JPS62297755A - 間質性肺炎診断用試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３、発明の詳細な説明 （産業上の利用分野） 本発明は、ヒト肺組織に親和性を有するマウスモノクロ
ーナル抗体を使用し、各種の間質性肺炎患者白酒中に存
在する可溶性抗原を定性又は定量する際に使用できる診
断薬にＩＩ！　するものである。

（従来の技術） 間質性肺炎は肺胞隔壁の細胞浸潤を特徴とする疾患であ
る。その病因は甲−でイにく、特発性間質性肺炎、サル
コイド−シス、過敏性肺臓炎、膠原病性肺臓炎、じん肺
、放射線肺臓炎、薬剤性肺臓炎など多種の疾患を含む病
態の総称である。これらの疾患の病因は不明のものが多
いため、治療法にも有効なものは少なく、僅かに副腎皮
質ホルモンの投与に反応して病態の改善をみとめる症例
が少数あるのみであり、多くは急速あるいは徐々に増悪
し、呼吸不全のため死に至る疾患群である。

ちなみに特発性間質性肺炎の平均予後は５年前後と報告
されている。また間質ｖ１肺炎の診断を下Ｊにあたって
は、本来病理学的検索が不可欠であるが、その病巣は肺
の末梢に（＜／置づるため、経気道的に気管支鏡を用い
て行う末梢肺生検を用いて病巣の主座を採取ηることは
困難であり、全身麻酔下に開胸瞳生検を施行する場合も
ある。組織学的裏付けの得られぬ症例に関しては、胸部
し線検査や肺機能検査及び病歴を参考にして臨床診断例
として取り扱わざるを得ない。また、間質性肺炎の進行
が慢性的長期にわたる症例の場合には、その病勢が活動
期にあるのかあるいは非活動期にあるのかということを
判断することもノ１常に困難とされている。活動性の指
標として坦在までに容認されているものとしては僅かに
３種の診断法があるのみで、第１に先に述べた開胸肺生
検による病理組ｍ像の検索、第２に６７Ｇａ−クエン酸
を用いたシンチグラムにおけるラジオアイソトープの集
積像の有無、及び第３に軽気退的に気管支鏡を用いて気
管支肺胞洗浄を行ない洗浄液中の細胞数の算程、細胞の
種類の同定をおこなうことである。

（発明が解決しようとする問題点） しかしながら、開胸肺生検【ま仝身麻酔下に行なう極め
て侵襲性の高い検査法であり、この検査を契機として間
質性肺炎の急性増悪をみとめることも少なからず存在す
ると報告されている。また６７Ｇａ−クエン酸を用いた
診断法は放射性物質を用いるため、充分な施設を有する
医療機関以外では実施不可能であるうえ、人体に放射性
物質を大量に投与することは医学上極めて好ましくない
と考えられるため繁回の実施は不可能である。第３の気
管支肺胞洗浄法は、第１にあげた開胸肺生検稈ではない
が、気道内に気管支鏡を挿入するため、換気量の低下を
伴ない思考の苦痛は並たいていではなく、頻回の実施は
ひかえられている。従って一般に、間質性肺炎の活動性
の指標としては面清中Ｌ　Ｄ　Ｈ（１ａｃｔｉｃ　ｄｅ
ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）値の測定が頻用されているが
、Ｌ　Ｄ　＋１値の変動は極めて鈍感であり、ＩＤＨ値
の増加をきたリー症例のほとんどは、非常に重篤な急性
増悪をおこしＩこ症例に限られているため間質性肺炎の
病勢把握の１゛ぐれた指標とは言い難い。

従って、間質性肺炎の活動性を適確かつ容易に評価でき
る指標の開発は非常に価値あることと考えられる。

（問題点を解決するための手段） 本発明はヒト肺組織を始めとするヒト組織に親和性を有
し、免疫学的測定法により血中の可溶性抗原を検出する
グロブリンクラスＩｇＧ１のマウスモノクローナル抗体
を作製し、その抗体の検出する白酒中の可溶性抗原を定
量することにより間質性肺炎の病態の活動性を評価する
指標とするものである。

即ち、本発明は、ヒト肺胞■型上皮、細気管支上皮及び
気管支腺漿液細胞に反応するＩＣｌＧ１クラスに属する
モノクローナル抗体Ｋ［−６を含むことを特徴とするヒ
ト間質性肺炎診断用試薬に関する。

なお、以下の説明において、特にことわりのない限り細
胞１組織等はヒトの細胞１組織である。

−只　　　　一 本発明で用いるヒト肺組織に対するモノクローナル抗体
は、例えばヒト肺組織由来の肺腺癌細胞株で免疫したマ
ウスの婢細胞とマウス骨髄腫細胞株との細胞融合により
ハイブリドーマを作製し、培養上清中の抗体の中から肺
組織に反応するものを選び、更に免疫学的手法により面
清中の可溶性抗原を検出する抗体を選択して作製される
。

本発明によるモノクロ−プル抗体を使用し、この抗体が
特異的に反応する面清中可溶性抗原を定量することによ
り、間質性肺炎思考の病態の活動性を鋭敏に診断するこ
とが可能であることを本発明者らははじめて見い出した
。

本発明のモノクローナル抗体は次のようにして製造する
ことができる。即ち、ヒト肺組織やヒト肺癌細胞株等で
マウス又はラット等を免疫し、免疫された動物から牌細
胞を得、これと骨髄腫細胞と融合し、得られた融合細胞
をクローン化し、ヒト肺胞■型上皮及び細気管支上皮、
気管支腺漿液細胞に反応する抗体を産生ずる融合細胞を
選択し、これを培養し抗体を回収する。得られた抗体を
精製し、一部の精製抗体に酵素や放射ｔ１を同位元素を
標識し、非標識抗体と標識抗体を用いてサンドイツチ法
を実施し、血清中の分子１ｉ１１００万以上の可溶性抗
原を検出する融合細胞を選択する。免疫法。

細胞融合法、融合細胞の選択法、　＋）ンドイッヂ法等
は公知の通常の方法によって行なうことができる。

更に詳しくは、例えば次のようにして本発明のモノクロ
ーナル抗体を製造し、診断用試薬とすることができる。

先ず、マウスを肺昂細胞で免疫覆る。免疫する動物はマ
ウスに限らず、ラット等のネズミ科の動物又はその他の
動物を使用してもよいが、通常はマウスを用いるのが好
ましい。又肺癌細胞の代りに正常肺組織やこれらのホモ
ジネート又はそれから採取された抗原を用いてもよい。

例えばＢＡＬＢ／Ｃマウスに肺癌細胞又は正常肺組織又
はこれらのホモジネート又はそれから採取された抗原を
数日〜数週間おきに数回接種する。接種間は１匹当り　
１回につき１０５〜１０８個の細胞を使うのが好ましい
。その後マウスより稗臓を摘出し、遠心分離により抗体
産生細胞を得る。この細胞は増殖していく能力を持たな
いので、自己増殖能力を有する細胞と融合させる。自己
増殖能力を有する細胞としては骨髄腫細胞が特に好まし
い。骨髄腫細胞としては、同種の動物のものを用いるの
が好ましい。又、骨髄腫細胞としては、抗体を産生じな
いものを選択するのが好ましい。抗体産生細胞と骨髄腫
細胞をポリエチレングリコール等の細胞融合剤と混合し
、細胞融合を行なう。抗体産生細胞と骨髄腫細胞の使用
割合は、細胞数比で１；１〜１０：１と覆るのが好まし
い。ｔｑられた融合細胞は限界希釈法により分離し、分
離した融合細胞は増殖させたのち、各穴（ウェル）にお
いて産生される抗体は公知の方法、例えば蛍光抗体法又
は酵素抗体法等により、各種細胞や組織等と反応させ、
その結果から所望の抗体を産生ずるハイブリドーマを選
択する。選択したハイブリドーマをｉｎ　ＶｉｔｒＯ培
養法又はｉｎ　ｖｉｖｏ移植法により増殖させ抗体を得
る。

ｉｎ　ＶｉｔｒＯ培養法としては、例えば次のように行
なうことができる。即ち、ハイブリドーマを適当な培養
液（例えば完全ＲＰＭＩ培地）で増殖限界になるまで培
養し、その培養上清を回収する。土浦中に分泌されたモ
ノクローナル抗体は以下の方法によりＩｑＧ分画として
精製して使用できる。即ち、培養上清を４０％飽和硫安
で沈澱させた後、ｐＨ７，８の２０１１Ｍリン酸緩衝液
で平衡化したジエブルアミンエチルセルロース力ラムを
通過させ不純物を除去して用いる。

又、ｉｎ　ｖｉｖｏ移植法としては、例えば次のように
行なうことができる。即ら、生体内、例えばヌードマウ
ス腹腔内にハイブリドーマを注入し、ヌードマウス体内
で腫瘍として生育させ、ヌードマウス血清あるいは腹水
から抗体を回収する。更に詳しくは、ハイブリドーマを
移植するＢＡＬＢ／Ｃマウスにあらかじめ（５〜１０日
前）　　２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカ
ンを腹腔内に０．５ｄ注射しておき、次にハイブリドー
マ５×１０６〜１０７個を腹腔内に移植する。移植され
たマウスを適当な時間飼育すると、腹腔内にバイブリド
−７の腫瘍が形成され、腹部が肥大してくる。この結果
、腹水及び血清中に高濃度のモノクロ−プール抗体が生
成され、それらを採取する。この腹水及び血清中には目
的のモノクローナル抗体以外に、マウス自身に由来する
多クローン竹抗体が合まれているが、それらはヒトの組
織とは反応しないために、特に分離しないで用いられる
。又、ｉｎ　ＶｉｊｒＯ培養法の場合と同様に、ｉｎ　
ｖｉｖｏ移植法においてもＩｏＧ分画にして使用するこ
とが可能である。

このようにして得られるモノクローナル抗体ＫＬ−６を
用いて血清中の抗原を免疫学的方法により定量しヒト間
質性肺炎の診断を行うことが出来る。

免疫学的測定法としてはエンザイムイムノアッセイ（Ｅ
ＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ＞、フルオレセ
インイムノアッセイ（ＦＩＡ）などの方法があり、モノ
クロ−犬ル抗体Ｋｌ　−６はこれらいずれの方法にも使
用でき、それらの方法用に合った形にして試薬として使
用される。これら試薬の製造は公知の方法によればよい
。これら免疫学的測定法において従来の測定技術即ち競
合法（例えば競合的Ｅｌｉｓａ法）、非競合法を用いる
ことによって、モノクローナル抗体ＫＬ−６を含む試薬
と抗原との反応物を形成させて測定される。

測定においては、Ｌツクローナル抗体ＫＬ−６を標識し
測定に用いる。標識剤としては、ＦＩＡでは西洋ワサビ
パーオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルカ
リフＡスフ７ターゼ等通常使用される酵素が使用され、
ＲＩＡでは　　Ｉ。

３日等の、又、ＦＩＡではフルオレセインイソチオシア
ネート等の、通常使用される標識剤が使用され得、標識
剤の活性が測定可能なものであればいずれでもよい。

標識剤が酵素である場合にはその活性を測定するために
基質が用いられる。基質としては例えば西洋ワサビパー
オキシダーゼの基質として５−アミノサリチル酸−Ｈ２
Ｏ２，０−フェニレンジアミン−Ｈ０、４−アミノアン
チピリン−Ｈ２Ｏ２などが、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ
の基質としては、フルオレセイン−ジー　（β−Ｄ−ガ
ラクトピラノシド）、Ｏ−ニトロソ１ノールーβ−Ｄ−
ガラクトピラノシド等を挙げることができる。

又、ポリスヂレン、ポリエチレン、ポリアクリル、テフ
ロン、プラスチック等合成樹脂製のビーズ、プレート等
の従来の免疫学的測定において使用される不溶性担体に
モノクローナル抗体ＫＬ−６をイ」着させて使用するこ
とが出来る。

又、前記標識物が不要な測定法を採用することもでき、
モノクローナル抗体ＫＬ−６と血清中の抗原との反応物
を形成させ、これを比濁法、ＰＥＧ沈澱法、ラテックス
凝集法等のｈｄｌを応用することにより測定を行うこと
ができる。

より具体的な例を示すと、精製したモノクローナル抗体
に１−６の酵素標識法としては、例えば過ヨウ素酸法で
西洋ワサビパーオキシダーゼを標識することができる。

また、放射性同位元素の１２５■標識法としては、例え
ばラクトパーオキシダーゼ法を用いることができる。

血清中の可溶性抗原の検出法としては、結合阻害法やサ
ンドイツチ法が好ましいとされているが、結合阻害法を
実施するためには、大量の抗原の精製が前提となるため
、一般にはサンドイツチ法が用いられる。サンドイツチ
法の実施法としては、まずポリスチレン等のビーズに精
製モノクローナル抗体を吸着させ、抗体標識ビーズとし
、試験管内で血清と反応させる。血清中に可溶性抗原が
存在すれば、抗体に結合する。洗浄後、酵素あるいは　
　Ｉを標識した標識抗体を反応させ洗浄すると、血清中
の抗原量に比例して、標識抗体がビーズに間接的に結合
したことになり、次いで結合した酵素の吊あるいは　　
Ｉの量を測定することにより、血清中の可溶性抗原のＭ
を定量することが可能である。

（実施例） 実施例１ １　）　　免　　疫 ８週令のｍ　Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃ　ｖウスを５×１
０６個の肺腺癌由来の細胞株（以下ＶＨＲＣ−ＬＣＲと
いう）で皮下に免疫し、その後２週間の間隔で２回腹腔
内に８×１０６個の細胞を注入した。

２）　細胞融合 最終免疫より３日後に牌臓を取り出し、ステンレスメツ
シュを通すことにより細胞懸濁液を作製した。この８．
４Ｘ　１０７個の牌細胞と４．２Ｘ　１０７個の８アザ
グアニン耐性骨髄腫細胞Ｐ３−ＮＳＩ−Ａｏ４／１（Ｎ
ＳＩ＞を混合し、遠沈後沈漬に１ｄの４５％ポリ■チレ
ングリコール（平均分子１ｆｉ６０００）を加え、２分
間ゆるやかに撹拌した。洗浄後、細胞混合液を１０％牛
脂児血清を含むＲＰＭＩ培地（完全ＲＰＭＩ培地）に懸
濁し、９６穴マイクロ培養プレートに　１穴当り１０６
個の割合で０．１−ずつまいた。２４時間後、ヒポキサ
ンチン１１００ｔ１　、アミノプテリン０．４μＭ、チ
ミジン１６μＭを含む完全ＲＰＭＩ培地（＋−ＩＡ　Ｔ
培地）を０．１＃１１！加えた。

培養開始後２日目、３日目、５日目、７日日、１０日目
に培養上清０．１ｍを捨て、ｌ−Ｉ　Ａ　Ｔ培地０．１
＃＋１！を加えた。１２日後に全ての穴にハイブリドー
マが増殖するのが観察された。

３）　ハイブリドーマの選択 ＶＨＲＣ−ＬＣＲ細胞に対して抗体を産生じているハイ
ブリドーマを酵素抗体法により選択した。酵素抗体法は
以下の如く行なった。

ＶＨＲＣ−ＬＣＲ細胞を９６穴マイクロ培養プレートで
増殖限界に達するまで培養し、０．２５％グルタルアル
デヒドで５〜７分間固定し、５回洗浄した。ハイブリド
ーマの培養上清０．１ｄを加え、室温で１時間反応させ
た。５回洗浄した後、第２抗体として５０成の西洋ワサ
ビベルＡキシダーＬ標識ヤギ抗マウス免疫グロブリンを
加え、１時間反応させた。

６〜７回洗った後、１．１％過酸化水素水と１５０ＩＩ
！ｇ／ｌｌｌ１！のアジノービス（３−エチルベンゾチ
アゾリン−６−６−スルフォン酸）（ＡＢＴＳ）を含む
５０１１１Ｍクエン酸緩衝液を１００／Ｚｉ！加え、１
０分間室温で発色させた。停止液として１０％シュウ酸
を５０成加え、４０５ｎｌｌｌの吸光度をマイクロプレ
ート用の分光光度計により測定し、０．０２以上吸光度
のあるハイブリドーマを選択した。

選択されたハイブリドーマはあらかじめＢＡＬＢ／ｃマ
ウスの胸腺細胞（フィーダー細胞）をまかれた２４穴培
養プレートに移され、１００μＭヒボキサンチンと１６
μＭチミジンを含む完全ＲＰＭＩ培地（ＨＴ培地）で培
養した。増殖限界に達した後、再び酵素抗体法によりＶ
ＨＲＣ−１，ｃＲ細胞に対して抗体産生を行なっている
ハイブリドーマを選んだ。

次に、選択されたハイブリドーマを限界希釈法によりク
ローニングした。即ち、細胞を５０個／ｄ！あるいは１
０個／ｄに希釈し、あらかじめフィーダー細胞をまかれ
た９６穴マイク［１培養プレートに０．１ｄずつ分注し
、ｌ−Ｉ　Ｔ培地により２週間培養した。１穴に　１個
のハイブリドーマコロニーが形成された場合をクローン
として取り出した。酵素抗体法によりＶＨＲＣ−ＬＣＲ
細胞に対して反応し、正常ヒト肺線維芽細胞に対して反
応しない抗体を分泌しているハイブリドーマクローンを
選択した。

更に、これらのクローンのうち、ヒト肺腺癌組織に反応
するクローンを凍結切片の免疫パーオキシダーゼ染色に
より選択した。つまり、ヒトの肺癌、その他の臓器癌及
び正常組織を手術材料により得、その４ＩＩＩＲ凍結切
片を作製した。アセトン固定後、ハイブリドーマクロー
ンの培養上清を加え、室温で３０分反応させた。よく洗
った後、ビオチン標識抗マウスＴＯＧ抗体（γ鎖、λ鎖
、に鎖と反応する）と室温で３０分反応させた。更に洗
浄後、アビジンとビオヂン標識西洋ワ１ノビパーオ↑シ
ダーゼを加え室温で１時間反応させ、よく洗った後基質
として０．５ＩＰｊ／Ｉｄのジアミノベンチジンと０．
０１％Ｈ２Ｏ２を含む５０ｍＭ　ｔ−リス−塩酸緩衝液
（ｐＨ７，０）を加え発色させた。

このようにして、肺胞■型上皮、細気管支上皮。

気管支腺漿液細胞、甲状腺瀘胞細胞１食道上皮。

噴門腺細胞、膵管上皮、尿細管上皮、膀胱移行上皮、子
宮内膜、肺腺癌、肺扁平上皮癌、肺小細胞癌、胃・十二
指賜乳頭部・胆管・膵・結腸・直腸・甲状腺・乳腺の腺
癌９食道扁平上皮癌には反応するが、気管支上皮、胃表
層粘Ｈｐ細胞、幽門腺。

十二指腸上皮、結腸上皮、直腸十皮、肝細胞、膵外分泌
細胞、膵内分泌細胞、腎糸球体細胞、子宮頚部扁平上皮
細胞、皮膚上皮、子宮扁平上皮癌。

肝細胞筋には反応しないモノクローナル抗体を産生する
ハイブリドーマが得られ、これをＫＬ−６細胞と名付け
、その産生ずるモノクローナル抗体をＫＬ−６抗体と命
名した。

４）　モノクローナル抗体の作製 （ａ）　　ｉｎ　ＶｉｔｒＯ培養法 １０５個／ｍｌ！のハイブリドーマを培養液（完全ＲＰ
ＭＩ培地）で増殖限界（２×１０６個／ｄ）になるまで
培養し、その培養上清を回収した。（但し、以下の方法
によりＩＯＧ分画にして使用することもできる。即ち、
培養上清を４０％飽和硫安で沈澱させた後、ｐｌ＋　７
．８の２０１１１Ｍリン酸緩衝液で平衡化したジエヂル
アミノ■プルセルロ−スカラム過させ不純物を除去して
用いる。） （ｂ）　ｉｎ　ｖｉｖｏ移ＩＩｉ！Ｉ払ハイブリドーマ
を移植するＢΔＬ　Ｂ　／　Ｃマウスにあらかじめ（５
〜１０日前）　　２，６，１０．１４−テトラメヂルペ
ンタデカンを腹腔中に０．　５ｍｌ！注射しておく。次
にハイブリドーマ５×１０６個を腹腔内に移植する。移
植されたマウスを３週間飼育すると、腹腔内にハイブリ
ドーマの腫瘍が形成され、腹部が肥大してくる。この結
果、腹水及び血清中に高Ｉ！！度のモノクローナル抗体
が生成され、それらを採取した。この腹水及び血清中に
は目的のモノクローナル抗体以外に、マウス自身に由来
する多クローン性抗体が含まれているが、それらはヒト
の組織とは反応しないために、特に分離しないで用いた
。（また、４）の（ａ）に示した方法によりＩＣＪＧ分
画にして使用できる。） ５）　ｔツクローナル抗体ＫＬ−６の特ｆ１ａ）正常肺
組織との反応性 Ｋ　Ｌ−６抗体と正常肺組織との反応性を免疫パーオキ
シダーゼ染色により調べた３、Ｋ　Ｌ．　−　６抗体＝
　　２　１　　− は■型肺胞十皮，細気管支上皮，気管支腺漿液細胞と反
応したが、■型ＩＭｉ胞上皮，気管支上皮，気管支腺粘
液細胞，間質とは反応しなかった。

ｂ）間質性肺炎の肺組織との反応性 ＫＬー６抗体は特発性間質性肺炎の肺組織における間質
性肺炎及び線維化部位において、再生した肺胞■型上皮
に反応したが、間質の膠原線維。

線雑芽細胞，炎症細胞には反応しなかった。

Ｃ）肺以外の正常組織との反応性 ＫＬ−６抗体は、甲状腺ｉ＆１胞上皮，食道上皮。

噴門腺細胞，膵管上皮，尿細管」−皮，膀胱移行上皮，
子宮内膜細胞と反応したが、胃表層粘膜細胞。

幽門腺細胞．十二指腸士皮．結腸上皮，直腸上皮。

肝細胞，膵外分泌・内分泌細胞，腎糸球体細胞。

子宮頚部扁平上皮，皮膚上皮．赤面法，白血球とは反応
しなかった。

ｄ）癌組織との反応性 Ｋ　Ｌ　−６抗体は肺腺癌、肺扁平上皮癌、肺小細胞癌
、胃癌、乳頭部癌、胆管癌、膵癌、結腸癌。

直腸癌、甲状腺乳頭状腺癌、乳癌、腎癌１食道扁平上皮
癌と反応したが、子宮頚部扁平上皮癌、肝細胞癌とは反
応しなかった。

ｅ）モノクローナル抗体ＫＬ−６と反応する細胞抗原 ＫＬ−６抗体と反応する細胞を過ヨーソ酸、ノイラミニ
ダーゼ、プロテアーゼで処即後、ＫＬ−６抗体と反応さ
せることにより、細胞抗原の生化学的性状を調べた。９
６穴マイクロ培養プレートにＶＨＲＣ−ＬＣＩｔ細胞を
増殖限界になるまで培養後、０．２５％ゲルタールアル
デヒドで固定し、よく洗った後、１　、１０．１００ｍ
Ｍの過ヨーソ酸、　０．０１，０．１．ｌｕ（単位）／
−のノイラミニダーゼを加え３０分間反応させた後洗浄
し、ＫＬ−６抗体と１時間反応させた。洗浄後、ｉ、Ｑ
Ｘ　１０　　ＣｐＨｌの　　Ｉ−標識ヤギ抗マウス免疫
グロブリンを加え１時間反応させた後、洗浄後、１００
ｐの０，２Ｎ水酸化ナトリウムで細胞を可溶化してポリ
スチレンチューブに移して、ガンマ−カウンターで放射
活性を測定した。その結果、未処理のものに比べて、過
ヨーソ酸、ノイラミニダーゼで処理した細胞に対するＫ
　Ｌ　−６抗体の結合は低下しており、ＫＬ−６抗体の
反応する細胞抗原は末端にシアル酸を有する糖鎖抗原で
あることがわかった。また、５×１０６個のＶＨＲＣ−
ＬＣＲ細胞を０，２５％プロナーゼと３０分間反応させ
た後洗浄し、０５−のＫ　Ｌ　−６抗体を３０分間反応
させ、洗浄後、１０／ｕのＦＩＴＣ（フルオレセイン　
イソヂオシアネート）標識ヤギ抗マウスＩ　ＯＧ　　Ｆ
　（ａｂ’）　２７ラグメン１−と３０分間反応させた
。洗浄後１％パラホルムアルデヒドで固定し、蛍光顕微
鏡で蛍光を観察したところ、プロナーゼで処理した細胞
は未処理の細胞に比べて蛍光が減弱していた。従って、
細胞上のＫＬ−６抗体反応抗原は蛋白部分も有している
ことがわかった。以上のことより、ＫＬ−６抗体の反応
する細胞抗原は糖蛋白で、抗原決定基は末端にシアル酸
を有する糖鎖であることが判明した。

ｆ）モノクローナル抗体ＫＬ−６と反応する可溶性抗原
の分子量 Ｋ１−６抗体の反応する可溶性抗原の分子量の測定のた
めには、癌性胸水をセファ［１−ス４Ｂでゲル濾過し、
得られた各フラクション中の可溶性抗原間を後述するサ
ンドイッチ酵素抗体法で定量化して決定した。その結果
、Ｋ　Ｌ−６抗体の反応する可溶性抗原の分子量は少な
くとも１００万以上であることが判明した。

６）　　ＫＬ−６抗体の反応する血清中可溶性抗原（Ｋ
Ｌ−６抗原）の定量 ａ）　　ＫＬ−６抗原の定量のためのサンドイッチ酸素
抗体法 血清中のＫＬ−６抗涼の定量のために、サンドイッチ酵
素抗体法をおこなった。同相としてポリスチレンど一ズ
を用いたが、まずビーズを５０埒／ｄの精製ＫＬ−６抗
体溶液（０，２５Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７，５）に浸し、
３７℃で１時間インキコベートした後、１０分間氷水中
で冷却しＩＣものを抗体吸着ビーズとして使用した。精
製Ｋ　ｉ−６抗体の酵素標識法は過ヨーソ酸法を用いた
。すなわち、５ＩＰＪの西洋ワサビパー第４〕シダーゼ
を１＃Ｉｌ！の０．３Ｍ炭酸緩衝液ｐＨ８，１に溶解し
た液に０．１−のＩＸ　１−フルオロ−２，４〜ジニト
ロベンゼン　エタノール溶液を加え、２０分間インキュ
ベート後、０．０１Ｍ炭酸緩衝液ｐＨ９，５に透析した
。透析後１ｄの０．０６Ｍ過ヨーソ酸を加え３０分間反
応させた後、更に１ｄの０、１６Ｍ　ｘブレングリコー
ルを加えて６０分間反応させ、再び０．０１Ｍ炭［衝液
１）８９．５に透析した後、同じ緩衝液で平衡化した５
ｍｇの精！１ＩＫＬ−６抗体溶液と混合して室温で反応
させた。３時間後、５■の水素化ホウ素ナトリウムを加
え、４℃で一夜静置した。その後ＰＢＳに透析して、更
にセファデックスＧ　−２００カラムでゲル濾過しで得
られた最初のピークをパーオキシダーゼ標識ＫＬ−６抗
体として使用した。

測定手順は、まずＫＬ−６抗体吸盾ヒーズを入れたガラ
スチューブに、プロティンバッファー（１０％正常ウサ
ギ血清、０．１％牛血清アルブミン。

０．１５Ｍ　　Ｐ　Ｂ　Ｓ　　Ｉｌｌ　６．４）で４０
倍に希釈した検体を０，３ｄ加え、３７℃で３時間イン
キコベートした。

その後生食で３回洗浄し、プロティンバッファーで１０
０倍に希釈したバーオキシダー１標識Ｋ　Ｌ　−６抗体
を０．３ｄ加え、１６から２０時間インキ１ベートした
。洗浄後、ビーズをポリスヂレンチューブに移し、０．
３〆の０ＰＤＡ溶液（０，３％ｏ−ｐｈｅｎｙｉｅｎｅ
ｄｉａｍｉｎｅ　ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、　
０．０２％　＠２Ｑ２゜０．０５Ｍ　Ｃ１ｔｒａｔｅ　
ｂｕｆｆｅｒ　ｐＨ４，０）を加え３０分間反応させた
後１ｄの２ＮＰＡ酸を加え反応を停止させ、吸光度０Ｄ
４９２を測定した。

標準検体として、毎回、肺癌による癌性胸水を１６０倍
希釈したものを６４０／ｄとし、第１図に示すこと＜　
０．２，４，８，１６，３２，６４ｕ／ｄの７点を使っ
て標準曲線を描き、検体の定ａをおこなった。

ｂ）健常者、各種悪性！ｌｆｒ瘍思考、良性肺疾患患者
及び他の炎症竹疾患患音の血清中ＫＬ−６抗原値の分布 第２図に示すごとく、健常者８０名のＫＬ−６抗原値は
２１８±１５２　ｕ／ｍｅ　（平均（ｍ１士標準偏差（
ＳＤ））であり、ｍ＋２ＳＤ値５８２０／ｄをｃｕｔ　
ｏｆｆ値とした。癌患者での陽性率は、肺癌３２％（３
２／９９）　。

胃癌Ｏ％（０／１９）　、大賜癌０χ（０／８）、肝細
胞病０％（０／８）、膵癌４４％（４／９）　、乳癌７
５％（６／８）であった。

良性肺疾患でのＫ　Ｌ−６抗原値は第３図に示しである
が、陽性率は肺胞性肺炎１０％（２／２１）、慢性気管
支炎０％（０／１５）、気管支喘息１１％（１／９）　
、肺気腫４０％（４／１０）、気管支拡張症４０％（２
１５）　、肺結核４３％（９／２１）、びまん性汎細気
管支炎４０％（４／１０）。

間質性肺炎５８％（２９１５０）であった。

肺以外の炎症性疾患におけるに１−−−６抗原値は第４
図に示しであるが、陽性率は慢性肝炎１１％（１／９）
、肝硬変１８％（２／１１）、膵炎０％（０／１４）、
胆のう炎θ％（０／７）であった。

Ｃ）間質性肺炎患者における血清中Ｋ　Ｌ−６抗原値 前述した如く間質性肺炎５０例の検討では血清中ＫＬ−
６抗原の陽性率が５８％と高率であったが、病因別に分
類すると、その陽性率は第５図に示すごとく、特発性間
質性肺炎６７％（１８／２７）　、膠原病性肺疾患４４
％（４／９）　、サルコイド−シス４０％（２１５）、
過敏性肺臓炎１００％（２／２）　、放射線肺臓炎及び
薬剤性肺臓炎５０％（３／６）　、じん肺０％（０／１
）であった。

間質性肺炎２８例における血清中Ｋ　Ｌ　−６抗原値と
血清中１［）　）ｌ　（ｌａｃｔｉｃ　ｄｅｈｙｄｒｏ
ｇｅｎａｓｅ）活性を比較検討すると、第６図に示すご
とく、両者の間に有意の相関はみとめず、陽性率は、Ｌ
ＤＨ値１１％（３／２７）であったのに対し、ＫＬ−６
抗原値は５７％（１６／２８）であり、ＫＬ−６抗原の
方が明らかにずぐれた５ｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙを示した
。

間質性肺炎の活動性を評価しつるとされている６７Ｇａ
−クエン酸シンチグラムの施行されていた１５例の間質
性肺炎について、Ｋ　Ｌ　−６抗原値を検討したところ
、第７図に示すごとり６７Ｇａの肺集積像をみとめた１
０例のＫＬ−６抗原陽性率は８０％（８／１０）であっ
たのに対し、６７Ｇａの集積像をみとめなかった５例で
はＫＬ−６抗原の陽性者をみとめず、雨音の間には強い
相関がみとめられた。

経過観察をおこなった間質性肺炎１２例のＫ　Ｌ　−６
抗原値の推移を第８図に示しである。自他覚所見の改善
をみとめ、間質性肺炎の軽快傾向を示した１例ではＫＬ
−６抗原値の低下を示した。臨床上、活動性にあまり変
化をみとめなかった６例でのＫｌ　−６抗原値の変動は
同様に僅少であった。

臨床上増悪傾向を示した５例、これらはすべて肺癌症例
であり、放射線療法がおこなわれて放射線肺臓炎をおこ
した症例であるが、肺臓炎をおこした後のＫ１−６抗原
値は全綱において増加していた。

以上のことから、血清Ｋ　Ｌ　−６抗原は、間質性肺炎
の活動性の指標として有用であることは明白である。

（発明の効果） 本発明の間質性肺炎診断用試薬を用いた場合、間質性肺
炎患者の病態の活１．ＩＪ　ｔ／Ｉを鋭敏に診断するこ
とができる。

【図面の簡単な説明】

第１図はＫｌ　−６抗原の標準曲線を示すグラフ、第２
図は血清中に１−６抗原値の分布を示す図、第３図は良
性肺疾患患者の血清中ＫＬ−６抗原値の分布を示す図、 第４図は肺疾患以外の良性疾患患者の血清中ＫＬ−６抗
原値の分布を示す図、 第５図は病因別に分類した間質性肺炎患者の血清中ＫＬ
−６抗原値の分布を示す図、 第６図は間質性肺炎患者の血清中ＫＬ−６抗原値と血清
中Ｌ　Ｄ　ｌ−１値との相関関係を示す図、第７図は６
７Ｇ　ａ−シンチグラムにょる間質性肺炎患者の血清中
ＫＬ−６抗現値の分布を示す図、第８図は間質性肺炎患
者の血清中ＫＬ−６抗原値の推移を示す図である。 第１図 ＫＬ−６推榛ｔ＋Ｕチ頗報 ＫＬ−６＊葡（ＭＪｒｆＬ　／ｍｌ　／開１十ま 伐巻例 第８区 師￥遼に＄邸１ｂ訪鼾辷清中ＫＬ−６看ｌ騒１ｒ　　　
攻　　　−ｔｌ　　　俊 イＸ′ＩＬ　　　　　喉例

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ヒト肺胞II型上皮、細気管支上皮及び気管支腺漿液細胞
   に反応するＩｇＧ＿１クラスに属するモノクローナル抗
   体ＫＬ−６を含むことを特徴とするヒト間質性肺炎診断
   用試薬。