JPS6229971A - Ｂ型肝炎ウイルス抗原を産生するハイブリツド細胞及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３、発明の訂細イ’ｔ　ｉＪｉ明 本発明はハイブリッド細胞に係り、該ハイブリッド細胞
は免疫学的↑１質を右するポリペプチドの産生に有用で
あり、該性質はまた好ましくは［３型肝炎ウィルスの抗
原の免疫原付であり、好ましくはウィルスの被膜の抗原
のものであり、特にｌ−Ｉ　ＢＳ　　Ａａ抗原あるいは
そのフラグメントのものであって、該ポリペプチドはり
［１−ン化したあるいは前記ハイブリッド細胞中でり［
コーン化可能なりＮＡ配列によって二コードされている
。本発明はまた、該ハイブリッド細胞の製ｊ告方法及び
前記ポリペプチドの産生へのでの利用に１９係る。

本発明のハイブリッド細胞は厚木特許中に既に記載した
ものの範囲に入るものである。基本特許のハイブリッド
細胞は所定クローン化ＤＮＡ配列により形質転換されて
いるか形質転換可能＜ｉものであり、前記クローン化Ｄ
ＮＡか、その構造中に該ポリペプチドのものに同一か類
似のポリペプチド配列を含んでいるものにＪ−ってコー
ドされ１＝ポリペプチドにＪ：り構成されるタンパク質
をコードづ−る天然項伝子の発現に生来都合のよい初期
細胞系の遺伝形質の少なくとも一部と、遺伝標識形質を
含み、この遺伝標識形質はそれ等を、通常ならばそのハ
イブリッドが由来する細胞にとって致死−日　　　− 的であるが前記萌伝標識形質にょＩ′）発現されるポリ
ペ１ブトにＪ、り不活↑１１化される活１１物貿を含む
培地である選択培地へ入れることを可能にづるｂのであ
る。例えば前に使用した「初期細胞」なる表現は、特に
吐乳動物から採取され、生産が所望されるタンパク質あ
るいはそのタンパク質に対応するポリペプチドの生産の
中枢となり得る能力により知られている全Ｃの細胞を指
している。これ等の初期細胞はインビトロでは殆んど増
殖ｌず、その増殖は中−床（ｍｏｎｏｃｏｕｃｈｅ）の
生産に限定され、従って増殖は「接触用害」あるいは類
似のものにより中断されることにより特徴（１’　＋ｊ
られる。これ等の細胞はいずれにしても同様に引続き一
定の時間適当な培地中で相持しておくことができる。

「樹立真核細胞１なる表現は、特に吐乳動物の真核細胞
で、インビ１−［１で培養でき複数の世代に渡って継代
し得るｂのを指している。

基本特許の発明にＪ、る、クローン化ｒｌＮへ所定配列
を発現づるかあるいは発現づるようになり得るハイブリ
ッド細胞の形成方法は、ぞの中で前記り「１−ン化１’
）ＮＡ配列が発現され得るがあるいは発現されている樹
ｆｉ　ｐ、！核細胞と、前記り［１−ン化ｒｌＮ△かそ
の適当な（１４造中に該ポリペプチドのものに同一か類
似のポリペプチド配列を含んでいるものにＪ、っτコー
ドされたポリペプチドにより構成されるタンパク質を丁
１−ドする天然遺伝子の発現に生来都合のＪ−い初期細
胞を、それ等がバイブリプ−ジョンひきる適当な条イ′
１下で共培養し、この共培養は前記（Δ４−ｒｒ　ＩＩ
ｌ胞が適当な遺伝子配列を補給されないと増殖しないＪ
−うな培地中で行なうものであること、細胞ハイブリｆ
−ジョンにかけられる初期細胞はｐめ前記培養培地中Ｃ
゛形成れるハイブリッド細胞の少なくとも一部分に適当
な前記遺伝子配列を供給りるのに有効であるかあるい１
．１右効どなり得るものであること、及び形成されたハ
イブリッド細胞を回収することを特徴とりるものである
。

従って基本特許の発明は、遺伝子］学技術の実施により
クローン化ＤＮＡ配列（・形質転換されてＮΔが、一般
にぞの発現に特に好ましいことが判明している自然条件
に近い遺伝子的環境で買き換る（例えば判別のレベルあ
るいは同一または等価のＩ”）ＮＡ配列を含むゲノムの
１０グラ１１化のレベルにおいて起る）ことが判る。

本発明の目的は、特に好ましくはサルの細胞とリールの
肝細胞に山来し、Ｂ型肝炎ウィルスの抗原、好ましくは
ｌ−ＩＦ５　Ｓ　　Ａ　Ｏあるいは類似の免疫原性を示
すポリペプチドを生産づるｌこめのハイブリッド細胞の
類を提供でることにあり、これ等のハイブリッド細胞は
極めて安定であり、特にワクチンの生産のために遺伝子
Ｆ学による形質転換微う１物ではめったに得られイ１い
かあるいは決して１■られない効率で抗原を生産りるこ
とができる。言い換えれば本発明は、基本特許において
ｊ、り一般的に定義されたハイブリッド細胞の類の中で
特に有効イｔハイブリッド細胞を選択したちのである。

本発明のハイブリッド細胞は、Ｂ１０り肝炎ウィルスの
ゲノム中に含まれる所定遺伝子の全部あるいは一部を含
むりＩＩ−ン化ＤＮＡ配列にＪ、り形質転換されている
かあるいは形質転換可能なものであり、該配列は該ハイ
ブリッド細胞中での発現が可能な条件下で組み込まれて
いるかあるいは組み込むことが可能＜’Ｋ　Ｇのであっ
て、該ハイブリッド細胞はＢ型肝炎ウィルスのゲノム中
に含まれる天然萌伝子の発現に／１束好適である、好ま
しくはチンパンジーあるいはＡ−ノーがＩｆルであるサ
ルの肝細胞系の遺伝形質の少なくとも一部ど、遺伝標識
形質を含Δ７でおり、該遺伝標識形質は、通常４１らば
サルの細胞にどって致死的であるが前記遺伝標識形質に
より発現されるポリペプチドに」、り不活性化される活
性物質を含む培地である選択培地中に該ハイブリッド細
胞を入れることを可能に乃る。本発明のハイブリッド細
胞はまた、４ノルの非腫瘍＋１１あるいは腫瘍形成性の
樹立細胞の遺伝形質の−・部を含むことが好ましく、特
異的な特徴がより遠くまで呼び出されるＶＦＲＯ系の細
胞の１）のであることが好ましい。

本発明ＩＪまた、適当な培養培地中でそのＪ、うなハイ
ブリッド細胞を製造する方法にも係り、該ＩＣ法は、そ
の中で前記のＢ型肝炎ウィルスのゲノムの遺伝子の−・
部を発現可能であるかあるいは発現しているものである
が所定遺伝子配列を欠いている非腫瘍↑１す゛ル樹立細
胞と、前記培養培地中に形成されるハイブリッド細胞の
少なくとも一部に前記所定遺伝子配列を供給し得るかあ
るいｌＪ予め供給し得るようになることが可能な、好ま
しくはブンパンジーて゛ある］Ｊルの肝細胞との共培養
をでれ等がバイブリプ゛−シ」ンし１９るような適当な
条件下で行イ’ｒい、この培養は樹Ｓ’７　ＩＣ胞に前
記所定遺伝子配列あるいは肝細胞により適当に保持され
たｊ盲伝了配列が補給されないどサルの樹ｆノ細胞（Ｊ
増殖し得ないようイを培地中で行ない、形成されたハイ
ブリッド細胞を回収Ｊることを特徴どする。

培養中鞘持できるような勺ルの非腫瘍性樹立細胞であれ
ば恐らく全でのものが本発明の方法の実施に使用覆るこ
とができる。例λばＰＦＴＲＩＣＣＩ＾Ｎｌ。

Ｊ、　Ｃ，、ＫＩＲ３ＣＩＩＳＴＩＩＮ、　Ｒ，１，、
、１ＩＩＮｒｓ、’、１．Ｅ、、　ＷＡＩＩＡＣ［、Ｒ
，Ｆ、及びＨＡＲＴＩＮ、　ｒｌ、　Ｐ、によって記載
された（、Ｌ　Ｎａｔｌ、　ｃａｎｃｅｒ　ｒｎｓｔ、
、　５１．１９１１９６（１９７３））、ヒ１へではな
い霊長類の置数体Ｖｅｒｏ細胞系を使用号＝　１２− るのが好ましい。これ等の細胞は、免疫抑制剤処即した
１ノルでの試験でも腫瘍形成性を示さなかったものであ
る。

培養培地は使用した樹立細胞と同様に、上記で定義した
条件を満足するように選択される。１８地はそのような
ものであり、樹立細胞は例えば選択された培地中では、
肝細胞によって保持されＩＣ遺伝子配列を補給された場
合以外は増殖できないものである。

樹立細胞は例えば天然あるいはその遺伝子の段階で誘発
された欠損を示す細胞により構成されており、この欠損
は所定の培地中でのそれ等の増殖を停止１−するが、こ
の欠損はそれが欠損のあるものでない場合に対応Ｊる遺
伝子により特定されるものに相同のタンパク質の型で発
現可能な相同遺伝子を組み込むことにより補償される。

該相同遺伝子を組み込まれた細胞は、使用される培地中
で増殖し得る状態どなる。この補償の可能↑（１を「補
給」という表現で示１）、前記に示した本発明の方法の
より一般的な定義で使用している。補給可能な遺伝子あ
るいはＤＮＡ配列の種々の例は例えば１９８１年３月２
日出願のフランス特許出願８１０１１３７号に挙げられ
ている。この型のＤＮＡは特に、タイプ１の［単純ヘル
ペスウィルス（Ｈｅｒｐａｓ　ｓｉｍｐｌｅｘＶｉｒｕ
ｓ）Ｊど呼ばれるウィルスのもの、デミジンキナーゼ（
ＴＫ）の遺伝子、アデニンボスボリボシルＩ〜ランスフ
Ｊラーゼ（ＡＰＲＴ）及びジヒド［］ホレシーレダクタ
ーゼ（ＤＩＩｒＲ）等の遺伝子、キサンヂングアニン小
スホリボシルトランスフ■ラーゼ酵素（ＸＧＰＲＴ）　
、あるいはヒポキサンチングアニンホスホリボシル１〜
ランスフエラーゼ（ＨＧＰＲＴ）のものに属するもので
ある。

これ等の［補給ＤＮＡＪのそれぞれは前記の条件に応え
る培地に対応するものである。本発明をりｒまし〈実施
づる場合、Ｖ［ＲＯＨＧＰＲＴ−細胞を使用することが
τ゛き、ｒ　ｌ−Ｉ　Ａ　Ｔ培地−１の名前で知られる
培地（チミジンに加λてヒポ１リン°１ン及びアミツブ
ゾリンを含右４る）を使用覆るのが有利である。この培
地は［再生経路（ｖｏｉＯｄｅ　ｓａｕｖａｇｅ）　１
ど呼ばれる代部１軒路を介してブミジンホスフｒ−１・
の合成を生起し得ることが知られ−（おり、この経路は
そこで増殖し１９る細胞の薄伝了ＩＩＧＰ旧の完全な保
護を含むものである。補給核酸配列は肝細胞（それ自体
はＩＩ　Ｇ　Ｐ　ＲＴ″）にＪ、り保持されるように（
７るので、細胞融合の間に対応Ｊる遺伝子が転移された
ハイブリッドのみが、選択培養培地中で増殖しＶ）る。

ハイブリッドを構成するのに参加しなかった樹立細胞及
び補給を受Ｉノ／’；かった樹Ｘ′Ｉ細胞はそこで増殖
できず、このような初期細胞自体は本来の限られた生存
期間しか有さない。

本発明方法に等価の方法の一つの実施態様では、培地に
増殖をμｍ１害し、さらに細胞の２つの型を速やかに死
滅させる物′ｄを導入Ｊ−ることができ、こねはこの物
ｖ１がｌｆｆ１ｆｆｉのものを不活↑１化できる特に耐
糸Ｃ゛ある２番目の物質であって、第２のものは初１１
１１細胞中に予め導入し得る所定１’）Ｎ△配列で−１
−ドされているように行なわれる。第１の物質は例えば
抗生物質により構成され、例えば０４１８という相称に
より知られているものであり、第２の物ｉ’ｔ　ｔ、Ｌ
その場合アミノグリコシト３°−ボス小］ヘランスフ］
ラーぜで構成される。この原理の説明については先に挙
げた特許出願８１０４３７号をまた参照Ｊることができ
〆よう。前の場合のように、初期細胞の遺産である前記
アミノグリコシト３°−小スホ１〜ランスフＴラーぜを
コードするＤＮ△配列を受ＩＪ継いだハイブリッドのみ
が生き残る。

本発明方法で他に取り得る第１の方法では、樹ｒＬ細胞
、あるいは肝細胞、あるいはその両方を前記共培養の前
に予めＢ型肝炎ゲノムのフラグメンｌ〜を含むＤＮＡ配
列で形質転換した。従って本発明のこの方法は、前記共
培養の後に形成されたハイブリッドで前記クローン化ｒ
）Ｎ△配列にまりコードされた抗原あるいは免疫原ペプ
チドを産生Ｊるものの選択を含む。

本発明の方法で他に取り得る第２の方法では、得られる
ハイブリッド細胞は非分泌性であって、クローン化ＤＮ
Ａ配列で形質転換りるものであり、本発明にＪ、るこの
方法もまた前記共培養の後に形成されたハイブリッド細
胞で、り日−ン化ＤＮＡ配列でコードされる特にＨＢｓ
　Ａｇ型である抗原を生産するものの選択を含む。上記
のものでは、非分泌性のハイブリッド（，１それ自身は
予め形質転換されてい４ｉい樹立細胞及び肝細胞から１
！Ｖだハイブリッドでも構成され得る。それ等はその間
イのままであり得る。この場合、形質転換に使用するハ
イブリッドは、取り１りる第１の方法で見られたハイブ
リッドの選択の範囲にはないものであり得た。

発現が所望される、Ｂ型肝炎ウィルスのゲノムに由来す
るクローン化ＤＮＡ配列は、天然遺伝子の全フラグメン
１〜又は一本鎖核酸配列片の逆転写により得られる全配
列により構成され得、例えばｍＲＮ　Ａのもの、Ｐ’素
内的経路さらに化学的合成により得られた全でのＤＮＡ
により構成され得る。

例えばこの配列は対応覆る天然遺伝子により発現される
ものに同一のポリペプチドあるいは同等のポリペプチド
をコードするＣＤＮＡにより構成され、この同等すべに
より特に、該天然ポリペプチド及び同等のポリペプチド
に対して予め形成された抗体との対応でる交差反応にお
いてこの２つのポリペプチドの間で認識され得る免疫学
的類似が得られる。例えば前記の本発明の定義で使用し
た「遺伝子」なる用語は、上記に挙げたように対応する
全核酸配列まで拡大して解釈されなければならない。

ハイ１リゾ−ジョンをＪる前の樹立細胞あるいは初期細
胞、あるいはまた予め形成したハイブリッドの形質転換
あるいはトランスフｒクションを行なうために、全での
ベクター、特に適当なプラスミドを使用づることが出来
る。このベクターが満足しなければならない条伺は、使
用する細胞内でそれが有効な形質転換及びクローン化ｆ
）ＮＡ配列の発現を可能にし得ることだけである。当業
省であれば必ず、バイブリプ−ジョンに使用覆る細胞と
必要であればクローン化するｒｌＮＡ配列の性質を考慮
して、使用するプラスミドのタイプを選択することがで
きるであろう３．クローン化する配列が、形質転換細胞
中でこの配列を弁環す−ることを可能にするプロモータ
ーの］ントロール下に既にあるか判明していない時は、
該発現のみを可能にづるものではなく、１８養培地中で
発現されるポリペプチドの分泌を可能にするプロモータ
ーの直接の］ン１〜「Ｉ−ル下（Ｊ買くことが有利であ
る。この右利なブ［］モーターは、例えばＳＶ４０ウィ
ルスあるいはＨＨＴ　Ｖウィルスから得られた強力ｔｈ
プ［］モーターである。

当然ながら問題のベクターは、例えばポリアデニル化部
位である、４ノルの細胞中のクローン化ＤＮＡ配列の転
写とｖＡ訳を確保し、好ましくはまた関連するＤＮＡ配
列のＩｔｌ訳の末端化を確保し得る全での遺伝子成分を
含んでいるのが右利である。

この場合、使用できるプラスミドの構成について強調す
る必要はない。数多くのこれ等のプラスミドが技術文献
に記載されいる。吐乳類の細胞、特にＶＥＲＯ系の細胞
を形質転換し得ること、及びその最後に細胞内で転写及
び発現し得るクローン化ＤＮＡ配列あるいは遺伝子を保
持し得ることが認識されるもの全てが使用できる。

最後に、いわゆる初期細胞及び樹０細胞のハイブリデー
シヨンは従来の条件下で行ない１９る。該°ハイブリッ
ドシ」ンは細胞壁を脆弱化することができるそれ自体公
知の試薬を用いて、融合を得ることが可能（２時点で実
施できる。従来のように、レンダイ（Ｓｅｎｄａ　ｉ　
）ウィルスあるいはより有利にはポリアル゛Ｖレンーポ
リオール（ＰＥＧ　１０００）、特にポリエチレン−グ
リコールを例えば培養培地に対して５００ｍｙ／−ある
いは４０重吊／容吊％の割合で使用して面詰を含まない
培養培地中で１分間行なう。

本発明の他の好ましい特徴は、以下の実施例中の本発明
の好ましい実施態様の記載の中でも明らかになるであろ
う。

使用した平置 初代培養のサル肝細胞を用い、サル正常細胞（ＶＦＲＯ
細胞）と融合させる。このν［ＲＯ細胞は（後の選択の
ために）　　Ｉｔ　Ｇ　Ｐ　ＲＴ−にされており、ｓ遺
伝子を尋人するとこれをかなり低レベルで発現する。

次にハイブリッドク（−１−ンを選択し、その発現レベ
ルを検査する。

−＋４　Ｉ’ｊ　、！ｍ涛−払 へ１冑 νＦＲＯＨＧＰＲＴ−細胞（１９８３年にｌｅｅ　Ｃ１
，Ｙ、らにＪ：つて得られたヒボキサンチングアニンホ
スホリボシルトランスフェラーゼを欠損しているＶＥＲ
Ｏ細胞由来のサル細胞）を２秤のベクターＤＮＡで同時
形質転換した（Ｇｒａｈａｍ　＆　Ｖａｎ　Ｄｅｒ　Ｅ
ｂ　（１９７３年）の方法によった）。一方のベクター
ＤＮＡはＨＢｓタンパク質をコードしている領域をもっ
ており（プラスミドＰＡＳＶ、　＋Ｊブタイブａｙｗ）
　、もう一方はアミノグリコシト−３°−ホスホートラ
ンスフエラー１４（ＡＰＬ＋３°）の遺伝子をもってい
た（プラスミドＰＷ）。酵素Ａ　ＰＩ−＋　３°を発現
Ｊるｌ・ランスフエクション細胞をアミノグリコシトＧ
　４１８（４００ｇ　／ｍｅ）のｔｊ　７４化ｒ、１択
した（Ｃｏｌｂδｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら、１９８０Ｚ
ｉ）。次にこの選択操作で１ｑられたり［１−ンをＨ１
３ｓタンパク質の産生についてテスｌ−した。

プラスミドＰＡＳＶのＤ　Ｎ　Ａ　ｉｏｇどプラスミド
ＰＷの１１ＮＡ　２’；Ｉ　トラ用イｒＶ［Ｒｏ　ＨＧ
ＰＲＴ−細ｐ　５Ｘ１０”個を同時トランスフェクショ
ンした。１〜ランスフエクシヨンの４目後に細胞を４つ
の分け、選択培地を加λ）：。

２）１−囚ノノフ■リシＢスρ−ｌ、、−ｎ−平Ａ　Ｆ
ｒ　１ｊ１−米プラスミドＰＡＳＶはプラスミドＰＡＣ
２（Ｐｏｔ＋ｒｃｅｌら、１９８２年）の誘導体であり
、ＨＦＩ　ＶウィルスのＳ領域をコードしている遺伝子
（Ｓ　Ｉ：　１１４３−　Ｂ　ｏ　ｍフラグメン１−１
１９８４年）と、ＳＶ４０ウィルスの複製開始点と、初
期プロモーター（ＰｖｕｌＴ　２３５−１１ｉｎｄｌｌ
　５１５４フラグメント）とをもっている。ｐＢＲ３２
２フラグメントは１１２０と２４９００間（Ｒ１４３６
０−８ａｔ　Ｉ　６５０）が欠失１．　Ｔ　イル（１，
ｕｓｋｙ　Ｈ，ら、１９８１年）。

プラスミドＰ　Ｗ　ＧＪアミノ〜グリ］シト−３゛−ホ
スホ１〜ランスフ■ラーゼをコードしている遺伝子をも
っており、この酵素を発現する細胞はアミノグリコシト
Ｇ４１８に対して耐性になる（ＣＯ１ｂｅｒ’ｅ−Ｇａ
ｒａｐｉｎ、　１９８１年）。

３）９ヲリＬＬ胞（７）Ｉｌ？］ｌ’ｌｌ！ＩＩ遺１１
」−１’ＵＪｎサル（アフリカミドリザル）の肝臓はメ
リコー研究所（ビＩｎ５ｔｉｔ吋Ｈ６ｒｉｅｕｘ）がら
入手した。

Ｓｅｇｌｅｎ　（１９７３年）の方法にいくつかの改良
を施した方法（Ｇ１１ｊ１１１ｅｎ−ＧｔｌｌｌｌＯＵ
ＺＯら、１９８０年：ならびに、１．　Ｆ、　＋１０１
＋５ｓａｉｓおよびＮ、　Ｃｈｅｎｃｉｎｅｒ、　１９
８３年）を用い、肝臓に］ラゲナーぜを注入した後肝細
胞を甲離した。

血清アルブミン、インクコリン。ヒドロコルチシン、お
よび１０％ウシ胎児面清を含有Ｊるｌｌａｍ　Ｆ１２培
地で肝細胞を培養した。

肝細胞をＦａｌｃｏｎプラスヂックフラス］に入れて３
６時間培養した後融合した。Ｖ［ＲＯＨＧＰＲＴ−細胞
の２種のクローン（クローン３．クローン３５７）の細
胞２×１０６個を培養肝細胞に加λ、細胞が１１着した
後ポリエチレングリコールに短時間接触させて融合を起
こした（　Ｒ，Ｉ　、　ＤａｖｉｄｓｏｎおよびＰ、５
Ｇｅｒａｌｄ、　１９７６年に記載のｊｊ法によった）
。２４時間後細胞をＩ−ＩＡ　Ｔ選択培地（１１１０ｅ
ｆｉｅｌｄ、　１９６４年）に移して親細胞ＶｒＲ０１
１ＧＰＲＴ−を除いた。融合せずにＰＥＧによって脆弱
化した肝細胞は自然に除かれ　ｌこ　。

引続き数週間にｎす、牛きているハイブリッドクローン
を甲離し、培養し、ｌ−Ｉ　Ｂ　ｓ抗原産！１能をテス
１〜した。

５）　Ｌ地−中−（７２ｊｊ　Ｂ下−抗一即産生の一塗
」［ζ］Ｌ定ＨＦ３　ｓ抗原の存在は、放射免疫法Ａｌ
ｌ５−ＲＴＡ　ＩＩ（Ａｂｂｏｔｔ）を用いて検出し１
、：ｏ培地に分泌されたｔｌＢｓＡｇの聞は、ＨＢｓ　
Ａｏ標品（＾ｂｂｏｔｔ）を希釈して作成ｌノだ栓型曲
線を用い、これど比較して決定した。

枯　　宋 ＶＥＲＯＨＧＰＲＴ−細胞を同時トランスフェクション
して得られた２種の細胞系（Ｖ３とＶ　３５７）を用い
て→Ｊル徂細胞（ＩＩＡｓ）との融合実験を行なった。

この２種の細胞系でのト（Ｂ　ｓ抗原の産生レベルは次
のとおりであった。

ｖ３（４回継代）・３６ｎｇ／１０６細胞／２４時間（
すなわち１８ｎｏ１５ｘ　１０”細胞） Ｖ３５７（７回継代）　：６５ｎｊｌ／１０”細胞／２
４時間（１なわち３２．５ｎ（］１５Ｘ　１０５細胞）
ハイブリッドクローン中のトＩＢＳ抗原産生レベルは次
のとおり。

ａ）ハイブリー７−ド」良５７ｘｊｊＱＳ　　（供試ク
ローンは４個）１９０　ｎＱ１５Ｘ　１０５細胞／２４
時間１６９　Ｈ１５Ｘ　１０５細胞／２４時間９５　ｎ
ｏ１５ｘ１０”細胞／２４時間７０　ｎｇ１５ｘ　１０
５細胞／２４時間ｂ）バイブ■久下−］現り祷凱 ４８４　ｎｇ１５ｘ　１０５細胞／２４時間４６５　ｎ
　ｇ／　５Ｘ　１０５細胞／２４時間３８４　ｎｇ１５
ｘ１０５細胞／２４時間２３１　ｎ（１１５Ｘ１０５細
胞／２４時間７１４　ｎｇ１５ｘ１０”細胞／２４時間
２９１　ｎｇ１５ｘ１０５細胞／２４時間細胞７御４ −　　ｖｒｎｏ細胞中細胞中台、多くの実験室で様々に
試験されているが、Ｓ遺伝子の導入後のこの遺＝　２７
　− 仏子の発現レベルは常に低かった。

−　ハイブリッドＶ３５７ｘ　ＨＡＳでは産生レベルが
２〜５倍になった。

一Ｖ３ＸｌＩＡＳの融合では１２〜４０倍レベルが」二
昇した。

当業者には明らかなように上記のハイブリッド細胞シス
テムｂ様々に最適化できる。たとえば、ベクターと１ヘ
ランスフエクシヨンするＤ　Ｎ　Ａ　Ｍｉ！　′９１１
（細胞性プロモーター、１ンハンサ一配列９等）とのレ
ベルで、およびハイブリッドのレベル（１ノブクローニ
ング、高産生（Ｌブクローンの単離１等）で最適化処理
ができ、または培地の組成を変化させたり、遺伝子の発
現を増強する天然もしくは合成の分子を加えたりするこ
とができる。

上記では特にＨＢＳ抗原の産生に関して本発明を説明し
た。もちろん、説明した方法はＢ型肝炎ウィルスのゲノ
ムのいずれかの部分にコードされているポリペプチドの
産生、たとえばＬＩ　Ｂｃ抗原の産生にも同様に適用で
きる。別の好ましい形態では、（上述の方法を用いて）
重合血清アルブミンに対づるレセプターを含有するペプ
ヂド領域（いわゆるプレＳ）をもつトＩ　Ｂ　ｓ粒子を
産生するハイブリッド細胞を得ることもできる。

ハイブリッドＶ３ｘｔ１＾Ｓ（細胞ｂ３２ｃ）は１９８
５年４月２５日付でフランス、パリのパスツール研究所
（ビＩｎ５ｔｉｌ：ｕｔ　Ｐａ５ｔｅ＋ｉｒ）のｌａ　
Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　Ｎａｔｉｏｎａｌｅｄｅｓ　Ｃ
＋目ｔｕｒｅｓ　ｄｅ　Ｈｉｃｒｏｏｒｇａｉｓｍｅｓ
　（ＣＮＣＨ）に番号Ｊ−４３８として寄託されている
。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）Ｂ型肝炎ウィルスゲノムの少なくとも一部に対応
   するクローン化ＤＮＡ配列を発現するかあるいは発現す
   る能力を獲得し得るハイブリッド細胞の製造方法であつ
   て、その中で前記クローン化ＤＮＡ配列が発現され得る
   かあるいはされているサルの樹立真核細胞と、好ましく
   はチンパンジーであるサルの肝細胞を、それ等がハイブ
   リデーシヨンできる適当な条件下で共培養し、該共培養
   は前記樹立細胞が前記肝細胞によって保持される適当な
   遺伝子配列を補給されないと増殖しないような培地中で
   行なうこと、及び形成したハイブリッド細胞を回収する
   ことを特徴とする前記方法。 （２）樹立細胞あるいは肝細胞あるいはその両方が前記
   共培養に先立つて前記クローン化ＤＮＡ配列で形質転換
   されており、前記共培養の後形成されたハイブリッド細
   胞から前記クローン化ＤＮＡによつてコードされたポリ
   ペプチドを生産するものであることを示すものを選択す
   ることを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の方法
   。 （３）前記共培養の結果得られたハイブリッド細胞自体
   を前記クローン化ＤＮＡ配列で形質転換すること、及び
   前記共培養の後形成されたハイブリッド細胞から前記ク
   ローン化配列によつてコードされたポリペプチドを生産
   するものであることをも示すものを選択することを特徴
   とする特許請求の範囲第１項に記載の方法。 （４）サルの樹立細胞がＶＥＲＯ系の細胞であることを
   特徴とする特許請求の範囲第１項乃至第３項のいずれか
   に記載の方法。 （５）ＶＥＲＯ細胞がＨＧＰＲＴ＾−細胞であること及
   び培養培地がＨＡＴ選択培地であることを特徴とする特
   許請求の範囲第４項に記載の方法。 （６）培養培地が特にアミノグリコシドタイプのような
   真核細胞内に侵入できる抗生物質を含んでおり、肝細胞
   が予め該抗生物質を不活性化できる酵素をコードするＤ
   ＮＡ配列で形質転換されていることを特徴とする特許請
   求の範囲第１項乃至第５項のいずれかに記載の方法。 （７）抗生物質がＧ４１８であり、ＤＮＡ配列がアミノ
   グリコシド３′−ホスホトランスフェラーゼをコードす
   ることを特徴とする特許請求の範囲第６項に記載の方法
   。 （８）前記クローン化ＤＮＡ配列がウィルス性Ｂ型肝炎
   ウィルスのＳ遺伝子の少なくとも一部を含んでいること
   を特徴とする特許請求の範囲第１項乃至第７項のいずれ
   かに記載の方法。 （９）前記クローン化ＤＮＡ配列がウィルス性Ｂ型肝炎
   ウィルスのゲノムのプレＳ領域をも含むことを特徴とす
   る特許請求の範囲第８項に記載の方法。 （１０）安定で継代し得、Ｂ型肝炎ウィルスゲノム中に
   含まれる所定遺伝子の全部あるいは一部を含むクローン
   化ＤＮＡ配列により形質転換されているか形質転換可能
   であるハイブリッド細胞で、前記配列は組み込まれてい
   るかあるいは前記ハイブリッド細胞中での発現が可能な
   条件下で組み込むことが可能なものであって、生来Ｂ型
   肝炎ウィルスのゲノム中に含まれる天然遺伝子の発現に
   好都合である、好ましくはチンパンジーであるサルの肝
   細胞系の遺伝形質の少なくとも一部と、遺伝標識形質を
   含み、この遺伝標識形質はこのハイブリッド細胞を、通
   常ならばサルの細胞に対して致死的ではあるが、該遺伝
   標識形質により発現されるポリペプチドにより不活性化
   される活性物質を含む培地である選択培地へ入れること
   を可能にするものである前記ハイブリッド細胞。 （１０）Ｂ型肝炎ウィルスに対する免疫原性防御体ポリ
   ペプチドをコードするＤＮＡ配列をゲノム中に組み込ま
   れて保持することを特徴とする特許請求の範囲第１０項
   に記載のハイブリッド細胞。 （１２）Ｂ型肝炎ウィルスのゲノムのＳ遺伝子の少なく
   とも一部、あるいは場合によってはプレＳ領域をコード
   する特許請求の範囲第１１項に記載のハイブリッド細胞
   。