JPS6315553B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は免疫学的検査用試薬として有効な免疫
活性微粒子に関し、特に粒子状担体に免疫活性物
質を固定化してなる免疫活性粒子を用いてヒト又
は動物の体液中の成分を検出若しくは測定又は細
胞を識別する免疫学的検査用試薬として有効な免
疫活性微粒子の改良に関する。 抗原と抗体との反応を利用してその一方を免疫
学的に検出又は定量する場合に、測定したい物質
に結合する側の物質を粒子状担体に固定化させて
おき、その粒子が被測定物質の存在下で凝集を起
こす現象を利用して高感度の測定を行なう方法は
免疫学的臨床検査の重要な手段となつている。ま
た逆に測定したい物質を粒子状担体に固定化させ
ておき、その被測定物質と特異的に反応する抗原
又は抗体の存在による被測定物質固定化粒子の凝
集が、被検液中の被測定物質の存在により阻止さ
れることにより被測定物質を検出又は定量する方
法も免疫学的臨床検査において広く用いられてい
る。また特定の細胞と選択的に結合する物質を粒
子状担体に固定化させておき、その粒子が細胞に
結合するか否かによつて細胞の識別を行なう方法
も免疫学的検査の手段としてしばしば採用されて
いる。 このような免疫活性粒子を用いた免疫学的検査
用試薬における粒子状担体としては、従来、ヒト
を含む哺乳動物や鳥類の赤血球、カオリンや炭素
など無機物の粒子、天然ゴムラテツクスやポリス
チレンなどの有機高分子化合物のラテツクスが凝
集反応用として広く用いられている。これらのう
ち赤血球は多種類の抗原・抗体を固定化すること
が可能で応用範囲が最も広い。しかし採取する動
物個体によつて品質等に差があること、安定性に
難があり保存が難しいこと、またヒト血清により
非特異的に凝集する場合があることなどの問題点
がある。非生物由来の粒子として最も広く用いら
れているのはポリスチレン粒子であり、これは合
成高分子化合物であるところから品質を一定にす
ることが可能でまたそれ自体では安定である。ポ
リスチレンは疎水性で種々の蛋白質を吸着する性
質があるため、通常ポリスチレンへの抗原又は抗
体の固定は物理吸着によつて行なわれる。しかし
物理吸着によつて抗原又は抗体を固定化した場合
には固定化した抗原（又は抗体）と遊離の抗原
（又は抗体）との間に平衡が存在し、そのため測
定の目的物質である対応する抗体（又は抗原）に
対し粒子に固定化した抗原（又は抗体）と遊離の
抗原（又は抗体）との間に競争反応が起こり、そ
の競争反応は凝集に対して抑制的に作用する。そ
の結果、多くの例において感度と安定性の不足が
指摘されている。また当然のことながらポリスチ
レンに対して物理的に吸着されにくい物質は固定
化することができない。これらの問題点のために
ポリスチレン粒子は赤血球を担体とする場合に比
較して限られた範囲でしか実用に供されていな
い。これらの問題点の解決を図る目的で最近、ス
チレン−メタクリル酸コポリマーラテツクスにヒ
ト絨毛性ゴナドトロピンをカルボジイミドを使用
して結合させた試薬（DT2649218）、カルボキシ
ル化スチレン−ブタジエンコポリマー、カルボキ
シル化ポリスチレン、アミノ基をもつカルボキシ
ル化ポリスチレン、アクリル酸ポリマー、アクリ
ロニトリルポリマー、メタクリル酸ポリマー、ア
クリロニトリル−ブタジエン−スチレンコポリマ
ー、ポリ酢酸ビニルアクリレート、ポリビニルピ
リジン、塩化ビニル−アクリレートコポリマーな
ど種々のラテツクスポリマーにカルボジイミドを
縮合剤としてヒト絨毛性コーナドトロピン、ヒト
血清アルブミン又は変性ガンマグロブリンをアミ
ド結合を介して縮合させた粒径0.01〜0.9ミクロ
ンの粒子からなる試薬（特公昭53−12966）、メタ
クリル酸、２−ヒドロキシエチルメタクリレート
及びメチルメタクリレートを共重合して製造した
ヒドロキシル基とカルボキシル基を含有するメチ
ルメタクリレート系ラテツクスにトレポネーマ抗
原を臭化シアノゲン又はカルボジイミド法で結合
させた試薬（臨床病理27、補冊、522頁（1978））、
ポリスチレン粒子を芯として、それをスチレン−
グリシジルメタクリレートコポリマーの外皮で被
覆したラテツクスの遊離エポキシ基とヒト絨毛ゴ
ナドトロピン又はインシユリンを反応させ、それ
らをラテツクスに結合させた試薬（特公開昭55−
110118）など、共有結合により抗原又は抗体を担
体に結合させた試薬が提案されている。これら先
行技術においてはカルボジイミドにより免疫活性
物質を粒子に結合させる方法が多用されている
が、カルボジイミドを使用すると免疫活性物質分
子間および分子内の縮合反応を惹起する。これは
のぞましくない副反応であつて免疫活性物質の活
性を損なうものである。臭化シアノゲンを用いれ
ば免疫活性物質分子間および分子内の縮合反応を
回避することはできるが、この場合にはヒドロキ
シル基を有するポリマーと臭化シアノゲンとの反
応の再現性を得ることが難かしく、その結果免疫
活性物質を固定化した粒子の免疫活性が変動しす
い。これらの免疫活性物質固定化法に比較して重
合体に導入された遊離エポキシ基と蛋白質又はポ
リペプチドを反応させる方法は免疫活性の失活も
少なく再現性も良好である。しかしエポキシ基を
利用する上記先行技術においては重合体粒子表面
がスチレンのような疎水性化合物の共重合体であ
るため蛋白質を非特異的に吸着する傾向を有して
いる。一般にヒト又は動物の体液中には多種類の
蛋白質が含まれ、とくに血漿又は血清中にはこれ
が高濃度で含有されている。検体体液から蛋白質
が担持粒子に吸着されると、それが目的とする抗
原−抗体反応などの免疫学的反応に干渉し、凝集
反応の選択性や感度の低下をもたらすおそれがあ
る。本発明者らはこのような問題点を解消するこ
とを目的に検討を行なつた結果、本発明に到達し
た。 本発明は、(1)グリシジルアクリレートおよび
（または）グリシジルメタクリレートと、(2)炭素
炭素不飽和二重結合を有する水溶性単量体との共
重合体からなる平均直径が0.03〜10μｍの微粒子
に、アミノ基を有する免疫活性物質が共有結合に
よつて固定化されていることを特徴とする免疫活
性微粒子を提供するものであり、該微粒子は免疫
学的検査用試薬として著効を示す。本発明によれ
ば免疫活性物質はそのアミノ基と微粒子表面の遊
離エポキシ基との反応によつて生成する共有結合
によつて担体微粒子上に固定化される。免疫活性
物質との反応によつて遊離エポキシ基が全部消費
されずに変性を有するまま残存する可能性がある
場合には血清アルブミン、ゼラチンなど目的とす
る免疫学的検査に干渉しない親水性蛋白質を遊離
エポキシ基と反応させることによつて、エポキシ
基の反応性を失わせることができる。その際エポ
キシ基消去用の新水性蛋白質は固定化の目的であ
る免疫活性物質と混合して同時に反応させてもよ
く、また免疫活性物質を先に単独で反応させその
後で反応させてもよい。また上記アルブミンやゼ
ラチンなどの親水性蛋白質の代りにグリシン、ア
ラニンなどのアミノ酸を用いることも可能であ
る。このようにして免疫活性物を固定化した後に
重合体微粒子表面で何らの結合物によつて覆われ
ることなく露出しているのは、水溶性単量体に由
来する親水性部分である。蛋白質は水性媒体中で
は親水性重合体には吸着しにくいので、本発明に
よる免疫活性物質固定化微粒子は、検体体液に対
して安定で非特異的凝集を起こしにくく、また細
胞に対する非特異的付着がない。 本発明において共重合に用いる水溶性単量体と
しては、例えば２−オキシエチルアクリレート、
２−オキシエチルメタクリレート、２−オキシプ
ロピルアクリレート、２−オキシプロピルメタク
リレート、重合度２ないし25のポリエチレングリ
コールモノアルキルエーテルのアクリル酸エステ
ル又はメタクリル酸エステル、アクリルアミド、
メタクリルアミド、Ｎ−ビニルピロリドン、グリ
セロールメタクリレートなどが好ましく用いられ
る。これらの水溶性単量体は２種以上併用しても
よい。グリシジルアクリレートとグリシジルメタ
クリレートとの和に対する水溶性単量体の和の比
率はモル比で95：５ないし５：95の範囲で変える
ことができる。またグリシジルアクリレートとグ
リシジルメタクリレートの使用比は100：０ない
し０：100（モル比）すななわち任意でよい。遊離
エポキシ基はアミノ基のみでなく、カルボキシル
基、アルコール性ヒドロキシル基、フエノール性
ヒドロキシル基及びメルカプト基などとも反応し
得るが、重合体粒子の製造条件を適当に選べばグ
リシジルアクリレート又はグリシジルメタクリレ
ートのエポキシ基を副反応によつて失なうことな
く免疫活性物質の固定化に利用することができ
る。 本発明の重合体微粒子は例えば次の方法によつ
て製造することができる。 重合反応は通常乳化重合、沈澱重合又は懸濁重
合によつて好ましく行なわれる。これらいずれの
方法も重合と同時に重合体が粒子状になつて析出
するので本発明の目的に適している。とくに好ま
しいのは沈澱重合である。沈澱重合は、単量体は
溶解するが重合によつて生成する重合体は溶解し
ない媒体中で重合を行なう方法であつて、単量体
と重合媒体との組合せを選択することによつて生
成する重合体粒子の平均直径を0.03ないし10μｍ
の範囲に入るよう調節することが比較的容易であ
り、粒径の分布も比較的狭い。また沈澱重合は、
乳化重合や懸濁重合の場合と異なつて、乳化剤や
懸濁安定剤を使用しないので、重合反応後これら
の添加剤を除去する必要がないのも利点の一つで
ある。 架橋剤を重合系に添加することは必須ではない
が、通常重合に当つて重合性炭素炭素二重結合を
分子内に２基以上含む多官能性単量体を添加して
積極的に重合体を架橋させることがのぞましい。
そのような目的で重合系に添加するに適した多官
能性単量体は多数存在するが、若干例をあげれ
ば、ジビニルベンゼン、エチレングリコールジメ
タクリレート、Ｎ，N′−メチレンビスアクリル
アミド、コハク酸ジビニル、コハク酸ジアリル、
メタクリル酸ビニル、メタクリル酸アリル、トリ
アリルシアヌレート、トリアリルイソシアヌレー
トなどである。また架橋結合は重合反応後生成重
合体の反応性を利用してこれを多官能化合物と反
応させることによつて導入することもできる。例
えば生成重合体に含まれるエポキシ基とエチレン
ジアミンなどのジアミンとを反応させることによ
り重合体を架橋させることができる。 粒子の形状は多くの場合球形であるが球形であ
ることは必要条件ではなく不規則な形状であつて
も差し支えない。不規則な形状の粒子の直径は最
大径と最小径の和の1/2とする。平均直径は式(1)
によつて定義されるによつて表わされる。ただ
しd_iはｉ番目の粒子の直径、Ｎは粒子の総数であ
る。 ＝_N 〓ⁱ⁼¹ d_i／Ｎ ……(1) 凝集反応が判定しやすいのは経験的に平均直径
が0.1μｍ以上10μｍ以下の場合である。また細胞
標識の目的には平均直径は0.03μｍ以上5μｍ以下
の範囲が好ましい。また染料ないし顔料により適
当に着色した粒子は凝集反応、細胞標識いずれの
目的に対しても好都合である。また細胞標識に対
しては螢光を付与した粒子も好ましい。 免疫活性物質の微粒子への固定化反応は水性媒
体中で行ない、PHは7.0〜9.0、温度は０℃〜40℃
の範囲が適当である。反応液中の免疫活性物質の
濃度は個々の免疫活性物質の性質によつて増減す
る必要があり一律には決められない。その際すで
に述べたように血清アルブミン、ゼラチンなどの
親水性蛋白質を反応液に添加することはしばしば
免疫活性物質固定化微粒子の分散安定性を改良す
る上で有効である。また固定化反応後にグリシ
ン、アラニンなどのアミノ酸で処理することもし
ばしば同様に好ましい効果をもたらす。 本発明において使用する免疫活性物質はアミノ
基を有することが必要であるが、免疫活性物質の
大部分は蛋白質であるかまたはポリペプチド部分
を含んでいるのでその条件に適合する。ここで免
疫活性物質とは抗原および抗体のみでなく、補
体、Fcレセプター、C3レセプターなど液性免疫
反応ないし細胞性免疫反応に関与してある物質に
特異的に結合する物質を意味するものとする。具
体例を若干あげれば、梅毒トレポネーマ抗原、Ｂ
型肝炎表面抗原（HBs抗原）、Ｂ型肝炎表面抗原
に対する抗体（抗HBs抗体）、風疹抗原、トキソ
プラズマ抗原、ストレプトリジンＯ、抗ストレプ
トリジンＯ抗体、マイコプラズマ抗原、ヒト絨毛
性ゴナドトロピン（HCG）、抗HCG抗体、熱凝
集ヒトIgG、リウマチ因子、核蛋白、DNA、抗
DNA抗体、Ｃ反応性蛋白質（CRP）、抗CRP抗
体、抗エストロゲン抗体、α−フエトプロテイン
（α−FP）、抗α−FP抗体、癌胎児性抗原
（CEA）、抗CEA抗体、C1q、抗C1q抗体、C3、
抗C3抗体、抗C3b抗体、抗C3bi抗体、C4、抗C4
抗体、プロテイン−Ａ、コングルチニン、イムノ
コングルチニンなどである。 実施例 １ グリシジルメタクリレート、２−オキシエチル
メタクリレートおよびエチレングリコールジメタ
クリレートの３者を85.7：9.5：4.8のモル比で混
合し、その単量体混合物24部（重量、以下同じ）、
プロピオン酸エチル76部および２，2′−アゾビス
（２，４−ジメチル−４−メトキシバレロニトリ
ル）0.13部（4.7ｍmol／）の混合物を窒素ガス
雰囲気下40℃で３時間重合させた。白濁した重合
混合物をアセトンに注ぎ、1500×ｇで10分間遠心
分離し、沈降した粒子をエタノールで再分散して
洗浄、次いで再び遠心分離した。減圧下に乾燥し
て微粒子状重合体11.3部を得た。この微粒子状重
合体は球形でその直径は1.8μｍと4.2μｍの間にあ
り平均3.3μｍ、標準偏差は0.45μｍであつた。 上記のようにして調製した重合体微粒子にTP
抗原を下記のようにして固定化した。先ず梅毒病
原体Treponema pallidum（以下TPと略記）
Nichols株菌体成分をリン酸塩緩衡生理食塩水
（リン酸水素２ナトリウム＋リン酸水素１カリウ
ム0.01mol／、塩化ナトリウム0.14mol／、
PH7.2、以下PBSと略記）の中に10⁹cell／mlの割
合で分散させた分散液を氷水で冷却しながら10K
Hzの超音波で20分間処理して菌体を破壊し、これ
をTP抗原液とした。このTP抗原液１容とウシ血
清グリコプロテインを１mg／mlの濃度でPBSに
溶解した溶液３容とを混合し、その混合液１mlと
前記重合体50mgをPBS1mlに分散した分散液とを
混合して30℃で２時間撹拌した。次に遠沈により
微粒子を分離してPBSで遠沈により３回洗浄し
た後、ウシ血清アルブミン（以下BSAと略記）
を１％添加したPBS20mlに分散した。このTP抗
原固定化微粒子分散液を３日間４℃の冷蔵庫中で
放置した後、下記のようにして活性を検定した。 Ｕ字型管底を有するポリスチレン製のマイクロ
タイタープレートに、TPHA力価640の梅毒陽性
血清希釈液を希釈倍率10倍を起点とする2ⁿ希釈系
列で各50μずつ入れた。ただし希釈用液として
はPBSにBSAを１％、梅毒補体結合反応用ライ
ター抗原溶液KW（日本凍結乾燥研究所）を５％、
塩化アンモニウムを0.73mol／の濃度で添加し
た溶液を使用した。またコントロールとして梅毒
陰性血清についても同様の希釈液をマイクロタイ
タープレートに入れた。次に血清希釈液の入つて
いるマイクロタイタープレートの各穴にTP抗原
固定化微粒子分散液を各50μずつ加え、３分間
振盪して両液を混合した後窒温で２時間静置し、
沈降像によつて凝集の程度を判定した。その結果
は表１の通りでTPHA以上の感度で血清中の梅
毒抗体を検出できることがわかる。

【表】

【表】 実施例 ２ １mg／mlの濃度のヒトIgG／PBS溶液0.4mlと
１mg／mlの濃度のウシ血清グリコプロテイン／
PBS溶液1.6mlとを混合し、その混合液に、実施
例１に使用したのと同じ重合体微粒子50mgを分散
させ、30℃で３時間撹拌した。この反応混合物を
４℃の冷蔵庫中で１夜放置した後遠沈により
PBSで洗浄し、BSAを１％添加したPBS4mlに微
粒子を再分散させ、30℃で２時間撹拌した後、４
℃の冷蔵庫に１夜放置した。このようにしてヒト
IgGを固定化した重合体微粒子と抗ヒトIgG抗体
とを次のようにして反応させた。すなわち顕微鏡
用スライドグラス上で抗ヒトIgG血清（ヤギ）
IgG分画のPBS溶液10μと上記ヒトIgG固定化
微粒子分散液10μとを混合し、３分後の凝集状
態を肉眼で判定した。その結果を表２に示す。抗
ヒトIgG抗体の検出限界は約10nｇ／mlであるこ
とがわかる。

【表】 実施例 ３ ５mg／mlの濃度のBSA／PBS溶液２mlに実施
例１で使用したものと同じ重合体微粒子を分散さ
せ、30℃で７時間撹拌した後４℃の冷蔵庫に１夜
放置した。次いで遠沈によりPBSで洗浄し、ヒ
ト血清アルブミンを0.5％添加したPBS4mlに微粒
子を再分散し、30℃で１時間撹拌してから４℃の
冷蔵庫に１夜放置した。このようにしてPBSを
固定化した重合体微粒子と抗BSA抗血清（ウサ
ギ）とを実施例２と同様にしてスライドグラス上
で反応させた結果は表３の通りであつた。抗
BSA抗体検出限界は0.1μｇ／mlであることがわ
かる。

【表】 実施例 ４ グリシジルメタクリレート、２−オキシエチル
メタクリレートおよびエチレングリコールの３者
の混合比を71.4：23.8：4.8（モル比）に変えた以
外は実施例１と全く同様にして重合し、平均直径
1.0μｍの微粒子10.8部を得た。この重合体微粒子
を用いて実施例３の場合と全く同様にしてBSA
を固定化した。実施例３と同様にしてスライドグ
ラス上で抗BSA抗血清と反応させた結果は実施
例３の場合と全く同等で、抗BSA抗体検出限界
は0.1μｇ／mlであつた。 実施例 ５ グリシジルメタクリレート、２−オキシプロピ
ルメタクリレートおよびトリエチレングリコール
ジメタクリレートを47.6：47.6：4.8（モル比）の
比率で混合し、その単量体混合物24部、メチルｎ
−プロピルケトン76部および２，2′−アゾビス
（２，４−ジメチル−４−メトキシバレロニトリ
ル）0.13部（4.7ｍmol／）の混合物をアルゴン
雰囲気下40℃で３時間重合させた。白濁した重合
混合物を実施例１と同様に処理して重合体微粒子
8.4部を得た。平均直径は2.5μｍであつた。この
重合体微粒子を0.5％ヒト血清アルブミン水溶液
中に重合体含量が1.25％になるように分散し、実
施例３と同様にしてBSAを固定化した。そして
実施例３と同様にして抗BSA抗血清とスライド
グラス上で反応させた。その結果を表４に示す。

【表】 実施例 ６ グリシジルメタクリレートの代りにグリシジル
アクリレートを使用しグリシジルアクリレート、
２−オキシエチルメタクリレートおよびトリエチ
レングリコールジメタクリレートの混合比を
23.8：71.4：4.8（モル比）にした以外は実施例５
と同様にして重合し、平均直径約1μｍの重合体
微粒子7.2部を得た。実施例５と全く同様にして
BSAを重合体微粒子に固定化し、実施例５と同
様にして抗BSA抗血清と反応させた。その結果
は実施例５の場合と同等で、抗BSA抗体検出感
度は約10μｇ／mlであつた。 実施例 ７ 実施例１の２−オキシエチルメタクリレートの
代りに２−オキシエチルアクリレートを使用した
以外は実施例１と全く同様にして重合し、平均直
径約3μｍの重合体微粒子9.5部を得た。この重合
体微粒子に実施例１と同様にしてTP抗原の固定
化を行ない活性を検定した結果、血清中の梅毒抗
体検出感度は実施例１の場合と同等であつた。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ (1)グリシジルアクリレートおよび（または）
   グリシジルメタクリレートと、(2)炭素炭素不飽和
   二重結合を有する水溶性単量体との共重合体から
   なる平均直径が0.03〜10μｍの微粒子に、アミノ
   基を有する免疫活性物質が共有結合によつて固定
   化されていることを特徴とする免疫活性微粒子。