JPS63164895A - 培養細胞由来のレクチン様蛋白質及びその製法並びに該物質を主成分とする抗腫瘍剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は培養細胞由来のレクチン様蛋白質ことにセンチ
ニクバエ（Ｓａｒｃｏｐｈａｇａ　ｐｅｒｅｇｒｉｎａ
）胚由来の細胞培養により得られるレクチン様蛋白質及
びその製法並びに該物質を主成分とする抗腫瘍剤に関す
るものである。

（従来技術） レクチンは動植物あるいは細菌で見出される免疫学的産
物にあらざる糖結合性蛋白質の総称であり古くから植物
由来の血球凝集素が知られている。

近年植物からばかりでなく動物からも数々のレクチンが
見出されており、この中には赤血球のみでなく白血球や
ガン細胞等を特異的に凝集するものも発見されその生理
的意義や特性について注目される所となってきた。

本発明者も先に昆虫であるセンチニクバエよりレクチン
様活性を示す物質（ザルコファーガーレクチン）を見出
し、それがｉｎ　ｖｌｔｒｏ　　でマクロファージを刺
激して殺腫瘍性物質を産生せしめることを見出している
。（特願昭５７−１２３２９８号、特願昭５８−９４９
７２号、特願昭５ｓｍ””；２１２４３６号、特願昭弓
９−６６３３０号）二゛′癌患者が急増している現在よ
り有効な抗癌剤の開発が望まれている。抗癌剤としては
現在化学療法剤、免疫療法剤等が用いられているが、副
作用が強くより安全性の高い治療剤の開発が望まれてい
る。ザルコファーガーレクチンは安全性の高い抗癌剤と
して期待されてはいるものの原料物質の確保、精製並び
に生産性に問題があり、工業的生産方法の確立が望まれ
ていた。

（発明が解決しようとする問題点） 本発明は上記の従来技術に鑑みてセンチニクバエ由来の
レクチンについて工業的生産方法を検討するためセンチ
ニクバエ胚由来の株化細胞ＮＩＨＳａｐｅ−４にも同様
に抗腫瘍活性を有する有用物質が存在するのではないか
と推定して誠意研究をおこない、本発明を完成するに至
ったものである。

したがって本発明が解決しようとする問題点及び本発明
の課題はセンチニクバエ胚由来の株化細胞ＮＩＨ３ａｐ
ｅ−４より抗腫瘍活性を有する物質を単離精製すること
並びに工業的生産方法を見出すことにある。

（問題点を解決する為の手段及び作用）本発明によれば
上記の問題点のうちで主たるものはセンチニクバエ胚由
来株化細胞の産生ずる抗腫瘍生理活性物質であって ａ）ゲルろ過法による分子量が約１８５．０００であっ
てＳＤＳゲル電気泳動法による分子量が約３２．０００
のサブユニット４分子と分子量約３０．０００のサブユ
ニット２分子にわかれ、 ｂ）培地中ではインヒビターと共に存在しインヒビター
をはずすと血球凝集活性などのレクチンよう作用を示す
、ものであること特徴とするセンチニクバエ胚由来株化
細胞の産生ずる抗腫瘍生理活性物質により解決される。

本発明方法によればこの抗腫瘍剤はセンチニクバエ胚由
来株化細胞（ＮＩＨ３ａｐｅ−４）培養上清を出発原料
としイオン交換処理した後、疎水クロマトグラフィーに
より吸着、分離、および分画処理し、インヒビターと分
離を行なう。さらにガラクトースもしくはラクトース含
有物質をリガンドとするアフィニテークロマトグラフィ
ーにより吸着、分離、および分画処理により生成して得
ることができる。

本発明によるレクチン様蛋白質はゲルろ過法によれば、
分子量約１８５．０００で５ＤＳ−ゲル電気泳動によれ
ば上記のように分子量約３２．０００と３０．０００の
サブユニットにわかれ、その染色像の濃度比が常に２：
１にになっていることから分子量約３２．０００のサブ
ユニット４分子と分子量約３０．０００のサブユニット
２分子が会合した状態で存在すると推定される。本発明
物質はインヒビターと分離することによりレクチン様の
活性、たとえば血球凝集活性を有する。レクチンとは動
植物及び最近に見出される糖結合性蛋白質を言うが本発
明物質はかかるレクチン様の活性を示すものである。

本発明物質はｉｎ　ｖｌｖｏのテストにおいて、マウス
に移植した固型症Ｍｅｔｈ　Ａ細胞もしくはＩｃＲマウ
スに移植した腹水癌ザルコーマ１８０細胞の増殖を抑制
し、延命効果、治癒効果が確認されている。

（開明の効果） 本発明物質ならびに製法は、センチニクバエ株化細胞の
ｉｎ　ｖｉｔｒｏでの培養細胞上清を出発原料としてい
るので大量培養による大量かつ安定的な供給が可能であ
り、抗腫瘍剤としてのザルコファーガレクチンの工業的
生産供給を可能にするものである。

本発明による抗腫瘍剤は同系移植腫瘍モデルに対して有
効であり、ヒトでの臨床上の有効性が強く示唆される。

さらには腫瘍に対する診断薬としての利用も期待される
ものである。

以下、センチニクバエ胚由来株化細胞からのレクチン様
物質の分離精製、その薬理試験等に関し実施例をあげ本
発明をさらに詳細に説明する。

実施例１ （１）ＮＩＨ５ＡＦＥ−４細胞の培養 Ｎ　Ｉ　Ｈ５ａｐｅ−４細胞を培養（イーストレート５
、Ｏｇ　／Ｉ　、ラクトアルブミンハイドロライゼート
９．５ｇ　／Ｉ　、食塩７．０ｇ　／Ｉ　、塩化カリウ
ム０．２ｇ／ｌ、グルコース４．０ｇ／／ｌ　、リン酸
１ナトリウム０．２７ｇ／Ｉ　、炭酸水素ナトリウム０
．１２　ｇ　／１、塩化マグネシウム０．０５ｇ／ｌ　
）中にＩ　Ｘ　１０’個／ｍｌ培地となるように植込み
２５度Ｃで７〜１０日間培養する。細胞数が約２Ｘ１０
”個／ｍｌとなったところで継代を行い培地を遠心分離
によって回収する。

（２）レクチン様物質の分離精製方法 上記（１）にて得られた培地的１１をｌｏｍＭのリン酸
緩衝液、ＰＨ８，０に対して透析を行う。これをＣＭセ
ルロースのカラム（３，４Ｘ　１７ｃｍ）にかけてカラ
ムを先はどのリン酸緩衝液、で洗浄する。この素通り画
分を回収する。さらにこの画分をＮａＯＨでＰＨ８，０
に調節する。これをＤＥＡＥセルロースカラム（１，７
Ｘ　８４ｃｍ）にかけて吸着させる。カラムを１０ｍＭ
ＩＪン酸緩衝液ＰＨ８，０テ洗浄した後、０．１Ｍガラ
クトースと０．２Ｍ食塩を含む上記のリン酸緩衝液に溶
出される画分を５ｍｌずつ分取し駒野らの方法ｒＪ、Ｂ
１ｏ１．ｃｈｅｍ、第２５５巻２９１９〜２９２４Ｊに
よるラジオイムノアッセイによってザルコファーガレク
チンと免疫学的に交叉する画分を回収する。

次ぎにこの画分に最終濃度で２０％になるように飽和硫
安を加えプチルトーヨーパール８５０Ｍのカラム（１，
７Ｘ　８．３ｃｍ）にかけて吸着させた。この際に本発
明のレクチン様蛋白質と結合していたインヒビターは素
通り画分に移行して分離されるる。このカラムをリン酸
緩衝化生理食塩水でよく洗浄する。次にこのカラムを１
０％の飽和硫安を含むリン酸緩衝化生理食塩水で吸着物
を溶出させ５ｍｌずつ分取させた。この場合の各両分と
吸光度並びにラジオイムノアッセイの結果を示すクロマ
トグラムを第１図に示す。

図から明らかなように蛋白質のメインピークのすぐ前に
レクチンは溶出されていることがわかる。

このカラムでの回収率は９９％であった。

最後にこの両分をＢｕｆ’ｆ’ｅｄ　Ｉｎ５ｅｃｔ　Ｓ
ａｌｉｎｅ（１３０ｍＭＮａＣＩ　、５ｍＭＫＣｌ、１
ｍＭＣａＣｌ　　を含有するトリス塩酸緩衝液、以下Ｂ
ＩＳと略す。）に対して透析を行いラクトースをリガン
ドとしてセファロース６Ｂに結合させたカラム（１，５
Ｘ　５．Ｏｃｍ）にかけて吸着させる。カラムをＢＩＳ
でよく洗浄した後０．２Ｍのガラクトースを含むＢＩＳ
で溶出させ３ｍｌずつ分取した。

この場合の各分画と吸光度を示すクロマトグラムは図２
に示される。このガラクトース溶出画分を透析によって
ガラクトースを除き本発明物質を精製した。かかる操作
で約２００埒の精製品を得ることができた。

（３）本発明物質の血球凝集物質としての同定及び分子
量の推定。

上記（２）で得た精製各段階でのサンプルを駒野らの方
法ｒ　Ｊ、Ｂｉｏｌ　、Ｃｈｅｍ、第２５５巻２９１９
〜２９２４Ｊによって血球凝集活性を測定した結果を図
３に示す。本発明物質はプチルトーヨーパールでのカラ
ム精製以降で凝集活性を示す事がわかる。

また精製物をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に
かけたところ分子ｆｔ３２．０００と３０．０００のサ
ブユニットに分れしかもその染色像の濃度比が常に２：
１であった。またバイオゲルＰ−３００を用いたゲルろ
過性では分子量が約１８５．０００であることから本発
明物質は分子ｆｆ１３２．ｏｏｏのサブユニット４個と
３０．０００のサブユニット２個が会合して６量体を形
成しているものと考えられる。

（４）毒性試験例 ＢＡＬＢ／Ｃ及びＩｃＲマウスに本発明物質を生理食塩
水に溶解して皮下もしくは腹腔内に１００％以上を連続
して１０日間投与を行ったが特に壊死や炎症等の解剖学
的所見は認められなかった。また特にアナフィラキシ−
ショックは認められなかった。

（５）抗腫瘍作用試験 実験例１ オスのＢＡＬＢ／Ｃマウス（投与群、コントロール群共
に６匹）に同系移植腫瘍モデルであるＭｅｔｈ　−に Ａ細胞２Ｘ１０　個を右脇腹皮内に移植して固型癌を作
成した。移植６日目より本発明物質５ＯＮを生理食塩水
に溶解して癌の中もしくはその回りに１日おきに２０日
後まで投与した。

形成された固型癌の直径をノギスによって測定した。コ
ントロール群は生理食塩水のみを投与した。結果は図４
に示した通りであり、本発明物質投与群は３０日後には
完全に腫瘍の消失が観察された。

実験例２ ＩＣＲマウスに腹水癌ザルコーマ１８０細胞１×１０′
個を腹腔内に移植し腹水癌を作成した。本発明物質を２
５０埒／ｍｌに調製しその４００１１ｆｔを腹腔内に移
植後１日目と２日目に投与した。投与後３０日間生存し
ているマウスの数を表１に示す。

表１より本発明物質は腹水癌に対しても有効であること
が明らかとなった。

表１ （６）製剤例 本発明物質は、注射剤等として用いる場合は０゜１〜１
０ｍｇ／ｍｌとなるように添加して得たる溶液に安定化
剤として例えばマンニットを２％程度となるように加え
た溶液を除菌濾過し、ついで常法によりバイアル等に２
ｍｌ程度分注し、凍結乾燥させる。

用時には注゛射用生理食塩水等に溶解して用いる。

【図面の簡単な説明】

第１図は粗製品の飽和砿安溶液による溶出クロマトグラ
ムパターンを示す。 第２図はガラクトース溶出クロマトグラムパターンを示
す。 第３図は本発明物質精製各段階での血球凝集活性状況を
示す写真である。図中Ａはラクトースを結合したセファ
ロース６Ｂカラム精製段階でのサンプル、Ｂはプチルト
ーヨーパール精製段階でのサンプル、ＣはＤＥＡＥセル
ロース精製段階でのサンプル、ＤはＣＭセルロース精製
段階でのサンプル、Ｅはコントロールであり、Ａ−Ｄは
レクチンを０．５　、Ｂ／１含むように調製した。 第４図は本発明物質投与によるマウスにおける腫瘍発育
阻止状況の経時的変化を示す。 出Ｈよ　　　株式会社三和化学研究所 図面　　１ ２８０ｎｍ　　　　　　　　　　　　　　　　　レクチ
ン分画番号 図面　　２ 図面中の矢印はＱ、２Ｍガラクトース を流した位置 ８０ｎｍ の吸光度 分画番号 図面のｉ’Ｊ’シ ＢＣＤＥ Ａ：フグトー久樋含２７７０−ズ６Ｂカラム１；よｉ、
外積つ湊丁ソアｊし添加Ｂニアナルト−ヨー１ｆ−１ｔ
／ＵフムＣばる精うとテン７１１し話曹βＣ：　ＤＥＡ
Ｅｔルロース方ラム（フラム腎製７ンア１ｖズト即Ｄ：
ＣＭヱルロー又刀ラム、１ｚＪろ＃％−丁ンフ゛ル刃ト
ＤσＥ：　コ〉ドロー）シ（γ行畏ｖンーアＩＩＪ品摩
％）図面　　４　　　　　　・ 腫瘍移植後の日数 手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示 昭和６１年特許願第２１６１５８号 ２、発明の名称 培養細胞由来のレクチン様蛋白質及びその製法並びに該
物質を主成分とする抗腫瘍剤 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 愛知県名古屋市東区東外堀町３５番地 株式会社三和化学研究所 代表者　加　藤　　　周 ４、代理人　〒１０５ 東京都港区虎ノ門１丁目１１番７号 第２文成ビル （１）本願明細書第１９頁第６−１３行に「第３図は一
−−調製した」とあるを下記の通りに補正する。 肚“ ｒ第３図は、本発明によるレクチン様蛋白質を取得する
ための各精製段階で得たサンプルの溶液を血液に添加し
て各サンプルの血球凝集活性を調べた際の血球凝集状況
を描記した模写図である１ （２）本願図面中の第３図を別紙の訂正図面第３図の通
りに補正する。 ８、添付書類の目録 （１）訂正図面（第３図）　　１通 手続補正書（自発） 昭和６２年１２月７日

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）センチニクバエ（Ｓａｒｃｏｐｈａｇａ　ｐｅｒ
   ｅｇｒｉｎａ）胚由来の細胞培養により得られるレクチ
   ン様蛋白質であって、 ａ）ゲルろ過法による分子量が約１８５．０００であっ
   てＳＤＳゲル電気泳動法による分子量が約３２．０００
   のサブユニット４分子と分子量約３０．０００のサブユ
   ニット２分子にわかれ、 ｂ）培地中ではインヒビターと共に存在しインヒビター
   をはずすと血球凝集活性などのレクチン様作用を示す、 ものであることを特徴とする、センチニクバエ培養細胞
   由来のレクチン様蛋白質。
2. （２）センチニクバエ（Ｓａｒｃｏｐｈａｇａ　ｐｅｒ
   ｅｇｒｉｎａ）胚由来の細胞を出発原料とし、細胞培養
   により得られた上清（培地）をイオン交換クロマトグラ
   フィー並びに疎水クロマトグラフィーにより吸着、分離
   及び分画処理し、インヒビターをはずし、次にガラクト
   ース又はラクトースを担体にもつアフィニテークロマト
   グラフィーにより吸着、分離、及び分画処理することに
   より精製することを特徴とするセンチニクバエ（Ｓａｒ
   ｃｏｐｈａｇａ　ｐｅｒｅｇｒｉｎａ）胚由来の細胞培
   養により得られるレクチン様蛋白質の製法。
3. （３）センチニクバエ（Ｓａｒｃｏｐｈａｇａ　ｐｅｒ
   ｅｇｒｉｎａ）胚由来の細胞を出発原料とし、細胞培養
   により得られた上清（培地）をイオン交換クロマトグラ
   フィー並びに疎水クロマトグラフィーにより吸着、分離
   及び分画処理し、インヒビターをはずし、次にガラクト
   ース又はラクトースを担体にもつアフィニテークロマト
   グラフィーにより吸着、分離、及び分画処理することに
   より精製することを特徴とするセンチニクバエ（Ｓａｒ
   ｃｏｐｈａｇａ　ｐｅｒｅｇｒｉｎａ）胚由来の培養細
   胞により得られるレクチン様蛋白質を主成分とする抗腫
   瘍剤。