JPS63119681A - 癌胎児性抗原をコードするｃＤＮＡ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、発癌抗原のペプチド配列の遺伝情報を指定す
る核酸配列に関する。

発癌抗原（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃａｎｔｉ
ｇｅｎ）　（［ＣＥＡＪ　）は、最初にゴールド（Ｇｏ
ｌｄ）および７リードマン（Ｆ　ｒｅｅｄｍａｎ）　ｔ
　’）　＋−−ナル・オブ・イクスベリメンタル辱メデ
ィシン（Ｊ、　　Ｅｘ、　　Ｍｅｄ、）ｗ　　１２１．
４３９−４６２（１９６５）に記載された。ＣＥＡは、
５０〜６０重量％の炭水化物をもつ分子量はぼ２００゜
０００の糖蛋白質として特徴づけられる。ＣＥＡは正常
のヒト胎児の発育間に存在するが、正常の大人の腸管中
の濃度は非常に低い。それはある数の異なる腫瘍によっ
て生成されかつ分泌される。

ＣＥＡは結腸直腸の癌患者の監視のための、臨床的に有
用なＭ！瘍ママ−カーある。ＣＥ　Ａ　ｌ！！受性のイ
ムノアッセイ法を用いて測定できる。ＣＥＡの手術前の
血清レベルが高くなったとき、血清ＣＥＡの手術後の正
常範囲への低下は、典型的には、Ｍ瘍の切除に成功した
ことを示す。正常に戻らない手術後のＣＥＡレベルは、
しばしば、Ｉｌ［の切除が不完全であること、あるいは
患者中に追加の腫瘍部位が存在することを示す。正常レ
ベルへ戻った後、血清ＣＥＡレベルの引続く急速な上昇
は通常型段階（ｍｅｔａｓｔａｇｅ）の存在を示す。通
常レベルからのより遅い手術後の上昇は、最も頻繁に、
前に検出されない新しい一次腫瘍の存在を示すと解釈さ
れる。こうして、結腸の患者の手術後のｇ埋はＣＥＡの
測定によって促進される。

ＣＥＡは抗原族の１貝である。このために、現在利用可
能な方法によるＣＥＡのイムノアッセイは、ＣＥＡがい
くつかの潜在的に反応性の抗原の１つだけであるという
！＄大によって複雑である。

少なくとも１６のＣＥＡ様抗体が文献に記ｒｉされてき
た。これらのいくつかは異なる研究者らによって記載さ
れた同一の抗体と思われるので、異なる抗原の実際の数
は多少この数よりも少ない。

それにもかかわらず、腫瘍が放出するＣＥＡのイム／ア
ッセイを潜在的に妨害しうる交差反応性抗原の複雑な列
が存在する。ＣＥＡ様抗原の血清レベルは、多くのＭ１
瘍以外の状態、例えば、炎症性肝臓の病気およびまだ喫
煙者において増大することが知られている。癌患者の状
態の監視のために使用するイムノアッセイは、これらの
他のＣＥＡ様抗原によって妨害されないことが重要であ
る。

逆に、異なる型の腫瘍が異なる型のＣＥＡを優先的に発
現する可能性があるので、抗／ＪＸ類をイムノアッセイ
によって区別できることが重要である。

そうである場合、異なる型のＣＥＡを信頼性をもって測
定できることは、異なる型の癌を診断し、あるいはより
首尾よく処置する手段を提供する。

「放射性ヨウ素を使用する発癌抗原および診断法」と題
する米国特許第３，６６３，６８４号は、ＲＩＡにおい
て使用するためのＣＥＡの精製および放射性ヨウ素化に
関する。

米国特許１３，６９７，６３８号は、ＣＥＡが抗原類（
この場合成分Ａお上りＢ）の混合物であることを記載し
ている。米国特許第３，６９７゜６３８号は、各成分を
分離しかつ放射性ヨウ素化する方法および特定のＲＩＡ
におけるそれらの使用を述べている。

「発癌抗原の決定における血漿抽出物のための代替物と
して、ラジオイムノ７ツセイにおいて使用する組成物」
と題する米国特許第３，８５２゜４１５号は、ＣＥＡの
ＲＩＡのための希釈剤の代替物として、ＥＤＴＡお上り
ウシ血清アルブミンを含有するｍｓ液の使用に関する。

「発癌抗原」と題する米国特許第３，８６７゜３６３号
は、ＣＥＡの成分ＡおよびＢの分離、それらの標識つけ
およびＲＩ　Ａにおける使用に関する。

１′放射＃ａ標識した抗体による腫瘍の局在化」と題す
る米国特許第３．９２７，１９３号は、全身のＩｌ！傷
の映像化における放射線標識抗ＣＥＡの使用に関する。

「発癌抗原」と題する米国特許第３，９５６゜２５８号
は、ＣＥＡの成分ＡおよびＢの分離に関する。

「発癌抗原」と題する米国特許第４，０８６゜２１７号
は、ＣＥＡの成分ＡおよびＢの分離に関する。

「診断法および試薬」と題する米国特許第４゜１４０．
７５３号は、ＣＥＡ−８１と呼ばれるＣＥＡ！″４性本
の精製およびＲＩ　Ａにおけるその使用に関する。

１“発癌抗原の異性体」と題する米国特許第４゜１４５
．３３６号は、抗原ＣＥＡ−８１に関する。

１発癌抗原」と題する米国特許第４，１８０゜４９９号
は、ＣＥＡの成分Ａの生成法を記載している。

「発癌抗原を生成する方法」と題する米国特許第４，２
２８，２３Ｇ号は、確立された細胞系ＬＳ　−１７４Ｔ
およびＬＳ−１８０またはそのクローンまたは誘導体を
ＣＥＡの生成において使用することに関する。

「発癌抗原のアッセイのための抗体吸着支持体法」と題
する米国特許第４，２７２，５０４号は、ＣＥＡのラジ
オイムノ７ツセイのための２つの概念に関する。ＰＡｌ
に、米国特許第４，２７２゜５０４号は、試料をｐＨ５
において６５〜８５℃に加熱して予備処理して、異質蛋
白質を沈殿しかつ排除することに関する。第２に、それ
は分析物および放射ａ標識ＣＥＡ　）レーサーを捕捉す
る手段として、固体の抗体（ビーズまたは管上）を使用
することを記載している。

「発癌抗原の決定」と題する米国特許第４，２９９．８
１５号は、ＣＥＡ試料を水で希釈し、そして蛋白質の沈
殿が起こる温度より低い温度に加熱することによって予
備処理することに関する。

次いで、予備処理した試料を、ＲＩＡ、ＥＩＡ。

ＦＩＡまたは化学ルミネセンスイムノアッセイを使用し
てイムノアッセイする。

「高分子量の発癌抗原に対して特異的なモノクローナル
ハイブリドーマの抗体」と題する米国特許第４，３４９
，５２８号は、１８０ｋＤのＣＥＡと反応性であるが、
他の分子量の形態と反応性ではないモノクローナル抗体
に関する。

「発癌抗原のための酵素−イムノアッセイ」と題する米
国特許第４．４６７．０３１号は、２つの高ＣＥＡモノ
クローナル抗体の第１が同相に取付けられており、セし
て１２のモノクローナル抗体がペルオキシドと接合して
いる、ＣＥＡのためのサンドイッチ酵素イム／アッセイ
に関する。

［癌の検出のための方法および組成物］と題する米国特
許第４，４８９，１６７号は、ＣＥＡがヒト血清の正常
な成分であるα−酸性糖蛋白質（ＡＧ）と抗原決定基を
共有することを記載している。そこに記載されている方
法は、１つの抗体として、ＡＧを認識する抗体および、
ＣＥＡを認識するが、ＡＧを認識しない他の抗体を使用
する、固相サンドイッチ酵素イム／アッセイに関する。

「発癌抗原（ＣＥＡ）のためのイムノアッセイ」と題す
る米国特許第４，５７８，３４９号は、ＣＥＡのイム／
アッセイにおいて希釈剤として高い塩を含有する緩ｇＪ
液を使用することに関する。

［発癌抗原のための血液試料の７ツセイ　−シリカゲル
とのインキュベージ５ンによる妨害物質の除去後］と題
する欧州特許（ＥＰ）１１３０７２−Ａ号は、シリカゲ
ルで予備処理することによって血漿試料の血清から妨害
物質を除去することに関する。次いで、予備清浄化試料
をイムノアッセイにかける。

「癌の診断の発癌抗原　−電気泳動なしに過塩素酸抽出
物から生成された」と題する欧州特許（ＥＰ）９２２２
３−Ａ号は、血清または血漿中ではなく、Ｉｌｌｌｌ織
組織自体胞質ゾル分画中におけるＣＥＡのイムノアッセ
イに関する。

「癌、とくに乳癌における予測試論として細胞質ゾル−
ＣＥＡ−測定」と題する欧州特許（ＥＰ）８３１０３７
５９，６号は、欧州特許（ＥＰ）９２２２３−Ａ号に類
似する。

「発癌抗原に対して特異的なモノクローナル抗体類」と
題する欧州特許（ＥＰ）８３３０３７５９号は、１−Ｃ
ＥＡ特異的」モノクひ−ナル抗体類およびイム／アッセ
イにおけるそれらの使用に関する。

「特異的ＣＥＡ−族抗原類、それらに対して特異的な抗
体類およびそれらの使用法」と題するＷＯ３４１０２９
８３号は、ＣＥＡ−／：ｌ二’７Ａ（ＭＡ）−およびＮ
ＣＡ−特異的エビトープに対するモアクローナル抗体類
を、試料中のこれらの個々の成分の各々を選択的に測定
するように案出されたイムノアッセイにおいて使用する
ことに関する。

従来のＣＥＡのアッセイのすべては、選択した無傷の抗
原で動物を免疫化することによって発生したモノクロー
ナル抗体またはポリクローナル抗体のいずれかを利用し
ている。それらのいずれも、種々の抗原の独特の一次配
列を検出するために、配列特異的抗体をつくるという考
えを述べていない。それらは、合成ペプチドまたは天然
の産物の断片に対して抗体を生成するために一次アミノ
酸配列を使用することを包含していない。それらは、Ｃ
ＥＡの族の構成員を区別するために一次アミノ酸配列を
使用するという概念を含まない。

それらのいずれも、−次配列の決定に使用する遺伝子を
分離するために、ＤＮＡまたはＲＮＡのりａ−ンを使用
することを包含していない。

Ａ　　　　７デニン Ｇ　　　　グアニン Ｃシトシン ′ｒ　　　　チミジン Ｕ　　　　ウラシル Ａｓｐ　　　アスパラギン酸 Ａｓｎ　　　アスパラギン ’ｒ’ｈｒ　　　スレオニン Ｓｃｒ　　　セリン Ｇｌｕ　　　グルタミン酸 Ｇｌｎ　　　グルタミン Ｐｒｏ　　　プロリン Ｇｌ、　　　グリシン Ａｌａ　　　アラニン Ｃｙｓ　　　システィン Ｖａｌ　　　バリン Ｍｅｔ　　　メチオニン １１ｅ　　　インロイシン １、ｅｕ　　　ロイシン Ｔｙｒ　　　チロシン Ｐｈｅ　　　フェニルアラニン Ｔｒｐ　　　）リプドアアン １、ｙｓ　　　リジン Ｈｉｓ　　　ヒスチジン Ａｒｇ　　アルギニン ヌクレオチド　−　糖部分（ペントース）、ホスフェー
ト、および窒素の複素環塩基を含有するＤＮＡまたはＲ
Ｎ　Ａのモノマーの単位、塩基は糖部分にグリコシドの
炭素（ペントースの１゛炭ａ）を介して結合しており、
そして塩基と糖との組合せはヌクレオシドと呼ばれる。

塩基はヌクレオチドを特徴づける。４つのＤＮＡ塩基は
アデニン（ｒ　ＡＪ　）　、グアニン（ｒ　ＧＪ　）　
、シトシン（ｆｃＪ）およびチミジン（ＩＴＪ）である
。４つのＲＮＡ塩基はＡ％Ｇ、Ｃおよびウラシル（ｒＵ
Ｊ）である。

ＤＮＡ配列　−隣接ペントース類の３゛および５゛炭素
の間のホスホジエステル結合によって互いに結合するヌ
クレオチドの直線の列。

機能的同等体　−ＤＮＡ配列において、あるヌクレオチ
ドが発現生成物の配列を妨害しないで置換されうろこと
は、この分野においてよく知られている。ペプチドに関
すると、この用語は、特定の使用において機能をもたな
い１または２以上のアミ／ｆｉが欠失されるか、あるい
は他のものと置換されうろことを意味する。

コドン　−　醜ＲＮＡを通してアミノ酸、翻訳開始シグ
ナルまたは翻訳停止シグナルをコードする（　ｅｎｃｏ
ｄｅ）する３つのヌクレオチド（トリプレット）のＤＮ
Ａ配列１例えば、ヌクレオチドのトリフ”Ｌｚッ）　’
Ｉ”ＴＡ、Ｔ′ｒＧ、ＣＴ’ｌ’、ＣＴＣ，ＣＴＡおよ
びＣ’ｒ’　Ｇはアミノ酸のロイシン（ｒ　ＬｅｕＪ　
）についてコードし、七してＴＧＡは翻訳停止シグナル
であり、そしてＡＴＧは翻訳開始シグナルである。

リーディングフレーム　−　アミノ酸配列へのｍＲＮＡ
の翻訳の間のコドンのグループ。翻訳の間、適切なリー
ディングフレームが維持されなくてはならない。例えば
、配列Ｇ　ＣＴＧ　Ｇ　′ｒ　Ｔ　Ｇ　１”ＡＡＧは３
つのリーディング７レームまたは相において翻訳される
ことができ、それらの各々は異なるアミ／Ｉ！２配列 Ｇ　ＴＣＧ　Ｇ　Ｔ１’　Ｇ　Ｔ　　Ａ　Ａ　Ｇ　　　
　Ａ　ｌ　ａ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ Ｇ　　ＣＴＧ　　ＧＴＴ　ＧＴＡ　　ＡＧ　　　　Ｌｅ
ｕ−Ｖａｌ　　Ｖａｔ ＧＣｉ’ＧＧ　　ＴＴＧ　　ＴＡＡ　　Ｇ　　　　ｌ’
ｒｐ−Ｌｅｕ−（停止） を与える。

ポリペプチド　−　隣接アミノ酸類のａ−アミ７基とカ
ルボキシ基との間のペプチド結合によって互い結合した
アミノ酸の直線の列。

ゲ７ム　−　細胞またはウィルスの全ＤＮＡ。

それは、なかでも、細胞またはウィルスのポリペプチド
の遺伝情報を指定する構造遺伝子、ならびにそのオペレ
ーター、プロモーターお上りリポソーム結合および相互
作用配列、例えば、ＳＤ配列（Ｓ　ｈｉｕｅ　−Ｄ　ａ
１ｇａｒｎｏ配列）のような配列、を包含する。

構造遺伝子　−七の鋳型またはメツセンジャーＲＮＡ（
ｒ　１ＲＮＡＪ　）を通し゛ζ特定のポリペプチドの特
徴あるアミノ酸の配列をコードするＤＮＡ配列。

転写　−構造遺伝子からｌｌｌＲＮＡを生成するプロセ
ス。

翻訳　−ｍＲＮＡからポリペプチドを生成するプロセス
。

発現　−ポリペプチドを生成するためにｆＩ＋！逍遺伝
子によってなされるプロセス。それは転写と１１訳との
組み合わせである。

プラスミド　−　プラスミドが宿主細胞中で複製される
ように、無傷の「レプリコン」からなる非染色体二本領
ＤＮＡ配列。プラスミドが単細胞の有機体内に配置され
ると、その有機体の特性はプラスミドのＤＮＡの結果と
して変化または形質転換されうる。例えば、テトラサイ
クリン耐性（１’ｅｔＲ）のための遺伝子を有するプラ
スミドは、テトラサイクリンに対して以随感受性であっ
た細胞をそれに対して抵抗性の細胞に形質転換する。プ
ラスミドによって形質転換された細胞を「形質転換体」
と呼ぶ。

ファージまたはバクテリオファージ　−　バクテリアの
ウィルス、それらの多くは蛋白質のエンベロープまたは
コート）（「カプシド蛋白質」）中に包膜されたＤＮＡ
配列から成る。

クローニングビヒクル（ｃｌｏｎｉｎＨｖｅｈｉｃｌｅ
）−宿主Ｍ胞中で複製することができるプラスミド、７
７−ノＤＮＡまたは他のＤＮＡ配列、これはＤＮＡの本
質的生物学的８！能、例えば、複製、コート蛋白質の生
成を付随して損失しないで、あるいはプロモーターまた
は結合部位を損失しないで、決定可能な方法でこのよう
なりＮＡ配列を切断できる、エンドヌクレアーゼ認：ｌ
＆部位の１つまたは小さい数によって特徴づけられ、そ
して形質転換した細胞の同定において使用するために適
するマーカー、例えば、テトラサイクリン耐性またはア
ンピシリン体制を含有する。クローニングビヒクルはし
ばしばベクターと呼ばれる。

クローニング　−　無性生殖によって１つのこの上うな
有機体または配列から誘導された有機体またはＤＮＡ配
列の集団を得るプロセス。

岨換え体ＤＮＡ分子またはハイブリッドＤＮＡ−生きて
いる細胞の外部で端対端で接合し、そしである宿主細胞
を感染することができかつその中で維持されうる異なる
ゲノムからのＤＮＡのセグメントから成る分子。

発現制御配列　−構造遺伝子へ採作的に結合されたとさ
、ｍ造遺伝子の発現を制御しかつ調節するヌクレオチド
の配列。それらは、Ｉａｃ系、Ｔｒｐ系、７アージλの
主要なオペレーターおよびプロモーターの領域、ｆｄコ
ート蛋白質の制御領域およびそれらのウィルスの原核ま
たは真核細胞の遺伝子の発現を制御することが知られて
いる他の配列を包含する。

形質転換／トランス７エクシツン　−　ＤＮＡまたはＲ
ＮＡを細胞中に導入して遺伝子を発現させることができ
る。ここにおいて使用する［感染した（　１ｎｆｅｃｔ
ｅｄ）　Ｊは、ウィルスのベクターによってＲＮＡまた
はＤＮＡが宿主中に導入されることに関する。ここで使
用する［注入された（ｉｎｊｅｃＬｅｄ）　Ｊは、細胞
中へのＤＮＡのマイクロインジェクシタン（細い注射器
の使用）に関する。

以後述べるＣＥＡ−Ａ％ＣＥＡ−Ｂ、ＣＥＡ−Ｃ，ＣＥ
Ａ−Ｄは、下の実施例において記載するＣＥＡ族の構成
員である。

本発明は、新規な核酸配列、例えば、ＤＮＡまたはＲＮ
Ａ配列に関し、この核酸配列はＣＥＡ配列またはそれと
ハイブリグイゼーション可能な塩基配列（ＲＮＡまたは
ＤＮＡ）を有する核酸の遺伝情報を指定する塩基配列か
らなる。このような核酸は、完全なＣＥＡ遺伝子または
その一部、例えば、イントロン配列、ならびにエクソン
配列からなるゲノムＤＮＡであることができるか、ある
いはＣＥＡ蛋白質の遺伝情報を指定するメツセンジャー
ＲＮ　Ａ　＋：対して相補的であるように構成されたＤ
ＮＡ、すなわち、ｃＤＮＡであることができる。本発明
の核酸は、下に記載するＤＮＡ配列またはその断片、な
らびにそれとパイプリグイゼーション可能な配列からな
る： 配列は位置１から端（位置８６２）を表示する。

配列は位置１から番号を付しである。

完全なＣＥＡ蛋白質の遺伝情報を指定しかつ前述の配列
からなる本発明の核酸は、合計約５０００以下、より通
常的３６００の塩基を有するであろう、上の配列のｃＤ
ＮＡの断片は、少なくとも１０、ある場合において少な
くとも５０の塩基を有するであろう。

８５９塩基の上のＤＮＡ配列は、発現されうるＣＥＡの
免疫反応性断片、例えば、ラムダｇｔ＋１の遺伝情報を
指定する。この配列は、長さがほぼ３００塩基である内
部の反復を有し、そして長さが２８５アミノ酸の理論的
調製の遺伝情報を指定する。このｃＤＮＡは他のヒト遺
伝子中に見出される配列をコードし、そして遺伝子のこ
の金族はＣＥＡ族の蛋白質の遺伝情報を指定することが
できる。

本発明は、また、下に記載する塩基配列またはその断片
、ならびにそれとハイプリグイゼーション可能な配列か
らなる、２８３９塩基灯を有するＤＮＡ配列に関する； Ｉ：＋ｏ曽　（コ　　　　　　　［−口Ｃトー　　　　
　　　←−リ Ｎ　　　←−←　　　　　　　　←− ）＋　　　　（）　　　　トー　　　　　　　　く　　
　　　　　　トーー　　Ｑ貴Ｑ　　　　　＜　　　　　
■−＞　　　＜：　　　　　　ｕ　　　　　（：←　　
　　　Ｉ−Ｎ　　　■　　　　　←＋０　　　！−＜　
　　　　　（Ｊ Ｉ−■曽Ｉ−←く Ｌ）　　　　　　Ｉ−寸舛−ロ ロ　　　　　−　　ト　　く　　　　　０く　　　　　
ヒ　　Ｎ　　ＣＪ　　　　　　＋同様にＣＥＡ族の構成
員である蛋白質の遺伝情報を指定するそれ以上の配列は
、以後に実施例中に示されている。

本発明は、また、核酸、例えば、ＤＮＡからなるインサ
ートを有する複製可能な組換えクローニングビヒクル（
「ベクター」）に関し、この核酸はＣＥＡペプチドの遺
伝情報を指定するを塩基配列またはそれとハイブリグイ
ゼーション可能な塩基配列からなる。

本発明は、また、複製可能な組換えクローニングビヒク
ルまたは前述のｃＤＮＡとハイブリグイゼーション可能
な核酸で形質転換／トランス７ヱクシタン、感染または
注入した細胞に関する。こうして、本発明は、＊た、ク
ローニングビヒクルを使用しないで、遊離の核酸を使用
する細胞のトランスフヱクシうンに関する。

なおさらに、本発明は、前述のトランスフェクション、
感染または注入した細胞によって発現されたポリペプチ
ドに関し、ｉｆ記ポリペプチドはＣＥＡ、ならびに曲記
ポリペプチドの標識された形態と免疫学的交差反応性を
示す。本発明は、また、前述の複製可能な組換えクロー
ニングビヒクルでトランス７エクシ１ン、感染または注
入した細胞の発現生成物のアミノ酸配列、すなわち、合
成ペプチドを有するポリペプチド、ならびに標識された
形態のポリペプチドに関する。換言すると、本発明は、
前述の発現生成物の全アミノ酸配列またはその５以上の
７ミ７＠を有するその一部に相当するアミノ酸配列を有
する合成ペプチドに関する。

本発明は、さらに、前述のポリペプチドに対して特異的
な抗体調製物に関する。

本発明の他の面は、工程 （ａ）試験試料を前述の抗体調製物と接触させ、そして （ｂ）試料中のＣＥＡへ結合する前記抗体調製物を決定
する、 を含んでなる試験試料中のＣＥＡまたは機能的同等体を
検出するイムノアッセイ法に関する。

本発明は、また、工程 （ａ）試験試料を核酸プローブと接触させ、前記プロー
ブは、ＣＥＡペプチド配列またはそれとハイブリグイゼ
ーシタン可能な塩基配列の遺伝情報を指定する塩基配列
からなる核酸からなり、そして （ｂ）得られなハイブリダイゼーションしたプローブの
形成を決定する、 を含んでなる試験試料中のＣＥＡまたは関連する核＠（
ＤＮＡまたはＲＮＡ）を検出する核酸ハイブリグイゼー
ション法に関する。

本発明は、また、工程 ａ）動物またはヒトの患者に、本発明による標ａされた
（例えば、Ｘ＃ｉ、放射［Ｊ識、あるいはＮＭＲで検出
可能な常磁性物質で標識した）抗体調製物を導入し、そ
して ｂ）患者におけるこのような抗体調製の存在を標識の検
出により検出する、 を含んでなる生体内で患者における発癌抗原またはその
機能的同等体の存在を検出する方法に関する。

そしての面において、本発明は、本発明による抗体ｙ４
！ｌ！物を治療的目的に使用すること、すなわち、抗体
ｙ４製物を放射線核種または毒素に取付けて複合体を形
成し、そしてこのような複合体の有効量を動物またはヒ
トの患者に、例えば、注射により、導入すること、に関
する。標識した複合体は患者中のＣＥＡに結合し、そし
て放射線核種または毒素はＣＥＡを発現する細胞を破壊
する役目をするであろう。

いくつかのＣＥＡエピトープは独特である。これらは、
種々のＣＥＡ様抗原を免疫学的に区別するために有用で
あったエピトープである。ペプチドのエピトープは、抗
原の直線のアミノ酸配列および／または蛋白質の７オル
デイング（ｆｏｌｄｉｎｇ）から生ずる面によって定義
される。蛋白質の７オルデイングに要求される情報は、
−次アミノ酸配列中にコードされる。したがって、抗原
の差は、究極的には、異なるＣＥＡ分子の一犬構造にお
ける差から生ずる。こうして、ＣＥｌｆｆｌにおけるＣ
ＥＡ蛋白質中に存在する差は、−次アミノ酸配列の決定
によって決定することができる。これはＣＥ、Ａの遺伝
子の各々なりローユングしかつ配列決定することによっ
て最も容易に達成される。癌の診断にどの遺伝子生成物
が最も有用であるかを決定するために、独特プローブを
各遺伝子のために選択することができ、そして各遺伝子
の発現を異なる腫瘍の型において核酸ハイブリグイゼー
ション技術によって決定することができる。本発明は、
ＣＥＡ族の異なる構成免疫の遺伝情報を指定ｒる潜在的
遺伝子を同定し、そしてそれらのだめの理論的−次アミ
ノ酸配列を決定するために′ｉｒｉ具を提供する。自動
化されたペプチド合成法を使用すると、これらの抗原に
おける独特配列の対応するペプチドを合成できる。これ
らのペプチドを使用して、これらの配列に対する抗体を
生成することができ、これらの抗体は、無傷のＣＥＡ分
子において、免疫化された動物によって認識されること
ができない。これが達成されると、各抗原を測定するた
めの特別のイム７アツセイを発生するために、これらの
抗原の差を利用することができる。

広範な種類の宿主／クローニングビヒクルの机み合わせ
を、本発明に従い調製された二本鎖核酸のクローニング
に使用できる１例えば、有用なりローニングビヒクルは
、次のものから成ることができる：染色体、非染色体お
よび合成のＤＮＡ配列のセグメント、例えば、ＳＶ４０
の種々の既知の誘導体および既知のバクテリアのプラス
ミド、例えば、Ｅ、　ｃｏｌｉからのプラスミド、例え
ば、ｃｏｌＥｌ、ｐｃＲｌ、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ８９
およびそれらの誘導体、より広い宿主範囲のプラスミド
、例えば、ＲＰ４、および７７−ノのＤＮＡ。

例えば、７Ｔ−ノの多数の誘導体、例えば、ＮＭ９８９
、および他のデータ７アーノ、例えば、Ｍ２Ｓおよびフ
イラメンテアス（Ｆ　ｉｌａｍｅｎｔｅｏｕｓ）−本領
ＤＮＡ７アージおよびプラスミドト７ア一ノのＤＮＡと
の組み合わせから誘導されるベクター、例えば、ファー
ジＤＮＡを使用するように修飾されたプラスミドまたは
他の発現制御配列または酵母菌プラスミド、例えば、２
μプラスミドまたはその誘導体。有用な宿主は、次のも
のを包含することができる：バクテリアの宿主、例えば
、Ｅ、ｃｏｌｉ、例えば、Ｅ、ｃｏｌｉ　　ＨＢ　　１
０１、辷ｃｏｌｉ　　Ｘ　１７７６、Ｅ、　　　ｃｏｌ
ｉ　　Ｘ２２８２、Ｅ、　　ｃｏｌｉ　　ＭＲＣｌおよ
びシュードモナス（Ｌ他のＥ：、　　ｃｏｌｉ、バシル
ス、酵母菌および他の菌・カビ類、動物または植物の雑
種、例えば、培養における動物（ヒトを含む）または植
物の細胞または他の宿主。もちろん、すべての宿主／ベ
クターの組み合わせが同等に有効であるというわけでは
ない。宿主／ベクターの組み合わせの特定の選択は、本
発明の範囲を逸脱しないで、記載する原理を正当に考慮
した後、この当業者によってなされることができる。

さらに、各特定のクローニングビヒクルの範囲内で、本
発明による核酸の挿入のために種々の部位を選択するこ
とができる。これらの部位は、通常、それらを切断する
制限エンドヌクレアーゼによって表示される。例えば、
ｐＢＲ３２２において、Ｐｓｔ１部位はベーターラクタ
マーゼのための遺伝子中に、その蛋白質のアミノ酸１８
１およ１１８２の遺伝情報を指定するヌクレオチドのト
リプレットの間に位置する。ｐＢＲ３２２において、２
つのＨｉｎｄｌｌエンドヌクレアーゼ認識部位の１つは
アミノ酸１０１および１０２の遺伝情報を指定するトリ
プレットの開に存在し、そしていくつかのＴａｇｇ位の
１つはベーターラクタマーゼのアミノ酸４５の遺伝情報
を指定釘るトリプレットに存在する。同様な方法におい
て、このプラスミドにおけるＥｃｏＲＩ部位およびＰＶ
Ｕ１１部位はＭ、読領域の外側に存在し、そしてＥｃｏ
ＲＩ部位は、それぞれ、テトラサイクリンおよびアンピ
シリンに対する耐性の遺伝情報を指定する遺伝子の間に
位置する。これらの部位はこの分野においてよく認識さ
れている。もちろん、本発明において有用なりローニン
グビヒクルは、選択したＤＮＡ断片の挿入のための制限
エンドヌクレアーゼ部位を有する必要はないことを理解
ｒべきである。その代わり、ビヒクルを切断し、そして
別の手段により断片に接合することができる。

組換え核酸分子を形成するために選択した核酸断片を取
付けるための、ここにおいて選択したベクターまたはク
ローニングビヒクル、とくに部位は、種々の因子によっ
て決定され、それらの因子の例は、特定の制限酵素に対
して感受性の部位の数、発現すべき蛋白質の大きさ、宿
主細胞の酵素による蛋白質分解的減成に対する所望蛋白
質の感受性、精製の開の除去が困難な宿主細胞蛋白質に
より発現される蛋白質の汚染、発現の特性、例えば、ベ
クター配列の関釘る出発コドンおよび停止コドンの位置
、およびこの分野において認ａされている他の因子であ
る。特定の遺伝子のためのベクターの挿入部位の選択は
、これらの因子のバランスによって決定され、すべての
区画（３ｅｃｔｉｏｎ）が所定の場合に同等に有効であ
るというわけではない。

核酸配列をクローニングビヒクル中に挿入して組換え核
酸分子を形成ｒる方法は、例えば、ｃｌＡ−ｄＴティリ
ング（ｔａｉｌｉｎｇ）　、直接結合、合成すンカー、
エキソヌクレアーゼおよびポリメラーゼ連結イ１復反応
および引続く結合、あるいは適当なポリメラーゼおよび
適当な一本鎖鋳型を使用する核酸の伸張および引続く結
合を包含する。

また、クローニングビヒクルの選択した部位に挿入され
た核酸配列または核酸断片は、所望ポリペプチドまたは
成熟蛋白質のための実際の構造遺伝子の一部ではないヌ
クレオチドを含むことができるか、あるいは所望ポリペ
プチドまたは成熟蛋白質のための完全な補遺遺伝子の断
片のみを含むことができる。

異質遺伝子を含有するクローニングビヒクルまたはベク
ターを使用して適当な宿主を形質転換して、その宿主が
その異質遺伝子を複製できるようにしかつその異質遺伝
子またはその一部によって解読された蛋白質を発現する
ことができる。適当な宿主の選択は、また、ある数のこ
の分野で認識されている因子によって制御される。これ
らは、例えば、選択したベクタベクターとの適合性、へ
ブリッドによってフードされた蛋白質の毒性、所望蛋白
質の回収の容易さ、発現特性、生物安全性およびコスト
を包含する。特定の組換えＤＮＡ分子の発現のためにす
べての宿主が同等に有効でないであろうことを理解して
、これらの因子はバランスされなくてはならない。

蛋白質の生成レベルは、２つの主要な因子によって支配
される：細胞内のその遺伝子のコピーの数およびそれら
の遺伝子のコピーが転写および翻訳される効率。次に、
転写および翻訳（それらは−緒になって発現を構成する
）の効率は、通常所望解読配列より前に位置する、ヌク
レオチド配列に依存する。これらのヌクレオチド配列ま
たは発現制御配列は、なかでも、ＲＮＡポリメラーゼが
相互作用して転写を開始しくプロモーター配列）および
リポソームがωＲＮＡ（転写の生成物）と結合しかつ相
互作用して翻訳を開始する位置を定める。このような発
現制御配列のすべてが同等の効率で機能するわけではな
い。こうして、所望蛋白質のための特異的解読配列をそ
れらの隣接ヌクレオチド配列から分離し、そしてそれら
を他の既知の発現制御配列の代わりに融合して発現のレ
ベルをより高くすることは有利である。これが達成され
ると、新しく操作された核酸、例えば、ＤＮＡ１の断片
は、マルチコピーのプラスミドまたはバクテリオファー
ノの誘導体の中に挿入して、細胞内の遺伝子のコピーの
数を増加し、これによって発現された蛋白質の収率を改
良することができる。

いくつかの発現制御配列を前述にようにして使用できる
。これらは、次のものを包含する：以。

ｃｏｌｉのラクトースオペロン（「Ｉａｃ配列」）のオ
ペレーター、プロモーターおよびリポソームの結合およ
び相互作用の配列（例えば、ＳＤ配列のような配列を包
含する）、Ｅ、ｃｏｉｉのトリプトファンシンターゼ系
の対応する配列Ｃｒ　ｔｒｐ系」）、フγ−ノ人の主要
なオペレーターおよびプロモーター領域（ＯＬＰＬおよ
び０１く）くＲ）、フイラメンテアＸ　（Ｆ　ｉｌａｍ
ｅｎｔｅｏｕｓ）−本ｑ　Ｄ　Ｎ　Ａ　７７−ノの制御
領域、あるいは原核細胞または真核細胞およびそれらの
ツイルスの遺伝子の発現を制御する他の配列。したがっ
て、適当な宿主における特定のポリペプチドの生成を改
良するためには、そのポリペプチドの遺伝情報を指定す
る遺伝子を選択し、そしてそれを含有する組換え核酸分
子から除去し、そして組換え核酸分子の中に、その前者
の発現制御配列の近くにあるいはそれと一層適当な相関
関係で、あるいは前述の発現制御配列に１つの制御の下
に、再挿入することができる。このような方法はこの分
野において知られている。

ここにおいて使用するとき、「相関関係」は、多くの因
子、例えば、次のものを包含ｒる：、１１１換え核酸分
子の発現増大および促進領域および挿入された核酸配列
を分離する距離、ベクター自体における挿入された核酸
配列または他の配列の転写および翻訳の特性、ベクター
の挿入された核酸配列または他の配列の特定のヌクレオ
チド配列、およびベクターの発現増大および促進領域の
特定の特性。

さらに、所望生成物の細胞の収率の増加は、細胞中で利
用できる遺伝子の数の増加に依存する。

例示すると、これは次のようにして達成される。

操作した組換え核酸分子を鋳型のバクテリオ７７一ノ人
（ＮＭ９８９）の中に挿入して、最も簡単にはプラスミ
ドを制限酵素で消化して、線状分子を生成し、次いでこ
れを制限された７ア一ジ人クローニングビヒクル［例え
ば、次の文献に記載されている型のもの、Ｎ、Ｍ、ムレ
イ（Ｍ　ｕｒｒａｙ）ら、［生体外１１換え体の回収を
簡素化するラムドイド７アージ（Ｌ　ａｍｂｄｏｉｄ　
　Ｐ　ｈａｇｅ　　’Ｉ’　ｈａｔ　　Ｓ　１ｎｐｌｉ
ｆｙ　　ｔｈｅ　　Ｒｅｃｏｖｅｒｙ　　ｏｆ　　Ｉｎ
　　Ｖｉｔｒｏ　　ＲＧｅｎｅｔ、　）　、１．５０．
５３−６１ページ（１９７７）およびＮ、Ｅ、ムレイ（
Ｍ　ｕｒｒａｙ）ら、［バクテリオファーノＴ４からの
ＤＮＡす〃−ゼ遺伝子の分子クローニング（Ｍｏ１ｅｃ
ｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｇｏｆｔｈｅ　　ＤＮＡ　　Ｌ
ｉｇａｚｅ　　Ｇｅｎｅ　　Ｆｒｏ＋ａ　　Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｐｈａｇｅ　　Ｔ　４　）　、ジ　−ナルーオプ
ーモレキュラー・バイオロノ−（Ｊ、　　Ｍｏ１．Ｂｉ
ｏｌ、　）、１３２．４９３−５０５ベーノ（１９７９
）］と混合し、七して岨換え体ＤＮＡ分子をＤＮＡす〃
−ゼとのインキュベーションにより再環状化する。

次いで、所望の組換え７アーシを前のように選択し、そ
してＥ、　ｃｏｌｉの宿主金株を溶原化するために使用
する。

とくに有用なλクローニングビヒクルは、抑制遺伝子中
に温度感受性突然変異体および遺伝子Ｓ中に抑制突然変
異体、その生成物は宿主細胞の溶解のために必要である
、およｒＪ遺伝子Ｅ、その生成物はウィルスの主要なカ
プシド蛋白質である、を含有する。この系を用いると、
溶原性細胞を３２℃で生長させ、次いで４５°Ｃに加熱
してブロファーノの切除を誘発する。３７°Ｃにおいて
延長して生長させろと、細胞内に保持される蛋白質の生
産レベルが高くなり、これらは通常の方法で７７−ジ遺
伝子生成物によって溶解されないので、お上り７アーノ
遺伝子のインサートは包膜されないので、それはそれ以
上の転写のためｔこ利用可能にとどまる６次いで、ａＵ
ａの人工的溶解は高い収率で所望生成物を解放する。

さらに、本発明に従って調製されるポリペプチドの収率
は、また、存在するＤＮＡ配列のコドンの一部または全
部を異なるコドンで置換することによって改良すること
ができ、これらの置換されたコドンは置き代えられたコ
ドンによって遺伝管報を指定されるものと同一のアミノ
酸の遺伝情報を指定する。

最後に、本発明の組換え核酸分子によって生成されたポ
リペプチドの活性は、本発明の範囲がら逸脱しないで、
よく知られた手段によって、本発明の核酸配列またはポ
リペプチドを断片化、修飾または誘導体化することによ
って改良することができる。

本発明のポリペプチドは、次のものを包含する（　１）
前述の細胞によって発現されたポリペプチド、 （２）合成手段によって′８４製されたポリペプチド、 （３）上の（１）または（２）のポリペプチドの断片、
このような断片はアミノ酸の合成により、あるいは消化
または切断によって生成される。

本発明による合成ペプチドに関すると、ペプチドの化学
的合成は次の刊行物に記″Ｒされている：ルドバーグ（
Ｇｏｌｄｂｃｒｇ）　、　Ｅ、Ｐ、およびナカジマ、Ａ
、［（アカデミツク・〕゛レレスューヨーク）、２１３
−２４２（１９８０）；　Ａ、Ｒ。

ミッチェル（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ）　、Ｓ、　１３．　Ｈ
，ケント（Ｋｅｎｔ）　、Ｍ、　エングルハード（Ｅ　
ｎｇｃｌｈａｒｄ）およびＲ，Ｂ、　メリフィールド（
Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）、ジャーナル・オブ・オーガニ
ック・ケミストリー（Ｊ、　　　Ｏｒ、　　　Ｃｈｅｍ
、）、４３，２８４５−２８５２（１９７８）；　　Ｊ
、Ｐ、　タム（Ｔａｍ）、Ｔ、−Ｗ、ウォング（Ｗｏｅ
）　、Ｍ、　　リーマン（Ｒｉｅｍａｎ）　、　Ｆ、−
Ｓ、ジョング（Ｔ　ｊｏｅｎｇ）およびＲ，Ｂ、メリフ
ィールド（Ｍｅｒｒｉｒｉｅｌｄ）、テトラヘドロン・
レターズ（１蛙ニーＬｅｔ、　）、４０３３−４０３６
、（１９７９）；　Ｓ、モジツブ（Ｍｊｓｏｖ）　、Ａ
、　Ｒ，ミッチェル（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ）およびＲ，Ｂ
、メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）、ジャーナ
ル・オブ・オーガニック・ケミストリー（止ユーヌと」
ニー］Ｊヱち−）、±５，５５０−５６０（１９８０）
；　　Ｊ、Ｐ、　タム（′Ｉ’ａｍ）　、Ｒ。

Ｄ、ジマーチ（ＤｉＭａｒｅｈｉ）およびＲ，Ｂ、メリ
フィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）　、テトラヘドロ
ン番しターズ（Ｔｅｔ、　　Ｌｅｔ、　＞、２８５１−
２８５４、（１９８１）；　ｉ３よｔｌＳ、Ｂ、Ｉ（ａ
ケン）（Ｋｃｎｔ）　、Ｍ、　　リーメン（Ｒｉｃｍｅ
ｎ）　、　Ｍ、デ゛ドウクス（Ｄｅ　　Ｄｏｕｘ）　ｊ
；よ（７Ｒ，Ｂ、　　メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉ
ｅｌｄ）　、蛋白質配列の分析法についての第ＩＶ回国
際シンポジウムの会議録（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　　
　ｏｆ　　　ｔｂｅ　　　Ｉ　　Ｖ　　　Ｉ　ｏｔｅｒ
ｎａＬｉｏｎａｌＳｙｍｐｓｉｕｌｌｌｏｎ　　Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ　　ｏｆ　　Ｐｒｏｔｅｉｎ　　５ｅｑｕｅｎ
ｃｅ　　Ａ　ｎａｌｙｓｉｓ）　、（プルックヘブン令
プレス、フルックヘブン、ニューヨーク）、イン・プレ
ス、１９８１゜ メリーフィールド（Ｍｅｒｉｆｉｅｌｄ）の固相手順に
おいて、Ｌ−アミノ酸の適当な配列はカルボキン末端ア
ミノ酸からアミノ末端アミノｌ！［ｌｉこ構成される。

樹脂のクロロメチル基、ベンズヒトＩ７７レアミン基ま
たは他の基への化学結合を介してボＩＪスチレン（また
は他の適当な）樹脂へ取付けられた適当なカルボキシル
末端アミノ酸を使用して出発して、アミノ酸を次の手順
に従−１順番に付加する６ベプチドー樹脂を、 （ａ）　　塩化メチレンで洗浄し、 （ｂ）　　塩化メチレン中の５％（Ｖ／Ｖ）ジイソプロ
ピフレエチルアミン（または他のヒンダード塩基）で室
温にお−１で１０分間中和し、 （ｃ）　　塩化メチレンで洗浄し、 （ｄ）　　生長するペプチド鎖のモル量の６倍【二等し
い量のアミノ酸を、モル数の１７ ２倍の量のカーポジイミド（例えば、 ジシクロペキンルカーボンイミド、ま たはジイソピルカーポジイミド］と１ ０分間θ℃において組み合わせること によって活性化して、アミノ酸の対称 無水物を形成する。使用するアミノ酸 は、本末、Ｎ−フル７アーｔｅｒｔ−ブチルオキシカル
ボニル誘導体として提供 されるべきであり、側鎖は、ペプチド 合成において普通に使用される、ベン ノルエステル（例えば、アスパラギン 酸またはグルタミン酸）、ベンジルエ ーテル（例えば、セリン、スレオニン、システィンまた
はチロシン）、ペンノ ルオキシカルボニル基（例えば、リジ ン）または他の保護基で保護されてお ワ、 （ｃ）　　活性化アミノ酸をペプチド−樹脂と２時間室
温において反応させ、新しいア ミノ酸を生長するペプチド鎖の末端に 付加させ、 （ｆ）　　ペプチド−８（脂を塩化メチレンで洗浄し、 （８）Ｎ−アルファー（Ｌｅｒｔ−ブチルオキシカルボ
ニル）基を、最も最近付加され たアミノ酸から、塩化メチレン中の３ ０〜６５％（ｖ／ｖ）　、好ましくは５０％（ｖ／ｖ）
の）１Ｊフルオロ酢酸と室温において１０〜３０分間反
応させるこ とによって除去し、 （ｉｉ）　　ペプチド−樹脂を塩化メチレンで洗浄し、 （ｉ）　　要求するペプチド配列が構成されてしまうま
で、工程（ａ）〜（ｈ）を反復 する。

次いでペプチドを１ｆｆ（１ｆＩｔから除去し、そして
同時に、１０％ｖ／ｖの７ニソールまたは他の適当な（
芳香族）スキャベンジャ−を含有する無水７フ化水素酸
との反応によって、側鎖の保護基を除去する。

引続いて、ペプチドをデル濾過、イオン交換、高圧液体
クロマトグラフィー、または他の適当な手段によって精
製ｒる。

ある場合において、化学的合成は固相１１　Ｉｔを用い
ないで実施することができ、この場合におし１−乙合成
反応は完全に溶液中で実施される。反応はこの分野にお
いて同様でありかつよ（知られており、そして最終生成
物は本質的に同一である。

ポリペプチドの消化は、蛋白質分Ｍ酵索、ことにその基
質の特異性がアミノ酸の所望配列にすぐに隣接する部位
においてポリペプチドを切断する酵素を使用することに
よって達成できる。

ポリペプチドの切断（ｃｌｅａｖａｇｅ）は化学的手段
によって達成できる。アミノ酸量の特定の結合は、特異
的試薬との反応によって切断できる。実施例は次のもの
を包合する：メチオニンを含む結合は臭化シアンによっ
て切断される；アスパラギニル−グリジン結合はヒドロ
キシルアミンによって切断される。

合成ペプチド類およびそれらに対する抗体をつくる目的
に対して重要であると信じられる配列の非制限的列挙は
、次の通りである。各抗原は３つのレベルにカテゴリー
化される：　１）内部に潜在的に有用な部位を含有する
大さい領域；２）１のサブ領域および；　３）合成ペプ
チド抗原としての使用するためのプライムターデッドで
あると考えられる個々の部位。

大きさの カテゴリ ー（上を　残基からの　残基への ｊ−斐訓ニー−アミノ酸　　アミノ酸 ＣＥＡ　　　　　　　　１　　　　　　　１３５　　　
　　３８６２　０　８　　　　　　２　１　　Ｇ ＦＬ−５１１３５３８６ （卜’Ｌ−５４１１４９２ についての ＢＴ２０　　　　１　　　　　　　１３５　　　　　　
２８５本発明は次の利点を有する： （１）本発明によるＣＥＡの遺伝情報を指定する核酸は
、その一部分である完全な遺伝子を分離するためにプロ
ーブとして使用できる。

（２）それはＣＥＡ遺伝子族の他の構成員を分離するた
めのプローブとして使用できる。

（３）それは種々の腫瘍の型におけるこの遺伝子の発現
を決定するためにオリゴヌクレオチドプローブとして使
用できる。

（４）このヌクレオチド配列は、合成ペプチドの生成の
ための蛋白質の一次アミノ酸配列を予測するために使用
することができ、そしてＣＥＡ族の構成員を区別するた
めに使用できる。

（５）上の配列から誘導された合成ペプチドは、配列特
異的抗体を生成するだに使用できる。

（６）ＣＥＡ族の各構成員についてのイムノアッセイは
、これらの配列特異的抗体および合成特異的ペプチドを
用いて生成することができる。

（７）ＣＥＡ族の異なる構成員が異なる型の癌のための
臨床的に有用なマーカーであることが決定された場合、
これらのイム／アッセイは異なる型の癌のための診断に
使用できる。

本発明によるポリペプチドは、慣用の手段により、放射
１線部分、例えば、工１２５、酵素、色素および蛍光性
化合物を使用するで標識することができ、これらの標識
は単なる例である。

本発明によるイムノアッセイのためにいくつくの可能な
立体的配置を使用できる。これらのアッセにおいて使用
できる読出し系は多数存在し、そしてこのような系の非
制限的例は、蛍光性および比色の酵素系、ラジオアイソ
トープ標識および誘導体および化学ルミネセンス系を包
含する。イム／アッセイ法の２つの例は、次の通りであ
る：（１）　本発明による抗体調製物（それらから誘導
されｒ：、ＦａｂまたはＩ”（ｎｂ）　’断片を含む）
を使用する酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）　、
同相（例えば、マイクロタイター板またはラテックス のビーズ）に、酵素に接合するもの以 外の特異的をもつ精製された抗ＣＥＡ 抗体を取付ける。この固相抗体をＣＥ Ａを含有する試料と接触させる。洗浄 後、固相抗体−ＣＥＡ複介複合体接合 した抗ペプチド抗体（または接合した 断片）と接触させる。結合しない接合 体を洗浄除去した後、酵素のための発 色性または蛍光発生性の基質を添加す ることによって、色または蛍光を発生 させる。発生した色または蛍光は、試 料中のＣＥＡの量に比例する。

（２）　蛍光的に楳ａされたペプチドまたはｃＬＶ７に
よって特定化された配列の 合成ペプチドを使用する競合蛍光測定 イム／アッセイ。この実施例において、細胞によって発
現された精製されたペ プチドまたはその合成ペプチドを蛍光 的に標識する。同相に、精製された抗 ＣＥＡ抗体を取付ける。次いで、蛍光 性ペプチドプローブが添加されている ＣＥＡ含有試料とこの固相を接触させ る。結合後、過剰のプローブを洗浄除 去し、結合したプローブの量を定量す る。結合した蛍光性プローブの量は、 試料中のＣＥＡの量に対して反比例す る。

本発明による核酸ハイブリグイゼーンヨン法において、
核酸プローブを標識、例えば、酵素、蛍光団、ラジオア
イソトープ、化学ルミネセント化合物などと接合する。

最も一般的場合において、プローブを試料と接触させ、
そしてハイブリグイゼーション可能な核酸配列の存在は
、発色性酵素基質の存在下に発色させ、蛍光をエビフル
オレセンス（ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）により
検出するこにより、ラジオ７オソトープで楳ｎされたプ
ローブのオートラノオグラフイーにより、または化学ル
ミネセンスにより検出することができる。ハイブリダイ
ゼーション可能なＲＮＡ配列の検出は、（１）ドツトプ
ロット法または（２）正常部位（込紅阻）ハイプリグイ
ゼーシシン法によって達成することができる。これらの
最後の２つの技術についての方法は、それぞれ、次の文
献に記載されている：Ｄ、ギレスビー（Ｇ　１ｌｌｅｓ
ｐｉｅ）およびＪ、ブレッサー（Ｂｒｅｓｓａｒ）　、
　［ＮａＩ中のＤＩＲＮＡの固定化（ｍＲＮＡ　　Ｉｍ
ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ　　ｉｎ　　ＮａＩ）：クイ
ック・プ０７ツ（Ｑｕｉｃｋ　　Ｂｌｏｔｓ）　Ｊ　、
ｓ４ｔテ９：−−クス（Ｂｉ虹且０ユｉ工ａｓ）、１８
４１９２．１１月／１２月、１９８３お上りＪ、ロウレ
ンス（Ｌ　ａｗｒｅｎｃｅ）およびＲ，シンＩｆ−（Ｓ
ｉｎｇｅｒ）　、ｌ−サイトスケタル蛋白質についての
メツセンジャー　ＲＮ　Ａ類の細胞内局在化（Ｉ　ｎＬ
ｒｎｃｅｌｌｕｒｎｒ　　Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ　
　ｏｆ　　Ｍｅ！１ｓｅｎｇｅｒ　　ＲＮＡ５ｆｏｒ　
　Ｃｙｔｏｓｋｅｔａｌ　　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）　Ｊ　
、ＭＩｌｔ’＆（Ｃａｌ↓）、±１．４０７　４１５．
５ハ９日、１９８６゜読出し系は前述のものと同一であ
り、例えば、酵素標識、放射ｌｌ！標識などである。

前述のように、本発明は、また、本発明の前述の複合体
の薬物中の使用に関する。

本発明は、活性成分として、本発明の複合体を固体、液
体または液化ガスの希釈剤と混合して含有する製薬学的
組成物を提供する。

本発明は、さらに、活性成分として、本発明の複合体を
含有する、無菌および／または薬理学的に等張の水溶液
の形態の製薬学的組成物を提供する。

本発明は、また、本発明の複合体を含んでなる投与単位
の形態の薬物を提供する。

本発明は、また、本発明の複合体を含んでなる錠剤（ロ
ゼンノおよび顆粒を包含する）、糖剤、カプセル剤、カ
ブレット、ピル、アンプルおよび生薬の形態の薬物を提
供する。

「薬物」は、ここで使用するとき、医学的投与に適する
物理的に離散した、凝集性の部分を意味する。［投与単
位形態の薬物］は、ここで使用するとき、各々が本発明
の化合物の１日量または１日量の多数倍または酌量を担
体と一緒におよゾ／またはエンベロープ内に包装し゛Ｃ
合含有る、医学的投与に適する物理的に離散した凝集性
の部分を意味する６ 本発明による製薬学的組成物は、例えば、水性または非
水性の希釈剤中の懸濁液、溶液または乳濁液、シロップ
、顆粒または粉末の形態を取ることができる。

錠剤、糖剤、カプセル剤、カブレットおよびピルに形成
するために適合する製薬学的組成物（例えば、顆粒）中
に使用する希釈剤は、次のものを包含する＝（ａ）充填
剤および増量剤、（ｂ）結合剤、（ｅ）湿潤剤、（ｄ）
崩壊剤、（ｅ）溶解遅延剤、（ｆ）収着促進剤、（ｇ）
表面活性剤、（ｈ）吸着性担体、（ｉ）潤滑剤。

本発明の製薬学的組成物から形成される錠剤、糖剤、カ
プセル剤、カブレットおよびピルは、慣用の被膜、エン
ベロープおよび保護マトリックスを有することができ、
これらは不透明化剤を含有することができる。それらは
、活性成分を腸管のみに、あるいは、好ましくはその特
定の部分に、可能ならばある期間にわたって、放出する
ように構成することができる。

活性成分は、また、前述の希釈剤の１種または数種と一
緒にマイクロカプセルの形態に構成することができる。

非経口的投与のために、溶液および乳濁液は無菌であり
、そして、適当ならば、血８！等張性であるべきである
。

本発明の複合体に加えて、本発明による製薬学的組成物
および薬物は、また、そしての製薬学的に活性な化合物
を含有することができる。

本発明の薬物を構成する離散した凝集性の部分は、一般
に、それらの形状または包装のおかげで、医学的投与に
適合し、そして、例えば、次のいずれであることもでき
る二錠剤（ロゼンノおよび顆粒を包含する）、ピル、糖
剤、カプセル剤、カブレット、生薬およびアンプル。こ
れらの形態のあるものは、活性成分の遅延した放出のた
めに構成することができる。ある、このようなカプセル
剤は、薬物の一部分を物理的にＷ＆敗しか−）凝集性と
する保護的エンベロープを含むことができる。

前述の製薬学的組成物および薬物の調製は、この分野に
おいて知られた任意の方法により、例えば、活性成分を
希釈剤と混合して製薬学的組成物（例えば、顆粒）を形
成し、次いでこの組成物を薬物（例えば、錠剤）に形成
することによって実施される。

活性複合体は、経口的に、非経口的に（例えば、筋肉内
に、腹腔内に、皮下に、あるいは静脈内に）、経直腸的
にまたは局所的に投与することが４乏られる。

腫瘍メツセンツヤ−ＲＮＡを、Ｊ、７アボラロ（Ｆａｖ
ｏｌａｒｏ）　、Ｅ、　　）レイスマン（ＴｒｅｉＳ＋
ａａｎ）６５−１７１８、アカデミツク・プレス・イン
コーホレーテッド（１９８０）のプロイテナーゼに一フ
ェノール抽出法によって調製し、次いでオリゴｄＴセル
ロースクロマトグラフィーによってポリＡ＋ＲＮＡ（ポ
リペプチドに翻訳でさるほとんどの０ＩＲＮＡを含有す
る３゛−ポリアデニル化真植生物ＲＮＡ）を生成した。

はぼ１．２ａ＋ＨのポリＡ　＋　ＲＮ　Ａを得るために
、後期の対数生長後、はぼ５Ｘ１０’のロボ（１，ｏｖ
ｏ）　細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ　　２２９）　を１００Ｘ
８５０ｃ＋ａ１のローラーびんから収穫した。細胞を１
４０ミリモルのＮａＣｌ、１．５ミリモルのＭｇＣ＋２
．１０ミリモルのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８，０，５％の
ＮＰ４０．４ミリモルのクチオスレイトールおよび２０
単位／艶１の胎盤リボヌクレアーゼ阻害剤の水***液中
の均質化によって溶解した。次いで、ナトリウムデオキ
シコレートを０．２％に添加した。細胞質および核は、
ホモジネートを１２　＊　０００　Ｘｇにおいて２０分
間遠６ｒることによって分離した。！ｓ１．２５ミリモ
ルのＥＤＴＡｌ　０．３ミリモルｎ。

ＮａＣＬ　　２％のドデシル硫酸ナトリウムおよび４０
０μｍ／１１のプロイテナーゼにと混合し、１時間３７
℃でインキュベーションし、次いで等体積のエタノール
／クロロホルム（１：　　１／ｖ：　ｖ）　溶液で１回
抽出した。核酸は分離した水相のエタノール沈殿により
得た。合計のＲＮＡは、ポリＡ十ＲＮＡにライて、０．
５モルのＮａＣｌ、１０ミリモルのトリス−ＨＣｌ、ｐ
Ｈ７，８，０，１％のサルコシル中でオリゴｄＴ（１２
−１８）セルロースカラムに通過させることによって濃
縮した。洗浄後、結合したＲ　Ｎ　Ａを、塩化ナトリウ
ムの不存在下に同一溶液で溶離した。

５μＨのポリＡ十Ｌｏｖｏ　　ＲＮＡを、オリゴｄＴ（
１２−１８）で逆転写についてプライミングした。５０
μｍの反応を９０分間４２℃において７５単位のＡＭＶ
逆トランスクリプターゼ（ライフ・サイエンシズ・イン
コーホレーテッド、米国７０リグ州、セントベテルスバ
ーグ）を使用して実施した。ＲＮＡをアルカリ性加水分
解により除去し、そして−本領ｃＤＮＡを、それぞれ、
ＤＮＡポリポリーゼＩおよゾｒ４ＤＮＡポリメラーゼの
大きい断片（フレ／−）とともにインキュベーションす
ることによって一本鎖および平滑末Ｇｉｆｔ（ｂｌｕｎ
ｔｅｎｄ　）とした。

合成ＥｃｏＲＩ　　ＤＮＡリンカ−（５’９ＧＧＡＡＴ
ＴＣＣ３’）を、実施例に記載するようにして６！４製
したｃＤＮＡの末端に、過剰の”ｒ’　４　ＤＮＡす〃
−ゼ［２０ウエイス（Ｗｅｉｓｓ）単位１との平滑末端
結合によって取付けた。過剰のリンカ−を［セ７アデッ
９：Ｘ、ｃ　５ＥＰＨＡＤＥＸ）Ｊ　Ｇ−５０のゲル透
過クロマトグラフィーによって除去し、ＥｃｏＲＩ制限
酵素による切断およびＡ１５１１１（バイオラド、ラボ
ラトリーズ、米国カリフォルニア州すッチモンド）の７
〃ロース排除クロマトグラフイーによる分画によって、
ＥｃｏＲＩＰｉ着末ｉ（５ｔｉｋｙ　　ｅｎｄ）を発生
させた。５ｏｏｂ、より大きいＤＮＡ断片を、アガロー
スゲルの大きさ分類後に、選択し、９５％のエタノール
で沈殿させた。ＤＮＡを小さい体積の１０ミリモルのト
リス−ＭＣＩ、ｐＨ７，８，１ミリモルのＥＤＴＡ中に
再恩濁し、そして等モル量のラムダｇｔ１１の５１ホス
７Ｔターゼ化ＥｃｏＲＩ＊ｉアーム（プロメガ・バイオ
チク、米国ウィスコンシン州マディソン）に添加した。

この７７−ノは有利な性質をもち、ラムダｇＨ１のＥｃ
ｏＲＩ部位に挿入された異質ＤＮＡはベーター〃ラクト
シグーゼ融合蛋白質の一部として翻訳され、これはＣＥ
　Ａ　Ｉ：対する抗体との免疫反応性についてスクリー
ニングすることができる。ＤＮＡをＴ４ＤＮＡすγ−ゼ
の存在下に１００−２００μ！／ａｌｌの濃度において
２４時間結合した。３μｍの結合したＤＮＡを生体外ラ
ムグパケーノングを昆合物（ｐａｃｋａｇｉｎｇ　　ｍ
１ｘ）　（ストラタノーン、米国カリ７オルニア州サン
テ°イエゴ）に添加し、そしてパーケーシングされた粒
子を旦ｌＣｏ１１宿主ｙ１０８８（ＡＴＣＣ２７１９５
）の感染によって７ツセイした。４００万の７アーノの
うちで、１２０万はｃＤＮＡインサートを有することが
ベーターガラクトシダーゼの相補性によって決定された
。

５万の７７−ノを、Ｅ、ｃｏｌｉＹ１０９０（ＡＴＣＣ
３７１９７）上で、１０　ミ１７−［＝／Ｌ）Ｍ、ＳＯ
，および１００μｇ、’ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ
−ブロスを含有する１２枚の１５０ｍ＋＊の皿の各々に
おいてスクリーニングのために配置した。ある場合にお
いて、７アーノのストック（５ｔａｃｋ）は、スクリー
ニング萌に、増幅および力価決定（ｔｉｔｅｒｉＢ）に
よって調製した。７アーノを４２°Ｃで４時間溶解的に
生長させ、次いで１０ミリモルのＩＰ′ｒＧ（イソプロ
ピルチオガラクトシド）で含浸したニトロセルロースの
円形体を皿の上の配置し、そして３７°Ｃでさらに２時
間インキュベーションした。この期間の間、融合蛋白質
の合成は誘発され、そしてニトロセルロースのマトリッ
クスへ吸収された蛋白質を変性ＥＬＩＳＡ７オーマツト
１こおいてスクリーニングした。出願人のライブラリー
において、あるＬ　ｏｖｏ蛋白質はＣＥＡまたはＣＥＡ
関連エピトープの一部分を発現することができ、この部
分は適当な抗体によって認識することができる。出願人
は、自然のＣＥＡ（１８０ｋｄ）に対して向けられた商
業的に入手可能な抗血清および還元しかつアルキル化さ
れたＣＥＡに対して会社内で調ｇＪ１された抗血清を利
用して、フィルター上で抗原を検出した。これらのウサ
ギのポリクローナル抗血清をＰＢＳ／Ｔ（０，０５％の
「ツイーン−２０」および０．０１％のチメロサルを含
有するリン酸塩緩衝化食塩水（５０ミリモルのＮａリン
酸塩、ｐＨ７，３，１５０ミリモルのＮａＣ１））中で
希釈し、そして２時間インキュベーションしてニトロセ
ルロースの円形体へ付着する蛋白質を認識できるように
した。

過剰の抗体を除去し、そして融合蛋白質へ結合したウサ
ギＩｇＧ分子を、アルカリ性ホス７７ターゼと接合した
マウス抗つサギＩｇＧ抗体によって検出した。５−ブロ
モ−４−クロロ−３−インドリルホス７ヱートおよびニ
トロブルーテトラゾリウムの存在下に、色を検出した。

暗色に着色するプラークの像をマークし、そして潜在的
な陽性の区域の回復についてマスター７７−ノ平板で検
索（ｋｅｙ）　した。反復した希釈、免疫プロッティン
グによるスクリーニングおよびアッセイの増幅後に、抗
ＣＥＡ反応性ペプチドを発現しつづけるファーゾを使用
してＤＮＡを調製した。

Ｔ、ｖニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）　、Ｅ、ド、フイ
ツリトシ（Ｆ　ｒｉｔｓｃｈ）およびＪ、サムブルーク
（ＳＡ　　Ｌａｂ虹工ゆ」−」（１ユ吠住）、コールド
・スプリング・ハーバ−１（１９８２）に従い、７アー
ノＤＮＡを調製した。ＤＮＡのセグメントを低融点のア
がロースデルから分離し、そしてブルースクライブ（Ｂ
　１ｕｅｓｃｒｉｂｅ）プラスミドベクター（ストラト
ギーン、米国力’Ｊ　７オルニア州サンデイエゴ）中の
サブタローニゲのために挿入した。ＤＮＡの配列決定は
、Ｆ、サンＮ−（Ｓａｎｇｅｒ）　、Ｓ。

ニツクレン（Ｎ　１ｃｋｌｃｎ）およびＡ、Ｒ，クール
ソン（Ｃｏｕｌｓｏｎ）　、プロシーディンゲス・オブ
・す７４．５４６３−５４６７、（１９７７）のジデオ
キシ停止法によって実施した。

ラムダｃＬＶ７をＥ、　　ｃｏｌｉＹ１０８９中におい
て２０分間イソプロとルチオ〃ラクトシトで誘発し、そ
して３７°Ｃにおいて１時間生長させた。

細胞を５分間ベックマン・マイクロ７−ノ（Ｂ　ｅｃｋ
ｍａｎ　　Ｍ　ｉｃｒｏｆｕｇｅ）中で室温において遠
心した。細胞をもとの体積の１％で、１０μｇ／１１の
ロイペプチンおよびペプスタチン、１０ミリモルのＥＤ
ＴＡ、１　ミリモルのフェニルメチルスルホニルフルオ
リドおよび０．０１％のチメロサルを含有する５０モル
のトリス−ＨＣＬ　ｐＨ７，５、中に懸濁させた。細胞
を一８０℃で凍結し、融解し、そして０°Ｃで６分間超
音波処理した。超音波処理した懸濁液を遠心し、そして
上澄みの流体を酵素結合イムノアッセイによ’）ＣＥＡ
免疫反応性についてアッセイした。リンプロ（Ｌｉｎｂ
ｒｏ）　９６ウエルのマイクロタイタープレートを、４
００ｎＨのマウスのモノクローナル抗ベータガラクトシ
ダーゼ抗体で４℃において一夜被覆した。結合しない抗
体を洗浄除去し、そしてプレートをｌ）　Ｂ　Ｓ／’Ｉ
’（０，０５％の「ツイーン−２０」および０゜０１％
のチメロサルを含有するリン酸塩緩衝化食塩水（５０ミ
リモルのＮａリン酸塩、ｐＨ７，３，１５０ミリモルの
ＮａＣ１））で室温において３時間ブロッキングした。

超音波処理した細胞からの上澄みをＰＢＳ／’ｒ中で希
釈し、そして１００μｌの希釈した抗原を抗体液ｙσフ
ェルに添加した。室温において２時間インキュベーショ
ンした後、結合しない抗原を洗浄除去し、そして希釈し
たウサギ抗ＣＥＡ抗体をｉｏｏμｍのＰＢＳ／Ｔ中にお
いて添加した。次いで、プレートを２時間室温において
インキュベージタンした。洗浄後、各ウェルにＰＢＳ／
Ｔ中のヤギ抗ウサギＩｇＧからの１００μｍのセイヨウ
ワサビペルオキシグーゼ接合Ｉｇを添加した。室温にお
いて２時間インキュベージランした後、ウェルを洗浄し
、そしてベルオキシサーゼの基質（３，３，５，５’−
テトラメチルベンツクンおよび過酸化水素）５分間添加
した。、５０μＩの８モルの硫酸の添加により、発色反
応を停止した。４５０ｎｍの吸収を各ウェルについて決
定した。第２図の四角形（ｏｐｅｎ　　５ｑｕａｒｅ）
は、前述のような融合蛋白質抗原を加えたウェルを表わ
す。十のデータ点は、上のように処理したが、希釈した
融合蛋白質抗原の代わりに１００μｌのＰＢＳ／Ｔを加
えたウェルを表わす６融合蛋白質を含有するＥ、　　ｃ
ｏｌｉＹ１０Ｂ９リゼイトを、Ｕ、に、　　ラエムリ（
ＬａｅＩｇｍｌｉ）　、＋４−チ＋−（Ｎａｔｕｒｅ）
　、２２７．６８０−６８５（１９７０）の方法に従い
５ＤＳ−ＰＡＧＥ上に展開した。１０％のアクリル７ミ
ドデル上の電気泳動後、蛋白質は電気泳動的にニトロセ
ルロースへ移行した。移行後、フイターをＰＢＳ／Ｔ中
でブロッキングした。免疫プロットを、ウサギ抗ＣＥＡ
および、ヤギ抗ウサギＩｇＧからのセイヨウワサビペル
オキシグーゼ接合ＩｇＧを使用する順次のインキュベー
ジタンによって展開した。洗浄後、移行体を４−クロロ
−１−す７トールとともにインキュベージタンして帯を
可視化した。第３図におけるレーン１は対照、すなわち
、７アーノを含まないＥ、　　ｃｏｌｉリゼイドである
。第３図におけるレーン２はラムグｃＬＶ７融合蛋白質
を含有するリゼイトである。第３図の左側の番号は、蛋
白質の標準の移動度および分子量（キログルトン）を示
す、第３図の右側の番号は、ラムグＬＶ７融合蛋白質（
上のしるし）およびＥ、　　ｅｏｌｉベーター〃ラクト
シグーゼサブユニット（下のしるし）の計ヰした分子量
および移動度を示す。

細胞質のボ１７　Ａ　＋　ＲＮ　Ａを、Ｌ　ｏｖｏ腫瘍
細胞からおよびリンパ芽球様系統ＧＭ１９８９（対照の
細胞系）から調製した６５μｇの各ＲＮ　Ａを変性し、
そして１％の７〃ロース−２，２モルのホルムアルデヒ
ドのゲル中で電気泳動させ、次いでニトロセルロース紙
に移した。次いで、移したプツトを２ＸＳＳＰＥ１５Ｘ
デンハルト、５０／ＪＨ／Ｉａ１の変性サケ***ＤＮＡ
中においで６８゛Ｃで１８時間のわたって、）２Ｐ放射
ＭＡｃＬＶ７ＤＮＡと月抗させた。プロットを０．２Ｘ
ＳＳＰＥ、０．２５％のＳＤＳ中で６８°Ｃにおいて２
時間洗浄し、次いでｒ　ＫＯＤＡＫＪ　Ｘ−ＡＲフィル
ム上で２枚の増強スクリーンを使用してオートラノオグ
ラフイーにかけた。ＲＮ　Ａの大きさマーカー（ＢＲＬ
インコーボレーテッド、米国マリイランド州〃イサース
バーグ）をアガロースデルの隣接ウェル中で同時に電気
泳動し、そして０．０４％のメチレンブルーで着色する
ことによって可視化した。

１胆 Ｌｏｖｏ　　ｅＤＮＡ分子から独立に誘導し、ラムグｇ
ｔ１１発現ベクター系中に挿入されかつ抗ＣＥＡ免疫反
応性についてポリペプチドしてスクリーニングしたほぼ
１００万のうちで、２つの陽性のクローンを分離した。

インサートをブルースクライプ（十）プラスミドクロー
ニゲベクターのＥｃｏＲ１部位中にサブクローニゲし、
そしてこれらの１つ、Ｉ）ＣＬＶ７と表示する、をさら
に分析した。ｐＣＬＶ７を含有するＥｓｃｂｃｒｉｃｈ
ｉａ　　ｃｏｌｉ中のプラスミド、ＡＴＣＣＮｏ、６７
１６９は、１９８６年７月３０日１こアメリカン・タイ
プ・カルチャー１フレクシヨン（Ａｉｏｃｒｉｃａｎ　
　Ｔｙｐｅ　　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）
　（ｒ　ＡＴＣＣＪ　）に受託された。

ＤＮＡ配列の分析により、このクローンのインサートの
大きさは８５９ｂｐであり、そしてその配列は第１図に
示されている。上の線はｐｃＬＶ７のオープンリーディ
ングフレームのヌクレオチド配列を表わす。その下は、
それの遺伝情報を指定するペプチド配列である。ここに
おけるｃＤＮＡクローンを表示するために使用する一般
用語はｃＬＶ７またはＬＶ７である。この用語に付加す
るとき、接頭文字ラムグーまたはｐ−は、このクローン
が、それぞれ、ラムダ７アーノまたはプラスミドの中に
挿入されたことを意味する。

衷１ｊ」− 尺ざＪり生乳層− ＬＶ７　　ｃＤＮＡについての実施例１の手順と同一の
手順を、ＩＬＶ７　　ｃＤＮＡについて従う。

５０μｇのポリＡ＋ＲＮＡを、逆転写のために、オリゴ
ｄｔ（１２−１８）およびランダムデオキシエキサマー
でプライミングした。３５０μｍの反応を、９００単位
のＡＭＶ逆トランスクリプターゼ（ライフ・サイエンシ
ズ・インコーホレーテッド、米国７０リグ州、セントベ
テルスパーグ）とともに、４２℃で２．５時間インキュ
ベーションした。

次いで、ｃＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドのＲＮＡ成分を
、ＲＮアーゼＨ，Ｅ、ｃｏｌｉ　　ＤＮＡポリポリーゼ
エおよびＥ、　ｃｏｌｉ　　ＤＮＡす〃−ゼで、１２℃
および２２℃において各々１．５時間処理することによ
って、ｃＤＮＡ相補性鎖で置換した。

分子の末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼでポリッシングし
た（　ｐｏｌｉｓｈｅｄ）　。

引続く消化工程からの新しく合成されたｃＤＮＡに対し
て内部のＥｃｏＲ１部位を保護するために、合計のｃＤ
ＮＡを８０μモルのＳ−７デノシルメチオニンの存在下
に３７℃において１時間処理した。２〜５ｋｌ）の大き
さの範囲のｃＤＮＡセグメントを切除し、ゲルのスライ
スから抽出し、そして１００倍モル過剰量の合成Ｅｃｏ
ＲＩリンカ−（５゛ｐｄＧＧＡＡＴＴＣＣ３°）の存在
下にＴ４ＤＮＡす〃−ゼとともにインキュベージコンし
た。３Ａ剰のリンカ−をセファデックスＧ−２５（中程
度）のデル透過クロマトグラフィーにより除去し、モし
てＥｃｏＲＩ接着末端をＥｃｏＲＩ制限酵素の切断によ
って発生させた。ＥｃｏＲＩ末端ｃＤ末端上ＤＮＡセグ
メントＤＮＡす〃−ゼの存在下に５℃において一夜、バ
クテリオファージのベクターのラムダｇｔｌｌのＥｃｏ
ＲＩ切断およびホス７７ターゼのアームとともにインキ
ュベージコンした０次いで、結合混合物のアリコートを
生体外パッケージング抽出物（ストラタジーン、米国カ
リ７オルニア州サンデイエゴ）と混合し、そして７アー
ジの粒子をＥ、　　ｃｏｌｉＹ　１０８９Ｉａ胞上で滴
定した。

−ニング 生体外パッケージングしたライブラリーからの５万のフ
ァージ（ｐｆｕ）を、１．４％の観点、１０ミリモルの
Ｍ、ＳＯ４および１００μｇ、１０＋Ｉの７ンビシリン
を含有する４枚の１５０１のＬＢプレートの各々の上に
配置した。７アーノの大きさが直径０．２〜０．５ｍｍ
となるまで、７アーノに宿主細胞を溶解させた。次いで
、プレートを冷却し、そしてＷ、Ｄ、ベントン（Ｂ　ｅ
ｎｔｏｎ）およびＲｏＷ、ディビス（Ｄａｖｉｓ）　、
ｒ単一プラークへの正常部位のハイブリダイゼーション
によるラムダ６１組換え体クローンのスクリーニング（
ＳｃｒｅｅｎｉｎｇＬａｌＩｌｂｄａ　　ＧＴ　　Ｒｅ
ｅｏｍｂｉｎａｎｔ　　Ｃｌ。

ｎｅｓ　　Ｉｃｙ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　　ｔ
ｏ　　ＳｎｇＩｅ　　ＰｌａｑｕｅｓＩｎ　　５ｉＬｕ
）　Ｊ　、サイエンス（５ｃｉｅｎｃｅ）　、１−亀」
−１１８０−１８２、（１９７７）の方法により、ニト
ロセルロースのフィルターのレプリカを、調製した。フ
ィルターを２ＸＳＳＰＥ、５ｘデンハルト、０．１％の
ＳＤＳ、１００μｇ／ｎｌの変性サケ***ＤＮＡ中で予
備ハイブリダイゼーションし、そしてハイブリダイゼー
ションし、ハイブリダイゼーションのため、２万ｇ／ｆ
ｉｌｌの　３２１Ｊ識ｃＬＶフインサー）ＤＮＡを使用
した。非特異的ＤＮＡハイブリダイゼーションを０．５
ＸＳＳＰＥ、０．２５％のＳＤＳ中のフィルターの洗浄
により除去した。陽性のプラークをオートラノオグラフ
イーにより検出し、取り上げ、そして放射線標識プロー
ブを使用して２回の追加の連続の／へイプリグイゼーシ
うン１こついてスクリーニングした。

実施例１２からの陽性のプラークのインサートをバクテ
リアのプラスミドのベクター中に導入し、セしてエンド
ヌクレアーゼＩＩＩ発生二本鎖セグメントをノブオキシ
末端法によって配列決定した。

ＤＮＡ配列をプステル（Ｐｕ５ｔｅｌｌ）　Ｄ　Ｎ　Ａ
配列分析プログラム（ＩＢＩインタナシツナル、米国コ
ネチカット州ニューヘブン）を使用してコンピューター
によって分析した。

１胆 Ｌｏｖｏ　　ｃＤＮＡ分子から独立に誘導し、ラムグｇ
ｔｌｌベクター系中に挿入されかつ放射線標識したＬＶ
７プローブとの反応性についてスクリーニングしたほぼ
２０万のうちで、４０の陽性のクローンを分離した。こ
れらのうちの最大（はぼ３Ｋｂ）を配列決定し、その核
酸および蛋白質の配列を第５図に記載する。

Ｐｃｌ　ＬＶ７を含有するＥｓｃｂｅｒｉｃｈｉａ　　
ｃｏｌｉ中のプラスミド、ＡＴＣＣＮｏ、６７３１２は
、１９８７年２月６日（こアメリカン・タイプ・カルチ
ャー−コレクション（Ａａ＋ｅｒｉｃａｎ　　”ｌ”ｙ
ｐｅ　　Ｃｕ１Ｌｕｒｅ　　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）　
（１−ＡＴＣＣＪ　）に受託された。

ＤＮＡ配列の分析により、このクローンのインサートの
大きさは２８３９ｂｐであり。そしてその配列はＰｔ５
５図に示されている。上の線はｐｌＬＶ７のオーブンリ
ーディングフレームのヌクレオチド配列を表わす。その
下は、それの遺伝情報を指定するペプチド配列である。

ここにおけるｃＤＮＡクローンを表示するために使用す
る一般用語はｃｌＬＶ７またはＩＬＶ７である。この用
語に付加するとき、接頭文字ラムグーまたはｐ−は、こ
のクローンが、それぞれ、ラムグ７ア一ノまたはプラス
ミドの中に挿入されたことを意味する。

実１目覧上」− ＣＥＡ−Ｃの伝　　を　６するｃＦＬ−ＣＥＡバクテリ
オ７アージのベクターのラムグｇｔｌｌ中の胎児肝１１
ｃＤＮＡの２Ｘ１０５の独立のインサートを含有する岨
換え体ライブラリー（クロンチク、米国カリ７オルニア
州パロアルト）を、Ｗ。

Ｄ、ベントン（Ｂｅｎｔｏｎ）およびＲ，Ｗ、ディビス
（Ｄａｖｉｓ）　、サイエンス（５ｃｉｅｎｃｅ）　、
１９６．１８０−１８２、（１９７７）に従い放射線レ
ベルＬＶ７でスクリーニングした。単一の陽性クローン
を選択し、モしてＥｃｏＲＩインサートをプラスミドの
ベクターのブルースフリプ）ＫＳ＋（ストラタシーン、
米国カリ７ｔルニア州サンデイエゴ）中にサブクローニ
ゲした。検出クローンを両方向において調製し、そして
ド、サンガー（Ｓｕｎｇｅｒ）　、Ｓ、　ニー／グレン
（Ｎ　１ｃｋｌｅｎ）およびＡ。

Ｒ，クールソン（Ｃｏｕｌｓｏｎ）　、プロシーディン
グＵＳＡ％Ｌ先、５４６３−５４６７、（１９７７）の
ジデオキシ停止法により配列決定した。このり　−ロー
ン、ＦＬ５と表示する、は翻訳停止シグナルの欠如によ
って判断して不完全であった。Ｆ＋５の３°末端から誘
導される単一のコピーのプローブを使用して、前述の商
用胎児肝臓ライブラリーを再スクリーニングした。５つ
の陽性のクローンが得られ、インサートをブルースクリ
プトＫＳ＋ベクター中にクローニゲし、そして最大のＦ
Ｌ４と表示するものを配列決定した。これらの２つのｃ
ＤＮＡプラスミド、ＦＬ５およびＦＬ４は重複し、そし
て−緒に、ＦＬ−ＣＥＡとここで表示するポリペプチド
の全オープンリーディングフレームを含有する。Ｆ″Ｌ
−ＣＥＡの翻訳した配列は、次の通りである： （ｊ　　　　■ヶ　　　ロー　　　ロー　　　　ロ＝ロ
　　　く・−〇　〇−　　　［−ω　　　　く−の＋　
　　Ｑｌ　クーＣｊ　＜　　　　（！　１％　　　　。

口ＮＣＪ’　　　Ｃ＋＋島　　＜　ｋ　　　（Ｊ　ｂ　
　　　ＣＪ　０口０ロー　■ＡＱΦ　　Ｑ−〇 ←　■−ロリ　　　＜　１−　　　−（１）　Ｃｏ　　
　　ＣＪ　Ｉｌ、　ｃＮｌｊ　　　　（Ｊ　　　　　ｌ
−一　　　υＯＣＪＷＬ３　　　　＜　　　（）　　ｃ
＆＋　　　ロー　　　　く−ロロ　　　く　　Ｎ−υ＜
　　　　ＣＪ　ｏ＋ＣＪ　（Ｊ　ｍ口　　　Ｕ　　　　
ロー　　　（Ｊ（５ｗの１−Ｃ１←　　　　←―　　　
υ−＜為りＩ＋　ローロ　　　　ロ〉　　　０氏　　　
　（−一［−ｍ　　　　（Ｊｌ−６１＋ｅ　　　　＜ｍ
６　　　（Ｊｌ：Ｑ’＋（Ｊｌ＋■　　　Ｃυ〜　曽−
（ψ−ローｏ　　　くの−ω＜！＜φＣＯＷ　　＜＜■
　　　リ（ｖ＜　　　　−ｇ：４：　−１：Ｑｌ：− Ｑ−曽　　ωコＮ　ロ　−〇−＜ｂ６　　　＜−のロー
−１−ω脅　寸−（Ｊｌ−ｊ　　　υ１ト　　　←−ω
Ｈ＋　／　ｄ　　　　ｅ’）ロー　Ｉ＾　Ｏ乙す　　　
（←寸　　　リνマυａｌｊ　あ−Ｕコ−−＜ｋｅＱ　
　　　　ω仁〜　Ｑ　（α−ローの　−１＋Φ−ｕ１閃
　　　（φ硝　Ｏ“（−トＩＪ＜閃　−ω−サ　　　（
←啼　　　＜＜９　　ｃｏ　（Ｊ口！く　　　　　　　
　ｕ　　　ロ　　ｃｊ　　　　　　　［＋　　　　　　
りり　　　　　〈　　−一く　　　　Ｑ　　　　く［−
＋（−ｃｏｅＪ　　　　　←　　　　Ｑｔ−５＋−の−
（Ｊ　　　　　（Ｊ　　　　　ＣＪト＜ト　　　←　　
　　　　く　　　　　　リ（Ｊ　　　　　　　　　ＣＪ
　　　　ｍｌ＋　　　　　　　１−　　　　　　リ＜１
　　　　　　４：　　　　ＯＣＪ　　　　　　　ロ　　
　　　　Ｕく　盲　　　　　　　（Ｊ　　　　ＣＸ：Ｉ
−ヒ　　　　　　　く　　　　　　←＋　１　　　　　
　　＋　　　ト　　ω　　　　　　　Ｃ＋）＋？ ＋　　　　Ｏｌ−＜　　　　　　　＜　　　　ロ　　ロ
　　　　　　←（Ｊ　　　　Ｃ’Ｊ　　　＜Ｉ！　　　
　　　　＜　　　　１％−＜　　　　　　　←Ｑ（ 残留配列の目的のため、第１アミノ酸はＧｌｎであり、
これは核！１ｌ１９０の下に存在する。その後、アミノ
酸には連続番号が付されている。

腫瘍メツセンジャーＲＮ　Ａを、Ｊ、７７ボラロ（ｔ’
ａｖｏｌａｒｏ）　、Ｅ、　　）レイスマン（”Ｉ”ｒ
ｅｉｓ＋ｏａｎ）およびＲ，ケイメン（Ｋａａ＋ｅｎ）
　、メソッズ・イン・エンジモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ
　ｉｎ　　Ｅ　ｎｚｙｍｏｌｏＨｙ）、ＬＬ、７１８、
アカデミツク・プレス・インコーホレーテッド（１９８
０）のプロイテナーゼに−フェノール抽出法によって調
製し、次いでオリゴｄ′ｒセルロースクロマドグ：７フ
イーによってポリＡ＋ＲＮＡを生成した。はぼ１００μ
ｇのボｌ）　Ａ十ＲＮ　Ａ　ヲ４９７．）　タメＩ：、
１　ｇ（７ｎｎｍｆｆｉ）　ノＢ　”ｆ’２０ＪＱ胞（
ＡＴＣＣＨＴＢ　　１９）　ヲ２０１１１１の氷冷ＲＮ
Ａ溶解緩衝液（１４０ミ１７モルのＮｕＣｌ、１．５ミ
リモルのＭｇＣｌ２．１０ミリモルのトリス−ＨＣｌ、
ｐＨ７，８，０，５％のＮＰ−４０，４ミリモルのジチ
オスレイトールおよ１７２０単位／１の胎盤リボヌクレ
アーゼ阻害剤）中に再懸濁しかつ溶解した。ナトリウム
デオキシコレートを０．２％に添加した。細胞質および
核は、ホモノネートを１２　ｔ　０００　Ｘｇにおいて
２０号間遠心することによって分離した。細胞質の分画
を等体積のＰＫ緩衝液（０，２モルのトリス−ＨＣｌｌ
　２５ミリモルのＥＤＴＡ、０．３ミリモルのＮａＣ１
，２％のドデシル硫酸ナトリウムおよび４００μｇ／ｍ
ｌのプロイテナーゼＫ）と混合し、２時間３７℃でイン
キュベージタンし、次いで等体積の７二／−ル／クロロ
ホルム（１：　　１／ｖ：　ｖ）溶液で１回抽出した。

核酸は分離した水相のエタノール沈殿により得た。合計
のＲＮＡは、ポリＡ十ＲＮ　Ａにケイて、０．５モルの
ＮａＣ１，１０ミリモルのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，８
，０，１％のサルコシル中でオリゴｄＴ（１２−１８）
セルロースカラムにｉ１Ｍ遇させることによって濃縮し
ｐ、。

洗浄後、結合したＲＮＡを、塩化ナトリウムの不存在下
に同一溶液で溶離した。

及４杜七見 ｍＲＮＡの逆転写 １０μビのポリＡ＋ＢＴ−２０ＲＮＡを、オリゴｄＴ（
１２−１８）およびｐｄＮ６で逆転写のためにプライミ
ングした。１００μｍの反応を４時間４２℃において２
００阜位のＡＭＶ逆トランスクリプターゼ（ライフ・サ
イエンシズ・インコーホレーテッド、米国フロリダ州、
セントベテルスバーグ）を使用して実施した。ｃＤＮＡ
／ｍＲＮＡハイブリッドのＲＮＡ成分を、１２°Ｃおよ
１２２℃において各々１．５時１’ｉｌ’ｌ　ＲＮアー
ゼ、Ｅ、　ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼポリ上りＥ、　
　ｃｏｌｉ　　ＤＮＡ　ｌ）　Ｎ−ゼで処理することに
よって、第２相補性鎖で置換した。分子の末端をＴ　４
　Ｌ）　Ｎ　Ａポリメラーゼの処理によって平滑：こし
た。ｃＤ　Ｎ　Ａを７エ７−ル／クロロホルムで抽出し
、エタノール沈殿し、そして１０ミリモルのトリス−Ｈ
ＣＩ、ｐｉ−（７゜８．１ミリモルのＥＤＴＡ（ＴＥ）
中で調製した［セファデックス　Ｇ−２０Ｊスパン（５
ｐｕｎ）カラムで精製した。

合成りＮＡリンカ− ５’　ｐＣＣＣＧＧＧ　　３’ ３’　ＧＧＧＣＣＣＴＴＡＡ５’ を、ｃＤＮＡの末端に、過剰のＴ４ＤＮＡす〃−ゼとの
平滑末端結合によって数句けた。過剰のリンカ−をＴＥ
中（こおいて「セファデックス　Ｇ−５０」（中程度）
のクロマトグラフィーおよび０．８％の低融点の７ガロ
ースウゲルの分画によって除去した。ＢＴ−２０細胞系
のポリＡｆＲＮＡの７ザンプロツトに基づいて、ＣＥＡ
関連ｍＲＮＡの大きさは３．Ｏｋｂと推定された。した
がって、２〜４ｋｂの間のｃＤ　Ｎ　Ａ断片を、デルの
スライスから回収し、そしてエタノール沈殿した。ＴＥ
中のｃＤＮＡの再懸濁後、ＥｃｏＲＩ切断ラムグビうＯ
アームをユニ１の推定モル比におい′ζｃＤＮＡへ付加
した。結合をＴ　４　Ｄ　Ｎ　Ａ　’）　７７′−ゼの
存在下に７°Ｃにおいて２日間進行させた。標識反応の
７リコートを商業的に得られるパケーソング混合物（ス
トラドノーン、米国カリ７オルニア州サンデイエゴ）に
ラムダ粒子の調製のために添加した。

生体外のパッケージングおよびＥ、　ｃｏｌｉ　　宿主
ＮＭ５１４の感染後、５００万のファー７粒子が得られ
た。

５０万のパッケージングされたラムダ粒子を比。

ｃｏｌｉ　　ＮＭ５１４の菌叢上に配置し、複製のパタ
ーンを、Ｗ、Ｄ、ベントン（ａＢｅｎｔｏｎ）およびＲ
ｏＷ、ディビス（Ｄａｖｉｓ）　、サイエンス（５ｃｉ
ｅｎｃｅ）、１９６．１８０−１８２、（１９７７）に
記載されているようにニトロセルロースのシート上に持
上げた０種々のＣＥＡ族の構成員の間の反復領域を含有
する、 ：１２）Ｊ識ＬＶ７　　ｃＤＮＡインサートノフローフ
とのハイブリダイゼーシヨンにより、陽性の７７−ノを
選択した。この選択法によって、多数回の連続的スクリ
ーニング後に、１２の陽性のファージが得られた。個々
のプラークからの７７−ノを増幅し、力価決定し、そし
てこれらを使用して少量の組換え体７アーノＤＮＡを［
また。

］’、ｖ＝アチ入（Ｍａｎｉａｔｉｓ）　、Ｅ、　Ｆ、
　７リトシ（Ｆｒ１ｔｓｃｂ）およびＪ、サムプルツク
（Ｓａｍ−Ａ　　Ｌａｂ＋皿り且Ｕ−］ｂμ些ａｔ）　
、　：ｌ−ルト・Ｘ７’リング・ハーバ−２（１９８２
）に従い、７アーノＤＮＡを調製した。ＤＮＡのセグメ
ントを低融点のアガロースデルから分離し、そしてブル
ースクプト（Ｂ　１ｕｅｓｃｒｉｐＬ）プラスミドベク
ター（ストラドノーン、米国力Ｉ７７オルニア州サンデ
イエゴ）中のサブクローニゲのために挿入した。ＤＮＡ
の配列決定は、Ｆ、サンＮ−（Ｓａｎｇｅｒ）　、　Ｓ
。

ニックレン（Ｎ　１ｃｋｌｅｎ）およブＡ、Ｒ，クール
ソン（Ｃｏｕｌ！３ｏｎ）　、プロシーディンゲス◆オ
ブ・ナシ３ナル・アカ−ミー・オプ・サイエンシズ（Ｐ
５４６３−５４６７、（１９７７）のジデオキシ停止法
によって実施した。ＢＴ２０についての翻訳された配列
は次の通りである： トー　　　　　　　　ζＪＣＩ　　　　　　　　　Ｉ−
Ｑ）　　　　Ｃ’Ｊ　　　　＋ｊ　ロ）　　　　　　　
　　ｔコ　Ｉ＋０りく　　　ロー　０　ロコ　　　く；
　　　　Ｕ；υ　　　１−υ　■−＋Ｑ　　　く−ク　
　　！＋Φ寸＜　　　（＞　　　ＣＪ　　　　　　　ロ
ク　　　　　トΦ　　　　　　０口（Ｊ　　Ｃ＞−ＣＪ
　　　　ｌ−０Ｊ　　　！−−’１　０　　＜１ｌｌ（
’？）ＯｃＪ　　　　ＩＪ　　　　　■−←−Ｑの！−
０く　　　　　　←−ＯＱ−＝曽　　　　　く・−〜（
（Ｊ　　　　　ＣＪン　−一くト　　　　０工〜ロ　　
　　　＜　　　　　　　（Ｊコ　　　　　ωコ　　　　
　　Ｑ−←　　　Ｑ　　ロ　＜　−ｉ−ＯＪ〜　　　０
−一＜　　　　（Ｊ　　　　　Ｌ）ＣＬ　　　　（：←
　　　　ＣＪ−−ＣＩＣＪ　　　［−■Ｏ（ＪＣＩ　　
　　＜−（ＣＪ　　　　　　　［−０ＣＪ　ｂ　　　　
　　　Ｏ−ロ　０　く　　　　　■−ｌ−Ｃａ　　　　
　　（の０Ｉ＋←−＜　＜　−ｗ　　　　ＩＪロー　　
　ｊ−５１）−口ω〜ｃｐａＩ＋−０！”−一〇　　　
−ｑの　　　ロー寸　　　Ｑ（Ｊｌ＋η　トー■＝の　
　　（クト　　　Ｉ＋田ロ　ロ　Ｑ←←Ｎｃｎ＜ｌ＋Ｎ
＜＜ＦＪ　　　　ｗ＞ｃｙ＋　　ｍ−ＣＪＬ）ｌ−Ｌｌ
’）　　　　　　ロ　α寸　　　　　Ｑ　−曽　　−＜
Ｌ、ｌ’Ｊ　　　　　　口　１口＞■　　くψ００　り
自ト　　ロＱＯく１１＋ヒ〜　　　くくへ　Ｎ−ロロ〜
　　　−（イ）（イ）　　　−喝注二位置１３８０−１
２８１におけるｒｎｎＪおよび位置１５８９−１５９１
におけるｆ’ｎｎｎＪは、ＣＢ　Ｔ−２０の、まだ、配
列決定されない３°−翻ｉ＜頚域を表わす。

残留配列の目的のため、第１アミノ酸は第４列のＬｙｓ
であり、左から１１アミノ酸である。その後、アミノ酸
には連続番号が付されている。

この迷最初および特許請求の範囲は例示を目的とし、限
定を意味するものではなく、そして種々の変更および変
化は本発明の精神および範囲を速成しないで可能である
ことは、理解されるであろう。

【図面の簡単な説明】

ｆ５１図は、本発明によるｃＤＮＡ配列のアミノ酸およ
び核酸配列（８５９塩基）である。 第２図は、抗原（ｒ　ＡｇＪ　）の存在下または不存在
下における、本発明にょるＣＥＡ融合調製の酵素イム７
アツセイを描写するグラフである。 第３図は、本発明によるＣＥＡ融合蛋白貿の免疫プロッ
トである。 第４図は、本発明によるポリＡ＋ＲＮＡの検出のための
オートラノオグラフである。 第５図は、本発明によるｃＤＮＡ配列の？ミノ酸および
核酸配列（２８３９塩基）である。第５図において、残
基配列の目的のための第１アミノ酸は右から第２列第３
アミノ酸中のＬｙｓである。 その後、残りのアミノ酸は連続番号が付されている。 特許出願人　モレキュラー・ダイアグノスティックス・
インコーホレーテッド 代　理　人　弁理士　小田島　平　吉・□　：　：ｊ、
’レム　　　　の ４傘ＩＪｒ　　　　ｌ！ＩＩＩ　　　　Ｌｌｌｌ　　Ｏ
ｕｂ　　　　ＬＤＩｋ　　　　ＤＬ　　　　Ｉｊｌ　　
％−、ｕこｓａｔ−ａｍＩ−＋すＣ１會Ｌｌ（Ｌ４Ｕｎ
ｄ４（工ψＬＩＬＦＩＧ、３ ＦＩＧ、４ 手続補正書（方式） 昭和６２年１１月２６日 特許庁長官　　小　川　邦　夫　殿 １、事件の表示 昭和６２年特許願第２０１０３５号 ２、発明の名称 発癌抗原の遺伝情報を指定するｃＤＮＡ３、補正をする
者 事件との関係　　　　特許出願人 ４、代理人〒１０７ 電話　　　５８５−２２５６ ５、補正命令の日付　　昭８７６２年１０月２７日　（
発送日）６、補正の対象 （１〉　明細書筒１１２頁末行に「プロットである。」
とあるを、「プロットを示す写真である。１と訂正する
。 （２）　同第１１３頁第２行に「グラフである。」とあ
るを、「グラフの写真である。１と訂正する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ＣＥＡペプチド配列およびそれとハイブリダイゼー
   ション可能な塩基配列を有する核酸の遺伝情報を指定す
   る塩基配列を含んでなることを特徴とする核酸。 ２、核酸は（ａ） 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 その機能的同等体およびその断片から成る群より選択さ
   れるＤＮＡである特許請求の範囲第１項記載の核酸。 ３、特許請求の範囲第１または２項記載の核酸を含んで
   なるインサートを有する複製可能な組換えクローニング
   ビヒクル。 ４、特許請求の範囲第３項記載の複製可能な組換えクロ
   ーニングビヒクルでトランスフェクション、感染または
   注入された細胞。 ５、ＡＴＣＣ表示ＡＴＣＣ６７３１２およびＡＴＣＣ６
   ７１６９を有する細胞系。 ６、特許請求の範囲第４項記載の細胞の発現生成物の５
   以上のアミノ酸を有する全アミノ酸配列またはその一部
   に相当するアミノ酸配列を有するポリペプチド、その機
   能的同等体およびその標識された形態。 ７、特許請求の範囲第２項（ｂ）記載の配列から誘導さ
   れたアミノ酸配列を有し、かつ （ｉ）アミノ酸残基１３５〜３８６、 （ｉｉ）アミノ酸残基１７４〜２２０、 （ｉｉｉ）アミノ酸残基２８５〜３８６、 （ｉｖ）アミノ酸残基１７４〜２００、 （ｖ）アミノ酸残基２０８〜２１６、 （ｖｉ）アミノ酸残基２８５〜２９０、 （ｖｉｉ）アミノ酸残基２９２〜３０８、 （ｖｉｉｉ）アミノ酸残基３１２〜３２１、 （ｉｘ）アミノ酸残基３６０〜３７２、 （ｘ）アミノ酸残基３８０〜３８６、 から成る群より選択されるペプチド、 特許請求の範囲第２項（ｃ）記載の配列から誘導された
   アミノ酸配列を有し、かつ （ｉ）アミノ酸残基１３５〜３８６、 （ｉｉ）アミノ酸残基４１１〜４９２、 （ｉｉｉ）アミノ酸残基１７４〜２２０、 （ｉｖ）アミノ酸残基１７４〜２００、 （ｖ）アミノ酸残基２８５〜３８９、 （ｖｉ）アミノ酸残基２０８〜２２２、 （ｖｉｉ）アミノ酸残基２８５〜２９２、 （ｖｉｉｉ）アミノ酸残基２９５〜３１１、 （ｉｘ）アミノ酸残基３１５〜３２８、 （ｘ）アミノ酸残基３３１〜３４５、 （ｘｉ）アミノ酸残基３４８〜３６０、 （ｘｉｉ）アミノ酸残基３６３〜３７７、 （ｘｉｉｉ）アミノ酸残基３８３〜３９０、から成る群
   より選択されるペプチド、 特許請求の範囲第２項（ｄ）記載の配列から誘導された
   アミノ酸配列を有し、かつ （ｉ）アミノ酸残基１３５〜２８５、 （ｉｉ）アミノ酸残基１６８〜２２０、 （ｉｉｉ）アミノ酸残基１６８〜１９６、 （ｉｖ）アミノ酸残基２１０〜２２０、および （ｖ）アミノ酸残基２６４〜２８３、 から成る群より選択されるペプチド。 ８、特許請求の範囲第６または７項記載のポリペプチド
   またはペプチドに対して特異的な抗体調製物。 ９、ＣＥＡの検出法における特許請求の範囲第６または
   ７項記載のポリペプチドまたはペプチドあるいは特許請
   求の範囲第８項記載の抗体の使用。 １０、核酸のハイブリダイゼーション法における特許請
   求の範囲第１または２項記載の核酸の使用。 １１、特許請求の範囲第６または７項記載のポリペプチ
   ド、特許請求の範囲第８項記載の抗体または特許請求の
   範囲第１または２項記載の核酸の少なくとも１種を含ん
   でなることを特徴とする試験キット。 １２、特許請求の範囲第６または７項記載のポリペプチ
   ドあるいは特許請求の範囲第８項記載の抗体の少なくと
   も１種を含んでなることを特徴とする製薬学的生成物。 １３、工程 ａ）ＣＥＡの遺伝情報を指定する核酸を組換えクローニ
   ングビヒクルに挿入し、 ｂ）前記ビヒクルを宿主細胞中にトランスフェクション
   、感染または注入し、 ｃ）前記宿主細胞を生長させ、そして ｄ）前記宿主細胞によって発現されたＣＥＡペプチドを
   回収する、 を含んでなることを特徴とする特許請求の範囲第１また
   は２項記載の発癌抗原（ＣＥＡ）ペプチドをつくる方法
   。