JPS6318254A - 第一アミノ化合物の測定方法 - Google Patents
第一アミノ化合物の測定方法Info
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- FHNFHKCVQCLJFQ-UHFFFAOYSA-N xenon atom Chemical compound [Xe] FHNFHKCVQCLJFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
この発明は一般に、第一アミノ基を含有する化合物の測
定方法に関し、さらに詳しくは化学ルミネッセンス法に
関し、この方法においては第一アミノ基を含有するフル
オレッサー分析対象を化学的に励起することにより容易
に検出できそして定量できる分子種を生じさせる。
定方法に関し、さらに詳しくは化学ルミネッセンス法に
関し、この方法においては第一アミノ基を含有するフル
オレッサー分析対象を化学的に励起することにより容易
に検出できそして定量できる分子種を生じさせる。
螢光検出技法は分析化学の分野において広範囲の用途を
有する。この様な技法は典型的には注目の１又は複数の
成分を含むサンプルを所定の波長の光に暴露し、これＫ
よって特徴的な発光を各成分について観察することを含
む。従って、サンプルの定性的及び定量的測定を行うこ
とができる。
有する。この様な技法は典型的には注目の１又は複数の
成分を含むサンプルを所定の波長の光に暴露し、これＫ
よって特徴的な発光を各成分について観察することを含
む。従って、サンプルの定性的及び定量的測定を行うこ
とができる。
しかしながら、この様な吸収検出技法の問題点は、これ
らがしばしば高いパックグラウンドシグナルをもたらし
、これが検出感度を低下せしめることである。さらに詳
しくは、−量励起状態からの光誘導発光により特徴付け
られる螢光検出技法においては、迷光、及び他の散乱現
象、すなわちレイ９（Ｒａｌｅｌｇｈ ）及びラマン（
Ｒａｍａｎ ）散乱がパックグラウンドシグナルの増加
をもたらし、これによって螢光検出技法の感度が低下す
る。迷光及びレイリ散乱の両者からの妨害は適切に設計
されたセル室を用いることにより、又は発光フィルター
及びモノクロメータ−を用いることによって除去され得
る。ラマン散乱からの妨害を除去することもできるが、
これは非常に複雑な技術を必要とする。従って、螢光分
析技法におけるパックグラウンド妨害を実質的に除去す
ることは可能であるが、これは非常な追加の時間及び出
費によってのみ達成される。
らがしばしば高いパックグラウンドシグナルをもたらし
、これが検出感度を低下せしめることである。さらに詳
しくは、−量励起状態からの光誘導発光により特徴付け
られる螢光検出技法においては、迷光、及び他の散乱現
象、すなわちレイ９（Ｒａｌｅｌｇｈ ）及びラマン（
Ｒａｍａｎ ）散乱がパックグラウンドシグナルの増加
をもたらし、これによって螢光検出技法の感度が低下す
る。迷光及びレイリ散乱の両者からの妨害は適切に設計
されたセル室を用いることにより、又は発光フィルター
及びモノクロメータ−を用いることによって除去され得
る。ラマン散乱からの妨害を除去することもできるが、
これは非常に複雑な技術を必要とする。従って、螢光分
析技法におけるパックグラウンド妨害を実質的に除去す
ることは可能であるが、これは非常な追加の時間及び出
費によってのみ達成される。
高感度螢光検出技法に関し、従来技術において遭遇され
る困難のため化学ルミネッセンスを用いる技法が求めら
れている。
る困難のため化学ルミネッセンスを用いる技法が求めら
れている。
紫外線又は可視光線の吸収により注目の化合物が一景励
起状態になる螢光技法とは異シ、化学ルミネッセンス技
法は化学反応によって注目の化合物の励起を行う。従っ
て、これらは吸光法に関して観察されるのと同じ光散乱
現象を生じさせない。
起状態になる螢光技法とは異シ、化学ルミネッセンス技
法は化学反応によって注目の化合物の励起を行う。従っ
て、これらは吸光法に関して観察されるのと同じ光散乱
現象を生じさせない。
化学ルミネッセンス技法を行うためＫは、フルオレ、サ
ー（又はエネルギー受容体）にエネルギーを移送する化
学反応が起こシ、これＫよってフルオレッサーが励起状
態にされる。次に、励起されたフルオレ、サーは光子を
放出することにより又は他の非放射過程により自ら基底
状態にもどる。
ー（又はエネルギー受容体）にエネルギーを移送する化
学反応が起こシ、これＫよってフルオレッサーが励起状
態にされる。次に、励起されたフルオレ、サーは光子を
放出することにより又は他の非放射過程により自ら基底
状態にもどる。
言うまでもなく、光子の放出は適当な検出装置によって
記録される。
記録される。
螢光技法に対する化学ルミネッセンス技法の明白な利点
にもかかわらず、化学ルミネッセンス技法の実施は普及
していない。この理由は化合物を化学ルミネッセンスを
示す様にすることが非常に困難であったためである。さ
らに具体的には、まず第１に、螢光を示す、ナな光によ
る励起の後に光子を放出する化合物の数は非常に限られ
ている。
にもかかわらず、化学ルミネッセンス技法の実施は普及
していない。この理由は化合物を化学ルミネッセンスを
示す様にすることが非常に困難であったためである。さ
らに具体的には、まず第１に、螢光を示す、ナな光によ
る励起の後に光子を放出する化合物の数は非常に限られ
ている。
この限られた数の螢光物質の内、さらに少数の化合物が
化学ルミネッセンスを示す、すなわち化学反応による励
起の後に光子を放出するであろう。
化学ルミネッセンスを示す、すなわち化学反応による励
起の後に光子を放出するであろう。
これに加えて、測定技法への化学ルミネッセンスの適用
のためには注目の化合物（この発明の場合には第一アミ
ノ化合物）から化学ルミネッセンスを示す化合物が誘導
され得ることが必要であり、そして利用可能な化学ルミ
ネッセンスを用いる効果的な測定法はほとんど知られて
いない。
のためには注目の化合物（この発明の場合には第一アミ
ノ化合物）から化学ルミネッセンスを示す化合物が誘導
され得ることが必要であり、そして利用可能な化学ルミ
ネッセンスを用いる効果的な測定法はほとんど知られて
いない。
１つの化学ルミネッセンス技法においては、オレイン酸
アリルと過酸化水素との混合物を使用して、ダンシル化
（ｄａｎａｙｌａｔｅｄ ）アミノ酸、すなわち５−ジ
メチルアミノナフタレン−スルホニルクロリドと反応し
次に酸加水分解されたアミノ酸、から生成したフルオレ
、サーが活性化される。個個のダンシル化アミノ酸がま
ず高速液体りｐマドグラフィーにより分画される。単一
光子計数光電子増倍管に面するらせん流セルを用いる特
別に設計された検出器により検出を行う場合、この様な
活性化されたアミノ酸フルオレ、サーの検出限界は２〜
３フ工ムトモルである。
アリルと過酸化水素との混合物を使用して、ダンシル化
（ｄａｎａｙｌａｔｅｄ ）アミノ酸、すなわち５−ジ
メチルアミノナフタレン−スルホニルクロリドと反応し
次に酸加水分解されたアミノ酸、から生成したフルオレ
、サーが活性化される。個個のダンシル化アミノ酸がま
ず高速液体りｐマドグラフィーにより分画される。単一
光子計数光電子増倍管に面するらせん流セルを用いる特
別に設計された検出器により検出を行う場合、この様な
活性化されたアミノ酸フルオレ、サーの検出限界は２〜
３フ工ムトモルである。
アミノ酸及び第一アミンをダンシル化することにより形
成されるフルオレ、サーは、種々の脂肪族第一アミンに
ついて最も低い検出限界、すなわち０．８〜１４フ工ム
トモル〔ｆモル）を与えることが示された。脂肪族アミ
ンと４−クロロ−７−二トロヘン／−１，２，５−オキ
サジアゾール（ＮＢＤ−ＣＩ）及び０−７ｐｋ７にデヒ
ド（ＯＰＡ）との反応により生成するフルオレッサーは
それぞれ１９〜２４０フ工ムトモル、及び９４〜５８０
フ工ムトモルの検出限界を与える。
成されるフルオレ、サーは、種々の脂肪族第一アミンに
ついて最も低い検出限界、すなわち０．８〜１４フ工ム
トモル〔ｆモル）を与えることが示された。脂肪族アミ
ンと４−クロロ−７−二トロヘン／−１，２，５−オキ
サジアゾール（ＮＢＤ−ＣＩ）及び０−７ｐｋ７にデヒ
ド（ＯＰＡ）との反応により生成するフルオレッサーは
それぞれ１９〜２４０フ工ムトモル、及び９４〜５８０
フ工ムトモルの検出限界を与える。
化学ルミネッセンス測定技法におけるフルオレッサーと
してダンシル化誘導体を用いることＫよシ得られる上に
報告された検出限界は非常に良好であるが、高速液体ク
ロマトグラフィー技法により分画されるサンプルへのこ
れらの適用は是分限定される。逆相高速液体クロマトグ
ラフィー技法。
してダンシル化誘導体を用いることＫよシ得られる上に
報告された検出限界は非常に良好であるが、高速液体ク
ロマトグラフィー技法により分画されるサンプルへのこ
れらの適用は是分限定される。逆相高速液体クロマトグ
ラフィー技法。
すなわち固定相が水性でありそして移動相が有機性であ
る技法は、実質的カフつ非常に可変的々濃度の水の存在
を必要とする。しかしながら、ダンシル化されたアミノ
酸の螢光収量はこのような溶剤の変化により非常に影響
される。すなわち、有機溶剤中で０．３〜０．７の値を
有するダンシル化アミノ酸は水中では０．０５３〜０．
０９１の値を有することが見出された。従って、高速液
体クロマトグラフィーにより分画されたダンシル化アミ
ノ酸の螢光収量は、しばしば、非常に少量のこれらのア
ミノ酸を検出しそして定量するには許容されない程低い
レベルにある。
る技法は、実質的カフつ非常に可変的々濃度の水の存在
を必要とする。しかしながら、ダンシル化されたアミノ
酸の螢光収量はこのような溶剤の変化により非常に影響
される。すなわち、有機溶剤中で０．３〜０．７の値を
有するダンシル化アミノ酸は水中では０．０５３〜０．
０９１の値を有することが見出された。従って、高速液
体クロマトグラフィーにより分画されたダンシル化アミ
ノ酸の螢光収量は、しばしば、非常に少量のこれらのア
ミノ酸を検出しそして定量するには許容されない程低い
レベルにある。
従来技術の化学ルミネッセンス技法の前記の限界及び欠
点並びに上に具体的に記載しなかった欠点の観点から、
第一アミノ基を含有する非常に少量（フェムトモル）の
分析対象を測定するための、ＨＰＬＣ分離又は他の分離
技法において典型的に遭遇され悪条件によりネ都合な影
響を受けない化学ルミネッセンス技法の必要性が当業界
において存在する。従って、第一アミノ基を含有する化
合物から形成されそして変化する溶剤環境においてさえ
強い化学ルミネッセンスを示すように活性化され得る新
規なフルオレタサーを提供することによυ前記の要請を
満足せしめることが、本発明の第一の目的である。
点並びに上に具体的に記載しなかった欠点の観点から、
第一アミノ基を含有する非常に少量（フェムトモル）の
分析対象を測定するための、ＨＰＬＣ分離又は他の分離
技法において典型的に遭遇され悪条件によりネ都合な影
響を受けない化学ルミネッセンス技法の必要性が当業界
において存在する。従って、第一アミノ基を含有する化
合物から形成されそして変化する溶剤環境においてさえ
強い化学ルミネッセンスを示すように活性化され得る新
規なフルオレタサーを提供することによυ前記の要請を
満足せしめることが、本発明の第一の目的である。
第一アミノ基を含有する化合物を測定するための、これ
らの化合物をヘムトモル量以下の量で検出することがで
きる方法を提供することが本発明の他の目的である。
らの化合物をヘムトモル量以下の量で検出することがで
きる方法を提供することが本発明の他の目的である。
第一アミノ基を含有する化合物を化学ルミネ。
センスによυ測定するための一層高感度の方法を提供す
ることが本発明の他の目的である。
ることが本発明の他の目的である。
本発明の他の目的は、化学ルミネッセンス収率を増強す
る新しい種類の蓚酸エステルを用いて化学ルミネッセン
スにより第−アミノ基を含有する化合物を測定する方法
を提供することである。
る新しい種類の蓚酸エステルを用いて化学ルミネッセン
スにより第−アミノ基を含有する化合物を測定する方法
を提供することである。
本発明の他の目的は、化学ルミネッセンス法においてＮ
ＤＡ−第一アミン又はＡＤＡ−第一アミンフルオレッサ
ーを用いてシアン及び過酸化水素を測定するための方法
を提供少ることである。
ＤＡ−第一アミン又はＡＤＡ−第一アミンフルオレッサ
ーを用いてシアン及び過酸化水素を測定するための方法
を提供少ることである。
要約すれば、前記の目的及び他の目的は、第一アミノ基
を含有する化合物の測定方法であって、（Ｉ）次の反応
式： に従りて、第一アミノ基を含有する化合物をシアンイオ
ンの存在下でナフタレン−２，３−ジカル〆キシアルデ
ヒド（ＮＤＡ）又はアントラセン−２，３−ジカル？キ
シアルデヒド（ＡＤＡ）と反応せしめることによりュー
シアノ−２−置換一ペンズＩｆｆ）イソインドール又は
１−シアノ−２−置換−ナフス〔ｆ）イノインドールを
生成せしめ；（ＩＩ） 蓚酸エステル又は過酸化水素
を前記１−シアノ−２−ｆｉｌ換ベンズ〔ｆｉｌイソイ
ンドール・フルオレッサー又は１−シアノ−２−置換す
７ス〔ｆ〕イソインドール・フルオレッサーと反応せし
めることによ）化学ルミえ、センス分析対象を生成せし
め；そして （Ｉｌｌ）この化学ルミネッセンス分析対象からの化学
ルミネッセンス発光を検出手段により検出する；ことを
含んで成る方法により達成される。
を含有する化合物の測定方法であって、（Ｉ）次の反応
式： に従りて、第一アミノ基を含有する化合物をシアンイオ
ンの存在下でナフタレン−２，３−ジカル〆キシアルデ
ヒド（ＮＤＡ）又はアントラセン−２，３−ジカル？キ
シアルデヒド（ＡＤＡ）と反応せしめることによりュー
シアノ−２−置換一ペンズＩｆｆ）イソインドール又は
１−シアノ−２−置換−ナフス〔ｆ）イノインドールを
生成せしめ；（ＩＩ） 蓚酸エステル又は過酸化水素
を前記１−シアノ−２−ｆｉｌ換ベンズ〔ｆｉｌイソイ
ンドール・フルオレッサー又は１−シアノ−２−置換す
７ス〔ｆ〕イソインドール・フルオレッサーと反応せし
めることによ）化学ルミえ、センス分析対象を生成せし
め；そして （Ｉｌｌ）この化学ルミネッセンス分析対象からの化学
ルミネッセンス発光を検出手段により検出する；ことを
含んで成る方法により達成される。
好ましくは、第一アミノ基を含有する化合物の混合物を
ＮＤＡ又はＡＤＡと反応せしめることによってアダクト
を生成せしめた後、これを高速液体クロマトグラフィー
により分画し、モして糧々のアダクト画分を蓚酸エステ
ル及び過酸化水素と反応せしめ、次に化学ルミネッ七ン
ス分析を行う。この方法に代えて、ＮＤＡ又はＡＤＡと
の反応に先立つて混合物を分画することができる。
ＮＤＡ又はＡＤＡと反応せしめることによってアダクト
を生成せしめた後、これを高速液体クロマトグラフィー
により分画し、モして糧々のアダクト画分を蓚酸エステ
ル及び過酸化水素と反応せしめ、次に化学ルミネッ七ン
ス分析を行う。この方法に代えて、ＮＤＡ又はＡＤＡと
の反応に先立つて混合物を分画することができる。
この発明の前記の、及ｑ後の記載で明らかにする他の目
的、利点及び特徴により、さらに後に記載する具体的な
説明によ）１本発明は一層よく理解されよう。
的、利点及び特徴により、さらに後に記載する具体的な
説明によ）１本発明は一層よく理解されよう。
この発明の好ましい態様の全体的方法を第１図に流れ図
として示す。第一アミノ基を含有するサンプル（流れ■
）がまずシアンイオンの存在下においてナフタレン−２
，３−ジカルボキシアルデヒド（ＮＤＡ）又はアントラ
セン−２，３−ジカルボキシアルデヒド（ＡＤＡ）（流
れＩＩ）と反応し、誘導体フルオレッサーＣＢＩ及びＣ
ＮＩがそれぞれ生成する（流れ■）。次に、ＣＢＩ又は
ＣＮＩ誘導体を含有するサンプルが高速液体クロマトグ
ラフィーのごとき技法により分画され、第一アミノ化合
物の分画されたＣＢＩ又はＣＮＩ誘導体を含有する流出
液が得られる。酢酸エチル溶剤中の蓚酸エステル（流れ
■）、及びテトラヒドロフラン又は適当な溶剤中のＨ２
Ｏ２（流れ■）がＣＢＩ又はＣＮＩフルオレッサーの流
れ■と一緒にされ化学ルミボッセンス（流れ■）が生じ
、次にこれが分析のための検出装置に送られる。
として示す。第一アミノ基を含有するサンプル（流れ■
）がまずシアンイオンの存在下においてナフタレン−２
，３−ジカルボキシアルデヒド（ＮＤＡ）又はアントラ
セン−２，３−ジカルボキシアルデヒド（ＡＤＡ）（流
れＩＩ）と反応し、誘導体フルオレッサーＣＢＩ及びＣ
ＮＩがそれぞれ生成する（流れ■）。次に、ＣＢＩ又は
ＣＮＩ誘導体を含有するサンプルが高速液体クロマトグ
ラフィーのごとき技法により分画され、第一アミノ化合
物の分画されたＣＢＩ又はＣＮＩ誘導体を含有する流出
液が得られる。酢酸エチル溶剤中の蓚酸エステル（流れ
■）、及びテトラヒドロフラン又は適当な溶剤中のＨ２
Ｏ２（流れ■）がＣＢＩ又はＣＮＩフルオレッサーの流
れ■と一緒にされ化学ルミボッセンス（流れ■）が生じ
、次にこれが分析のための検出装置に送られる。
物質
この発明は、第一アミノ基を含有する単一化合物又は化
合物の混合物を与える。第一アミノ基を含有する化合物
にはアミノ酸類、第一アミン類、ペプチド類及びカテコ
ール類が含まれる。
合物の混合物を与える。第一アミノ基を含有する化合物
にはアミノ酸類、第一アミン類、ペプチド類及びカテコ
ール類が含まれる。
第一アミノ基を含有する１又は複数の化合物を含むと信
じられる任意のサンプルをこの発明に従って測定するこ
とができる。水性溶剤及び有機溶剤の両者から効果的な
測定結果が得られる。さらに、１ナノモルという少量の
第一アミノ化合物及び１ミリモルという多くの第一アミ
ノ化合物を含有するサンプルを測定することができる。
じられる任意のサンプルをこの発明に従って測定するこ
とができる。水性溶剤及び有機溶剤の両者から効果的な
測定結果が得られる。さらに、１ナノモルという少量の
第一アミノ化合物及び１ミリモルという多くの第一アミ
ノ化合物を含有するサンプルを測定することができる。
−層高濃度の第一アミノ化合物を測定することもできる
が、この様な高い濃度レベルにおいてはさらに簡単な技
法が一般に適当である。
が、この様な高い濃度レベルにおいてはさらに簡単な技
法が一般に適当である。
典型的には、測定される材料は生物学的液体。
例えば尿、全血、血漿、血清及び投与形態の医薬に由来
する。
する。
ダクトの生成
単一の第一アミノ化合物又は第一アミノ化合物の混合物
を含有するサンプルをシアン化物の存在下でＮＤＡと反
応せしめることにより−シアノー２−置換ベンズ〔ｆ）
イソインドール（ＣＢＩ）を生成せしめるか、又はシア
ンの存在下でＡＤＡと反応せしめることにより−シアノ
ー２−置換ナフス〔ｆ〕イソインドール（ＣＮＩ）を生
成せしめる。
を含有するサンプルをシアン化物の存在下でＮＤＡと反
応せしめることにより−シアノー２−置換ベンズ〔ｆ）
イソインドール（ＣＢＩ）を生成せしめるか、又はシア
ンの存在下でＡＤＡと反応せしめることにより−シアノ
ー２−置換ナフス〔ｆ〕イソインドール（ＣＮＩ）を生
成せしめる。
これらの反応は次の反応式で表わされる。
アントラセン−２，３−ジカルボキシアルデヒド１−シ
アノ−２−置換ナフス〔ｆ）イソインドール第一アミン
とグイアルデヒドとからイソインドールを生成せしめる
ための上記の２つの反応の内、ＮＤＡを使用する反応が
明らかに好ましい。
アノ−２−置換ナフス〔ｆ）イソインドール第一アミン
とグイアルデヒドとからイソインドールを生成せしめる
ための上記の２つの反応の内、ＮＤＡを使用する反応が
明らかに好ましい。
ＮＤＡ及びＡＤＡはいずれも従来技術において既知の化
合物である。従って、これらの製造についてはこの明細
書には記載しない。
合物である。従って、これらの製造についてはこの明細
書には記載しない。
第一アミノ基を有する化合物からのＣＢＩの生成は１９
８５年３月４日に出願された米国特許出願ム７０７．６
７６に詳細に記載されている。一般Ｋ、第一アミノ基を
含有する化合物を、ややアルカリ性の条件下、例えば９
〜１０の一レベルにおいてＮ Ｄ Ａ及びシアンイオン
と反応せしめにとによりＣＢＩが生成する。なお、ＣＢ
Ｉば４２０ｎｍの波長の光に暴露された場合螢光奮発す
る。螢光技法に内在する欠点のため、本発明はＣＢＩ及
びＣＮＩを化学ルミネッセンスにすることができる方法
を提供する。
８５年３月４日に出願された米国特許出願ム７０７．６
７６に詳細に記載されている。一般Ｋ、第一アミノ基を
含有する化合物を、ややアルカリ性の条件下、例えば９
〜１０の一レベルにおいてＮ Ｄ Ａ及びシアンイオン
と反応せしめにとによりＣＢＩが生成する。なお、ＣＢ
Ｉば４２０ｎｍの波長の光に暴露された場合螢光奮発す
る。螢光技法に内在する欠点のため、本発明はＣＢＩ及
びＣＮＩを化学ルミネッセンスにすることができる方法
を提供する。
第一アミノ基を含有する２種類以上の化合物を出発材料
が含む場合、これを一般番で分画段階にかける。分画は
第一アミンのＣＢＩ又はＣＮＩアダクトの形成前又は後
において行うことができる。最も好ましい分画技法は高
速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ） であシ、これ
は良く知られた分画技法である。言うまでもなく、第一
アミノ基を含有する化合物が１種類のみ測定サンプル中
に存在する場合、分画することは必要で彦い。
が含む場合、これを一般番で分画段階にかける。分画は
第一アミンのＣＢＩ又はＣＮＩアダクトの形成前又は後
において行うことができる。最も好ましい分画技法は高
速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ） であシ、これ
は良く知られた分画技法である。言うまでもなく、第一
アミノ基を含有する化合物が１種類のみ測定サンプル中
に存在する場合、分画することは必要で彦い。
本発明のサンプルの高速液体クロマトグラフィーはウォ
ーターズ製プログラム可能な溶剤供給系、２０μＬルー
プを有するレオダイン７１２５注大器、及び２５σＸ
４．６ ｖｍ又は１５α×４６ｘｍの寸法ヲ有するス被
ルコシルＬＣ−１８カラムを用いて行った。一般に、Ｈ
ＰＬＣグレードのア七トニトリル／イミダゾール綴衝液
（水中０． ＯＯ２５Ｍ 。
ーターズ製プログラム可能な溶剤供給系、２０μＬルー
プを有するレオダイン７１２５注大器、及び２５σＸ
４．６ ｖｍ又は１５α×４６ｘｍの寸法ヲ有するス被
ルコシルＬＣ−１８カラムを用いて行った。一般に、Ｈ
ＰＬＣグレードのア七トニトリル／イミダゾール綴衝液
（水中０． ＯＯ２５Ｍ 。
ｐＪ４７．２ ）の７０二３ｏ（ｖ／ｗ）混合物を１ｍ
／分の流速で移動相として用いた。言うまでもなく、他
の）（ＰＬＣ系及び他の分画技法を本発明に従って効果
的に用いることもできる。
／分の流速で移動相として用いた。言うまでもなく、他
の）（ＰＬＣ系及び他の分画技法を本発明に従って効果
的に用いることもできる。
（Ｉｖ） ＣＢＩ又はＣＮＩ フルオレッサーの化学
ルミネッセンス活性化 ＣＢＩ又はＣＮＩアタ゛クトを生成せしめ、そして所望
により分画した後、これらを蓚酸エステル及び過酸化水
素（このものはＣＢＩ又はＣＮＩのごときフルオレ、サ
ーを基底状態から励起状態にする）の添加により活性化
する。この発明に従って使用することができる蓚酸エス
テルには新規な蓚酸エステルでｓる蓚酸ビス−（２，４
−ジフルオロフェニル） （２、４−ＤＦＰＯ）及び８
酸ビス−（２，６−ジフルオロフェニル）（２，６−Ｄ
ＦＰＯ）、並びに既知の蓚酸エステルである蓚酸ビス−
（２，４−ジニトロフェニル）（２，４−ＤＮＰＯ）、
蓚酸ビス−（２，４，６−トリクロロフェニル）（ＴＣ
ＰＯ）、及ヒ蓚酸ビス−（ペンタフルオロフェニル）（
ＰＦＰＯ）が含１ ｈ ６−蓚酸エステル２ 、４−
ＤＮＰＯ，ＴＣＰＯ及びＰＦＰＯの合成は従来技術にお
いて知られている。
ルミネッセンス活性化 ＣＢＩ又はＣＮＩアタ゛クトを生成せしめ、そして所望
により分画した後、これらを蓚酸エステル及び過酸化水
素（このものはＣＢＩ又はＣＮＩのごときフルオレ、サ
ーを基底状態から励起状態にする）の添加により活性化
する。この発明に従って使用することができる蓚酸エス
テルには新規な蓚酸エステルでｓる蓚酸ビス−（２，４
−ジフルオロフェニル） （２、４−ＤＦＰＯ）及び８
酸ビス−（２，６−ジフルオロフェニル）（２，６−Ｄ
ＦＰＯ）、並びに既知の蓚酸エステルである蓚酸ビス−
（２，４−ジニトロフェニル）（２，４−ＤＮＰＯ）、
蓚酸ビス−（２，４，６−トリクロロフェニル）（ＴＣ
ＰＯ）、及ヒ蓚酸ビス−（ペンタフルオロフェニル）（
ＰＦＰＯ）が含１ ｈ ６−蓚酸エステル２ 、４−
ＤＮＰＯ，ＴＣＰＯ及びＰＦＰＯの合成は従来技術にお
いて知られている。
例えば、ＤＮＰ Ｏの製造方法はＭ 、 Ｍ ＃ Ｒａ
ｕｈｕ ｔ 。
ｕｈｕ ｔ 。
Ｌ 、 Ｊ 、 Ｂｏｌｌｙｋｙ、 Ｂ 、Ｇ 、Ｒｏ
ｂｓｒｔｓ 、 Ｍ、Ｌｏｙ。
ｂｓｒｔｓ 、 Ｍ、Ｌｏｙ。
Ｒ，Ｈ，Ｗｈｌｔｍａｎ、 Ａ ｔＶ＊ Ｉａｎｎｏｔ
ｔａ、 ＡＲＭ、 Ｓ＠ｍ−ｇｅｌ及びＲ，Ａ、Ｃ１ａ
ｒｋｅ、 ”Ｃｈｅｒｎｉｌｕｍｌｎｅｓｅａｎｅｅｆ
ｒｏｍ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｏｉ Ｅ１ｅｃｔｒｏｎ
七蓚酸ｔｌｖｅｌｙＳｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ Ａｒｙｌ
０ｘａｌａｔｅｓ ｗｉｔｈ ＨｙｄｒｏｇｅｎＰｅ
ｒｏｘｉｄｅ ａｎｄ Ｆｌｕｏｒｅｇｃａｎｃｅ Ｃ
ｏｍｐｏｕｎｄｓ ’ 。
ｔａ、 ＡＲＭ、 Ｓ＠ｍ−ｇｅｌ及びＲ，Ａ、Ｃ１ａ
ｒｋｅ、 ”Ｃｈｅｒｎｉｌｕｍｌｎｅｓｅａｎｅｅｆ
ｒｏｍ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｏｉ Ｅ１ｅｃｔｒｏｎ
七蓚酸ｔｌｖｅｌｙＳｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ Ａｒｙｌ
０ｘａｌａｔｅｓ ｗｉｔｈ ＨｙｄｒｏｇｅｎＰｅ
ｒｏｘｉｄｅ ａｎｄ Ｆｌｕｏｒｅｇｃａｎｃｅ Ｃ
ｏｍｐｏｕｎｄｓ ’ 。
５ｏｃｌａｔｙ、８９，２５．１９６７年１２月６日。
６５１５−６５２２頁に￥載されている。ＤＮＰＯの製
造においてはまず、５ｔの試薬グレードのベンゼン中３
６８．２ｇ（２モル）の２．４−ジニトロフェノールの
溶液を１ｔの溶剤の共沸蒸留により乾燥した。乾燥した
溶液を窒素のもとて１０℃に冷却し、そして２０２．４
９Ｃ２モル）の新たと蒸留したトリエチルアミンを添加
した。次に塩化オキサリル（Ｉ３９，６，ｐ、ｘ、１モ
ル）を３０分間にわたって攪拌し、水浴を用いて反応温
度を１０〜２５℃に維持しながら加えた。
造においてはまず、５ｔの試薬グレードのベンゼン中３
６８．２ｇ（２モル）の２．４−ジニトロフェノールの
溶液を１ｔの溶剤の共沸蒸留により乾燥した。乾燥した
溶液を窒素のもとて１０℃に冷却し、そして２０２．４
９Ｃ２モル）の新たと蒸留したトリエチルアミンを添加
した。次に塩化オキサリル（Ｉ３９，６，ｐ、ｘ、１モ
ル）を３０分間にわたって攪拌し、水浴を用いて反応温
度を１０〜２５℃に維持しながら加えた。
生ずる黄色スラリーを３時間攪拌し、そして減圧下で蒸
発乾燥した。固形物を１ｔのクロロホルムと共に十分に
攪拌してトリエチルアミン塩酸塩を溶解し、そして生成
物を焼結ガラス漏斗上に集め、クロロホルムで洗浄し、
そして真空乾燥した。
発乾燥した。固形物を１ｔのクロロホルムと共に十分に
攪拌してトリエチルアミン塩酸塩を溶解し、そして生成
物を焼結ガラス漏斗上に集め、クロロホルムで洗浄し、
そして真空乾燥した。
１００℃より低温でのニトロベンゼンからのＭｌ晶化に
より１５１．３Ｆ（３５，８％）の淡黄色結果を得た。
より１５１．３Ｆ（３５，８％）の淡黄色結果を得た。
融点１８９℃〜１９２℃。
ＰＦＰＯの製造も記載されている。他の既知の蓚酸エス
テルＴＣＰＯは一般的に上記の方法に従って、轟業者に
より容易に行われるわずかな変更を伴って製造すること
ができる。
テルＴＣＰＯは一般的に上記の方法に従って、轟業者に
より容易に行われるわずかな変更を伴って製造すること
ができる。
新規化合物２．４−及び２ 、６−ＤＦＰＯの合成方法
は次の通りである。まず、トリエチルアミン（Ｅｔ、Ｎ
）を蒸留し、そして２，４−又は２，６−フルオロフェ
ニル化合物ト乾燥ヘンゼン溶液中。
は次の通りである。まず、トリエチルアミン（Ｅｔ、Ｎ
）を蒸留し、そして２，４−又は２，６−フルオロフェ
ニル化合物ト乾燥ヘンゼン溶液中。
℃にて混合する。次に、窒素雰囲気下で攪拌された溶液
中に塩化オキサリルを滴加し、そして室温にて一夜反応
を進行せしめる。一般に、約２重量部の（Ｅｔ）３Ｎ、
５重量部のフェノール化合物、及び１．３重量部の塩化
オキサリルを過剰量の乾燥ベンゼン中で用いる。
中に塩化オキサリルを滴加し、そして室温にて一夜反応
を進行せしめる。一般に、約２重量部の（Ｅｔ）３Ｎ、
５重量部のフェノール化合物、及び１．３重量部の塩化
オキサリルを過剰量の乾燥ベンゼン中で用いる。
２ 、４−ＤＦＰＯの場合、合成の後に得られたトリエ
チルアンモニウム壇酸塩（ＥＴ３Ｎ ＨＣｌ ）と蓚酸
エステルとの固体混合物を温ベンゼンにより処理して蓚
酸塩を溶解せしめ、こうして未溶解のＥｔ３Ｎ ＨＣｌ
を蓚酸塩及びベンゼン部分から分離する。溶剤の除去、
及び同じ溶剤からの再結晶化の後、２．４−ＤＦＰＯの
針状結晶を５８チの収率で得た。
チルアンモニウム壇酸塩（ＥＴ３Ｎ ＨＣｌ ）と蓚酸
エステルとの固体混合物を温ベンゼンにより処理して蓚
酸塩を溶解せしめ、こうして未溶解のＥｔ３Ｎ ＨＣｌ
を蓚酸塩及びベンゼン部分から分離する。溶剤の除去、
及び同じ溶剤からの再結晶化の後、２．４−ＤＦＰＯの
針状結晶を５８チの収率で得た。
２ 、６−ＤＦＰＯの場合、Ｅｔ３Ｎ ＨＣｌを蓚酸エ
ステルから除去する試みを、前者を石油エーテルに溶解
することＫよって行った。しかしながら、この方法は非
常圧効果的でなかった。従って、蓚酸エステルを温ベン
ゼンに溶解し、そして２，４−ＤＦＰＯについて前に記
載した様にして、大部分の目的２．６−ＤＦＰＯを得た
。残シの固体物質（主としてＥｔ３ＮＨＣｔ）を石油エ
ーテル洗浄液と混合し、そして混合物を水で洗浄した。
ステルから除去する試みを、前者を石油エーテルに溶解
することＫよって行った。しかしながら、この方法は非
常圧効果的でなかった。従って、蓚酸エステルを温ベン
ゼンに溶解し、そして２，４−ＤＦＰＯについて前に記
載した様にして、大部分の目的２．６−ＤＦＰＯを得た
。残シの固体物質（主としてＥｔ３ＮＨＣｔ）を石油エ
ーテル洗浄液と混合し、そして混合物を水で洗浄した。
有機相をＭｇ５Ｏ，で乾燥し、そして溶剤を除去した後
、追加の２．６−ＤＦＰＯを得た。−緒にした２、６−
ＤＦＰＯ画分を酢酸エチル−石油エーテルから再結晶化
し、２ 、６− ＤＦＰＯの無色結晶を７８％の収率で
得た。
、追加の２．６−ＤＦＰＯを得た。−緒にした２、６−
ＤＦＰＯ画分を酢酸エチル−石油エーテルから再結晶化
し、２ 、６− ＤＦＰＯの無色結晶を７８％の収率で
得た。
新規な蓚酸塩２．６−ＤＦＰＯは試験された条件下での
ＣＢＩ誘導体の検出についてＴＣＰＯに卓越しておシ、
静的系において測定した場合−暦高い全化学ルミネッセ
ンス強度を与え、そしてＩ（ＰＬＯ−化学ルミネッセン
ス系において一層低い検出限界を与えることが見出され
た。最近、ＴＣＰＯは報告されたＨＰＬＣ−化学ルミネ
ッセンス研究においてほとんど排他的に使用されている
。ＴＣＰＯに対する２ 、６−ＤＦＰＯを用いる他の利
点はこのエステルの酢酸エチル中での７倍高い溶解性で
あり、これにより系における化学ルミネッセンス試薬の
濃度を増加せしめ、そしてさらにＣＢＩ誘導体の検出の
感度を上昇せしめることができることである。
ＣＢＩ誘導体の検出についてＴＣＰＯに卓越しておシ、
静的系において測定した場合−暦高い全化学ルミネッセ
ンス強度を与え、そしてＩ（ＰＬＯ−化学ルミネッセン
ス系において一層低い検出限界を与えることが見出され
た。最近、ＴＣＰＯは報告されたＨＰＬＣ−化学ルミネ
ッセンス研究においてほとんど排他的に使用されている
。ＴＣＰＯに対する２ 、６−ＤＦＰＯを用いる他の利
点はこのエステルの酢酸エチル中での７倍高い溶解性で
あり、これにより系における化学ルミネッセンス試薬の
濃度を増加せしめ、そしてさらにＣＢＩ誘導体の検出の
感度を上昇せしめることができることである。
一般に、酢酸エチル又はＴＨＦのととぎ適幽な溶剤中で
０．０１〜１、ＯＭの過酸化水素溶液を０．００５〜０
．０５Ｍの蓚酸エステル溶液と反応せしめることＫよシ
蓚酸エチル／ Ｈ２Ｏ２反応生成物が生成する。
０．０１〜１、ＯＭの過酸化水素溶液を０．００５〜０
．０５Ｍの蓚酸エステル溶液と反応せしめることＫよシ
蓚酸エチル／ Ｈ２Ｏ２反応生成物が生成する。
前記のＨＰＬＣ系を用いる場合、蓚酸エステル／Ｈ２Ｏ
２反応生成物を次の様にして調製した。まず、酢酸エチ
ル溶剤中５．０ ｍＭの蓚酸エステル溶液とＴＨＦ中Ｉ
ＭのＨ２Ｏ２溶液を１：２の北軍で混合する。ＴＣＰＯ
は酢酸エチル中で長時間にわたって非常に安定であるた
め、蓚酸エステルの溶剤として酢酸エチルを選択した。
２反応生成物を次の様にして調製した。まず、酢酸エチ
ル溶剤中５．０ ｍＭの蓚酸エステル溶液とＴＨＦ中Ｉ
ＭのＨ２Ｏ２溶液を１：２の北軍で混合する。ＴＣＰＯ
は酢酸エチル中で長時間にわたって非常に安定であるた
め、蓚酸エステルの溶剤として酢酸エチルを選択した。
ＨＰＬＣ流出液との混合の後ＴＣＰＯの沈澱を防止する
ため、ＨＰＬＣ移動相中の水分含量及び流速を最小に維
持し、この結果としてＨＰＬＣ分離法のだめの二元溶剤
の選択が幾分制限される。具体的には、移動相の流速を
０．３〜０．５ｄ／分に制限し、そして水含量を５０−
未満に制限した。ＴＨＦ中Ｈ２Ｏ２のみをＨＰＬＣ系に
おいて酢酸エチル中蓚酸エステルと組合わせて使用した
。ＴＨＦはＴＣＰＯの沈澱の問題を最小にするからであ
る。
ため、ＨＰＬＣ移動相中の水分含量及び流速を最小に維
持し、この結果としてＨＰＬＣ分離法のだめの二元溶剤
の選択が幾分制限される。具体的には、移動相の流速を
０．３〜０．５ｄ／分に制限し、そして水含量を５０−
未満に制限した。ＴＨＦ中Ｈ２Ｏ２のみをＨＰＬＣ系に
おいて酢酸エチル中蓚酸エステルと組合わせて使用した
。ＴＨＦはＴＣＰＯの沈澱の問題を最小にするからであ
る。
各５００耐容量の２個のシリン・ゾポンプ（ネステル／
ファウスト）を使用して蓚酸エステル／酢酸エチル及び
Ｈ２Ｏ２／ＴＨＦ溶液を混合機に供給し、ここで２つの
溶液を機械的攪拌機により混合した。
ファウスト）を使用して蓚酸エステル／酢酸エチル及び
Ｈ２Ｏ２／ＴＨＦ溶液を混合機に供給し、ここで２つの
溶液を機械的攪拌機により混合した。
この化学ルミネッセンス試薬を、０．２５ｍｘステンレ
ス鋼チューブを有する第２インターフエース混合機に供
給した。蓚酸エステル及び過酸物試薬の流速をそれぞれ
１．０ｍ／／分及び２．０ｒｎｔ／分に維持した。第２
インターフエース混合機は約２５μＬのデッドボリウム
を有していた。次に、化学ルミネッセンス試薬をＩ（Ｐ
ＬＯからの流出液と混合し、そして下記の様にして検出
器に送った。
ス鋼チューブを有する第２インターフエース混合機に供
給した。蓚酸エステル及び過酸物試薬の流速をそれぞれ
１．０ｍ／／分及び２．０ｒｎｔ／分に維持した。第２
インターフエース混合機は約２５μＬのデッドボリウム
を有していた。次に、化学ルミネッセンス試薬をＩ（Ｐ
ＬＯからの流出液と混合し、そして下記の様にして検出
器に送った。
蓚酸エステルをＨ２Ｏ２と混合した後、得られる溶液を
第一アミノ基から生成したＣＢＩ又はＣＮＩアダクトと
混合する。
第一アミノ基から生成したＣＢＩ又はＣＮＩアダクトと
混合する。
一般に、上記の様にして調製されたｂ酸エステル／過酵
化物混合物を、ＣＢＩ又はＣＮＩを含有する分画された
ＨＰＬＣ流出液と直接混合する。添加された蓚酸エステ
ル／過酸化物の量は、０．１ ｍＰＪ朱満の濃度で存在
するＣＢＩ又はＣＮＩアダクトのそれに比べて約１０倍
以上であるべきである。
化物混合物を、ＣＢＩ又はＣＮＩを含有する分画された
ＨＰＬＣ流出液と直接混合する。添加された蓚酸エステ
ル／過酸化物の量は、０．１ ｍＰＪ朱満の濃度で存在
するＣＢＩ又はＣＮＩアダクトのそれに比べて約１０倍
以上であるべきである。
新しく導入された１−シアノ−２−置換ベンズ〔ｆ〕イ
ソインドール誘導体の化学ルミネッセンス性を静的流検
出系及び特（で設計されたＨＰＬＣ／化学ルミネッセン
ス流検出系の百方において試験した。
ソインドール誘導体の化学ルミネッセンス性を静的流検
出系及び特（で設計されたＨＰＬＣ／化学ルミネッセン
ス流検出系の百方において試験した。
静的系を使用して、種々のざ酸エステル並び：てＣＢＩ
及びＣＮＩ誘導体にっｂで、時間の関数として化学ルミ
ネッセンス収量を決定した。
及びＣＮＩ誘導体にっｂで、時間の関数として化学ルミ
ネッセンス収量を決定した。
静的検出系は改変されたアミコンーデウマン分光螢光計
ＳＰＦ ４−８９４０ ＳＰであった。第２図に示す
ようよ、この系はキセノンランプ、励起モノクロメータ
−及び発光モノクロメータ−１光電子増信管、４個のス
リッ）Ｓ、−３４（０，５〜４、０ ｍｓ ）及び１．
ＯＸ １． Ｏｃｍの寸法を有し３．０ゴの容量を有
する化学ルミネッセンス反応セルを含む。
ＳＰＦ ４−８９４０ ＳＰであった。第２図に示す
ようよ、この系はキセノンランプ、励起モノクロメータ
−及び発光モノクロメータ−１光電子増信管、４個のス
リッ）Ｓ、−３４（０，５〜４、０ ｍｓ ）及び１．
ＯＸ １． Ｏｃｍの寸法を有し３．０ゴの容量を有
する化学ルミネッセンス反応セルを含む。
上記の系のセル室は、セルの内容物を定礎攪拌できる様
に改良されている。各蓚酸エステル／酢酸エチル溶液を
まず酢酸エチル中に溶解したフルオレッサーと混合した
。発光モノクロメータ−を所与の分析対照の最大発光設
定した。次：て、Ｈ２Ｏ２／ＴＨＦの溶液をセルに加え
、光電子増倍管のシャッターを開き、そして化学ルミネ
ッセンス強度のプロットを時間の関数としてストリップ
チャートレコーダーを用いて記録した。軌跡の下の積分
された面積を、所与の系において発生した全化学ルミネ
ッセンス収率の相対測定値として採用した。
に改良されている。各蓚酸エステル／酢酸エチル溶液を
まず酢酸エチル中に溶解したフルオレッサーと混合した
。発光モノクロメータ−を所与の分析対照の最大発光設
定した。次：て、Ｈ２Ｏ２／ＴＨＦの溶液をセルに加え
、光電子増倍管のシャッターを開き、そして化学ルミネ
ッセンス強度のプロットを時間の関数としてストリップ
チャートレコーダーを用いて記録した。軌跡の下の積分
された面積を、所与の系において発生した全化学ルミネ
ッセンス収率の相対測定値として採用した。
蓚酸エステル、過酸化水素及びフルオレッサー濃度を各
試行について一定に維持し、所与のエネルギー受容体を
用いる一連の蓚酸エステルからの相対化学ルミネッセン
ス収量の直接比較を可能にした。
試行について一定に維持し、所与のエネルギー受容体を
用いる一連の蓚酸エステルからの相対化学ルミネッセン
ス収量の直接比較を可能にした。
第２図に示す静的系の装置は、化学ルミネッセンス反応
の前後の螢光発光スペクトルの測定を可能にし、従って
化学ルミネッセンス反応条件下で■種々のエネルギー受
容体の研究及び比較を可能にする。これらの研究におい
て、励起ラングを作動させ、モしてＸ−Ｙレコーダー（
螢光強度対発光波長）により螢光スペクトルを記録した
。
の前後の螢光発光スペクトルの測定を可能にし、従って
化学ルミネッセンス反応条件下で■種々のエネルギー受
容体の研究及び比較を可能にする。これらの研究におい
て、励起ラングを作動させ、モしてＸ−Ｙレコーダー（
螢光強度対発光波長）により螢光スペクトルを記録した
。
特に設計された）（ＰＬＣ／化学ルミネッセンス流れ検
出系を第３図に示す。この系は、５μｔ７０−セルヲ有
ｆ ：Ｅ＝クラトス／ショエフェルＦＳ９７０螢光検出
器を含む。４１８ ｎｍの放射波長を有するカットオフ
発光フィルターを使用Ｕた。検出器は５μｔフローセル
を有する。光電子増倍管の電圧及びフルスケール出力は
腫々の実験モードに調整することができる。
出系を第３図に示す。この系は、５μｔ７０−セルヲ有
ｆ ：Ｅ＝クラトス／ショエフェルＦＳ９７０螢光検出
器を含む。４１８ ｎｍの放射波長を有するカットオフ
発光フィルターを使用Ｕた。検出器は５μｔフローセル
を有する。光電子増倍管の電圧及びフルスケール出力は
腫々の実験モードに調整することができる。
第３図にさらに示す様に、音光検出器ＤＥＴはレオゲイ
ンインジェクターＲ，タイプ７１２５に連結され、今度
はこれが混合器Ｍ２に連結され、ここでＨＰＬＣカラム
からの流出液と蓚酸エステル／過酸化物反応生成物が混
合される。この系は、混合器已１．及び検出器ＤＥＴの
間に置かれた上記のレオダイ７７１２５パルプによる試
薬の停止−流れ測定のため及び試薬の流れを転するため
に適合されている。こうして、サンプルを検出器セル中
に保持することができ、化学ルミネッセンスシグナルの
減少を時間の関数としてモニターすることができる。
ンインジェクターＲ，タイプ７１２５に連結され、今度
はこれが混合器Ｍ２に連結され、ここでＨＰＬＣカラム
からの流出液と蓚酸エステル／過酸化物反応生成物が混
合される。この系は、混合器已１．及び検出器ＤＥＴの
間に置かれた上記のレオダイ７７１２５パルプによる試
薬の停止−流れ測定のため及び試薬の流れを転するため
に適合されている。こうして、サンプルを検出器セル中
に保持することができ、化学ルミネッセンスシグナルの
減少を時間の関数としてモニターすることができる。
ＣＢＩ及びＣＮＩアダクトを用いるこの発明の化学ルミ
ネッセンス法はまた、痕跡量のシアン化物及び過酸化水
素の測定のためにも有用でちる。痕跡量の過酸化水素を
測定するため、啓酸エステル及び既知量のあらかじめ調
製されたＣＢＩ又はＣＮＩアダクトを、過歳化物を含有
するサンプルに添加する。混合物の化学ルミネッセンス
が過酸化物の存在を必要とするため、及び前記の系にお
けるすべての変量が既知であるため、生ずる化学ルミネ
ッ七ンスの強度を用いて系に存在するＨ２Ｏ２の量を確
定することができる。
ネッセンス法はまた、痕跡量のシアン化物及び過酸化水
素の測定のためにも有用でちる。痕跡量の過酸化水素を
測定するため、啓酸エステル及び既知量のあらかじめ調
製されたＣＢＩ又はＣＮＩアダクトを、過歳化物を含有
するサンプルに添加する。混合物の化学ルミネッセンス
が過酸化物の存在を必要とするため、及び前記の系にお
けるすべての変量が既知であるため、生ずる化学ルミネ
ッ七ンスの強度を用いて系に存在するＨ２Ｏ２の量を確
定することができる。
同様にして、痕跡量のシアン化物を測定することができ
、この場合には調節された牙のＡＤＡ又はＮＤＡ及び第
一アミノ化合物を用いて、シアンイオンの量に依存する
一定量のＣＢＩ又はＣＮＩを生成せしめる。次Ｋ、生ず
るアダクトを蓚酸エステル及び過酸化物と混合して、や
け少存在するシアンイオンの量に依存する程度の化学ル
ミネッセンスを示す分析対象を生成せしめることができ
る。
、この場合には調節された牙のＡＤＡ又はＮＤＡ及び第
一アミノ化合物を用いて、シアンイオンの量に依存する
一定量のＣＢＩ又はＣＮＩを生成せしめる。次Ｋ、生ず
るアダクトを蓚酸エステル及び過酸化物と混合して、や
け少存在するシアンイオンの量に依存する程度の化学ル
ミネッセンスを示す分析対象を生成せしめることができ
る。
次に、例によりこの発明をさらに具体的に説明するが、
これＫよシこの発明の範囲を限定するものではない。
これＫよシこの発明の範囲を限定するものではない。
比較例Ｉ Ｓ々の蓚酸エステル活性化剤を用いるＣＢＩ
ｐ導体及びダンシルアミノ酸誘導体の化学ルミネッセン
ス収率 蓚酸エステルＴＣＰＯ及び２．６−ＤＦＰＯから生成ス
る高エネルギ一種を用いて、ダンシル化アスパラギン（
ＤａｎＢ−ＡＳＮ ）の化学ルミネッセンス収率をＣＢ
Ｉ −ｔ−ＢｕＡのこれと比較した。
ｐ導体及びダンシルアミノ酸誘導体の化学ルミネッセン
ス収率 蓚酸エステルＴＣＰＯ及び２．６−ＤＦＰＯから生成ス
る高エネルギ一種を用いて、ダンシル化アスパラギン（
ＤａｎＢ−ＡＳＮ ）の化学ルミネッセンス収率をＣＢ
Ｉ −ｔ−ＢｕＡのこれと比較した。
他のダンシル化アミノ酸の中からＤａｎｓ −ＡＳＮを
選択したのは、これが有機溶剤中の良好な溶解性を示す
ため、及びこれがＩ（ＰＬＣ／化学ルミネ。
選択したのは、これが有機溶剤中の良好な溶解性を示す
ため、及びこれがＩ（ＰＬＣ／化学ルミネ。
センス検出系において他のダンシル化アミノ酸と同じか
又はそれより強い強度シグナルを与えるためである。従
って、Ｄａｎｓ −ＡＳＮと比べてＣＢＩ誘導体につい
て得られる化学ルミネッセンス収率の改良は他のすべて
のダンシル化アミノ酸よシ良好ではないＫしても少なく
とも同程度には良好なはずである。簡単に検討されたＤ
ａｎｓ −ＧＬ’ｌの場合も同様であろう。
又はそれより強い強度シグナルを与えるためである。従
って、Ｄａｎｓ −ＡＳＮと比べてＣＢＩ誘導体につい
て得られる化学ルミネッセンス収率の改良は他のすべて
のダンシル化アミノ酸よシ良好ではないＫしても少なく
とも同程度には良好なはずである。簡単に検討されたＤ
ａｎｓ −ＧＬ’ｌの場合も同様であろう。
比較を行うため、等モル量のこの発明のＣＢＩアダクト
及び従来技術のダンシル化アダクト、すなわち酢酸エチ
ル中３．８ Ｘ １０−’Ｍの螢光アダクトを測定した
。ダンシル化アミンは購入し、そしてこの発明のＣＢＩ
アダクトは前記の米国比Ｈｓ７０７、６７６に記載され
ている様にしてアミンをＮＤＡ及びＣＮと反応せしめる
ことによりａ製した。
及び従来技術のダンシル化アダクト、すなわち酢酸エチ
ル中３．８ Ｘ １０−’Ｍの螢光アダクトを測定した
。ダンシル化アミンは購入し、そしてこの発明のＣＢＩ
アダクトは前記の米国比Ｈｓ７０７、６７６に記載され
ている様にしてアミンをＮＤＡ及びＣＮと反応せしめる
ことによりａ製した。
酢酸エチル及びＴＨＦの８０／２０（容量）混合物から
成る溶剤中でｌＸｌ０ Ｍ蓚酸エステル（ＴＣＰＯ又
は２．６−ＤＦＰＯ）を０．１ Ｍ Ｉ（２０２と混合
することにより高エネルギ一種を形成せしめた。静的系
においてアミコンーデウマン分光螢光検出器を用いてＤ
ａｎｓ −ＡＳＮ及びＣＢＩ−ｔ−ＢｕＡについてそれ
ぞれ５０５ ｎｍ及び４８０ ｎｍを用いて化学ルミネ
ッセンス収率を測定した。実際の測定の前に酢酸エチル
中で蓚酸エステルを貯蔵した時間はＴＣＰＯについては
１日、２．６−ＤＦＰＯについては６日であった。この
結果は、全化学ルミネッセンス収量が酢酸エチル平の蓚
酸エステルの安定性の差異によるものでないことを示し
た。酢酸エチル中エネルギー受容体（Ｄａｎｓ−ＡＳＮ
及びＣＢＩ−ｔ−ＢｕＡ）の新しく調製された３、８Ｘ
１０−’Ｍストット溶液を使用した。
成る溶剤中でｌＸｌ０ Ｍ蓚酸エステル（ＴＣＰＯ又
は２．６−ＤＦＰＯ）を０．１ Ｍ Ｉ（２０２と混合
することにより高エネルギ一種を形成せしめた。静的系
においてアミコンーデウマン分光螢光検出器を用いてＤ
ａｎｓ −ＡＳＮ及びＣＢＩ−ｔ−ＢｕＡについてそれ
ぞれ５０５ ｎｍ及び４８０ ｎｍを用いて化学ルミネ
ッセンス収率を測定した。実際の測定の前に酢酸エチル
中で蓚酸エステルを貯蔵した時間はＴＣＰＯについては
１日、２．６−ＤＦＰＯについては６日であった。この
結果は、全化学ルミネッセンス収量が酢酸エチル平の蓚
酸エステルの安定性の差異によるものでないことを示し
た。酢酸エチル中エネルギー受容体（Ｄａｎｓ−ＡＳＮ
及びＣＢＩ−ｔ−ＢｕＡ）の新しく調製された３、８Ｘ
１０−’Ｍストット溶液を使用した。
比較実験の結果を第１表に示す。
第１表
ＴＣＰＯ９０ρ００ （４：９６） １０６，０００
（３０ニア０）ａ：時間に対する強度のプロットの下の
面積として測定された仮シの単位で表した全化学ルミネ
ッセンス収率。
（３０ニア０）ａ：時間に対する強度のプロットの下の
面積として測定された仮シの単位で表した全化学ルミネ
ッセンス収率。
ｂ：最初の化学ルミネッセンスの発生の後、最初の３分
間及び３分間から後の化学ルミネッセンス収率の比率。
間及び３分間から後の化学ルミネッセンス収率の比率。
第１表中のデーターの分析が明らかに示すところによれ
ば、ＣＢＩ−ｔ−ＢｕＡはＤｅｎｓ −ＡＳＮに比べて
有意に高い化学ルミネッセンス収率をもたらし、化学ル
ミネッセンス活性化剤として２ 、６−ＤＦＰＯを使用
する場合特にそうである。他方、Ｄａｎｓ−ＡＳＨの全
化学ルミネッセンス効率（曲線下の積分された面積→は
２．６−ＤＦＰＯの場合よ）もＴＣＰＯの場合に大であ
った。この場合、’ｒｃＰｏに比べて２．６−ＤＦＰＯ
について、最初の３分間に３倍以上の光が放射された。
ば、ＣＢＩ−ｔ−ＢｕＡはＤｅｎｓ −ＡＳＮに比べて
有意に高い化学ルミネッセンス収率をもたらし、化学ル
ミネッセンス活性化剤として２ 、６−ＤＦＰＯを使用
する場合特にそうである。他方、Ｄａｎｓ−ＡＳＨの全
化学ルミネッセンス効率（曲線下の積分された面積→は
２．６−ＤＦＰＯの場合よ）もＴＣＰＯの場合に大であ
った。この場合、’ｒｃＰｏに比べて２．６−ＤＦＰＯ
について、最初の３分間に３倍以上の光が放射された。
化学ルミネッセンスの時間依存性はすべての場合に極め
て複雑であり、反応の時間内に複数の極大を示す。
て複雑であり、反応の時間内に複数の極大を示す。
化学ルミネッセンス反応の３分間まで及び３分間から後
の全化学ルミネッセンス中の部分を計算し、そしてやは
シ第１表に示す。２ 、６−ＤＦｐＱ／ ＣＢＩ−ｔ−
ＢｕＡＫついて、全化学ルミネッセンス収率に対する反
応の初期段階のノ々−セントはＴＣＰＯ／Ｂａｎｇ−Ａ
ＳＮより相対的に高かった。この特徴はＨＰＬＣ−化学
ルミネッセンス検出のために価値があると予想され、Ｅ
ｔＯＡｃ／Ｔ）ＩＦによ・ける速度挙動は水／アセトニ
トリル含有溶剤の場合と同じである。第１表のデーター
は、２，６−ＤＦＰＯ／ＣＢＩ−ｔ−ＢｕＡ系の化学ル
ミネッセンス収率がＤａｎｅ−ＡＳＮ／ＴＣＰＯのそれ
より２倍以上大であることを示している。同様に、２．
６−ＤＦＰＯ／ＣＢＩ−ｔ−ＢｕＡの化学ルミネッセン
ス収率は２．６−ＤＦＰＯ／Ｄａｎｍ−ＡＳＮＫ比べて
８倍以上犬でありた。これらすべての観察は、流れ系に
おけるＣＢＩＥ導体の化学ルミネッセンス検出のために
はＴＣｒ’Ｏではな（’ ２．６−ＤＦＰＯを使用する
のが好ましいことを明瞭に示している。
の全化学ルミネッセンス中の部分を計算し、そしてやは
シ第１表に示す。２ 、６−ＤＦｐＱ／ ＣＢＩ−ｔ−
ＢｕＡＫついて、全化学ルミネッセンス収率に対する反
応の初期段階のノ々−セントはＴＣＰＯ／Ｂａｎｇ−Ａ
ＳＮより相対的に高かった。この特徴はＨＰＬＣ−化学
ルミネッセンス検出のために価値があると予想され、Ｅ
ｔＯＡｃ／Ｔ）ＩＦによ・ける速度挙動は水／アセトニ
トリル含有溶剤の場合と同じである。第１表のデーター
は、２，６−ＤＦＰＯ／ＣＢＩ−ｔ−ＢｕＡ系の化学ル
ミネッセンス収率がＤａｎｅ−ＡＳＮ／ＴＣＰＯのそれ
より２倍以上大であることを示している。同様に、２．
６−ＤＦＰＯ／ＣＢＩ−ｔ−ＢｕＡの化学ルミネッセン
ス収率は２．６−ＤＦＰＯ／Ｄａｎｍ−ＡＳＮＫ比べて
８倍以上犬でありた。これらすべての観察は、流れ系に
おけるＣＢＩＥ導体の化学ルミネッセンス検出のために
はＴＣｒ’Ｏではな（’ ２．６−ＤＦＰＯを使用する
のが好ましいことを明瞭に示している。
率
ＣＢＩ−ｔ−ＢｕＡを使用する発光の収率を種々の蓚酸
エステルについて比較した。やはシ、２，６−ＤＦＰＯ
はＴＣＰＯ（第１表を参照のこと）と比較してのみ々ら
ず２ 、４−ＤＮＰＯ及び２ 、４− ＤＦＰＯと比較
しても最大の化学ルミネッセンス収率を与えることが見
出された。
エステルについて比較した。やはシ、２，６−ＤＦＰＯ
はＴＣＰＯ（第１表を参照のこと）と比較してのみ々ら
ず２ 、４−ＤＮＰＯ及び２ 、４− ＤＦＰＯと比較
しても最大の化学ルミネッセンス収率を与えることが見
出された。
前記比較何重におけるのと同様にして調製されたＣＢＪ
−ｔ−ＢｕＡの溶液を使用したが、但しＣＢＩ−ｔ−Ｂ
ｕＢを使用前６週間室温にて貯蔵した。酢酸エチル中新
しく！！製した存酸エステル溶液を使用した。下記の化
学ルミネッセンス収新は第１表に示したのと同様に仮シ
のユニットであるが５０５ｎｍの発光（４８Ｑ ｎｍに
おけるよりも２０チ弱い）において測定したものである
。
−ｔ−ＢｕＡの溶液を使用したが、但しＣＢＩ−ｔ−Ｂ
ｕＢを使用前６週間室温にて貯蔵した。酢酸エチル中新
しく！！製した存酸エステル溶液を使用した。下記の化
学ルミネッセンス収新は第１表に示したのと同様に仮シ
のユニットであるが５０５ｎｍの発光（４８Ｑ ｎｍに
おけるよりも２０チ弱い）において測定したものである
。
第２表
挽々の蓚酸エステルによるＣＢＩ−ｔ−ＥｕＡの化学ル
ミネッセンス収ｔ ２ 、４−ＤＦＰＯ５，７００ ２、６−ＤＦＰＯ１６，ＯＯ０ ＴＣＰＯ５，３００ ２、４−ＤＮＰＯ１２，７００ 使用したＤａｎｅ−ＡＳＮ溶液は９８チの水及び２チの
ＴＨＦかも成る溶剤中３．８ Ｘ １０ ＭＤａｎｍ
−ＡＳＮを含有するストック溶液であった。室温での
貯蔵時間がそれぞれ４，１２及び３６時間であるＤａｎ
ｓ−ＡＳＮの３種類のサンプルを２，６−ＤＦＰＯ蓚酸
エステルを用いて分析した。
ミネッセンス収ｔ ２ 、４−ＤＦＰＯ５，７００ ２、６−ＤＦＰＯ１６，ＯＯ０ ＴＣＰＯ５，３００ ２、４−ＤＮＰＯ１２，７００ 使用したＤａｎｅ−ＡＳＮ溶液は９８チの水及び２チの
ＴＨＦかも成る溶剤中３．８ Ｘ １０ ＭＤａｎｍ
−ＡＳＮを含有するストック溶液であった。室温での
貯蔵時間がそれぞれ４，１２及び３６時間であるＤａｎ
ｓ−ＡＳＮの３種類のサンプルを２，６−ＤＦＰＯ蓚酸
エステルを用いて分析した。
使用しだＣＢＩ−ＡＬＡ は９８％の水及び２％のＴ
ＨＦの混合物から成る溶剤中３．８ Ｘ １０ Ｍの
ストック溶液であった。この溶液は、適切な重量のＣＢ
Ｉ−ＡＬＡをＴＨＦ／Ｈ２０溶液中に溶解することによ
り調製した。
ＨＦの混合物から成る溶剤中３．８ Ｘ １０ Ｍの
ストック溶液であった。この溶液は、適切な重量のＣＢ
Ｉ−ＡＬＡをＴＨＦ／Ｈ２０溶液中に溶解することによ
り調製した。
化学ルミネッセンスをＤａｎｓ−ＡＳＨについては５０
５ ｎｍにおいて、そしてＣＢＩ−ＡＬＡについては４
８０ ｎｍにおいて前に記載した静的系を用いて測定し
た。
５ ｎｍにおいて、そしてＣＢＩ−ＡＬＡについては４
８０ ｎｍにおいて前に記載した静的系を用いて測定し
た。
上記の比較の結果を第３表に示す。
以下金白
第３表
５０チの水、４２チのＴＨＦ及び８％のＥｔＯＡｃ中Ｃ
ＢＩ−ＡＬＡ及びＤａｎｓ−ＡＳＮを用いて生ずる全化
学ルミネッセンス収率の比較、水／ ＴＨＦ溶液中誘導
体にされたアミノ酸の安定性２．６−Ｉ）ＦＰＯ４００
（４） １４ユ００（４） １：３３１
２、Ｚｏｏ（５） ４００ （Ｉ２） ５，５００（Ｉ２）２ 、４−
ＤＦＰＯ測定せず ３，９００（６）カッコ内の数
値はサンプルを室温にて貯蔵した時間（時）を示す。
ＢＩ−ＡＬＡ及びＤａｎｓ−ＡＳＮを用いて生ずる全化
学ルミネッセンス収率の比較、水／ ＴＨＦ溶液中誘導
体にされたアミノ酸の安定性２．６−Ｉ）ＦＰＯ４００
（４） １４ユ００（４） １：３３１
２、Ｚｏｏ（５） ４００ （Ｉ２） ５，５００（Ｉ２）２ 、４−
ＤＦＰＯ測定せず ３，９００（６）カッコ内の数
値はサンプルを室温にて貯蔵した時間（時）を示す。
ＣＢＩ誘導体及びＢａｎ５−ＡＳＮについての全化学ル
ミネッセンス収率は水を含有する溶剤中ＣＢＩ−ＡＬＡ
（第３表）よりも−１劇的でさえある。この結果が示す
ごとく、ＣＩＢＡ−ＡＬＡの化学ルミネッセンスはＤＩ
Ｌ！ＩＩ−ＡＳＮのそれに比べて約３３倍大である。有
機溶剤系における同様の比較は、ＣＢＩ−ｔ−Ｂｕｔの
化学ルミネッセンスのわずか８倍の増強をもたらした（
第１表）。この結果は、−層良好な検出感度がＨＰＬＣ
−化学ルミネッセンス系において、溶出する混合物がか
なシの量の水を含む場合（これはＨＰＬＣ分画において
しばしば生ずる）Ｋダンシル化類似体ではな（ＣＢＩｐ
導体化アミンを用いることＫよシ達成されるであろうこ
とを確認するものである。
ミネッセンス収率は水を含有する溶剤中ＣＢＩ−ＡＬＡ
（第３表）よりも−１劇的でさえある。この結果が示す
ごとく、ＣＩＢＡ−ＡＬＡの化学ルミネッセンスはＤＩ
Ｌ！ＩＩ−ＡＳＮのそれに比べて約３３倍大である。有
機溶剤系における同様の比較は、ＣＢＩ−ｔ−Ｂｕｔの
化学ルミネッセンスのわずか８倍の増強をもたらした（
第１表）。この結果は、−層良好な検出感度がＨＰＬＣ
−化学ルミネッセンス系において、溶出する混合物がか
なシの量の水を含む場合（これはＨＰＬＣ分画において
しばしば生ずる）Ｋダンシル化類似体ではな（ＣＢＩｐ
導体化アミンを用いることＫよシ達成されるであろうこ
とを確認するものである。
水を含有する溶液中での化学ルミネッセンス発光の動態
は有機溶剤中のそれとは実質的に異る。
は有機溶剤中のそれとは実質的に異る。
有機溶剤においては２個以上の極大が見られるのに対し
て、１個のみの極大が観察される。５０〜７０％の強度
の減少が、化学ルミネッセンス試薬を混合して４秒及び
１４秒後に見られた。全体化学ルミネッセンス収率もま
た。水含有媒体において非常に低下した。しかしながら
、強度の低下は、ＣＢＩ訪導体の場合（Ｉ：１３）に比
べてＤｕｎｓ −ＡＳＨの場合（Ｉ：５２）において−
層深刻であった。
て、１個のみの極大が観察される。５０〜７０％の強度
の減少が、化学ルミネッセンス試薬を混合して４秒及び
１４秒後に見られた。全体化学ルミネッセンス収率もま
た。水含有媒体において非常に低下した。しかしながら
、強度の低下は、ＣＢＩ訪導体の場合（Ｉ：１３）に比
べてＤｕｎｓ −ＡＳＨの場合（Ｉ：５２）において−
層深刻であった。
室温にて水含有媒体中に貯蔵されそして室の光に４時間
暴露したＣＢＩ及びダンシル誘導体の安定性の予備的研
究は、ＣＢＩ−ＡＬＡについて約１３％の化学ルミネッ
センス収率の低下を示した（第４表、後記）。Ｄａｎｓ
−ＡＳＮの化学ルミネッセンス収率は３６時間まで変化
しなかった。しかしながら、ＣＢ Ｉ−ＡＬＡの安定性
（第４表）はＣＮＩ−ＡＬＡよシ非常に大であ〕、サン
プルが水から保護されそして冷蔵庫に貯鷺された場合に
特にそうであった。
暴露したＣＢＩ及びダンシル誘導体の安定性の予備的研
究は、ＣＢＩ−ＡＬＡについて約１３％の化学ルミネッ
センス収率の低下を示した（第４表、後記）。Ｄａｎｓ
−ＡＳＮの化学ルミネッセンス収率は３６時間まで変化
しなかった。しかしながら、ＣＢ Ｉ−ＡＬＡの安定性
（第４表）はＣＮＩ−ＡＬＡよシ非常に大であ〕、サン
プルが水から保護されそして冷蔵庫に貯鷺された場合に
特にそうであった。
化学ルミネッセンス収率
ＣＢＩ−ＡＬＡの化学ルミネッセンス放射の収率を蓚酸
エステル２ 、６−ＤＦＰＯ及びＴＣＰＯを用いて類似
のＣＮＩ−ＡＬＡと比較した。
エステル２ 、６−ＤＦＰＯ及びＴＣＰＯを用いて類似
のＣＮＩ−ＡＬＡと比較した。
２．６−ＤＦＰＯ及びＴＣＰＯは酢酸エチル溶剤中０、
１ Ｍスト、ト溶液であシ、そしてそれぞれ８日間及び
１４日間貯蔵した。
１ Ｍスト、ト溶液であシ、そしてそれぞれ８日間及び
１４日間貯蔵した。
ＣＢＩ−ＡＬＡの化学ルミネッセンスを４８０ ｎｍに
おいて、前記のごとくアミコン−ボウマン分光螢光検出
器にようモニターした。ＣＮＩ−ＡＬＡの化学ルミネッ
センスを、ＣＮＩ−ＡＬＡアダクトの螢光の極大波長に
相当する５ ８０ ｎｍにおいてモニターした。検出器
の光電子増倍管感度は、４８０ ｎｍにおける感度と比
較して５８０ ｎｍにおいて約５０チであった。ＣＮＩ
−ＡＬＡの螢光ピークの半幅はＣＢ Ｉ−ＡＬＡのそれ
よシ非常に犬であった。
おいて、前記のごとくアミコン−ボウマン分光螢光検出
器にようモニターした。ＣＮＩ−ＡＬＡの化学ルミネッ
センスを、ＣＮＩ−ＡＬＡアダクトの螢光の極大波長に
相当する５ ８０ ｎｍにおいてモニターした。検出器
の光電子増倍管感度は、４８０ ｎｍにおける感度と比
較して５８０ ｎｍにおいて約５０チであった。ＣＮＩ
−ＡＬＡの螢光ピークの半幅はＣＢ Ｉ−ＡＬＡのそれ
よシ非常に犬であった。
上記の比較試験の結果を次の第４表に示す。
第４表
ＤＦＰＯ及びＴＣＰＯ蓚酸エステルと共にＣＢ Ｉ−Ａ
ＬＡ及びＣＮＩ−ＡＬＡを使用する場合の化学ルミネッ
センス収率の比較２．６−ＤＦＰＯ１９８ρ００ ２
４，７００ＴＣＰＯ７７，０００１２，４００ ＴＣＰＯ及び２．６−ＤＦＰＯの両者について、ＣＮｒ
誘導体はＣＢＩ訪導体に比べて有意に低い全体化学ルミ
ネッセンス収率を与えた。しかしながら、これらの化学
ルミネッセンス放射を異る２つの波長（ＣＩＩＩ及びＣ
ＮＩのためそれぞれ４８０ ｎｍ及び５８０ｎｍ）にお
いてモニターした。従って、これらは光電子増倍管感度
の相違にゆだねられる。
ＬＡ及びＣＮＩ−ＡＬＡを使用する場合の化学ルミネッ
センス収率の比較２．６−ＤＦＰＯ１９８ρ００ ２
４，７００ＴＣＰＯ７７，０００１２，４００ ＴＣＰＯ及び２．６−ＤＦＰＯの両者について、ＣＮｒ
誘導体はＣＢＩ訪導体に比べて有意に低い全体化学ルミ
ネッセンス収率を与えた。しかしながら、これらの化学
ルミネッセンス放射を異る２つの波長（ＣＩＩＩ及びＣ
ＮＩのためそれぞれ４８０ ｎｍ及び５８０ｎｍ）にお
いてモニターした。従って、これらは光電子増倍管感度
の相違にゆだねられる。
この相違を考慮して、第４表中のＣＮＩ誘導体の化学ル
ミネッセンス収率は２倍にされるべきである。
ミネッセンス収率は２倍にされるべきである。
さらに、ＣＮｌ１導体の螢光放射ピークの半幅はＣＢＩ
誘導体のそれに比べて非常に大であり、このことがこれ
らの動態測定が行われる放射の極大波長における化学ル
ミネッセンスの低い強度を導く。
誘導体のそれに比べて非常に大であり、このことがこれ
らの動態測定が行われる放射の極大波長における化学ル
ミネッセンスの低い強度を導く。
しかしながら、これらの非常に不都合な条件を考慮に入
れた後でさえ、有機溶剤中のＣＮＩ−ＡＬＡ誘導体の全
化学ルミネッセンス収率は対応するＣＢＩＢ導体の場合
よシも低いようである。ＣＮＩ−ＡＬＡについて化学ル
きネッセンス強度対時間のプロットは、有機溶剤中での
ＣＢＩ誘導体の挙動に類似して３つの極大を示した。
れた後でさえ、有機溶剤中のＣＮＩ−ＡＬＡ誘導体の全
化学ルミネッセンス収率は対応するＣＢＩＢ導体の場合
よシも低いようである。ＣＮＩ−ＡＬＡについて化学ル
きネッセンス強度対時間のプロットは、有機溶剤中での
ＣＢＩ誘導体の挙動に類似して３つの極大を示した。
ｃＢｒｎ導体の場合のように、後記第５表の結果が明瞭
に示すところＫよれば、ＣＮＩ誘導体の化学ルミネッセ
ンス検出のために化学ルミネッセンス活性化剤としてＴ
ＣＰＯＯ代シに２．６−ＤＦＰＯを使用した場合、ＣＮ
ｌ−１導体の化学ルミネッセンス収率はほとんど２倍高
かりた。
に示すところＫよれば、ＣＮＩ誘導体の化学ルミネッセ
ンス検出のために化学ルミネッセンス活性化剤としてＴ
ＣＰＯＯ代シに２．６−ＤＦＰＯを使用した場合、ＣＮ
ｌ−１導体の化学ルミネッセンス収率はほとんど２倍高
かりた。
化学ルミネッセンス活性化剤として２，６−ＤＦＰＯを
用いる同じ反応条件下でのＣＢＩ−ｔ−ＢｕＡ（第１表
）とＣＢＩ−ＡＬＡ（第４表）の全化学ルミネッセンス
収率の比較により示されるところによれば、誘導体化ア
ミンＣＢＩ−ｔ−ＢｕＡに比べて誘導体化アミノ酸ＣＢ
Ｉ−ＡＬＡＫついて収率は感知できるほど変化しない。
用いる同じ反応条件下でのＣＢＩ−ｔ−ＢｕＡ（第１表
）とＣＢＩ−ＡＬＡ（第４表）の全化学ルミネッセンス
収率の比較により示されるところによれば、誘導体化ア
ミンＣＢＩ−ｔ−ＢｕＡに比べて誘導体化アミノ酸ＣＢ
Ｉ−ＡＬＡＫついて収率は感知できるほど変化しない。
従って、異る蓚酸エステル系におけるＣＢＩ−ｔ−Ｂｕ
Ａについての相対化学ルミネッセンス収率についての結
論は他のＣＢＩ−アミノ酸誘導体について同様に適合す
る。
Ａについての相対化学ルミネッセンス収率についての結
論は他のＣＢＩ−アミノ酸誘導体について同様に適合す
る。
静的系において得られた結果（主として純有機溶剤媒体
中で行われる）をＨＰＬＣ−化学ルミネ。
中で行われる）をＨＰＬＣ−化学ルミネ。
センス流れ検出系と比較するために計画された研究を行
った。第２の目的は、ＣＢＩ誘導体化アミン酸の化学ル
ミネッセンス検出のための最良条件を見出すこと、及び
これらの誘導体の検出限界（ＬＯＤ）をダンシル化アミ
ノ酸のＬＯＤと比較することであった。
った。第２の目的は、ＣＢＩ誘導体化アミン酸の化学ル
ミネッセンス検出のための最良条件を見出すこと、及び
これらの誘導体の検出限界（ＬＯＤ）をダンシル化アミ
ノ酸のＬＯＤと比較することであった。
比較例１に記載したのと同じ検出及びＨＰＬＣ条件を使
用したが、但しＨＰＬＣ移動相において水の代りに水中
０．００２５λ１イミ〆ゾールから成るω！！（≠＝７
．２ 、 ＨＣｌにて調整）を使用した。この様な条件
下で、化学ルミネッセンスシグナルは第４図に示される
シグナルに比べて約３の係数上もって化学ルミネッセン
スシグナルが上昇した。
用したが、但しＨＰＬＣ移動相において水の代りに水中
０．００２５λ１イミ〆ゾールから成るω！！（≠＝７
．２ 、 ＨＣｌにて調整）を使用した。この様な条件
下で、化学ルミネッセンスシグナルは第４図に示される
シグナルに比べて約３の係数上もって化学ルミネッセン
スシグナルが上昇した。
ジペプチドのスト、り溶液を次の様にして調製した。０
．０４４６■のＣＢＩ−ＡＬＡ−ＡＬＡを水中に溶解し
くストックＡ）、２０μｔのストックＡを９８０μｔの
水で稀釈してスト、りＢとした。これは５μを中に２．
５ｐモルのジペプチドを含有した。
．０４４６■のＣＢＩ−ＡＬＡ−ＡＬＡを水中に溶解し
くストックＡ）、２０μｔのストックＡを９８０μｔの
水で稀釈してスト、りＢとした。これは５μを中に２．
５ｐモルのジペプチドを含有した。
上記の試験の結果を第５表に示す。
以下余白
第５表
ＨＰＬＣ−化学ルミネッセンス流れ検出系におけるアラ
ニンのシアノベンズ〔ｆ〕インインドール訪導体（ＣＢ
Ｉ−ＡＬＡ）及びアラニル−アラニンのシアノベンズ〔
ｆ〕イソインドール誘導体（ＣＢＩ−ＡＬＡ−ＡＬＡ）
の化学ルミネッセンスシグナル応答の 比較 ＡＬＡ ３．６ ６９５ １９９ＡＬＡ
−ＡＬＡ ２．５ ５４０ ２１６さらに、
第４図において、流れＨＰＬＣ系におけるＣＢＩ−ＡＬ
Ａの化学ルミネッセンス検出と螢光検出との比較を示す
。さらに詳しくは、次のサンプルを調製しそして分析し
た。１００−の水中７．５ｍ９のＣＢＩ−ＡＬＡのスト
、り溶液を室温にて２ケ月間貯蔵して使用した（ストッ
クＡ）。２０μＬのストックＡを３８０μｔの水で稀釈
して、５μを中に７１ｐモルのＣＢＩ−ＡＬＡｉ含有す
るストックＢを得た。２０μｔのストックＢを３８０μ
ｔの水で稀釈することにより、５μを中に３．６ｐモル
のＣＢＩ−ＡＬＡを含有する溶液を得た。５μｔのサン
プルをＨＰＬＣ系に注入した。螢光検出条件は次の通シ
であった。励起波長に３９０ ｎｍ、励起フィルター（
７−５９）、発光フィルター波長７４１８ｎｍ、レンジ
＝０．１マイクロアンペアー１光量子増倍管電圧＝５１
０Ｖ。
ニンのシアノベンズ〔ｆ〕インインドール訪導体（ＣＢ
Ｉ−ＡＬＡ）及びアラニル−アラニンのシアノベンズ〔
ｆ〕イソインドール誘導体（ＣＢＩ−ＡＬＡ−ＡＬＡ）
の化学ルミネッセンスシグナル応答の 比較 ＡＬＡ ３．６ ６９５ １９９ＡＬＡ
−ＡＬＡ ２．５ ５４０ ２１６さらに、
第４図において、流れＨＰＬＣ系におけるＣＢＩ−ＡＬ
Ａの化学ルミネッセンス検出と螢光検出との比較を示す
。さらに詳しくは、次のサンプルを調製しそして分析し
た。１００−の水中７．５ｍ９のＣＢＩ−ＡＬＡのスト
、り溶液を室温にて２ケ月間貯蔵して使用した（ストッ
クＡ）。２０μＬのストックＡを３８０μｔの水で稀釈
して、５μを中に７１ｐモルのＣＢＩ−ＡＬＡｉ含有す
るストックＢを得た。２０μｔのストックＢを３８０μ
ｔの水で稀釈することにより、５μを中に３．６ｐモル
のＣＢＩ−ＡＬＡを含有する溶液を得た。５μｔのサン
プルをＨＰＬＣ系に注入した。螢光検出条件は次の通シ
であった。励起波長に３９０ ｎｍ、励起フィルター（
７−５９）、発光フィルター波長７４１８ｎｍ、レンジ
＝０．１マイクロアンペアー１光量子増倍管電圧＝５１
０Ｖ。
化学ルミネッセンス検出条件は次の通りであった。シリ
ンジ２ンプＡ ： ＥｔＯＡｅ中０．００５ＭＴＣＰＯ
（２００−のＥｔＯＡｃ中４４８．９７１りのＴｃｐｏ
）、流速１ｍ／分；シリンジポンプＢ ： ＴＨＦ中Ｉ
Ｍ）Ｔ２０２（４５，２ｄ）３０％Ｈ２Ｏ２をＴＨＦに
より４００ゴに稀釈）、流速２Ｔ！Ｌｔ／分；励起ラン
プ：オフ：放射フィルター波長）４１８ ｎｒｎ ；レ
ンジ＝Ｏ１０２マイクロアンペア−；光電子塩″倍管重
圧＝５１０ＨＰＬＣ条件は次の通りであった。移動相、
３０％Ｍ６ ＣＮ ／ ７０ ％ Ｈ２Ｏ、均一（Ｉｓ
ｏｃｒａｔｉｃ ）、流速１ｄ／分；カラム： ２５Ｌ
：ｒｎＸ ４．６ｚｘス−！ル＝ｒシルＬＣ−１８、注
入されるストックＢ及びｃｏｇ：５μＬ０ ８４図に、流れＨＰＬＣ系におけるＣＢ Ｉ −ＡＬＡ
の化学ルミネッセンス検出対仏光検出の比較を示す。
ンジ２ンプＡ ： ＥｔＯＡｅ中０．００５ＭＴＣＰＯ
（２００−のＥｔＯＡｃ中４４８．９７１りのＴｃｐｏ
）、流速１ｍ／分；シリンジポンプＢ ： ＴＨＦ中Ｉ
Ｍ）Ｔ２０２（４５，２ｄ）３０％Ｈ２Ｏ２をＴＨＦに
より４００ゴに稀釈）、流速２Ｔ！Ｌｔ／分；励起ラン
プ：オフ：放射フィルター波長）４１８ ｎｒｎ ；レ
ンジ＝Ｏ１０２マイクロアンペア−；光電子塩″倍管重
圧＝５１０ＨＰＬＣ条件は次の通りであった。移動相、
３０％Ｍ６ ＣＮ ／ ７０ ％ Ｈ２Ｏ、均一（Ｉｓ
ｏｃｒａｔｉｃ ）、流速１ｄ／分；カラム： ２５Ｌ
：ｒｎＸ ４．６ｚｘス−！ル＝ｒシルＬＣ−１８、注
入されるストックＢ及びｃｏｇ：５μＬ０ ８４図に、流れＨＰＬＣ系におけるＣＢ Ｉ −ＡＬＡ
の化学ルミネッセンス検出対仏光検出の比較を示す。
ＡＬＡのＣＢＩ誘導体についての化学ルミネッセンス検
出対螢光検出の感度の比較を、！ず化学ルミネッセンス
活性化剤としてＴＣＰＯを用いて行った（第４図）。化
学ルミネッセンスから得られたシグナルは、同一のシグ
ナル対ノイズ比（Ｓ／Ｎ）３：１で測定した場合、直接
螢光検出からのものより少なくとも８０倍強かった（ピ
ークの高さ。
出対螢光検出の感度の比較を、！ず化学ルミネッセンス
活性化剤としてＴＣＰＯを用いて行った（第４図）。化
学ルミネッセンスから得られたシグナルは、同一のシグ
ナル対ノイズ比（Ｓ／Ｎ）３：１で測定した場合、直接
螢光検出からのものより少なくとも８０倍強かった（ピ
ークの高さ。
螢光検出条件は検出について最適感度を与える様にした
が、化学ルミネッセンス検出のためにはこの様な最適化
は行わなかった。さらに、ここでは最も容易に入手可能
な蓚酸エステルとしてＴＣＰＯを使用した。これらの条
件下でさえ、ＣＢＩ−ＡＬＡについて８フ工ムトモル（
注入量）のＬＯＤを容易に達成することができた（スキ
ーム２及び第６表）。
が、化学ルミネッセンス検出のためにはこの様な最適化
は行わなかった。さらに、ここでは最も容易に入手可能
な蓚酸エステルとしてＴＣＰＯを使用した。これらの条
件下でさえ、ＣＢＩ−ＡＬＡについて８フ工ムトモル（
注入量）のＬＯＤを容易に達成することができた（スキ
ーム２及び第６表）。
アミノ酸及びジペプチドのＣＢ Ｉ 巳１導体てついて
化学ルミネッセンス検出器を用いて得られたシグナル強
度も比較した。第５表のデーターが示す様に、アミノ酸
及びジペプチドの両者について実質的に同じシグナル強
度が得られた。この観察は非常に価値が有ろう。なぜな
ら、アミノ酸エステル及びペプチドは、ｏ−７タルアル
デヒド／チオール試薬系を用いて、比較的低い螢光収量
の誘導体を生じさせるからである。
化学ルミネッセンス検出器を用いて得られたシグナル強
度も比較した。第５表のデーターが示す様に、アミノ酸
及びジペプチドの両者について実質的に同じシグナル強
度が得られた。この観察は非常に価値が有ろう。なぜな
ら、アミノ酸エステル及びペプチドは、ｏ−７タルアル
デヒド／チオール試薬系を用いて、比較的低い螢光収量
の誘導体を生じさせるからである。
よるＣＢＩ誘導体とダンシル誘導体の検出感度の比較
最も重要で興味ある実験はＨＰＬＣ−化学ルミネ、セン
ス検出によるＣＢＩ誘導体とダンシル誘導体の検出感度
の比較であった。
ス検出によるＣＢＩ誘導体とダンシル誘導体の検出感度
の比較であった。
化学ルミネッセンス検出条件は第４図に記載したものと
同じであった。化学ルミネッセンス活性化剤としてＴＣ
ＰＯを使用した。ＨＰＬＣ分析は第４図に記載する様に
して行った。次のサンプルを調製しそして分析した。Ｄ
ａｎｍ −ＡＳＮ、 ０．２９５１ｎ９／４−水（スト
、りＡ）、２０μｔのストックＡを３８０μｔの水で稀
釈しくスト、りＢ）、２０μ乙のスト、りＢを３８０μ
ｔの水で稀釈した（ストックＣ，５μｔが２．５ｐモル
を含有した）。
同じであった。化学ルミネッセンス活性化剤としてＴＣ
ＰＯを使用した。ＨＰＬＣ分析は第４図に記載する様に
して行った。次のサンプルを調製しそして分析した。Ｄ
ａｎｍ −ＡＳＮ、 ０．２９５１ｎ９／４−水（スト
、りＡ）、２０μｔのストックＡを３８０μｔの水で稀
釈しくスト、りＢ）、２０μ乙のスト、りＢを３８０μ
ｔの水で稀釈した（ストックＣ，５μｔが２．５ｐモル
を含有した）。
Ｄａｎｓ −ＧＬＹ 、 ０．１６５ ｍ９７４ ｍｌ
水（ストックＢ）、２０μＬのストック人を３８０μｔ
の水で稀釈しくストックＢ）、２０μｔのストックＢを
３８０μＬの水で稀釈した（ストックＣ，５μＬが１．
６５ｐモルを含有した）。ＣＢＩ−ＡＬＡ、 ０．２１
００１ｎ９／４ｖＬｔ水（ストックＡ′）、２０μＬの
スト、りＡ′を３８０μｔの水で稀釈しくスト、りＢ’
）、２０μｔのスト、りＢ′を３８０μｔの水で稀釈し
くストックＣ′、５μＬが２，３ｐモルを含有した）、
２０μｔのストックＣ′を３８０μｔの水で稀釈した（
ストックＤ′、５μｔが１１５ｆモルを含有した）。ダ
ンシル誘導体及びｃＢｒＨ導体の両者のための化学ルミ
ネッセンス検出条件は次の通シであった。励起ランプ：
オフ、放射波長）４１８ｎｍの放射フィルター、光量子
増倍管電圧＝５１０’／、レンツ＝０，２マイクロアン
４ア、時定数＝６秒。
水（ストックＢ）、２０μＬのストック人を３８０μｔ
の水で稀釈しくストックＢ）、２０μｔのストックＢを
３８０μＬの水で稀釈した（ストックＣ，５μＬが１．
６５ｐモルを含有した）。ＣＢＩ−ＡＬＡ、 ０．２１
００１ｎ９／４ｖＬｔ水（ストックＡ′）、２０μＬの
スト、りＡ′を３８０μｔの水で稀釈しくスト、りＢ’
）、２０μｔのスト、りＢ′を３８０μｔの水で稀釈し
くストックＣ′、５μＬが２，３ｐモルを含有した）、
２０μｔのストックＣ′を３８０μｔの水で稀釈した（
ストックＤ′、５μｔが１１５ｆモルを含有した）。ダ
ンシル誘導体及びｃＢｒＨ導体の両者のための化学ルミ
ネッセンス検出条件は次の通シであった。励起ランプ：
オフ、放射波長）４１８ｎｍの放射フィルター、光量子
増倍管電圧＝５１０’／、レンツ＝０，２マイクロアン
４ア、時定数＝６秒。
螢光検出のためには、混合機Ｍ！（第３図）を取シ外し
、そしてＨＰＬＣカラムからの流出液を１０ｃ！ＲＸ０
．２５１１１のステンレス鋼チューブを有する化学ルミ
ネッセンス検出器に直接供給した。螢光検出条件は次の
通シであった。ダンシル誘導体のため、励起波長＝それ
ぞれ励起フィルター７−５４及び７−５１を用いて３４
０ ｎｍ又は３６０ｎｍ、光量子増倍管電圧＝５０２Ｖ
、レンジ＝０．１マイクロアン４アー、時定数＝６秒、
放射フィルター波長）４１８ ｎｍ：ｃＢＩ誘導体のた
め、励起波長＝３９０ ｎｍ、励起フィルター７−５９
、光量子増倍管電圧＝５１８Ｖ、レンジ＝０１マイクロ
アンペア−１時定数＝６秒、放射フィルター波長＞ ４
１８１１ｍ６ いずれもシグナル：ノイズ（Ｓ／Ｎ）比として算出され
た螢光検出（ＬＯＤｆ）対化学ルミネッセンス検出（Ｌ
ＯＤｃＬ）の検出（ＬＯＤ）限界の比率は３：１であっ
た。
、そしてＨＰＬＣカラムからの流出液を１０ｃ！ＲＸ０
．２５１１１のステンレス鋼チューブを有する化学ルミ
ネッセンス検出器に直接供給した。螢光検出条件は次の
通シであった。ダンシル誘導体のため、励起波長＝それ
ぞれ励起フィルター７−５４及び７−５１を用いて３４
０ ｎｍ又は３６０ｎｍ、光量子増倍管電圧＝５０２Ｖ
、レンジ＝０．１マイクロアン４アー、時定数＝６秒、
放射フィルター波長）４１８ ｎｍ：ｃＢＩ誘導体のた
め、励起波長＝３９０ ｎｍ、励起フィルター７−５９
、光量子増倍管電圧＝５１８Ｖ、レンジ＝０１マイクロ
アンペア−１時定数＝６秒、放射フィルター波長＞ ４
１８１１ｍ６ いずれもシグナル：ノイズ（Ｓ／Ｎ）比として算出され
た螢光検出（ＬＯＤｆ）対化学ルミネッセンス検出（Ｌ
ＯＤｃＬ）の検出（ＬＯＤ）限界の比率は３：１であっ
た。
Ｓ ／Ｎ ＝ ３ ／ １における検出限界（ＬＯＤ
）最大ピーク高さを計算のため）て援用したため、及び
均一条件下でのＣＢＩＢ導体の保持時間がダンシル誘導
体に比べて有意に長いため、観察されるピークが広くな
り、ダンシル誘導体）てついて同じ条件下で測定された
ＬＯＤよりＣＢＩについてのＬＯＤの値が相対的（〔高
くなる。
）最大ピーク高さを計算のため）て援用したため、及び
均一条件下でのＣＢＩＢ導体の保持時間がダンシル誘導
体に比べて有意に長いため、観察されるピークが広くな
り、ダンシル誘導体）てついて同じ条件下で測定された
ＬＯＤよりＣＢＩについてのＬＯＤの値が相対的（〔高
くなる。
上記の試験の結果を次の第６表洗示す。
第６表
アラニンのシアノベンズＣＤイソインドール誘導体（Ｃ
ＨＩ−ＡＬＡ）とたつかのダンシル誘導体化アミノ酸の
との、 ＨＰＬＣ−化学ルミネッセンス検出の感度の比
較、並びに同一の誘導体の螢光検出感度との比較 Ｄａｎａ −ＡＰＡＲ２５２１，０６０１１１８０Ｄａ
ｎｍ −ＧＬＹ １０ ３ ０．４ １００＝１５
０ ７５０〜７０ＣＢＩ −ＡＬＡ １９６ ５
７．８ ８ ４ ５７０上記の結果が明らかに示す
ところ洗よれば、ｃＢＢａ−導体化アラニンの化学ルミ
ネッセンス検出の感度はそれぞれアスパラギン及びグリ
シンのダンシル誘導体のそれよシも約８〜２０倍高い。
ＨＩ−ＡＬＡ）とたつかのダンシル誘導体化アミノ酸の
との、 ＨＰＬＣ−化学ルミネッセンス検出の感度の比
較、並びに同一の誘導体の螢光検出感度との比較 Ｄａｎａ −ＡＰＡＲ２５２１，０６０１１１８０Ｄａ
ｎｍ −ＧＬＹ １０ ３ ０．４ １００＝１５
０ ７５０〜７０ＣＢＩ −ＡＬＡ １９６ ５
７．８ ８ ４ ５７０上記の結果が明らかに示す
ところ洗よれば、ｃＢＢａ−導体化アラニンの化学ルミ
ネッセンス検出の感度はそれぞれアスパラギン及びグリ
シンのダンシル誘導体のそれよシも約８〜２０倍高い。
このような感度の上昇は化学ルミネッセンス活性化剤と
してＴＣＰＯを使用して達成された。アミン、アミノ酸
及びジイプチドの検出感度は、ダンシル誘導体化では７
（ＣＢＩｉ導体化及び化学ルミネッセンス検出を用いる
ことにより少なくとも１オーダー改良され得ると結論す
ることができる。
してＴＣＰＯを使用して達成された。アミン、アミノ酸
及びジイプチドの検出感度は、ダンシル誘導体化では７
（ＣＢＩｉ導体化及び化学ルミネッセンス検出を用いる
ことにより少なくとも１オーダー改良され得ると結論す
ることができる。
ＴＣＰＯ／ダンシル誘導体系がアミノ酸のＨＰＬＣ／化
学ルミネッセンス検出のための現在使用し得る最も鋭敏
汝方法であると考えられる（スパイラル検出セル及び光
電増倍管からの単一光子計数を用いて０．５ｆモルのＬ
ＯＤが報告された）ので、ＣＢＩ誘導体の使用は検出限
界をさらにｌオーダー下げるであろう。
学ルミネッセンス検出のための現在使用し得る最も鋭敏
汝方法であると考えられる（スパイラル検出セル及び光
電増倍管からの単一光子計数を用いて０．５ｆモルのＬ
ＯＤが報告された）ので、ＣＢＩ誘導体の使用は検出限
界をさらにｌオーダー下げるであろう。
第６表のデーターはまた、ダンシルアミノ酸誘導体及び
ＣＤＩアミノ酸誌酸体導体いて、化学ルミネッセンス検
出により達成されるＬＯＤが螢光検出により得られる限
界に対して非常に卓越していることを確認するものであ
る。本発明者等の分析条件下では、ダンシル化アミノ酸
の検出感度は、螢光検出に比べて化学ルミネッセンス検
出の場合に５０〜１８０倍上昇した。ＣＢＩ誘導体につ
いてのこの上昇率は約５７０であシ、化学ルミネッセン
ス法の特別な利点が示された。
ＣＤＩアミノ酸誌酸体導体いて、化学ルミネッセンス検
出により達成されるＬＯＤが螢光検出により得られる限
界に対して非常に卓越していることを確認するものであ
る。本発明者等の分析条件下では、ダンシル化アミノ酸
の検出感度は、螢光検出に比べて化学ルミネッセンス検
出の場合に５０〜１８０倍上昇した。ＣＢＩ誘導体につ
いてのこの上昇率は約５７０であシ、化学ルミネッセン
ス法の特別な利点が示された。
ＨＰＬＣ条件は次の通うであった。１５α×４．６間ス
ペルコシルＬＣ−１８カラム、移ｔｅ相：２５％ＭａＣ
Ｍ／７５％Ｏ，ＯＯ２５Ｍイミダゾール緩衝液（ｐ）（
７，２）、流速１ゴ／分、均一分離、注入容量５μｔ、
蓚酸エステルの濃度は同じ（０，００５Ｍ）であった。
ペルコシルＬＣ−１８カラム、移ｔｅ相：２５％ＭａＣ
Ｍ／７５％Ｏ，ＯＯ２５Ｍイミダゾール緩衝液（ｐ）（
７，２）、流速１ゴ／分、均一分離、注入容量５μｔ、
蓚酸エステルの濃度は同じ（０，００５Ｍ）であった。
２．６−ＤＦＰＱの場合、３１４．２ｍ９の蓚酸エステ
ルを２００ｔＬｌのＥｔＯＡｃに溶解し、シリンジポン
プＡに入れ、そして１ｍｌ／分つ流速で系にポンプ輸送
した。他方、第４図及び第４表て前記したようにして化
学ルミネッセンス検出を行った。
ルを２００ｔＬｌのＥｔＯＡｃに溶解し、シリンジポン
プＡに入れ、そして１ｍｌ／分つ流速で系にポンプ輸送
した。他方、第４図及び第４表て前記したようにして化
学ルミネッセンス検出を行った。
Ｄａｎｅ−ＡＳＮ及びＣＢ Ｉ−ＡＬＡのため、それぞ
れ例３に記載したストック溶液Ｃ及びＤを使用した。
れ例３に記載したストック溶液Ｃ及びＤを使用した。
２５のＸ ４．６ ｍｓスイルコシルＬＣ−１８カラム
を使用した。
を使用した。
この実験においては、２．５−ＤＦＰＯの高い絶対シグ
ナル強度は２５ｃＩｎから１５０へのＨＰＬＣカラムの
長さの減少によるものかもしれない。後者の場合、保持
時間は一層短かく、ピークは一７υシャープでおり、そ
してピークの高さは相対的に高かった。さらに、ベース
ラインの安定性は他の実験の場合はど良くはなかった。
ナル強度は２５ｃＩｎから１５０へのＨＰＬＣカラムの
長さの減少によるものかもしれない。後者の場合、保持
時間は一層短かく、ピークは一７υシャープでおり、そ
してピークの高さは相対的に高かった。さらに、ベース
ラインの安定性は他の実験の場合はど良くはなかった。
報告されたＬＯＤ値はＳ／Ｎ＝３／１においてでちる。
上記の試験の結果を次の第７表に示す。
以下余白
第７表
化学ルミネッセンス活性化剤としてＴＣＰＯ及び２ 、
６−ＤＦＰＯを使用する、ダンジルアスパラギン（Ｄａ
ｎ＋５−ＡＳＮ ）及びアラニンのシアノベンズ［”ｆ
］インインドール誘導体のＨＰＬＣ−化学ルミネッセン
ス検出の比較へｎ８−ぶ２５ｐり ６０ １１２ １．
９ ６０ ６４ＧＩＩ−ＡＬＡ １１５ｆ砂 ２４
５５ ２．３ ８ ３第７表の結果が示すところ
によれば、化学ルミネッセンス試薬として２．６−ＤＦ
ＰＯを使用することによル、ＣＢＩ誘導体を用いて得ら
れる感度よシも２倍以上高い感度が達成され、これが８
ｆモルから３ｆモルへのＬＯＤに反映される。これは、
２．６−ＤＦＰＯを用いるＣＢＩ誘導体−化学ルミネッ
センス検出系がアミノ酸の検出のための今まで報告され
た最も腐感度の方法である。との系を用いて、現在使用
可能な最良の方法、すなわちダンシル誘導体／ＴＣＰＯ
系：て比べて、検出感度を約２０〜４０倍に上昇せしめ
ることができた。
６−ＤＦＰＯを使用する、ダンジルアスパラギン（Ｄａ
ｎ＋５−ＡＳＮ ）及びアラニンのシアノベンズ［”ｆ
］インインドール誘導体のＨＰＬＣ−化学ルミネッセン
ス検出の比較へｎ８−ぶ２５ｐり ６０ １１２ １．
９ ６０ ６４ＧＩＩ−ＡＬＡ １１５ｆ砂 ２４
５５ ２．３ ８ ３第７表の結果が示すところ
によれば、化学ルミネッセンス試薬として２．６−ＤＦ
ＰＯを使用することによル、ＣＢＩ誘導体を用いて得ら
れる感度よシも２倍以上高い感度が達成され、これが８
ｆモルから３ｆモルへのＬＯＤに反映される。これは、
２．６−ＤＦＰＯを用いるＣＢＩ誘導体−化学ルミネッ
センス検出系がアミノ酸の検出のための今まで報告され
た最も腐感度の方法である。との系を用いて、現在使用
可能な最良の方法、すなわちダンシル誘導体／ＴＣＰＯ
系：て比べて、検出感度を約２０〜４０倍に上昇せしめ
ることができた。
ＴＣＰＯに代えて２．６−ＤＦＰＯを使用した場合、Ｄ
ａｎｇ−ＡＳＮについて絶対シグナル増加も観察された
。しかしながら、パックグラウンドノイズ及びＨＰＬＣ
カラム長さの増加のため、Ｓ／Ｎ＝３／１におけるＬＯ
Ｄ値はＴＣＰＯ及び２．６−ＤＦＰＯエステルの両者に
ついて実際的に変化しないままであっ九。
ａｎｇ−ＡＳＮについて絶対シグナル増加も観察された
。しかしながら、パックグラウンドノイズ及びＨＰＬＣ
カラム長さの増加のため、Ｓ／Ｎ＝３／１におけるＬＯ
Ｄ値はＴＣＰＯ及び２．６−ＤＦＰＯエステルの両者に
ついて実際的に変化しないままであっ九。
この報告に記載した検出限界は）ＩＰＬＣ−化学ルミネ
ッセンス検出系を最速化するためのなんらの努力もする
ことなく得られた。第５図に、ＣＢＩ−ＡＬＡの典型的
な化学ルミネッセンスシグナルを示す０ ＣＤＩ−ＡＬＡが冷蔵庫中で２週間貯蔵されたスト、り
溶液中で安定であったことを条件として、このシグナル
は１１１ｆモルの注入された誘導体化分析対象に相当す
る。なお、この分析忙おいて化学ルミネッセンス活性化
剤としてＴＣＰＯエステル（２，６−ＤＦＰＯエステル
ではなく）を使用した。
ッセンス検出系を最速化するためのなんらの努力もする
ことなく得られた。第５図に、ＣＢＩ−ＡＬＡの典型的
な化学ルミネッセンスシグナルを示す０ ＣＤＩ−ＡＬＡが冷蔵庫中で２週間貯蔵されたスト、り
溶液中で安定であったことを条件として、このシグナル
は１１１ｆモルの注入された誘導体化分析対象に相当す
る。なお、この分析忙おいて化学ルミネッセンス活性化
剤としてＴＣＰＯエステル（２，６−ＤＦＰＯエステル
ではなく）を使用した。
第５図に示した試験の条件は次の通シであった。
！（ＰＬＣ条件： １５ｃ１ｎＸ ４．６ｍスベルコシ
ルＩ、Ｃ−１８カラム、移動相：３０チＭ＠ ＣＮ ／
７０％０゜００２５Ｎイミダゾール緩衝液（ｐ）！＝
７．２）。
ルＩ、Ｃ−１８カラム、移動相：３０チＭ＠ ＣＮ ／
７０％０゜００２５Ｎイミダゾール緩衝液（ｐ）！＝
７．２）。
均一溶出、流速１−７分。保持時間は１分４０秒間であ
った。
った。
化学ルミネッセンス検出条件は第４図に記載したのと同
じであるが、光電子増倍管電圧は６００Ｖ１時定数１０
秒、レンジ＝０．０１ミクロアンペアー１化学ルミネッ
センス活性化剤としてＴＣＰＯを使用した。
じであるが、光電子増倍管電圧は６００Ｖ１時定数１０
秒、レンジ＝０．０１ミクロアンペアー１化学ルミネッ
センス活性化剤としてＴＣＰＯを使用した。
新たに調製されたストックＤ’（例３を参照のこと）５
μｔを注入しそして分析した。これは１１５ｆモルの注
入されたＣ Ｂ Ｉ −Ａ ＬＡ ｉＣ相’３する。ス
トックＤはストックＡから調製し、後者は冷蔵庫中に２
週間貯蔵した。
μｔを注入しそして分析した。これは１１５ｆモルの注
入されたＣ Ｂ Ｉ −Ａ ＬＡ ｉＣ相’３する。ス
トックＤはストックＡから調製し、後者は冷蔵庫中に２
週間貯蔵した。
前記の例及び比較例から、選釈されたアミン、アミノ酸
及び小ペプチドのｃＢｘｐ導体が蓚酸エステル−Ｈ２０
２化学ルミネ、センス検出系において卓越したエネルギ
ー受容体（フルオレッサー）であることが明らかである
。
及び小ペプチドのｃＢｘｐ導体が蓚酸エステル−Ｈ２０
２化学ルミネ、センス検出系において卓越したエネルギ
ー受容体（フルオレッサー）であることが明らかである
。
静的系の研究において得られた結果は、アミン及びアミ
ノ酸のＣＢＩ誘導体がアミノ酸のダンシル誘導体よりも
高い全化学ルミネッセンス収率を生じさせることができ
ることを示している。この効果は特に、ＨＰＬＣ技法に
おいて典型的に用いられる水性溶液中で顕著である。事
実、有機溶剤ではなく水性溶剤が使用された場合、この
発明のＣＢＩアダクトの螢光量子収率はほとんど変化し
ないままである。ＣＢＩアダクトとは対照的に、ダンシ
ル化類似体の螢光の量子収率はかなシ低下することすな
わち有機溶剤での０．３〜０．７が水性溶剤中では０．
０５３〜０．０９１に低下することが観察された。これ
は尚業界における有意な進歩を少すものである。なぜな
ら、集光及び光子計数のための現在の電子装置を使用す
るＴ ＣＰ Ｏ／ Ｈ２Ｏ２Ｋよるダンシル化アミノ酸
のＨＰＬＣ／化学ルミネッセンス検出はアミノ酸のため
の最も鋭敏力検出方法と考えられているからである。し
かしながら、ＣＢｒ誘導体及び２．６−ＤＦＰＯの使用
は、従来使用されているダンシル−ＴＣＰＯ系に対して
２０〜４゜の係数を転って、そしであるオーダーで第一
アミン分析対象の検出限界を低下せしめるはずである。
ノ酸のＣＢＩ誘導体がアミノ酸のダンシル誘導体よりも
高い全化学ルミネッセンス収率を生じさせることができ
ることを示している。この効果は特に、ＨＰＬＣ技法に
おいて典型的に用いられる水性溶液中で顕著である。事
実、有機溶剤ではなく水性溶剤が使用された場合、この
発明のＣＢＩアダクトの螢光量子収率はほとんど変化し
ないままである。ＣＢＩアダクトとは対照的に、ダンシ
ル化類似体の螢光の量子収率はかなシ低下することすな
わち有機溶剤での０．３〜０．７が水性溶剤中では０．
０５３〜０．０９１に低下することが観察された。これ
は尚業界における有意な進歩を少すものである。なぜな
ら、集光及び光子計数のための現在の電子装置を使用す
るＴ ＣＰ Ｏ／ Ｈ２Ｏ２Ｋよるダンシル化アミノ酸
のＨＰＬＣ／化学ルミネッセンス検出はアミノ酸のため
の最も鋭敏力検出方法と考えられているからである。し
かしながら、ＣＢｒ誘導体及び２．６−ＤＦＰＯの使用
は、従来使用されているダンシル−ＴＣＰＯ系に対して
２０〜４゜の係数を転って、そしであるオーダーで第一
アミン分析対象の検出限界を低下せしめるはずである。
これは０．１ｆモルレベルより低い検出限界に反映され
る。
る。
ＣＢＩ−ソＲ７″チドについて観察された検出限界がこ
の発明の方法を用いてＣＨＩ−ＡＬＡによυ得られるそ
れに匹敵したから、この発明の方法は小シプチドの鋭敏
な検出に一般的に適用され得ることが明らかである。
の発明の方法を用いてＣＨＩ−ＡＬＡによυ得られるそ
れに匹敵したから、この発明の方法は小シプチドの鋭敏
な検出に一般的に適用され得ることが明らかである。
以上、好ましい態様を具体的に記載したが１本発明の範
囲内で種々の変更を行うことができよう。
囲内で種々の変更を行うことができよう。
第１図はこの発明の全体工程の１つの具体例の流れ図で
ある。 第２図は静的系の化学ルミネッセンス分析器の概略図で
ある。 第３図は高速液体クロマトグラフィー後のカラム流検出
系概略区である。 第４図は冒速液体クロマトグラフィー系：τおけるＣＢ
Ｉ−ＡＬＡの化学ルミネッセンス検出と螢光検出を比較
するグラフである。 第５図はＣＢＩ−ＡＬＡについての高速液体クロマトグ
ラフィー化学ルミネッセンス検出シグナルを示すグラフ
でちる。
ある。 第２図は静的系の化学ルミネッセンス分析器の概略図で
ある。 第３図は高速液体クロマトグラフィー後のカラム流検出
系概略区である。 第４図は冒速液体クロマトグラフィー系：τおけるＣＢ
Ｉ−ＡＬＡの化学ルミネッセンス検出と螢光検出を比較
するグラフである。 第５図はＣＢＩ−ＡＬＡについての高速液体クロマトグ
ラフィー化学ルミネッセンス検出シグナルを示すグラフ
でちる。
Claims (20)
- １．第一アミノ基を含有する化合物の測定方法であっ
て、 （Ｉ）第１アミノ基を含有する化合物を（Ａ）ナフタレ
ン−２，３−ジカルボキシアルデヒド又はアントラセン
−２，３−ジカルボキシアルデヒド、及び（Ｂ）シアン
化物と反応せしめることにより−シアノ−２−置換ベン
ズ〔ｆ〕イソインドールフルオレッサー又は１−シアノ
−２−置換ナフス〔ｆ〕イソインドールフルオレッサー
を形成せしめ； （ＩＩ）蓚酸エステル及び過酸化水素を前記１−シアノ
−２−置換ベンズ〔ｆ〕イソインドール・フルオレッサ
ー又は前記１−シアノ−２−置換ナフス〔ｆ〕イソイン
ドール・フルオレッサーと混合することにより化学ルミ
ネッセンスを示す分析対象を形成せしめ：そして （ＩＩＩ） 前記化学ルミネッセンスを示す分析対象か
らの化学ルミネッセンス発光を検出手段により検出する
： 段階を含んで成る方法。 - ２．前記段階（Ｉ）の前又は後に複数の第一アミノ化
合物を含有する混合物を分画することをさらに含んで成
る特許請求の範囲第１項に記載の方法。 - ３．前記分画段階を前記段階（Ｉ）の後に行う特許請
求の範囲第２項に記載の方法。 - ４．前記分画段階を高速液体クロマトグラフィーによ
り行う特許請求の範囲第２項に記載の方法。 - ５．前記分画段階を高速液体クロマトグラフィーによ
り行う特許請求の範囲第３項に記載の方法。 - ６．第一アミノ基を含有する前記化合物が第１アミン
類、第一アミノ酸類、少なくとも１個の第一アミノ基を
有するペプチド類、又はカテコールアミン類である特許
請求の範囲第１項に記載の方法。 - ７．前記ペプチドがアラニン−アラニンである特許請
求の範囲第６項に記載の方法。 - ８．前記蓚酸エステルが蓚酸ビス−（２，６−ジフル
オロフェニル）、蓚酸ビス（２，４−ジフルオロフェニ
ル）、蓚酸ビス−（２，４，６−トリクロロフェニル）
、蓚酸ビス−（２，４−ジニトロフェニル）、又は蓚酸
ビス−（ペンタフルオロフェニル）である特許請求の範
囲第１項に記載の方法。 - ９．前記蓚酸エステルが蓚酸ビス−（２，６−ジフル
オロフェニル）又は蓚酸ビス−（２，４−ジフルオロフ
ェニル）である特許請求。範囲第８項に記載の方法。 - １０．前記蓚酸エステルが蓚酸ビス−（２，６−ジフ
ルオロフェニル）である特許請求の範囲第８項に記載の
方法。 - １１．第一アミノ基を含有する前記化合物をナフタレ
ン−２，３−ジカルボキシアルデヒドと反応せしめる特
許請求の範囲第１項に記載の方法。 - １２．第一アミノ基を含有する前記化合物が溶液中に
約１ｎＭの濃度で存在する特許請求の範囲第１項に記載
の方法。 - １３．高速液体クロマトグラフィーによる前記分画を
水性媒体中で行う特許請求の範囲第５項に記載の方法。 - １４．第一アミノ基を含有する前記化合物がアラニン
又はｔｅｒｔ−ブチルアラニンである特許請求の範囲第
１項に記載の方法。 - １５．第一アミノ基を含有する前記化合物がカテコー
ルアミンである特許請求の範囲第１項に記載の方法。 - １６．サンプル中の痕跡量のシアンイオンを測定する
ための方法であって、 （Ｉ）第一アミノ基を含有する既知量の化合物をシアン
化物の存在化で既知量のナフタレン−２，３−ジカルボ
キシアルデヒド又はアントラセン−２，３−ジカルボキ
シアルデヒドと反応せしめることにより１−シアノ−２
−置換ペンズ〔ｆ〕イソインドール・フルオレッサー又
は１−シアノ−２−置換ナフス〔ｆ〕イソインドール・
フルオレッサーを生成せしめ： （ＩＩ）蓚酸エステル及び過酸化水素を前記１−シアノ
−２−置換ペンズ〔ｆ〕イソインドール・フルオレッサ
ー又は前記１−シアノ−２−置換−ナフス〔ｆ〕イソイ
ンドール・フルオレッサーと混合して化学ルミネッセン
スを示す分析対象を生成せしめ；そして （ＩＩＩ）前記化学ルミネッセンスを示す分析対象から
の化学ルミネッセンス発光を検出手段により検出する； ことを含んで成る方法。 - １７．サンプル中の痕跡量の過酸化水素を測定するた
めの方法であって、 （Ｉ）過酸化水素を含有する前記サンプルを蓚酸エステ
ルと混合し； （ＩＩ）既知量のあらかじめ調製された１−シアノ−２
−置換ペンズ〔ｆ〕イソインドール・フルオレッサー又
は１−シアノ−２−置換ナフス〔ｆ〕イソインドール・
フルオレッサーを前記サンプルに加えることによって化
学ルミネッセンスを示す分析対象を生成せしめ；そして （ＩＩＩ）化学ルミネッセンスを示す前記分析対象から
の化学ルミネッセンス発光を検出しそして測定する： ことを含んで成る方法。 - １８．１−シアノ−２−置換−ペンズ〔ｆ〕イソイン
ドール又は１−シアノ−２−置換−ナフス〔ｆ〕イソイ
ンドールと蓚酸エステル及び過酸化水素との化学ルミネ
ッセンス相互作用生成物。 - １９．蓚酸ビス−（２，６−ジフルオロフェニル）。
- ２０．蓚酸ビス−（２，４−ジフルオロフェニル）。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/837,671 US4758520A (en) | 1986-03-10 | 1986-03-10 | Chemiluminescence method for assaying compounds containing primary amino groups using 1-cyano-2-substituted benz(f)- or naphth(f)-isoindole fluorescers |
| US837671 | 1986-03-10 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6318254A true JPS6318254A (ja) | 1988-01-26 |
Family
ID=25275099
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62052225A Pending JPS6318254A (ja) | 1986-03-10 | 1987-03-09 | 第一アミノ化合物の測定方法 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4758520A (ja) |
| EP (1) | EP0242245A3 (ja) |
| JP (1) | JPS6318254A (ja) |
| AU (1) | AU602676B2 (ja) |
| CA (1) | CA1290670C (ja) |
| DK (1) | DK119987A (ja) |
| NO (1) | NO870898L (ja) |
| NZ (1) | NZ219546A (ja) |
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| DE3612302A1 (de) * | 1986-04-11 | 1987-10-15 | Hoechst Ag | Chromophore peptide, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung zum nachweis der peptidylglycin-(alpha)-amidierenden monooxygenase |
| US4891323A (en) * | 1987-03-11 | 1990-01-02 | Oread Laboratories, Inc. | Method for assaying primary amines, secondary amines and peptides using fluorogenic derivatization reagents |
| US5298427A (en) * | 1990-04-24 | 1994-03-29 | The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas | Chemiluminescent detection of amino acids |
| DE4304728C2 (de) * | 1993-02-13 | 1997-04-10 | Igor Dr Popov | Verfahren und Testbesteck zur Bestimmung von Ascorbinsäure in biologischen Proben |
| DE19623814C2 (de) * | 1995-06-15 | 1999-02-11 | Lab Molecular Biophotonics | Verfahren und Vorrichtung zur analytischen Bestimmung von 5-Hydroxyindolen oder Catecholaminen |
| AU2003243257A1 (en) * | 2002-05-15 | 2003-12-02 | Diversa Corporation | Assays and kits for detecting the presence of nitriles and/or cyanide |
| US20100297778A1 (en) * | 2009-05-20 | 2010-11-25 | Abbott Laboratories | Conjugate Having Cleavable Linking Agent |
| US11530352B2 (en) | 2016-10-03 | 2022-12-20 | Illumina, Inc. | Fluorescent detection of amines and hydrazines and assaying methods thereof |
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| US3511612A (en) * | 1967-03-20 | 1970-05-12 | American Cyanamid Co | Chemiluminescent systems |
| US3539794A (en) * | 1967-09-12 | 1970-11-10 | American Cyanamid Co | Self-contained chemiluminescent lighting device |
| US3557233A (en) * | 1968-03-14 | 1971-01-19 | American Cyanamid Co | Aromatic hydrocarbons substituted by phenylethynyl groups |
| US3576987A (en) * | 1968-11-07 | 1971-05-04 | American Cyanamid Co | Chemical lighting device to store, initiate and display chemical light |
| US3578962A (en) * | 1969-07-25 | 1971-05-18 | Robert L Gerber | Light producing device |
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| US3933430A (en) * | 1975-06-25 | 1976-01-20 | Durrum Instrument Corporation | Constant flow system for detection of amino acids |
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| JPS6082967A (ja) * | 1983-10-14 | 1985-05-11 | Shimadzu Corp | アミノ酸分析方法及び装置 |
| JPS60200167A (ja) * | 1984-03-24 | 1985-10-09 | Toyobo Co Ltd | 化学発光法による過酸化水素の定量法 |
| ATE64012T1 (de) * | 1985-03-04 | 1991-06-15 | Oread Lab Inc | Verfahren zur bestimmung von primaeraminen unter verwendung von aromatischen dialdehyden. |
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- 1986-03-10 US US06/837,671 patent/US4758520A/en not_active Expired - Fee Related
-
1987
- 1987-03-04 NO NO870898A patent/NO870898L/no unknown
- 1987-03-05 AU AU69756/87A patent/AU602676B2/en not_active Ceased
- 1987-03-09 DK DK119987A patent/DK119987A/da not_active Application Discontinuation
- 1987-03-09 CA CA000531493A patent/CA1290670C/en not_active Expired - Fee Related
- 1987-03-09 JP JP62052225A patent/JPS6318254A/ja active Pending
- 1987-03-09 NZ NZ219546A patent/NZ219546A/xx unknown
- 1987-03-10 EP EP87400527A patent/EP0242245A3/en not_active Withdrawn
Also Published As
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|---|---|
| EP0242245A2 (en) | 1987-10-21 |
| EP0242245A3 (en) | 1989-09-06 |
| DK119987A (da) | 1987-09-11 |
| NZ219546A (en) | 1989-05-29 |
| AU6975687A (en) | 1987-09-17 |
| DK119987D0 (da) | 1987-03-09 |
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| US4758520A (en) | 1988-07-19 |
| NO870898L (no) | 1987-09-11 |
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