JPS63160592A - Ｌ−バリンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、Ｌ−バリンの製造法に関するものである。更
に詳しくは、プレピバクテリウム属に属しＤＬ−α−ア
ミノ酪酸に耐性を有する微生物を好気的に培養して、そ
の培養液よりＬ−バリンを得る方法に関するものでろる
。

本発明の方法によれば、Ｌ−バリンの生成蓄積量が大巾
に向上し、高収量でＬ−バリンが製造できる。

Ｌ−バリンは必須アミノ酸として、人間及び動物の栄養
上重要な役割をするアミノ酸でアリ、医薬、食品、飼料
強化剤としての需要は近年急激に増加しつつある。

先行技術 Ｌ−バリンの工業的製造法としては、他のアミノ酸の場
合と同様に立体異性体が存在する為に化学合成法では、
Ｌ一体のみの製造は困難であるため、主として醗酵法に
よる生産が行なわれている。

従来、Ｌ−バリンの醗酵による製造法としては各積卸ら
れており、醗酵菌として栄養要求変異株を用いる方法（
特公昭３７−１６９２、同３７−１２４４８、同４２−
５１３、同４３−１１７５６、同５１−３３９９６、同
５２−１１６、同５３−２５０３４、同５８−３２５９
４、特開昭４９−　　′１１６２９３各号公報等）、培
地に金属イオンを添加する方法（特公昭３８−２５２８
４、同３８−２５２８６、同４０−４０４０、同４２−
５１３各号公報等）、プリン又はピリミジン誘導体を添
加する方法（特公昭４０−１９９１号公報）、カルボン
酸エステルを添加する方法Ｃ特公昭４３−１１７５４号
公報）、バルビッール酸、２−チオバルビッール酸（特
公昭４３−１１７５５号公報）を添加する方法、界面活
性剤（特公昭４１−２１７５２号公報等）を添加する方
法、アクリル酸（特公昭４３−１３６７８号公報）を添
加する方法、有機酸（１！！！公昭４７−２３０３５、
同５１−４６８３６、特開昭４９−５０１８５各号公報
）を添加する方法等がある。

しかしながら、公知のし一バリン直接醗酵菌である各種
栄養要求性変異株ではＬ−バリンの蓄積に限界があるこ
とから、新たな観点でＬ−バリンを著量生成蓄積せしめ
る方法の提供が求められていた。

発明の要旨 本発明は、プレピバクテリウム属に属し、ＤＬ−α−ア
ミノ酪酸に耐性を有する微生物を、栄養培地に好気的に
培養し培養液中にＬ−バリンを生成蓄積せしめ、この培
養液よりＬ−バリンを採取するものである、醗酵法によ
るＬ−バリンの製造法を提供するものである。

発明の効果 本発明の方法によれば、栄養培地中に従来になく著量の
Ｌ−バリンを生成蓄積できる。この為、Ｌ−バリンが安
価な原料で工業的に有利な収量高く製造することができ
る。

発明の詳細な説明 従来、α−アミノ酪酸耐性を有する変異株を用いての醗
酵法べよるＬ−バリンの製造法は、セラチア・マルセエ
センス（４？公昭＋５−２４２７４号公報）、プロテウ
ス・レトゲリ属菌株（特開昭５９−１４３５９５号公報
）によるものがあるが、プレピバクテリウム属に属する
微生物についてはかかる知見は全く知られていない。

本発明において用いられるプレピバクテリウム属に属し
、ＤＬ−α−アミノ酪酸に耐性を有する微生物は、プレ
ピバクテリウムに属する微生物を次の操作により耐性変
異株とすることができる。

即ち、紫外線照射、めるいは化学的薬剤（例え１ｆＮ−
メｆルーＮ／−ニトローＮ−ニトロソクアニジン等）処
理によ９該し−バリン生産菌株に変異を誘起せしめた後
、この菌懸濁液をα−アミノ酪酸１０１＋９／１１７含
有する平板培地〔尿素０．２％、硫安０．７％、ＫＨ２
ＰＯ４０，０５％、ＫＨ２Ｏ４０，０５％、Ｍｇ５Ｏａ
　・７Ｈ２００，０５％、Ｎ１ン２　”Ｆ　／　Ｌｘ　
Ｃａαｚ・２ＨｚＯ２’ｌ／　ｔ、　ＦｅＳＯ４４？Ｈ
ｚＯ２’ｔ／　ＬＮＭｎＳＯ４・４−６Ｈ２０、ＺｎＳ
Ｏ４・７Ｈ２０２ｑ／　Ｌ、ビオチン２００μＶ／ｌ、
チアミン塩酸塩１００μＶ／！、、ＤＬ−α−アミノ酪
酸１．０％、寒天２．０％、エタノール２容量％（滅菌
後添加）〕に、３０℃にて数日間培養し生じた大コロニ
ーを分離すること罠より、耐性変異株を得る。

代表的な耐性変異株としてはプレピバクテリウム・フラ
バムＭＪ−２３３−ＡＢ−４１（微工研菌寄第３８１２
号、特公昭５９−２８３９８号参照。以下ＭＪ−２３３
−ＡＢ−４１と記す）があり、この耐性変異株は、ブレ
ビバクテリタム・フラバムＭＪ−２３３（微工研菌寄第
３０６８号、以下ＭＪ−２３３と記す）から上記手法で
誘導されたものである。

前記のＭＪ−２３３−ＡＢ−４１（ＤＬ−α−アミノ酪
酸耐性株）とその親株であるＭ　Ｊ　−２３３のα−ア
ミノ酪酸に対する相対生育度は次の表−１のり口くであ
る。

表−１ 注）表中の数値は、ＤＬ−α−アミノ酪酸無添加時の生
育度０．Ｄ、ａｔｏ　（吸光度測定二東京大学農学部農
芸化学教室実験農芸化学上巻ｐ。

２１２朝倉書店、１９７８年に準拠して行った）をｉｏ
ｏとした相対生育度を示す。

注）使用培地の組成及び培養方法 尿素０．２％、髄安０．７％、ＫＨ２ＰＯ４０，０５％
、Ｋ２ＨＰＯ４０，０５％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，
０５％、酵母エキス０．０１％、カザミノ酸０．０１％
、ＦｅＳＯ４・７Ｈｚ０２　Ｗｔ　／　Ｌ、　　Ｍｎ５
Ｏ４ａ　４−’６ＨｚＯ２ｑ／　ｚ、　ＮａＣＪ　２　
’９／　Ｌ、　Ｃａ（Ｊｚ、２Ｈ２０２Ｎ！／　Ｌ、　
　ＺｎＳＯ４・７Ｈ２０２ｙｙ／　ｔ。

ビオチン２００μｙ／ｌ、チアミン塩酸塩１００μｙ／
ｌからなる培地（ＤＬ−α−アミノ酪酸は、表−１に示
す量をそれぞれ加える）１０ｘｉを２４ｇ３大型試験管
に分注し、１２０℃で１０分間滅菌後、ＭＪ−２３３−
ＡＢ−４１株及びＭＪ−２３３株を各々接種し、更にエ
タノールを無菌条件下にて０．２Ｋｔ（２容量％）添加
したものを３０℃で３日間振盪培養を行なった。

なお本願発明においてＤＬ−α−アミノ酪酸耐性株又は
ＤＬ−α−アミノ酪酸に耐性を有する微生物とは、ＤＬ
−α−アミノ酪酸２％添加した上記培地において、３０
℃で３日間振盪培養した時の、 α−ＡＢ２％添加時の生育度０．Ｄ　６１０相対生育度
ｗ　　　　　　　　　　　　　　　Ｘ　１００α−ＡＢ
無添力時の生育度０．Ｏｒ＋。

が３０以上のものと定義する。（上式中のα−ＡＢはＤ
Ｌ−α−アミノ酪酸の略号である。）本発明のＬ−バリ
ン製造法における培養に使用する培地組成は、炭素源及
び窒素源無機塩は特に限定されない。通常、炭素源とし
ては主にグルコースを用い、窒素源としてはアンモニア
、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニ
ウム、尿素を単独もしくは混合し用いることができる。

無機塩としては、リン酸−水素カリウム、リン酸二水素
カリウム、硫酸マグネシウム等が用いられる。この他に
菌の生育及びＬ−バリンの生育に必要であれば、ぺ１ト
ン、肉エキス、酵母エキス、コーンステイープリカー、
カザミノ酸、各押ビタミン等の栄養素を培地に添加し用
いることができる。

培養は通気攪拌、振盪等の好気的条件下で行ない、培！
！！温度は２０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃で行
なう。培養途中のｐＨは５〜１０、好ましくは７〜８付
近にて行ない、培養液中のｐＨの調整には酸、アルカリ
を添加して行なう。ＤＬ−α−アミノ酪酸の添加濃度は
、０．１〜５重量％好ましくけ、１〜３重箭％である。

培養開始時のグルコース濃度は１〜５容ｔ％、好ましく
は２〜３容量％が適する。培養期間は２〜８日、最適期
間は４〜５日である。

培養液からのＬ−バリンの回収は、培養液を遠心分離に
より、菌体の除去後、公知の手法、すなわちイオン交換
樹脂処理法あるいは、沈殿法等により容易に行なうこと
ができる。

実験例 以下の実験例においてＬ−バリンの定性は、ペーパーク
ロマトグラムのＲｆ値、電気泳動法の易動度、微生物に
よる生物活性値により確認した。

定欧は、ロイコノストック・メセンテロイデスＡＴＣ，
Ｃ８０４２を用いるマイクロバイオアッセイ法により行
なった。またシと表したのは重量％を意味する。

実施例−１ 前培養培地（尿素０．４％、硫酸アンモニウム１．４％
、Ｋ２ＨＰＯ４０，０５％、ＫＨｚＰＯａ　０．０５％
、Ｍｇ５Ｏａｅ７Ｈｚｏ　０．０５％、ＣａＣ２ｚ　会
２Ｈ２０２ｐｐｍ　％ＦｅＳＯ４・７Ｈ２０２ｐｐｍＳ
ＭｎＳＯ４・４−６Ｈ２０２２９ｍ％Ｚｎ５Ｏｉ・７Ｈ
２０２ｐｐｍＮ　　Ｎａ（Ｊ　２　ｐｐｍ、　　ビオチ
ン２００μｙ／ｌ、チアミン・）ＩＣｔｌ　００μ？／
１１　カザミノ酸０．１％、酵母エキス０．１％）１０
ｄを２４β大型試験管に分注、滅菌（滅菌後ｐＨ７，０
）した。これに更に別滅菌（１２０℃、１５分間）を行
って調製した５０％グルコース溶液０．２　ｍを加えた
後、更にプレピバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｆｌａｖｕｍ　）　Ｍ　Ｊ　−２３
３−Ａ　Ｂ　−４１（ＦＥＲＭ　Ｐ−３８１２）を植菌
し、３０℃にてｐＨを７〜７．５に調節しつつ２日間振
盪培養を行なった。

次に本培傳培地（尿素０．４％、硫酸アンモニウム１．
４％、ＫＨ２ＰＯ４０，０５％、Ｋ２ＨＰＯ４０，０５
％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，０５％、ＣａＣ１ｚ　＠
　２Ｈ２０２ｍ”　％ＦｅＳＯ４１７ＨｓＯ２ｐｐｍＳ
ＭｎＳＯ４・４−６Ｉ（２０２ｐｐｍ。

ＺｎＳＯ４・７Ｈ２０２ｐｐｍ、　ＮａＣｔ２　ｐｐｍ
、　　ビオチン２００　ｆｉｔ／ｌ、チアミン”　Ｈｃ
ｔｌ　００　ｐｆ／Ｚ％　コーンステイープリカー１０
ｄ／１）５０−を５００ｄ三角フラスコに分注、滅菌し
た（滅菌後ｐＨ７）。

これにさらに別滅菌（１２０℃、１５分間）した５０％
グルコース溶液２ｄを添加後、前培養物の１　ｍｌを植
菌し、３０℃にて３日間ｐＨを７〜７．５に調節しつつ
振盪培養を行なった。培養３日目にＬ−バリンが培養液
１を当９２．Ｏｆ蓄積された。

培養液から菌体その他不純物を除いたＦ液を、強酸性陽
イオン交換樹脂（Ｈ＋型）のカラムに通してＬ−バリン
を吸着させ、水洗後、０．５規定アンモニア水で溶出し
たのち、Ｌ−バリン画分を濃縮し、冷エタノールでＬ−
バリンの結晶を析出させた。かくして培養液１を当り１
．３ｆの粗結晶を得た。

なお、同条件で親株であるＭＪ−２３３を使用した場合
、培地中のＬ−バリンの蓄積は培養液１を当り５０叩以
下であった。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）プレピバクテリウム属に属し、ＤＬ−α−アミノ
   酪酸に耐性を有する微生物を、栄養培地に好気的に培養
   し培養液中にＬ−バリンを生成蓄積せしめ、この培養液
   よりＬ−バリンを採取するものである、醗酵法によるＬ
   −バリンの製造法。