ンスの強度を用いて系に存在するH2O2の量を確
定することができる。
同様にして、痕跡量のシアン化物を測定することができ
、この場合には調節された牙のADA又はNDA及び第
一アミノ化合物を用いて、シアンイオンの量に依存する
一定量のCBI又はCNIを生成せしめる。次K、生ず
るアダクトを蓚酸エステル及び過酸化物と混合して、や
け少存在するシアンイオンの量に依存する程度の化学ル
ミネッセンスを示す分析対象を生成せしめることができ
る。
、この場合には調節された牙のADA又はNDA及び第
一アミノ化合物を用いて、シアンイオンの量に依存する
一定量のCBI又はCNIを生成せしめる。次K、生ず
るアダクトを蓚酸エステル及び過酸化物と混合して、や
け少存在するシアンイオンの量に依存する程度の化学ル
ミネッセンスを示す分析対象を生成せしめることができ
る。
次に、例によりこの発明をさらに具体的に説明するが、
これKよシこの発明の範囲を限定するものではない。
これKよシこの発明の範囲を限定するものではない。
比較例I S々の蓚酸エステル活性化剤を用いるCBI
p導体及びダンシルアミノ酸誘導体の化学ルミネッセン
ス収率 蓚酸エステルTCPO及び2.6−DFPOから生成ス
る高エネルギ一種を用いて、ダンシル化アスパラギン(
DanB−ASN )の化学ルミネッセンス収率をCB
I −t−BuAのこれと比較した。
p導体及びダンシルアミノ酸誘導体の化学ルミネッセン
ス収率 蓚酸エステルTCPO及び2.6−DFPOから生成ス
る高エネルギ一種を用いて、ダンシル化アスパラギン(
DanB−ASN )の化学ルミネッセンス収率をCB
I −t−BuAのこれと比較した。
他のダンシル化アミノ酸の中からDans −ASNを
選択したのは、これが有機溶剤中の良好な溶解性を示す
ため、及びこれがI(PLC/化学ルミネ。
選択したのは、これが有機溶剤中の良好な溶解性を示す
ため、及びこれがI(PLC/化学ルミネ。
センス検出系において他のダンシル化アミノ酸と同じか
又はそれより強い強度シグナルを与えるためである。従
って、Dans −ASNと比べてCBI誘導体につい
て得られる化学ルミネッセンス収率の改良は他のすべて
のダンシル化アミノ酸よシ良好ではないKしても少なく
とも同程度には良好なはずである。簡単に検討されたD
ans −GL’lの場合も同様であろう。
又はそれより強い強度シグナルを与えるためである。従
って、Dans −ASNと比べてCBI誘導体につい
て得られる化学ルミネッセンス収率の改良は他のすべて
のダンシル化アミノ酸よシ良好ではないKしても少なく
とも同程度には良好なはずである。簡単に検討されたD
ans −GL’lの場合も同様であろう。
比較を行うため、等モル量のこの発明のCBIアダクト
及び従来技術のダンシル化アダクト、すなわち酢酸エチ
ル中3.8 X 10−’Mの螢光アダクトを測定した
。ダンシル化アミンは購入し、そしてこの発明のCBI
アダクトは前記の米国比Hs707、676に記載され
ている様にしてアミンをNDA及びCNと反応せしめる
ことによりa製した。
及び従来技術のダンシル化アダクト、すなわち酢酸エチ
ル中3.8 X 10−’Mの螢光アダクトを測定した
。ダンシル化アミンは購入し、そしてこの発明のCBI
アダクトは前記の米国比Hs707、676に記載され
ている様にしてアミンをNDA及びCNと反応せしめる
ことによりa製した。
酢酸エチル及びTHFの80/20(容量)混合物から
成る溶剤中でlXl0 M蓚酸エステル(TCPO又
は2.6−DFPO)を0.1 M I(202と混合
することにより高エネルギ一種を形成せしめた。静的系
においてアミコンーデウマン分光螢光検出器を用いてD
ans −ASN及びCBI−t−BuAについてそれ
ぞれ505 nm及び480 nmを用いて化学ルミネ
ッセンス収率を測定した。実際の測定の前に酢酸エチル
中で蓚酸エステルを貯蔵した時間はTCPOについては
1日、2.6−DFPOについては6日であった。この
結果は、全化学ルミネッセンス収量が酢酸エチル平の蓚
酸エステルの安定性の差異によるものでないことを示し
た。酢酸エチル中エネルギー受容体(Dans−ASN
及びCBI−t−BuA)の新しく調製された3、8X
10−’Mストット溶液を使用した。
成る溶剤中でlXl0 M蓚酸エステル(TCPO又
は2.6−DFPO)を0.1 M I(202と混合
することにより高エネルギ一種を形成せしめた。静的系
においてアミコンーデウマン分光螢光検出器を用いてD
ans −ASN及びCBI−t−BuAについてそれ
ぞれ505 nm及び480 nmを用いて化学ルミネ
ッセンス収率を測定した。実際の測定の前に酢酸エチル
中で蓚酸エステルを貯蔵した時間はTCPOについては
1日、2.6−DFPOについては6日であった。この
結果は、全化学ルミネッセンス収量が酢酸エチル平の蓚
酸エステルの安定性の差異によるものでないことを示し
た。酢酸エチル中エネルギー受容体(Dans−ASN
及びCBI−t−BuA)の新しく調製された3、8X
10−’Mストット溶液を使用した。
比較実験の結果を第1表に示す。
第1表
TCPO90ρ00 (4:96) 106,000
(30ニア0)a:時間に対する強度のプロットの下の
面積として測定された仮シの単位で表した全化学ルミネ
ッセンス収率。
(30ニア0)a:時間に対する強度のプロットの下の
面積として測定された仮シの単位で表した全化学ルミネ
ッセンス収率。
b:最初の化学ルミネッセンスの発生の後、最初の3分
間及び3分間から後の化学ルミネッセンス収率の比率。
間及び3分間から後の化学ルミネッセンス収率の比率。
第1表中のデーターの分析が明らかに示すところによれ
ば、CBI−t−BuAはDens −ASNに比べて
有意に高い化学ルミネッセンス収率をもたらし、化学ル
ミネッセンス活性化剤として2 、6−DFPOを使用
する場合特にそうである。他方、Dans−ASHの全
化学ルミネッセンス効率(曲線下の積分された面積→は
2.6−DFPOの場合よ)もTCPOの場合に大であ
った。この場合、’rcPoに比べて2.6−DFPO
について、最初の3分間に3倍以上の光が放射された。
ば、CBI−t−BuAはDens −ASNに比べて
有意に高い化学ルミネッセンス収率をもたらし、化学ル
ミネッセンス活性化剤として2 、6−DFPOを使用
する場合特にそうである。他方、Dans−ASHの全
化学ルミネッセンス効率(曲線下の積分された面積→は
2.6−DFPOの場合よ)もTCPOの場合に大であ
った。この場合、’rcPoに比べて2.6−DFPO
について、最初の3分間に3倍以上の光が放射された。
化学ルミネッセンスの時間依存性はすべての場合に極め
て複雑であり、反応の時間内に複数の極大を示す。
て複雑であり、反応の時間内に複数の極大を示す。
化学ルミネッセンス反応の3分間まで及び3分間から後
の全化学ルミネッセンス中の部分を計算し、そしてやは
シ第1表に示す。2 、6−DFpQ/ CBI−t−
BuAKついて、全化学ルミネッセンス収率に対する反
応の初期段階のノ々−セントはTCPO/Bang−A
SNより相対的に高かった。この特徴はHPLC−化学
ルミネッセンス検出のために価値があると予想され、E
tOAc/T)IFによ・ける速度挙動は水/アセトニ
トリル含有溶剤の場合と同じである。第1表のデーター
は、2,6−DFPO/CBI−t−BuA系の化学ル
ミネッセンス収率がDane−ASN/TCPOのそれ
より2倍以上大であることを示している。同様に、2.
6−DFPO/CBI−t−BuAの化学ルミネッセン
ス収率は2.6−DFPO/Danm−ASNK比べて
8倍以上犬でありた。これらすべての観察は、流れ系に
おけるCBIE導体の化学ルミネッセンス検出のために
はTCr’Oではな(’ 2.6−DFPOを使用する
のが好ましいことを明瞭に示している。
の全化学ルミネッセンス中の部分を計算し、そしてやは
シ第1表に示す。2 、6−DFpQ/ CBI−t−
BuAKついて、全化学ルミネッセンス収率に対する反
応の初期段階のノ々−セントはTCPO/Bang−A
SNより相対的に高かった。この特徴はHPLC−化学
ルミネッセンス検出のために価値があると予想され、E
tOAc/T)IFによ・ける速度挙動は水/アセトニ
トリル含有溶剤の場合と同じである。第1表のデーター
は、2,6−DFPO/CBI−t−BuA系の化学ル
ミネッセンス収率がDane−ASN/TCPOのそれ
より2倍以上大であることを示している。同様に、2.
6−DFPO/CBI−t−BuAの化学ルミネッセン
ス収率は2.6−DFPO/Danm−ASNK比べて
8倍以上犬でありた。これらすべての観察は、流れ系に
おけるCBIE導体の化学ルミネッセンス検出のために
はTCr’Oではな(’ 2.6−DFPOを使用する
のが好ましいことを明瞭に示している。
率
CBI−t−BuAを使用する発光の収率を種々の蓚酸
エステルについて比較した。やはシ、2,6−DFPO
はTCPO(第1表を参照のこと)と比較してのみ々ら
ず2 、4−DNPO及び2 、4− DFPOと比較
しても最大の化学ルミネッセンス収率を与えることが見
出された。
エステルについて比較した。やはシ、2,6−DFPO
はTCPO(第1表を参照のこと)と比較してのみ々ら
ず2 、4−DNPO及び2 、4− DFPOと比較
しても最大の化学ルミネッセンス収率を与えることが見
出された。
前記比較何重におけるのと同様にして調製されたCBJ
−t−BuAの溶液を使用したが、但しCBI−t−B
uBを使用前6週間室温にて貯蔵した。酢酸エチル中新
しく!!製した存酸エステル溶液を使用した。下記の化
学ルミネッセンス収新は第1表に示したのと同様に仮シ
のユニットであるが505nmの発光(48Q nmに
おけるよりも20チ弱い)において測定したものである
。
−t−BuAの溶液を使用したが、但しCBI−t−B
uBを使用前6週間室温にて貯蔵した。酢酸エチル中新
しく!!製した存酸エステル溶液を使用した。下記の化
学ルミネッセンス収新は第1表に示したのと同様に仮シ
のユニットであるが505nmの発光(48Q nmに
おけるよりも20チ弱い)において測定したものである
。
第2表
挽々の蓚酸エステルによるCBI−t−EuAの化学ル
ミネッセンス収t 2 、4−DFPO5,700 2、6−DFPO16,OO0 TCPO5,300 2、4−DNPO12,700 使用したDane−ASN溶液は98チの水及び2チの
THFかも成る溶剤中3.8 X 10 MDanm
−ASNを含有するストック溶液であった。室温での
貯蔵時間がそれぞれ4,12及び36時間であるDan
s−ASNの3種類のサンプルを2,6−DFPO蓚酸
エステルを用いて分析した。
ミネッセンス収t 2 、4−DFPO5,700 2、6−DFPO16,OO0 TCPO5,300 2、4−DNPO12,700 使用したDane−ASN溶液は98チの水及び2チの
THFかも成る溶剤中3.8 X 10 MDanm
−ASNを含有するストック溶液であった。室温での
貯蔵時間がそれぞれ4,12及び36時間であるDan
s−ASNの3種類のサンプルを2,6−DFPO蓚酸
エステルを用いて分析した。
使用しだCBI−ALA は98%の水及び2%のT
HFの混合物から成る溶剤中3.8 X 10 Mの
ストック溶液であった。この溶液は、適切な重量のCB
I−ALAをTHF/H20溶液中に溶解することによ
り調製した。
HFの混合物から成る溶剤中3.8 X 10 Mの
ストック溶液であった。この溶液は、適切な重量のCB
I−ALAをTHF/H20溶液中に溶解することによ
り調製した。
化学ルミネッセンスをDans−ASHについては50
5 nmにおいて、そしてCBI−ALAについては4
80 nmにおいて前に記載した静的系を用いて測定し
た。
5 nmにおいて、そしてCBI−ALAについては4
80 nmにおいて前に記載した静的系を用いて測定し
た。
上記の比較の結果を第3表に示す。
以下金白
第3表
50チの水、42チのTHF及び8%のEtOAc中C
BI−ALA及びDans−ASNを用いて生ずる全化
学ルミネッセンス収率の比較、水/ THF溶液中誘導
体にされたアミノ酸の安定性2.6−I)FPO400
(4) 14ユ00(4) 1:331
2、Zoo(5) 400 (I2) 5,500(I2)2 、4−
DFPO測定せず 3,900(6)カッコ内の数
値はサンプルを室温にて貯蔵した時間(時)を示す。
BI−ALA及びDans−ASNを用いて生ずる全化
学ルミネッセンス収率の比較、水/ THF溶液中誘導
体にされたアミノ酸の安定性2.6−I)FPO400
(4) 14ユ00(4) 1:331
2、Zoo(5) 400 (I2) 5,500(I2)2 、4−
DFPO測定せず 3,900(6)カッコ内の数
値はサンプルを室温にて貯蔵した時間(時)を示す。
CBI誘導体及びBan5−ASNについての全化学ル
ミネッセンス収率は水を含有する溶剤中CBI−ALA
(第3表)よりも−1劇的でさえある。この結果が示す
ごとく、CIBA−ALAの化学ルミネッセンスはDI
L!II−ASNのそれに比べて約33倍大である。有
機溶剤系における同様の比較は、CBI−t−Butの
化学ルミネッセンスのわずか8倍の増強をもたらした(
第1表)。この結果は、−層良好な検出感度がHPLC
−化学ルミネッセンス系において、溶出する混合物がか
なシの量の水を含む場合(これはHPLC分画において
しばしば生ずる)Kダンシル化類似体ではな(CBIp
導体化アミンを用いることKよシ達成されるであろうこ
とを確認するものである。
ミネッセンス収率は水を含有する溶剤中CBI−ALA
(第3表)よりも−1劇的でさえある。この結果が示す
ごとく、CIBA−ALAの化学ルミネッセンスはDI
L!II−ASNのそれに比べて約33倍大である。有
機溶剤系における同様の比較は、CBI−t−Butの
化学ルミネッセンスのわずか8倍の増強をもたらした(
第1表)。この結果は、−層良好な検出感度がHPLC
−化学ルミネッセンス系において、溶出する混合物がか
なシの量の水を含む場合(これはHPLC分画において
しばしば生ずる)Kダンシル化類似体ではな(CBIp
導体化アミンを用いることKよシ達成されるであろうこ
とを確認するものである。
水を含有する溶液中での化学ルミネッセンス発光の動態
は有機溶剤中のそれとは実質的に異る。
は有機溶剤中のそれとは実質的に異る。
有機溶剤においては2個以上の極大が見られるのに対し
て、1個のみの極大が観察される。50〜70%の強度
の減少が、化学ルミネッセンス試薬を混合して4秒及び
14秒後に見られた。全体化学ルミネッセンス収率もま
た。水含有媒体において非常に低下した。しかしながら
、強度の低下は、CBI訪導体の場合(I:13)に比
べてDuns −ASHの場合(I:52)において−
層深刻であった。
て、1個のみの極大が観察される。50〜70%の強度
の減少が、化学ルミネッセンス試薬を混合して4秒及び
14秒後に見られた。全体化学ルミネッセンス収率もま
た。水含有媒体において非常に低下した。しかしながら
、強度の低下は、CBI訪導体の場合(I:13)に比
べてDuns −ASHの場合(I:52)において−
層深刻であった。
室温にて水含有媒体中に貯蔵されそして室の光に4時間
暴露したCBI及びダンシル誘導体の安定性の予備的研
究は、CBI−ALAについて約13%の化学ルミネッ
センス収率の低下を示した(第4表、後記)。Dans
−ASNの化学ルミネッセンス収率は36時間まで変化
しなかった。しかしながら、CB I−ALAの安定性
(第4表)はCNI−ALAよシ非常に大であ〕、サン
プルが水から保護されそして冷蔵庫に貯鷺された場合に
特にそうであった。
暴露したCBI及びダンシル誘導体の安定性の予備的研
究は、CBI−ALAについて約13%の化学ルミネッ
センス収率の低下を示した(第4表、後記)。Dans
−ASNの化学ルミネッセンス収率は36時間まで変化
しなかった。しかしながら、CB I−ALAの安定性
(第4表)はCNI−ALAよシ非常に大であ〕、サン
プルが水から保護されそして冷蔵庫に貯鷺された場合に
特にそうであった。
化学ルミネッセンス収率
CBI−ALAの化学ルミネッセンス放射の収率を蓚酸
エステル2 、6−DFPO及びTCPOを用いて類似
のCNI−ALAと比較した。
エステル2 、6−DFPO及びTCPOを用いて類似
のCNI−ALAと比較した。
2.6−DFPO及びTCPOは酢酸エチル溶剤中0、
1 Mスト、ト溶液であシ、そしてそれぞれ8日間及び
14日間貯蔵した。
1 Mスト、ト溶液であシ、そしてそれぞれ8日間及び
14日間貯蔵した。
CBI−ALAの化学ルミネッセンスを480 nmに
おいて、前記のごとくアミコン−ボウマン分光螢光検出
器にようモニターした。CNI−ALAの化学ルミネッ
センスを、CNI−ALAアダクトの螢光の極大波長に
相当する5 80 nmにおいてモニターした。検出器
の光電子増倍管感度は、480 nmにおける感度と比
較して580 nmにおいて約50チであった。CNI
−ALAの螢光ピークの半幅はCB I−ALAのそれ
よシ非常に犬であった。
おいて、前記のごとくアミコン−ボウマン分光螢光検出
器にようモニターした。CNI−ALAの化学ルミネッ
センスを、CNI−ALAアダクトの螢光の極大波長に
相当する5 80 nmにおいてモニターした。検出器
の光電子増倍管感度は、480 nmにおける感度と比
較して580 nmにおいて約50チであった。CNI
−ALAの螢光ピークの半幅はCB I−ALAのそれ
よシ非常に犬であった。
上記の比較試験の結果を次の第4表に示す。
第4表
DFPO及びTCPO蓚酸エステルと共にCB I−A
LA及びCNI−ALAを使用する場合の化学ルミネッ
センス収率の比較2.6−DFPO198ρ00 2
4,700TCPO77,00012,400 TCPO及び2.6−DFPOの両者について、CNr
誘導体はCBI訪導体に比べて有意に低い全体化学ルミ
ネッセンス収率を与えた。しかしながら、これらの化学
ルミネッセンス放射を異る2つの波長(CIII及びC
NIのためそれぞれ480 nm及び580nm)にお
いてモニターした。従って、これらは光電子増倍管感度
の相違にゆだねられる。
LA及びCNI−ALAを使用する場合の化学ルミネッ
センス収率の比較2.6−DFPO198ρ00 2
4,700TCPO77,00012,400 TCPO及び2.6−DFPOの両者について、CNr
誘導体はCBI訪導体に比べて有意に低い全体化学ルミ
ネッセンス収率を与えた。しかしながら、これらの化学
ルミネッセンス放射を異る2つの波長(CIII及びC
NIのためそれぞれ480 nm及び580nm)にお
いてモニターした。従って、これらは光電子増倍管感度
の相違にゆだねられる。
この相違を考慮して、第4表中のCNI誘導体の化学ル
ミネッセンス収率は2倍にされるべきである。
ミネッセンス収率は2倍にされるべきである。
さらに、CNl1導体の螢光放射ピークの半幅はCBI
誘導体のそれに比べて非常に大であり、このことがこれ
らの動態測定が行われる放射の極大波長における化学ル
ミネッセンスの低い強度を導く。
誘導体のそれに比べて非常に大であり、このことがこれ
らの動態測定が行われる放射の極大波長における化学ル
ミネッセンスの低い強度を導く。
しかしながら、これらの非常に不都合な条件を考慮に入
れた後でさえ、有機溶剤中のCNI−ALA誘導体の全
化学ルミネッセンス収率は対応するCBIB導体の場合
よシも低いようである。CNI−ALAについて化学ル
きネッセンス強度対時間のプロットは、有機溶剤中での
CBI誘導体の挙動に類似して3つの極大を示した。
れた後でさえ、有機溶剤中のCNI−ALA誘導体の全
化学ルミネッセンス収率は対応するCBIB導体の場合
よシも低いようである。CNI−ALAについて化学ル
きネッセンス強度対時間のプロットは、有機溶剤中での
CBI誘導体の挙動に類似して3つの極大を示した。
cBrn導体の場合のように、後記第5表の結果が明瞭
に示すところKよれば、CNI誘導体の化学ルミネッセ
ンス検出のために化学ルミネッセンス活性化剤としてT
CPOO代シに2.6−DFPOを使用した場合、CN
l−1導体の化学ルミネッセンス収率はほとんど2倍高
かりた。
に示すところKよれば、CNI誘導体の化学ルミネッセ
ンス検出のために化学ルミネッセンス活性化剤としてT
CPOO代シに2.6−DFPOを使用した場合、CN
l−1導体の化学ルミネッセンス収率はほとんど2倍高
かりた。
化学ルミネッセンス活性化剤として2,6−DFPOを
用いる同じ反応条件下でのCBI−t−BuA(第1表
)とCBI−ALA(第4表)の全化学ルミネッセンス
収率の比較により示されるところによれば、誘導体化ア
ミンCBI−t−BuAに比べて誘導体化アミノ酸CB
I−ALAKついて収率は感知できるほど変化しない。
用いる同じ反応条件下でのCBI−t−BuA(第1表
)とCBI−ALA(第4表)の全化学ルミネッセンス
収率の比較により示されるところによれば、誘導体化ア
ミンCBI−t−BuAに比べて誘導体化アミノ酸CB
I−ALAKついて収率は感知できるほど変化しない。
従って、異る蓚酸エステル系におけるCBI−t−Bu
Aについての相対化学ルミネッセンス収率についての結
論は他のCBI−アミノ酸誘導体について同様に適合す
る。
Aについての相対化学ルミネッセンス収率についての結
論は他のCBI−アミノ酸誘導体について同様に適合す
る。
静的系において得られた結果(主として純有機溶剤媒体
中で行われる)をHPLC−化学ルミネ。
中で行われる)をHPLC−化学ルミネ。
センス流れ検出系と比較するために計画された研究を行
った。第2の目的は、CBI誘導体化アミン酸の化学ル
ミネッセンス検出のための最良条件を見出すこと、及び
これらの誘導体の検出限界(LOD)をダンシル化アミ
ノ酸のLODと比較することであった。
った。第2の目的は、CBI誘導体化アミン酸の化学ル
ミネッセンス検出のための最良条件を見出すこと、及び
これらの誘導体の検出限界(LOD)をダンシル化アミ
ノ酸のLODと比較することであった。
比較例1に記載したのと同じ検出及びHPLC条件を使
用したが、但しHPLC移動相において水の代りに水中
0.0025λ1イミ〆ゾールから成るω!!(≠=7
.2 、 HClにて調整)を使用した。この様な条件
下で、化学ルミネッセンスシグナルは第4図に示される
シグナルに比べて約3の係数上もって化学ルミネッセン
スシグナルが上昇した。
用したが、但しHPLC移動相において水の代りに水中
0.0025λ1イミ〆ゾールから成るω!!(≠=7
.2 、 HClにて調整)を使用した。この様な条件
下で、化学ルミネッセンスシグナルは第4図に示される
シグナルに比べて約3の係数上もって化学ルミネッセン
スシグナルが上昇した。
ジペプチドのスト、り溶液を次の様にして調製した。0
.0446■のCBI−ALA−ALAを水中に溶解し
くストックA)、20μtのストックAを980μtの
水で稀釈してスト、りBとした。これは5μを中に2.
5pモルのジペプチドを含有した。
.0446■のCBI−ALA−ALAを水中に溶解し
くストックA)、20μtのストックAを980μtの
水で稀釈してスト、りBとした。これは5μを中に2.
5pモルのジペプチドを含有した。
上記の試験の結果を第5表に示す。
以下余白
第5表
HPLC−化学ルミネッセンス流れ検出系におけるアラ
ニンのシアノベンズ〔f〕インインドール訪導体(CB
I−ALA)及びアラニル−アラニンのシアノベンズ〔
f〕イソインドール誘導体(CBI−ALA−ALA)
の化学ルミネッセンスシグナル応答の 比較 ALA 3.6 695 199ALA
−ALA 2.5 540 216さらに、
第4図において、流れHPLC系におけるCBI−AL
Aの化学ルミネッセンス検出と螢光検出との比較を示す
。さらに詳しくは、次のサンプルを調製しそして分析し
た。100−の水中7.5m9のCBI−ALAのスト
、り溶液を室温にて2ケ月間貯蔵して使用した(ストッ
クA)。20μLのストックAを380μtの水で稀釈
して、5μを中に71pモルのCBI−ALAi含有す
るストックBを得た。20μtのストックBを380μ
tの水で稀釈することにより、5μを中に3.6pモル
のCBI−ALAを含有する溶液を得た。5μtのサン
プルをHPLC系に注入した。螢光検出条件は次の通シ
であった。励起波長に390 nm、励起フィルター(
7−59)、発光フィルター波長7418nm、レンジ
=0.1マイクロアンペアー1光量子増倍管電圧=51
0V。
ニンのシアノベンズ〔f〕インインドール訪導体(CB
I−ALA)及びアラニル−アラニンのシアノベンズ〔
f〕イソインドール誘導体(CBI−ALA−ALA)
の化学ルミネッセンスシグナル応答の 比較 ALA 3.6 695 199ALA
−ALA 2.5 540 216さらに、
第4図において、流れHPLC系におけるCBI−AL
Aの化学ルミネッセンス検出と螢光検出との比較を示す
。さらに詳しくは、次のサンプルを調製しそして分析し
た。100−の水中7.5m9のCBI−ALAのスト
、り溶液を室温にて2ケ月間貯蔵して使用した(ストッ
クA)。20μLのストックAを380μtの水で稀釈
して、5μを中に71pモルのCBI−ALAi含有す
るストックBを得た。20μtのストックBを380μ
tの水で稀釈することにより、5μを中に3.6pモル
のCBI−ALAを含有する溶液を得た。5μtのサン
プルをHPLC系に注入した。螢光検出条件は次の通シ
であった。励起波長に390 nm、励起フィルター(
7−59)、発光フィルター波長7418nm、レンジ
=0.1マイクロアンペアー1光量子増倍管電圧=51
0V。
化学ルミネッセンス検出条件は次の通りであった。シリ
ンジ2ンプA : EtOAe中0.005MTCPO
(200−のEtOAc中448.971りのTcpo
)、流速1m/分;シリンジポンプB : THF中I
M)T202(45,2d)30%H2O2をTHFに
より400ゴに稀釈)、流速2T!Lt/分;励起ラン
プ:オフ:放射フィルター波長)418 nrn ;レ
ンジ=O102マイクロアンペア−;光電子塩″倍管重
圧=510HPLC条件は次の通りであった。移動相、
30%M6 CN / 70 % H2O、均一(Is
ocratic )、流速1d/分;カラム: 25L
:rnX 4.6zxス−!ル=rシルLC−18、注
入されるストックB及びcog:5μL0 84図に、流れHPLC系におけるCB I −ALA
の化学ルミネッセンス検出対仏光検出の比較を示す。
ンジ2ンプA : EtOAe中0.005MTCPO
(200−のEtOAc中448.971りのTcpo
)、流速1m/分;シリンジポンプB : THF中I
M)T202(45,2d)30%H2O2をTHFに
より400ゴに稀釈)、流速2T!Lt/分;励起ラン
プ:オフ:放射フィルター波長)418 nrn ;レ
ンジ=O102マイクロアンペア−;光電子塩″倍管重
圧=510HPLC条件は次の通りであった。移動相、
30%M6 CN / 70 % H2O、均一(Is
ocratic )、流速1d/分;カラム: 25L
:rnX 4.6zxス−!ル=rシルLC−18、注
入されるストックB及びcog:5μL0 84図に、流れHPLC系におけるCB I −ALA
の化学ルミネッセンス検出対仏光検出の比較を示す。
ALAのCBI誘導体についての化学ルミネッセンス検
出対螢光検出の感度の比較を、!ず化学ルミネッセンス
活性化剤としてTCPOを用いて行った(第4図)。化
学ルミネッセンスから得られたシグナルは、同一のシグ
ナル対ノイズ比(S/N)3:1で測定した場合、直接
螢光検出からのものより少なくとも80倍強かった(ピ
ークの高さ。
出対螢光検出の感度の比較を、!ず化学ルミネッセンス
活性化剤としてTCPOを用いて行った(第4図)。化
学ルミネッセンスから得られたシグナルは、同一のシグ
ナル対ノイズ比(S/N)3:1で測定した場合、直接
螢光検出からのものより少なくとも80倍強かった(ピ
ークの高さ。
螢光検出条件は検出について最適感度を与える様にした
が、化学ルミネッセンス検出のためにはこの様な最適化
は行わなかった。さらに、ここでは最も容易に入手可能
な蓚酸エステルとしてTCPOを使用した。これらの条
件下でさえ、CBI−ALAについて8フ工ムトモル(
注入量)のLODを容易に達成することができた(スキ
ーム2及び第6表)。
が、化学ルミネッセンス検出のためにはこの様な最適化
は行わなかった。さらに、ここでは最も容易に入手可能
な蓚酸エステルとしてTCPOを使用した。これらの条
件下でさえ、CBI−ALAについて8フ工ムトモル(
注入量)のLODを容易に達成することができた(スキ
ーム2及び第6表)。
アミノ酸及びジペプチドのCB I 巳1導体てついて
化学ルミネッセンス検出器を用いて得られたシグナル強
度も比較した。第5表のデーターが示す様に、アミノ酸
及びジペプチドの両者について実質的に同じシグナル強
度が得られた。この観察は非常に価値が有ろう。なぜな
ら、アミノ酸エステル及びペプチドは、o−7タルアル
デヒド/チオール試薬系を用いて、比較的低い螢光収量
の誘導体を生じさせるからである。
化学ルミネッセンス検出器を用いて得られたシグナル強
度も比較した。第5表のデーターが示す様に、アミノ酸
及びジペプチドの両者について実質的に同じシグナル強
度が得られた。この観察は非常に価値が有ろう。なぜな
ら、アミノ酸エステル及びペプチドは、o−7タルアル
デヒド/チオール試薬系を用いて、比較的低い螢光収量
の誘導体を生じさせるからである。
よるCBI誘導体とダンシル誘導体の検出感度の比較
最も重要で興味ある実験はHPLC−化学ルミネ、セン
ス検出によるCBI誘導体とダンシル誘導体の検出感度
の比較であった。
ス検出によるCBI誘導体とダンシル誘導体の検出感度
の比較であった。
化学ルミネッセンス検出条件は第4図に記載したものと
同じであった。化学ルミネッセンス活性化剤としてTC
POを使用した。HPLC分析は第4図に記載する様に
して行った。次のサンプルを調製しそして分析した。D
anm −ASN、 0.2951n9/4−水(スト
、りA)、20μtのストックAを380μtの水で稀
釈しくスト、りB)、20μ乙のスト、りBを380μ
tの水で稀釈した(ストックC,5μtが2.5pモル
を含有した)。
同じであった。化学ルミネッセンス活性化剤としてTC
POを使用した。HPLC分析は第4図に記載する様に
して行った。次のサンプルを調製しそして分析した。D
anm −ASN、 0.2951n9/4−水(スト
、りA)、20μtのストックAを380μtの水で稀
釈しくスト、りB)、20μ乙のスト、りBを380μ
tの水で稀釈した(ストックC,5μtが2.5pモル
を含有した)。
Dans −GLY 、 0.165 m974 ml
水(ストックB)、20μLのストック人を380μt
の水で稀釈しくストックB)、20μtのストックBを
380μLの水で稀釈した(ストックC,5μLが1.
65pモルを含有した)。CBI−ALA、 0.21
001n9/4vLt水(ストックA′)、20μLの
スト、りA′を380μtの水で稀釈しくスト、りB’
)、20μtのスト、りB′を380μtの水で稀釈し
くストックC′、5μLが2,3pモルを含有した)、
20μtのストックC′を380μtの水で稀釈した(
ストックD′、5μtが115fモルを含有した)。ダ
ンシル誘導体及びcBrH導体の両者のための化学ルミ
ネッセンス検出条件は次の通シであった。励起ランプ:
オフ、放射波長)418nmの放射フィルター、光量子
増倍管電圧=510’/、レンツ=0,2マイクロアン
4ア、時定数=6秒。
水(ストックB)、20μLのストック人を380μt
の水で稀釈しくストックB)、20μtのストックBを
380μLの水で稀釈した(ストックC,5μLが1.
65pモルを含有した)。CBI−ALA、 0.21
001n9/4vLt水(ストックA′)、20μLの
スト、りA′を380μtの水で稀釈しくスト、りB’
)、20μtのスト、りB′を380μtの水で稀釈し
くストックC′、5μLが2,3pモルを含有した)、
20μtのストックC′を380μtの水で稀釈した(
ストックD′、5μtが115fモルを含有した)。ダ
ンシル誘導体及びcBrH導体の両者のための化学ルミ
ネッセンス検出条件は次の通シであった。励起ランプ:
オフ、放射波長)418nmの放射フィルター、光量子
増倍管電圧=510’/、レンツ=0,2マイクロアン
4ア、時定数=6秒。
螢光検出のためには、混合機M!(第3図)を取シ外し
、そしてHPLCカラムからの流出液を10c!RX0
.25111のステンレス鋼チューブを有する化学ルミ
ネッセンス検出器に直接供給した。螢光検出条件は次の
通シであった。ダンシル誘導体のため、励起波長=それ
ぞれ励起フィルター7−54及び7−51を用いて34
0 nm又は360nm、光量子増倍管電圧=502V
、レンジ=0.1マイクロアン4アー、時定数=6秒、
放射フィルター波長)418 nm:cBI誘導体のた
め、励起波長=390 nm、励起フィルター7−59
、光量子増倍管電圧=518V、レンジ=01マイクロ
アンペア−1時定数=6秒、放射フィルター波長> 4
1811m6 いずれもシグナル:ノイズ(S/N)比として算出され
た螢光検出(LODf)対化学ルミネッセンス検出(L
ODcL)の検出(LOD)限界の比率は3:1であっ
た。
、そしてHPLCカラムからの流出液を10c!RX0
.25111のステンレス鋼チューブを有する化学ルミ
ネッセンス検出器に直接供給した。螢光検出条件は次の
通シであった。ダンシル誘導体のため、励起波長=それ
ぞれ励起フィルター7−54及び7−51を用いて34
0 nm又は360nm、光量子増倍管電圧=502V
、レンジ=0.1マイクロアン4アー、時定数=6秒、
放射フィルター波長)418 nm:cBI誘導体のた
め、励起波長=390 nm、励起フィルター7−59
、光量子増倍管電圧=518V、レンジ=01マイクロ
アンペア−1時定数=6秒、放射フィルター波長> 4
1811m6 いずれもシグナル:ノイズ(S/N)比として算出され
た螢光検出(LODf)対化学ルミネッセンス検出(L
ODcL)の検出(LOD)限界の比率は3:1であっ
た。
S /N = 3 / 1における検出限界(LOD
)最大ピーク高さを計算のため)て援用したため、及び
均一条件下でのCBIB導体の保持時間がダンシル誘導
体に比べて有意に長いため、観察されるピークが広くな
り、ダンシル誘導体)てついて同じ条件下で測定された
LODよりCBIについてのLODの値が相対的(〔高
くなる。
)最大ピーク高さを計算のため)て援用したため、及び
均一条件下でのCBIB導体の保持時間がダンシル誘導
体に比べて有意に長いため、観察されるピークが広くな
り、ダンシル誘導体)てついて同じ条件下で測定された
LODよりCBIについてのLODの値が相対的(〔高
くなる。
上記の試験の結果を次の第6表洗示す。
第6表
アラニンのシアノベンズCDイソインドール誘導体(C
HI−ALA)とたつかのダンシル誘導体化アミノ酸の
との、 HPLC−化学ルミネッセンス検出の感度の比
較、並びに同一の誘導体の螢光検出感度との比較 Dana −APAR2521,06011180Da
nm −GLY 10 3 0.4 100=15
0 750〜70CBI −ALA 196 5
7.8 8 4 570上記の結果が明らかに示す
ところ洗よれば、cBBa−導体化アラニンの化学ルミ
ネッセンス検出の感度はそれぞれアスパラギン及びグリ
シンのダンシル誘導体のそれよシも約8〜20倍高い。
HI−ALA)とたつかのダンシル誘導体化アミノ酸の
との、 HPLC−化学ルミネッセンス検出の感度の比
較、並びに同一の誘導体の螢光検出感度との比較 Dana −APAR2521,06011180Da
nm −GLY 10 3 0.4 100=15
0 750〜70CBI −ALA 196 5
7.8 8 4 570上記の結果が明らかに示す
ところ洗よれば、cBBa−導体化アラニンの化学ルミ
ネッセンス検出の感度はそれぞれアスパラギン及びグリ
シンのダンシル誘導体のそれよシも約8〜20倍高い。
このような感度の上昇は化学ルミネッセンス活性化剤と
してTCPOを使用して達成された。アミン、アミノ酸
及びジイプチドの検出感度は、ダンシル誘導体化では7
(CBIi導体化及び化学ルミネッセンス検出を用いる
ことにより少なくとも1オーダー改良され得ると結論す
ることができる。
してTCPOを使用して達成された。アミン、アミノ酸
及びジイプチドの検出感度は、ダンシル誘導体化では7
(CBIi導体化及び化学ルミネッセンス検出を用いる
ことにより少なくとも1オーダー改良され得ると結論す
ることができる。
TCPO/ダンシル誘導体系がアミノ酸のHPLC/化
学ルミネッセンス検出のための現在使用し得る最も鋭敏
汝方法であると考えられる(スパイラル検出セル及び光
電増倍管からの単一光子計数を用いて0.5fモルのL
ODが報告された)ので、CBI誘導体の使用は検出限
界をさらにlオーダー下げるであろう。
学ルミネッセンス検出のための現在使用し得る最も鋭敏
汝方法であると考えられる(スパイラル検出セル及び光
電増倍管からの単一光子計数を用いて0.5fモルのL
ODが報告された)ので、CBI誘導体の使用は検出限
界をさらにlオーダー下げるであろう。
第6表のデーターはまた、ダンシルアミノ酸誘導体及び
CDIアミノ酸誌酸体導体いて、化学ルミネッセンス検
出により達成されるLODが螢光検出により得られる限
界に対して非常に卓越していることを確認するものであ
る。本発明者等の分析条件下では、ダンシル化アミノ酸
の検出感度は、螢光検出に比べて化学ルミネッセンス検
出の場合に50〜180倍上昇した。CBI誘導体につ
いてのこの上昇率は約570であシ、化学ルミネッセン
ス法の特別な利点が示された。
CDIアミノ酸誌酸体導体いて、化学ルミネッセンス検
出により達成されるLODが螢光検出により得られる限
界に対して非常に卓越していることを確認するものであ
る。本発明者等の分析条件下では、ダンシル化アミノ酸
の検出感度は、螢光検出に比べて化学ルミネッセンス検
出の場合に50〜180倍上昇した。CBI誘導体につ
いてのこの上昇率は約570であシ、化学ルミネッセン
ス法の特別な利点が示された。
HPLC条件は次の通うであった。15α×4.6間ス
ペルコシルLC−18カラム、移te相:25%MaC
M/75%O,OO25Mイミダゾール緩衝液(p)(
7,2)、流速1ゴ/分、均一分離、注入容量5μt、
蓚酸エステルの濃度は同じ(0,005M)であった。
ペルコシルLC−18カラム、移te相:25%MaC
M/75%O,OO25Mイミダゾール緩衝液(p)(
7,2)、流速1ゴ/分、均一分離、注入容量5μt、
蓚酸エステルの濃度は同じ(0,005M)であった。
2.6−DFPQの場合、314.2m9の蓚酸エステ
ルを200tLlのEtOAcに溶解し、シリンジポン
プAに入れ、そして1ml/分つ流速で系にポンプ輸送
した。他方、第4図及び第4表て前記したようにして化
学ルミネッセンス検出を行った。
ルを200tLlのEtOAcに溶解し、シリンジポン
プAに入れ、そして1ml/分つ流速で系にポンプ輸送
した。他方、第4図及び第4表て前記したようにして化
学ルミネッセンス検出を行った。
Dane−ASN及びCB I−ALAのため、それぞ
れ例3に記載したストック溶液C及びDを使用した。
れ例3に記載したストック溶液C及びDを使用した。
25のX 4.6 msスイルコシルLC−18カラム
を使用した。
を使用した。
この実験においては、2.5−DFPOの高い絶対シグ
ナル強度は25cInから150へのHPLCカラムの
長さの減少によるものかもしれない。後者の場合、保持
時間は一層短かく、ピークは一7υシャープでおり、そ
してピークの高さは相対的に高かった。さらに、ベース
ラインの安定性は他の実験の場合はど良くはなかった。
ナル強度は25cInから150へのHPLCカラムの
長さの減少によるものかもしれない。後者の場合、保持
時間は一層短かく、ピークは一7υシャープでおり、そ
してピークの高さは相対的に高かった。さらに、ベース
ラインの安定性は他の実験の場合はど良くはなかった。
報告されたLOD値はS/N=3/1においてでちる。
上記の試験の結果を次の第7表に示す。
以下余白
第7表
化学ルミネッセンス活性化剤としてTCPO及び2 、
6−DFPOを使用する、ダンジルアスパラギン(Da
n+5−ASN )及びアラニンのシアノベンズ[”f
]インインドール誘導体のHPLC−化学ルミネッセン
ス検出の比較へn8−ぶ25pり 60 112 1.
9 60 64GII−ALA 115f砂 24
55 2.3 8 3第7表の結果が示すところ
によれば、化学ルミネッセンス試薬として2.6−DF
POを使用することによル、CBI誘導体を用いて得ら
れる感度よシも2倍以上高い感度が達成され、これが8
fモルから3fモルへのLODに反映される。これは、
2.6−DFPOを用いるCBI誘導体−化学ルミネッ
センス検出系がアミノ酸の検出のための今まで報告され
た最も腐感度の方法である。との系を用いて、現在使用
可能な最良の方法、すなわちダンシル誘導体/TCPO
系:て比べて、検出感度を約20〜40倍に上昇せしめ
ることができた。
6−DFPOを使用する、ダンジルアスパラギン(Da
n+5−ASN )及びアラニンのシアノベンズ[”f
]インインドール誘導体のHPLC−化学ルミネッセン
ス検出の比較へn8−ぶ25pり 60 112 1.
9 60 64GII−ALA 115f砂 24
55 2.3 8 3第7表の結果が示すところ
によれば、化学ルミネッセンス試薬として2.6−DF
POを使用することによル、CBI誘導体を用いて得ら
れる感度よシも2倍以上高い感度が達成され、これが8
fモルから3fモルへのLODに反映される。これは、
2.6−DFPOを用いるCBI誘導体−化学ルミネッ
センス検出系がアミノ酸の検出のための今まで報告され
た最も腐感度の方法である。との系を用いて、現在使用
可能な最良の方法、すなわちダンシル誘導体/TCPO
系:て比べて、検出感度を約20〜40倍に上昇せしめ
ることができた。
TCPOに代えて2.6−DFPOを使用した場合、D
ang−ASNについて絶対シグナル増加も観察された
。しかしながら、パックグラウンドノイズ及びHPLC
カラム長さの増加のため、S/N=3/1におけるLO
D値はTCPO及び2.6−DFPOエステルの両者に
ついて実際的に変化しないままであっ九。
ang−ASNについて絶対シグナル増加も観察された
。しかしながら、パックグラウンドノイズ及びHPLC
カラム長さの増加のため、S/N=3/1におけるLO
D値はTCPO及び2.6−DFPOエステルの両者に
ついて実際的に変化しないままであっ九。
この報告に記載した検出限界は)IPLC−化学ルミネ
ッセンス検出系を最速化するためのなんらの努力もする
ことなく得られた。第5図に、CBI−ALAの典型的
な化学ルミネッセンスシグナルを示す0 CDI−ALAが冷蔵庫中で2週間貯蔵されたスト、り
溶液中で安定であったことを条件として、このシグナル
は111fモルの注入された誘導体化分析対象に相当す
る。なお、この分析忙おいて化学ルミネッセンス活性化
剤としてTCPOエステル(2,6−DFPOエステル
ではなく)を使用した。
ッセンス検出系を最速化するためのなんらの努力もする
ことなく得られた。第5図に、CBI−ALAの典型的
な化学ルミネッセンスシグナルを示す0 CDI−ALAが冷蔵庫中で2週間貯蔵されたスト、り
溶液中で安定であったことを条件として、このシグナル
は111fモルの注入された誘導体化分析対象に相当す
る。なお、この分析忙おいて化学ルミネッセンス活性化
剤としてTCPOエステル(2,6−DFPOエステル
ではなく)を使用した。
第5図に示した試験の条件は次の通シであった。
!(PLC条件: 15c1nX 4.6mスベルコシ
ルI、C−18カラム、移動相:30チM@ CN /
70%0゜0025Nイミダゾール緩衝液(p)!=
7.2)。
ルI、C−18カラム、移動相:30チM@ CN /
70%0゜0025Nイミダゾール緩衝液(p)!=
7.2)。
均一溶出、流速1−7分。保持時間は1分40秒間であ
った。
った。
化学ルミネッセンス検出条件は第4図に記載したのと同
じであるが、光電子増倍管電圧は600V1時定数10
秒、レンジ=0.01ミクロアンペアー1化学ルミネッ
センス活性化剤としてTCPOを使用した。
じであるが、光電子増倍管電圧は600V1時定数10
秒、レンジ=0.01ミクロアンペアー1化学ルミネッ
センス活性化剤としてTCPOを使用した。
新たに調製されたストックD’(例3を参照のこと)5
μtを注入しそして分析した。これは115fモルの注
入されたC B I −A LA iC相’3する。ス
トックDはストックAから調製し、後者は冷蔵庫中に2
週間貯蔵した。
μtを注入しそして分析した。これは115fモルの注
入されたC B I −A LA iC相’3する。ス
トックDはストックAから調製し、後者は冷蔵庫中に2
週間貯蔵した。
前記の例及び比較例から、選釈されたアミン、アミノ酸
及び小ペプチドのcBxp導体が蓚酸エステル−H20
2化学ルミネ、センス検出系において卓越したエネルギ
ー受容体(フルオレッサー)であることが明らかである
。
及び小ペプチドのcBxp導体が蓚酸エステル−H20
2化学ルミネ、センス検出系において卓越したエネルギ
ー受容体(フルオレッサー)であることが明らかである
。
静的系の研究において得られた結果は、アミン及びアミ
ノ酸のCBI誘導体がアミノ酸のダンシル誘導体よりも
高い全化学ルミネッセンス収率を生じさせることができ
ることを示している。この効果は特に、HPLC技法に
おいて典型的に用いられる水性溶液中で顕著である。事
実、有機溶剤ではなく水性溶剤が使用された場合、この
発明のCBIアダクトの螢光量子収率はほとんど変化し
ないままである。CBIアダクトとは対照的に、ダンシ
ル化類似体の螢光の量子収率はかなシ低下することすな
わち有機溶剤での0.3〜0.7が水性溶剤中では0.
053〜0.091に低下することが観察された。これ
は尚業界における有意な進歩を少すものである。なぜな
ら、集光及び光子計数のための現在の電子装置を使用す
るT CP O/ H2O2Kよるダンシル化アミノ酸
のHPLC/化学ルミネッセンス検出はアミノ酸のため
の最も鋭敏力検出方法と考えられているからである。し
かしながら、CBr誘導体及び2.6−DFPOの使用
は、従来使用されているダンシル−TCPO系に対して
20〜4゜の係数を転って、そしであるオーダーで第一
アミン分析対象の検出限界を低下せしめるはずである。
ノ酸のCBI誘導体がアミノ酸のダンシル誘導体よりも
高い全化学ルミネッセンス収率を生じさせることができ
ることを示している。この効果は特に、HPLC技法に
おいて典型的に用いられる水性溶液中で顕著である。事
実、有機溶剤ではなく水性溶剤が使用された場合、この
発明のCBIアダクトの螢光量子収率はほとんど変化し
ないままである。CBIアダクトとは対照的に、ダンシ
ル化類似体の螢光の量子収率はかなシ低下することすな
わち有機溶剤での0.3〜0.7が水性溶剤中では0.
053〜0.091に低下することが観察された。これ
は尚業界における有意な進歩を少すものである。なぜな
ら、集光及び光子計数のための現在の電子装置を使用す
るT CP O/ H2O2Kよるダンシル化アミノ酸
のHPLC/化学ルミネッセンス検出はアミノ酸のため
の最も鋭敏力検出方法と考えられているからである。し
かしながら、CBr誘導体及び2.6−DFPOの使用
は、従来使用されているダンシル−TCPO系に対して
20〜4゜の係数を転って、そしであるオーダーで第一
アミン分析対象の検出限界を低下せしめるはずである。
これは0.1fモルレベルより低い検出限界に反映され
る。
る。
CBI−ソR7″チドについて観察された検出限界がこ
の発明の方法を用いてCHI−ALAによυ得られるそ
れに匹敵したから、この発明の方法は小シプチドの鋭敏
な検出に一般的に適用され得ることが明らかである。
の発明の方法を用いてCHI−ALAによυ得られるそ
れに匹敵したから、この発明の方法は小シプチドの鋭敏
な検出に一般的に適用され得ることが明らかである。
以上、好ましい態様を具体的に記載したが1本発明の範
囲内で種々の変更を行うことができよう。
囲内で種々の変更を行うことができよう。
第1図はこの発明の全体工程の1つの具体例の流れ図で
ある。 第2図は静的系の化学ルミネッセンス分析器の概略図で
ある。 第3図は高速液体クロマトグラフィー後のカラム流検出
系概略区である。 第4図は冒速液体クロマトグラフィー系:τおけるCB
I−ALAの化学ルミネッセンス検出と螢光検出を比較
するグラフである。 第5図はCBI−ALAについての高速液体クロマトグ
ラフィー化学ルミネッセンス検出シグナルを示すグラフ
でちる。
ある。 第2図は静的系の化学ルミネッセンス分析器の概略図で
ある。 第3図は高速液体クロマトグラフィー後のカラム流検出
系概略区である。 第4図は冒速液体クロマトグラフィー系:τおけるCB
I−ALAの化学ルミネッセンス検出と螢光検出を比較
するグラフである。 第5図はCBI−ALAについての高速液体クロマトグ
ラフィー化学ルミネッセンス検出シグナルを示すグラフ
でちる。
Claims (20)
- 1.第一アミノ基を含有する化合物の測定方法であっ
て、 (I)第1アミノ基を含有する化合物を(A)ナフタレ
ン−2,3−ジカルボキシアルデヒド又はアントラセン
−2,3−ジカルボキシアルデヒド、及び(B)シアン
化物と反応せしめることにより−シアノ−2−置換ベン
ズ〔f〕イソインドールフルオレッサー又は1−シアノ
−2−置換ナフス〔f〕イソインドールフルオレッサー
を形成せしめ; (II)蓚酸エステル及び過酸化水素を前記1−シアノ
−2−置換ベンズ〔f〕イソインドール・フルオレッサ
ー又は前記1−シアノ−2−置換ナフス〔f〕イソイン
ドール・フルオレッサーと混合することにより化学ルミ
ネッセンスを示す分析対象を形成せしめ:そして (III) 前記化学ルミネッセンスを示す分析対象か
らの化学ルミネッセンス発光を検出手段により検出する
: 段階を含んで成る方法。 - 2.前記段階(I)の前又は後に複数の第一アミノ化
合物を含有する混合物を分画することをさらに含んで成
る特許請求の範囲第1項に記載の方法。 - 3.前記分画段階を前記段階(I)の後に行う特許請
求の範囲第2項に記載の方法。 - 4.前記分画段階を高速液体クロマトグラフィーによ
り行う特許請求の範囲第2項に記載の方法。 - 5.前記分画段階を高速液体クロマトグラフィーによ
り行う特許請求の範囲第3項に記載の方法。 - 6.第一アミノ基を含有する前記化合物が第1アミン
類、第一アミノ酸類、少なくとも1個の第一アミノ基を
有するペプチド類、又はカテコールアミン類である特許
請求の範囲第1項に記載の方法。 - 7.前記ペプチドがアラニン−アラニンである特許請
求の範囲第6項に記載の方法。 - 8.前記蓚酸エステルが蓚酸ビス−(2,6−ジフル
オロフェニル)、蓚酸ビス(2,4−ジフルオロフェニ
ル)、蓚酸ビス−(2,4,6−トリクロロフェニル)
、蓚酸ビス−(2,4−ジニトロフェニル)、又は蓚酸
ビス−(ペンタフルオロフェニル)である特許請求の範
囲第1項に記載の方法。 - 9.前記蓚酸エステルが蓚酸ビス−(2,6−ジフル
オロフェニル)又は蓚酸ビス−(2,4−ジフルオロフ
ェニル)である特許請求。範囲第8項に記載の方法。 - 10.前記蓚酸エステルが蓚酸ビス−(2,6−ジフ
ルオロフェニル)である特許請求の範囲第8項に記載の
方法。 - 11.第一アミノ基を含有する前記化合物をナフタレ
ン−2,3−ジカルボキシアルデヒドと反応せしめる特
許請求の範囲第1項に記載の方法。 - 12.第一アミノ基を含有する前記化合物が溶液中に
約1nMの濃度で存在する特許請求の範囲第1項に記載
の方法。 - 13.高速液体クロマトグラフィーによる前記分画を
水性媒体中で行う特許請求の範囲第5項に記載の方法。 - 14.第一アミノ基を含有する前記化合物がアラニン
又はtert−ブチルアラニンである特許請求の範囲第
1項に記載の方法。 - 15.第一アミノ基を含有する前記化合物がカテコー
ルアミンである特許請求の範囲第1項に記載の方法。 - 16.サンプル中の痕跡量のシアンイオンを測定する
ための方法であって、 (I)第一アミノ基を含有する既知量の化合物をシアン
化物の存在化で既知量のナフタレン−2,3−ジカルボ
キシアルデヒド又はアントラセン−2,3−ジカルボキ
シアルデヒドと反応せしめることにより1−シアノ−2
−置換ペンズ〔f〕イソインドール・フルオレッサー又
は1−シアノ−2−置換ナフス〔f〕イソインドール・
フルオレッサーを生成せしめ: (II)蓚酸エステル及び過酸化水素を前記1−シアノ
−2−置換ペンズ〔f〕イソインドール・フルオレッサ
ー又は前記1−シアノ−2−置換−ナフス〔f〕イソイ
ンドール・フルオレッサーと混合して化学ルミネッセン
スを示す分析対象を生成せしめ;そして (III)前記化学ルミネッセンスを示す分析対象から
の化学ルミネッセンス発光を検出手段により検出する; ことを含んで成る方法。 - 17.サンプル中の痕跡量の過酸化水素を測定するた
めの方法であって、 (I)過酸化水素を含有する前記サンプルを蓚酸エステ
ルと混合し; (II)既知量のあらかじめ調製された1−シアノ−2
−置換ペンズ〔f〕イソインドール・フルオレッサー又
は1−シアノ−2−置換ナフス〔f〕イソインドール・
フルオレッサーを前記サンプルに加えることによって化
学ルミネッセンスを示す分析対象を生成せしめ;そして (III)化学ルミネッセンスを示す前記分析対象から
の化学ルミネッセンス発光を検出しそして測定する: ことを含んで成る方法。 - 18.1−シアノ−2−置換−ペンズ〔f〕イソイン
ドール又は1−シアノ−2−置換−ナフス〔f〕イソイ
ンドールと蓚酸エステル及び過酸化水素との化学ルミネ
ッセンス相互作用生成物。 - 19.蓚酸ビス−(2,6−ジフルオロフェニル)。
- 20.蓚酸ビス−(2,4−ジフルオロフェニル)。
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