JPS62297755A - Reagent for diagnosing interstitial pneumonia - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To enable sensitive diagnosis of the activity of a patient's disease condition by incorporating the monoclonal antibody KL-6 belonging to the IgG1 class which reacts with the human II-type alveolar epithelium, line bronchial epithelium, and bronchial gland serous cells into a titled reagent. CONSTITUTION:The mouse monoclonal antibody of the globulin class IgG1 which has the affinity to the human tissue including the human lung tissue and detects the soluble antigen in blood by an immunological measurement method is prepd. The soluble antigen in the serum detected by the antibody is quantitatively determined, by which the index to evaluate the activity of the disease condition of the interstitial pneumonia is obtd. More specifically, this reagent contains the monoclonal antibody KL-6 belonging to the IgG1 class which reacts with the human II-type alveolar epithelium, fine bronchial epithelium, and bronchial glad serous cells. The activity of the patient's disease condition is thus sharply diagnosed.

Description

【発明の詳細な説明】 ３、発明の詳細な説明 （産業上の利用分野） 本発明は、ヒト肺組織に親和性を有するマウスモノクロ
ーナル抗体を使用し、各種の間質性肺炎患者白酒中に存
在する可溶性抗原を定性又は定量する際に使用できる診
断薬にＩＩ！　するものである。Detailed Description of the Invention 3. Detailed Description of the Invention (Field of Industrial Application) The present invention uses a mouse monoclonal antibody that has an affinity for human lung tissue, and uses a mouse monoclonal antibody that has an affinity for human lung tissue to infect patients with various types of interstitial pneumonia in Baijiu. II! as a diagnostic agent that can be used to qualitatively or quantitatively quantify existing soluble antigens! It is something to do.

（従来の技術） 間質性肺炎は肺胞隔壁の細胞浸潤を特徴とする疾患であ
る。その病因は甲−でイにく、特発性間質性肺炎、サル
コイド−シス、過敏性肺臓炎、膠原病性肺臓炎、じん肺
、放射線肺臓炎、薬剤性肺臓炎など多種の疾患を含む病
態の総称である。これらの疾患の病因は不明のものが多
いため、治療法にも有効なものは少なく、僅かに副腎皮
質ホルモンの投与に反応して病態の改善をみとめる症例
が少数あるのみであり、多くは急速あるいは徐々に増悪
し、呼吸不全のため死に至る疾患群である。(Prior Art) Interstitial pneumonia is a disease characterized by cellular infiltration of alveolar septa. The etiology of this disease is most common, and is caused by various pathological conditions including idiopathic interstitial pneumonia, sarcoidosis, hypersensitivity pneumonitis, collagen pneumonitis, pneumoconiosis, radiation pneumonitis, and drug-induced pneumonitis. It is a generic term. Because the etiology of these diseases is often unknown, there are few effective treatments, and there are only a few cases in which the condition improves in response to the administration of adrenocortical hormones, and in many cases, the condition improves rapidly. Or it is a group of diseases that gradually worsen and lead to death due to respiratory failure.

ちなみに特発性間質性肺炎の平均予後は５年前後と報告
されている。また間質ｖ１肺炎の診断を下Ｊにあたって
は、本来病理学的検索が不可欠であるが、その病巣は肺
の末梢に（＜／置づるため、経気道的に気管支鏡を用い
て行う末梢肺生検を用いて病巣の主座を採取ηることは
困難であり、全身麻酔下に開胸瞳生検を施行する場合も
ある。組織学的裏付けの得られぬ症例に関しては、胸部
し線検査や肺機能検査及び病歴を参考にして臨床診断例
として取り扱わざるを得ない。また、間質性肺炎の進行
が慢性的長期にわたる症例の場合には、その病勢が活動
期にあるのかあるいは非活動期にあるのかということを
判断することもノ１常に困難とされている。活動性の指
標として坦在までに容認されているものとしては僅かに
３種の診断法があるのみで、第１に先に述べた開胸肺生
検による病理組ｍ像の検索、第２に６７Ｇａ−クエン酸
を用いたシンチグラムにおけるラジオアイソトープの集
積像の有無、及び第３に軽気退的に気管支鏡を用いて気
管支肺胞洗浄を行ない洗浄液中の細胞数の算程、細胞の
種類の同定をおこなうことである。Incidentally, the average prognosis for idiopathic interstitial pneumonia is reported to be around 5 years. In addition, when diagnosing interstitial V1 pneumonia, a pathological search is essential. It is difficult to extract the main site of the lesion using a biopsy, so open pupil biopsy may be performed under general anesthesia.In cases where histological support cannot be obtained, the chest line It must be treated as a clinical diagnosis case by referring to examinations, pulmonary function tests, and medical history.In addition, in cases where the progression of interstitial pneumonia is chronic and long-term, it is necessary to determine whether the disease is in an active stage or not. It has always been difficult to determine whether the patient is in the active stage.There are only three diagnostic methods that are currently accepted as indicators of activity. 1. Search for pathological images from open lung biopsy as described above, 2. Check for radioisotope accumulation on scintigrams using 67Ga-citric acid, and 3. This involves performing bronchoalveolar lavage using a mirror, calculating the number of cells in the lavage fluid, and identifying the type of cells.

（発明が解決しようとする問題点） しかしながら、開胸肺生検【ま仝身麻酔下に行なう極め
て侵襲性の高い検査法であり、この検査を契機として間
質性肺炎の急性増悪をみとめることも少なからず存在す
ると報告されている。また６７Ｇａ−クエン酸を用いた
診断法は放射性物質を用いるため、充分な施設を有する
医療機関以外では実施不可能であるうえ、人体に放射性
物質を大量に投与することは医学上極めて好ましくない
と考えられるため繁回の実施は不可能である。第３の気
管支肺胞洗浄法は、第１にあげた開胸肺生検稈ではない
が、気道内に気管支鏡を挿入するため、換気量の低下を
伴ない思考の苦痛は並たいていではなく、頻回の実施は
ひかえられている。従って一般に、間質性肺炎の活動性
の指標としては面清中Ｌ　Ｄ　Ｈ（１ａｃｔｉｃ　ｄｅ
ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）値の測定が頻用されているが
、Ｌ　Ｄ　＋１値の変動は極めて鈍感であり、ＩＤＨ値
の増加をきたリー症例のほとんどは、非常に重篤な急性
増悪をおこしＩこ症例に限られているため間質性肺炎の
病勢把握の１゛ぐれた指標とは言い難い。(Problems to be solved by the invention) However, open lung biopsy [is an extremely invasive test method performed under general anesthesia, and it is difficult to use this test as an opportunity to detect acute exacerbation of interstitial pneumonia. It is also reported that there are quite a few. Furthermore, since the diagnostic method using 67Ga-citric acid uses radioactive substances, it cannot be carried out except at medical institutions with sufficient facilities, and it is medically extremely undesirable to administer large amounts of radioactive substances to the human body. Therefore, it is impossible to implement it frequently. The third bronchoalveolar lavage method is not the open lung biopsy culm mentioned in the first method, but because it involves inserting a bronchoscope into the airway, the pain of thinking is not unusual as it is accompanied by a decrease in ventilation volume. , frequent implementation is discouraged. Therefore, LDH in the facial serum is generally used as an indicator of the activity of interstitial pneumonia.
Hydrogenase) level measurements are frequently used, but changes in L D +1 values are extremely insensitive, and most cases of Lee with increased IDH levels develop very severe acute exacerbation, and this is limited to this case. Therefore, it is difficult to say that it is an excellent indicator for understanding the disease status of interstitial pneumonia.

従って、間質性肺炎の活動性を適確かつ容易に評価でき
る指標の開発は非常に価値あることと考えられる。Therefore, the development of an index that can accurately and easily evaluate the activity of interstitial pneumonia is considered to be of great value.

（問題点を解決するための手段） 本発明はヒト肺組織を始めとするヒト組織に親和性を有
し、免疫学的測定法により血中の可溶性抗原を検出する
グロブリンクラスＩｇＧ１のマウスモノクローナル抗体
を作製し、その抗体の検出する白酒中の可溶性抗原を定
量することにより間質性肺炎の病態の活動性を評価する
指標とするものである。(Means for Solving the Problems) The present invention is a mouse monoclonal antibody of globulin class IgG1 that has affinity for human tissues including human lung tissue and detects soluble antigens in blood by immunoassay. The aim is to produce an antibody and quantify the soluble antigen in baijiu that is detected by the antibody, thereby using it as an index to evaluate the activity of the pathological condition of interstitial pneumonia.

即ち、本発明は、ヒト肺胞■型上皮、細気管支上皮及び
気管支腺漿液細胞に反応するＩＣｌＧ１クラスに属する
モノクローナル抗体Ｋ［−６を含むことを特徴とするヒ
ト間質性肺炎診断用試薬に関する。That is, the present invention relates to a reagent for diagnosing human interstitial pneumonia characterized by containing a monoclonal antibody K[-6 belonging to the IClG1 class that reacts with human alveolar type II epithelium, bronchiolar epithelium, and bronchial gland serous cells. .

なお、以下の説明において、特にことわりのない限り細
胞１組織等はヒトの細胞１組織である。In the following description, unless otherwise specified, cells 1 tissues, etc. are human cells 1 tissues.

−只　　　　一 本発明で用いるヒト肺組織に対するモノクローナル抗体
は、例えばヒト肺組織由来の肺腺癌細胞株で免疫したマ
ウスの婢細胞とマウス骨髄腫細胞株との細胞融合により
ハイブリドーマを作製し、培養上清中の抗体の中から肺
組織に反応するものを選び、更に免疫学的手法により面
清中の可溶性抗原を検出する抗体を選択して作製される
。- Monoclonal antibodies directed against human lung tissue used in the present invention can be prepared by, for example, producing hybridomas by cell fusion of murine myeloma cell lines and mouse murine cells immunized with a lung adenocarcinoma cell line derived from human lung tissue, and culturing the monoclonal antibodies against human lung tissue. It is produced by selecting antibodies in the supernatant that react with lung tissue, and then selecting antibodies that detect soluble antigens in the supernatant using immunological techniques.

本発明によるモノクロ−プル抗体を使用し、この抗体が
特異的に反応する面清中可溶性抗原を定量することによ
り、間質性肺炎思考の病態の活動性を鋭敏に診断するこ
とが可能であることを本発明者らははじめて見い出した
。By using the monoclonal antibody according to the present invention and quantifying the soluble antigen in the surface serum to which this antibody specifically reacts, it is possible to acutely diagnose the activity of the pathological condition of interstitial pneumonia. The present inventors discovered this for the first time.

本発明のモノクローナル抗体は次のようにして製造する
ことができる。即ち、ヒト肺組織やヒト肺癌細胞株等で
マウス又はラット等を免疫し、免疫された動物から牌細
胞を得、これと骨髄腫細胞と融合し、得られた融合細胞
をクローン化し、ヒト肺胞■型上皮及び細気管支上皮、
気管支腺漿液細胞に反応する抗体を産生ずる融合細胞を
選択し、これを培養し抗体を回収する。得られた抗体を
精製し、一部の精製抗体に酵素や放射ｔ１を同位元素を
標識し、非標識抗体と標識抗体を用いてサンドイツチ法
を実施し、血清中の分子１ｉ１１００万以上の可溶性抗
原を検出する融合細胞を選択する。免疫法。The monoclonal antibody of the present invention can be produced as follows. That is, mice, rats, etc. are immunized with human lung tissue or human lung cancer cell lines, etc., tile cells are obtained from the immunized animal, these are fused with myeloma cells, and the resulting fused cells are cloned to produce human lung cancer cells. cell type epithelium and bronchiolar epithelium,
Fused cells that produce antibodies that react with bronchial gland serous cells are selected, cultured, and the antibodies recovered. The obtained antibodies were purified, some of the purified antibodies were labeled with enzymes, radioactive t1, and isotopes, and the Sand-Deutsche method was performed using unlabeled and labeled antibodies to identify soluble antigens with more than 11 million molecules in serum. Select fused cells to detect. Immunization method.

細胞融合法、融合細胞の選択法、　＋）ンドイッヂ法等
は公知の通常の方法によって行なうことができる。The cell fusion method, the fused cell selection method, the +) Ndoidge method, etc. can be carried out by known conventional methods.

更に詳しくは、例えば次のようにして本発明のモノクロ
ーナル抗体を製造し、診断用試薬とすることができる。More specifically, the monoclonal antibody of the present invention can be produced as a diagnostic reagent, for example, as follows.

先ず、マウスを肺昂細胞で免疫覆る。免疫する動物はマ
ウスに限らず、ラット等のネズミ科の動物又はその他の
動物を使用してもよいが、通常はマウスを用いるのが好
ましい。又肺癌細胞の代りに正常肺組織やこれらのホモ
ジネート又はそれから採取された抗原を用いてもよい。First, mice are immunized with lung cells. The animal to be immunized is not limited to mice, but murine animals such as rats or other animals may be used; however, it is usually preferable to use mice. Furthermore, normal lung tissues, homogenates thereof, or antigens collected therefrom may be used instead of lung cancer cells.

例えばＢＡＬＢ／Ｃマウスに肺癌細胞又は正常肺組織又
はこれらのホモジネート又はそれから採取された抗原を
数日〜数週間おきに数回接種する。接種間は１匹当り　
１回につき１０５〜１０８個の細胞を使うのが好ましい
。その後マウスより稗臓を摘出し、遠心分離により抗体
産生細胞を得る。この細胞は増殖していく能力を持たな
いので、自己増殖能力を有する細胞と融合させる。自己
増殖能力を有する細胞としては骨髄腫細胞が特に好まし
い。骨髄腫細胞としては、同種の動物のものを用いるの
が好ましい。又、骨髄腫細胞としては、抗体を産生じな
いものを選択するのが好ましい。抗体産生細胞と骨髄腫
細胞をポリエチレングリコール等の細胞融合剤と混合し
、細胞融合を行なう。抗体産生細胞と骨髄腫細胞の使用
割合は、細胞数比で１；１〜１０：１と覆るのが好まし
い。ｔｑられた融合細胞は限界希釈法により分離し、分
離した融合細胞は増殖させたのち、各穴（ウェル）にお
いて産生される抗体は公知の方法、例えば蛍光抗体法又
は酵素抗体法等により、各種細胞や組織等と反応させ、
その結果から所望の抗体を産生ずるハイブリドーマを選
択する。選択したハイブリドーマをｉｎ　ＶｉｔｒＯ培
養法又はｉｎ　ｖｉｖｏ移植法により増殖させ抗体を得
る。For example, BALB/C mice are inoculated with lung cancer cells, normal lung tissue, homogenates thereof, or antigens collected therefrom several times at intervals of several days to several weeks. per animal between vaccinations
Preferably, 105 to 108 cells are used at one time. Thereafter, the glenoid is removed from the mouse, and antibody-producing cells are obtained by centrifugation. Since these cells do not have the ability to proliferate, they are fused with cells that have the ability to self-propagate. Myeloma cells are particularly preferred as cells with self-propagation ability. It is preferable to use myeloma cells from the same species of animal. Furthermore, it is preferable to select myeloma cells that do not produce antibodies. Antibody-producing cells and myeloma cells are mixed with a cell fusion agent such as polyethylene glycol to perform cell fusion. The ratio of antibody-producing cells to myeloma cells used is preferably 1:1 to 10:1 in cell number ratio. The tq'd fused cells are separated by limiting dilution method, and after the separated fused cells are grown, the antibodies produced in each well are treated with various types of antibodies using known methods such as fluorescent antibody method or enzyme antibody method. React with cells, tissues, etc.
From the results, hybridomas producing the desired antibody are selected. The selected hybridomas are grown by in VitrO culture method or in vivo transplantation method to obtain antibodies.

ｉｎ　ＶｉｔｒＯ培養法としては、例えば次のように行
なうことができる。即ち、ハイブリドーマを適当な培養
液（例えば完全ＲＰＭＩ培地）で増殖限界になるまで培
養し、その培養上清を回収する。土浦中に分泌されたモ
ノクローナル抗体は以下の方法によりＩｑＧ分画として
精製して使用できる。即ち、培養上清を４０％飽和硫安
で沈澱させた後、ｐＨ７，８の２０１１Ｍリン酸緩衝液
で平衡化したジエブルアミンエチルセルロース力ラムを
通過させ不純物を除去して用いる。The in VitrO culture method can be carried out, for example, as follows. That is, hybridomas are cultured in an appropriate culture medium (for example, complete RPMI medium) until the growth limit is reached, and the culture supernatant is collected. The monoclonal antibody secreted into Tsuchiura can be purified and used as an IqG fraction by the following method. That is, the culture supernatant is precipitated with 40% saturated ammonium sulfate, and then passed through a diebulamine ethyl cellulose ram equilibrated with 2011M phosphate buffer at pH 7.8 to remove impurities before use.

又、ｉｎ　ｖｉｖｏ移植法としては、例えば次のように
行なうことができる。即ら、生体内、例えばヌードマウ
ス腹腔内にハイブリドーマを注入し、ヌードマウス体内
で腫瘍として生育させ、ヌードマウス血清あるいは腹水
から抗体を回収する。更に詳しくは、ハイブリドーマを
移植するＢＡＬＢ／Ｃマウスにあらかじめ（５〜１０日
前）　　２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカ
ンを腹腔内に０．５ｄ注射しておき、次にハイブリドー
マ５×１０６〜１０７個を腹腔内に移植する。移植され
たマウスを適当な時間飼育すると、腹腔内にバイブリド
−７の腫瘍が形成され、腹部が肥大してくる。この結果
、腹水及び血清中に高濃度のモノクロ−プール抗体が生
成され、それらを採取する。この腹水及び血清中には目
的のモノクローナル抗体以外に、マウス自身に由来する
多クローン竹抗体が合まれているが、それらはヒトの組
織とは反応しないために、特に分離しないで用いられる
。又、ｉｎ　ＶｉｊｒＯ培養法の場合と同様に、ｉｎ　
ｖｉｖｏ移植法においてもＩｏＧ分画にして使用するこ
とが可能である。Further, as an in vivo transplantation method, for example, it can be carried out as follows. That is, a hybridoma is injected into the body, for example, into the peritoneal cavity of a nude mouse, allowed to grow as a tumor within the body of the nude mouse, and antibodies are collected from the serum or ascites of the nude mouse. More specifically, 2,6,10,14-tetramethylpentadecane was injected intraperitoneally for 0.5 d in advance (5 to 10 days before) into BALB/C mice to which hybridomas were to be transplanted, and then hybridomas of 5 x 106 ~ 107 cells are implanted intraperitoneally. When the transplanted mouse is kept for an appropriate period of time, a tumor of Vybrid-7 is formed in the abdominal cavity, and the abdomen becomes enlarged. As a result, high concentrations of monoclonal pooled antibodies are produced in the ascites and serum, and these are collected. In addition to the monoclonal antibody of interest, the ascites and serum contain polyclonal bamboo antibodies derived from the mouse itself, but since they do not react with human tissue, they are used without being isolated. Also, as in the case of the in VijrO culture method, in
It is also possible to use the IoG fraction in the in vivo transplantation method.

このようにして得られるモノクローナル抗体ＫＬ−６を
用いて血清中の抗原を免疫学的方法により定量しヒト間
質性肺炎の診断を行うことが出来る。Using the monoclonal antibody KL-6 thus obtained, the antigen in serum can be quantified by an immunological method to diagnose human interstitial pneumonia.

免疫学的測定法としてはエンザイムイムノアッセイ（Ｅ
ＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ＞、フルオレセ
インイムノアッセイ（ＦＩＡ）などの方法があり、モノ
クロ−犬ル抗体Ｋｌ　−６はこれらいずれの方法にも使
用でき、それらの方法用に合った形にして試薬として使
用される。これら試薬の製造は公知の方法によればよい
。これら免疫学的測定法において従来の測定技術即ち競
合法（例えば競合的Ｅｌｉｓａ法）、非競合法を用いる
ことによって、モノクローナル抗体ＫＬ−６を含む試薬
と抗原との反応物を形成させて測定される。Enzyme immunoassay (E
IA), radioimmunoassay (RIA), and fluorescein immunoassay (FIA).The monochrome antibody Kl-6 can be used in any of these methods, and can be made into a form suitable for these methods and used as a reagent. These reagents may be manufactured by known methods.In these immunoassays, monoclonal antibody KL It is measured by forming a reaction product between a reagent containing -6 and an antigen.

測定においては、Ｌツクローナル抗体ＫＬ−６を標識し
測定に用いる。標識剤としては、ＦＩＡでは西洋ワサビ
パーオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルカ
リフＡスフ７ターゼ等通常使用される酵素が使用され、
ＲＩＡでは　　Ｉ。In the measurement, the L-clonal antibody KL-6 is labeled and used for the measurement. As labeling agents, enzymes commonly used in FIA such as horseradish peroxidase, β-D-galactosidase, and alkaline A-sulfatase are used.
I at RIA.

３日等の、又、ＦＩＡではフルオレセインイソチオシア
ネート等の、通常使用される標識剤が使用され得、標識
剤の活性が測定可能なものであればいずれでもよい。For FIA, commonly used labeling agents such as fluorescein isothiocyanate can be used, and any labeling agent can be used as long as the activity of the labeling agent can be measured.

標識剤が酵素である場合にはその活性を測定するために
基質が用いられる。基質としては例えば西洋ワサビパー
オキシダーゼの基質として５−アミノサリチル酸−Ｈ２
Ｏ２，０−フェニレンジアミン−Ｈ０、４−アミノアン
チピリン−Ｈ２Ｏ２などが、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ
の基質としては、フルオレセイン−ジー　（β−Ｄ−ガ
ラクトピラノシド）、Ｏ−ニトロソ１ノールーβ−Ｄ−
ガラクトピラノシド等を挙げることができる。When the labeling agent is an enzyme, a substrate is used to measure its activity. As a substrate, for example, 5-aminosalicylic acid-H2 is used as a substrate for horseradish peroxidase.
Substrates for β-D-galactosidase include O2,0-phenylenediamine-H0, 4-aminoantipyrine-H2O2, etc.; −
Examples include galactopyranoside.

又、ポリスヂレン、ポリエチレン、ポリアクリル、テフ
ロン、プラスチック等合成樹脂製のビーズ、プレート等
の従来の免疫学的測定において使用される不溶性担体に
モノクローナル抗体ＫＬ−６をイ」着させて使用するこ
とが出来る。Furthermore, monoclonal antibody KL-6 can be attached to insoluble carriers used in conventional immunoassays, such as beads and plates made of synthetic resins such as polystyrene, polyethylene, polyacrylic, Teflon, and plastic. I can do it.

又、前記標識物が不要な測定法を採用することもでき、
モノクローナル抗体ＫＬ−６と血清中の抗原との反応物
を形成させ、これを比濁法、ＰＥＧ沈澱法、ラテックス
凝集法等のｈｄｌを応用することにより測定を行うこと
ができる。In addition, it is also possible to adopt a measurement method that does not require the label,
Measurement can be performed by forming a reaction product between the monoclonal antibody KL-6 and the antigen in serum, and applying hdl such as turbidimetry, PEG precipitation method, and latex agglutination method.

より具体的な例を示すと、精製したモノクローナル抗体
に１−６の酵素標識法としては、例えば過ヨウ素酸法で
西洋ワサビパーオキシダーゼを標識することができる。To give a more specific example, the purified monoclonal antibody can be labeled with horseradish peroxidase, for example, by the periodic acid method as an enzyme labeling method for 1-6.

また、放射性同位元素の１２５■標識法としては、例え
ばラクトパーオキシダーゼ法を用いることができる。Furthermore, as a 125-labeling method with a radioactive isotope, for example, a lactoperoxidase method can be used.

血清中の可溶性抗原の検出法としては、結合阻害法やサ
ンドイツチ法が好ましいとされているが、結合阻害法を
実施するためには、大量の抗原の精製が前提となるため
、一般にはサンドイツチ法が用いられる。サンドイツチ
法の実施法としては、まずポリスチレン等のビーズに精
製モノクローナル抗体を吸着させ、抗体標識ビーズとし
、試験管内で血清と反応させる。血清中に可溶性抗原が
存在すれば、抗体に結合する。洗浄後、酵素あるいは　
　Ｉを標識した標識抗体を反応させ洗浄すると、血清中
の抗原量に比例して、標識抗体がビーズに間接的に結合
したことになり、次いで結合した酵素の吊あるいは　　
Ｉの量を測定することにより、血清中の可溶性抗原のＭ
を定量することが可能である。The binding inhibition method and the Sand-Deutsch method are considered to be preferable methods for detecting soluble antigens in serum, but since the binding inhibition method requires purification of a large amount of antigen, the Sand-Deutsch method is generally used. is used. To carry out the sandwich method, first, purified monoclonal antibodies are adsorbed onto beads such as polystyrene to form antibody-labeled beads, which are then reacted with serum in a test tube. If soluble antigen is present in the serum, it will bind to the antibody. After washing, enzyme or
When a labeled antibody labeled with I is reacted and washed, the labeled antibody is indirectly bound to the beads in proportion to the amount of antigen in the serum, and then the bound enzyme is suspended or
M of soluble antigen in serum by measuring the amount of I
It is possible to quantify.

（実施例） 実施例１ １　）　　免　　疫 ８週令のｍ　Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃ　ｖウスを５×１
０６個の肺腺癌由来の細胞株（以下ＶＨＲＣ−ＬＣＲと
いう）で皮下に免疫し、その後２週間の間隔で２回腹腔
内に８×１０６個の細胞を注入した。(Example) Example 1 1) Immunization 8-week-old mBALB/cv mice were 5×1
06 lung adenocarcinoma-derived cell line (hereinafter referred to as VHRC-LCR), and then 8 x 106 cells were intraperitoneally injected twice at 2-week intervals.

２）　細胞融合 最終免疫より３日後に牌臓を取り出し、ステンレスメツ
シュを通すことにより細胞懸濁液を作製した。この８．
４Ｘ　１０７個の牌細胞と４．２Ｘ　１０７個の８アザ
グアニン耐性骨髄腫細胞Ｐ３−ＮＳＩ−Ａｏ４／１（Ｎ
ＳＩ＞を混合し、遠沈後沈漬に１ｄの４５％ポリ■チレ
ングリコール（平均分子１ｆｉ６０００）を加え、２分
間ゆるやかに撹拌した。洗浄後、細胞混合液を１０％牛
脂児血清を含むＲＰＭＩ培地（完全ＲＰＭＩ培地）に懸
濁し、９６穴マイクロ培養プレートに　１穴当り１０６
個の割合で０．１−ずつまいた。２４時間後、ヒポキサ
ンチン１１００ｔ１　、アミノプテリン０．４μＭ、チ
ミジン１６μＭを含む完全ＲＰＭＩ培地（＋−ＩＡ　Ｔ
培地）を０．１＃１１！加えた。2) Cell fusion Three days after the final immunization, the spleen was taken out and passed through a stainless mesh to prepare a cell suspension. This 8.
4X 107 tile cells and 4.2X 107 8 azaguanine-resistant myeloma cells P3-NSI-Ao4/1 (N
After centrifugation, 1 d of 45% polyethylene glycol (average molecular weight 1 fi 6000) was added and gently stirred for 2 minutes. After washing, the cell mixture was suspended in RPMI medium containing 10% tallow serum (complete RPMI medium) and placed in a 96-well microculture plate at 106 cells per well.
The seeds were sown at a ratio of 0.1. After 24 hours, complete RPMI medium (+-IA T
Medium) 0.1#11! added.

培養開始後２日目、３日目、５日目、７日日、１０日目
に培養上清０．１ｍを捨て、ｌ−Ｉ　Ａ　Ｔ培地０．１
＃＋１！を加えた。１２日後に全ての穴にハイブリドー
マが増殖するのが観察された。On the 2nd, 3rd, 5th, 7th, and 10th day after the start of culture, 0.1 m of the culture supernatant was discarded and 0.1 m of l-IAT medium was added.
#+1! added. After 12 days, hybridomas were observed to grow in all the wells.

３）　ハイブリドーマの選択 ＶＨＲＣ−ＬＣＲ細胞に対して抗体を産生じているハイ
ブリドーマを酵素抗体法により選択した。酵素抗体法は
以下の如く行なった。3) Selection of hybridomas Hybridomas producing antibodies against VHRC-LCR cells were selected by enzyme antibody method. The enzyme antibody method was performed as follows.

ＶＨＲＣ−ＬＣＲ細胞を９６穴マイクロ培養プレートで
増殖限界に達するまで培養し、０．２５％グルタルアル
デヒドで５〜７分間固定し、５回洗浄した。ハイブリド
ーマの培養上清０．１ｄを加え、室温で１時間反応させ
た。５回洗浄した後、第２抗体として５０成の西洋ワサ
ビベルＡキシダーＬ標識ヤギ抗マウス免疫グロブリンを
加え、１時間反応させた。VHRC-LCR cells were cultured in a 96-well microculture plate until reaching the growth limit, fixed with 0.25% glutaraldehyde for 5-7 minutes, and washed 5 times. 0.1 d of hybridoma culture supernatant was added and reacted at room temperature for 1 hour. After washing 5 times, 50 ml of horseradish BelA oxider L-labeled goat anti-mouse immunoglobulin was added as a second antibody and allowed to react for 1 hour.

６〜７回洗った後、１．１％過酸化水素水と１５０ＩＩ
！ｇ／ｌｌｌ１！のアジノービス（３−エチルベンゾチ
アゾリン−６−６−スルフォン酸）（ＡＢＴＳ）を含む
５０１１１Ｍクエン酸緩衝液を１００／Ｚｉ！加え、１
０分間室温で発色させた。停止液として１０％シュウ酸
を５０成加え、４０５ｎｌｌｌの吸光度をマイクロプレ
ート用の分光光度計により測定し、０．０２以上吸光度
のあるハイブリドーマを選択した。After washing 6-7 times, add 1.1% hydrogen peroxide and 150 II
! g/lll1! 100/Zi! In addition, 1
Color was developed for 0 minutes at room temperature. Fifty portions of 10% oxalic acid were added as a stop solution, and the absorbance of 405 nlll was measured using a microplate spectrophotometer, and hybridomas with an absorbance of 0.02 or more were selected.

選択されたハイブリドーマはあらかじめＢＡＬＢ／ｃマ
ウスの胸腺細胞（フィーダー細胞）をまかれた２４穴培
養プレートに移され、１００μＭヒボキサンチンと１６
μＭチミジンを含む完全ＲＰＭＩ培地（ＨＴ培地）で培
養した。増殖限界に達した後、再び酵素抗体法によりＶ
ＨＲＣ−１，ｃＲ細胞に対して抗体産生を行なっている
ハイブリドーマを選んだ。The selected hybridomas were transferred to a 24-well culture plate seeded with BALB/c mouse thymocytes (feeder cells), and treated with 100 μM hypoxanthin and 16
The cells were cultured in complete RPMI medium (HT medium) containing μM thymidine. After reaching the growth limit, V
Hybridomas producing antibodies against HRC-1 and cR cells were selected.

次に、選択されたハイブリドーマを限界希釈法によりク
ローニングした。即ち、細胞を５０個／ｄ！あるいは１
０個／ｄに希釈し、あらかじめフィーダー細胞をまかれ
た９６穴マイク［１培養プレートに０．１ｄずつ分注し
、ｌ−Ｉ　Ｔ培地により２週間培養した。１穴に　１個
のハイブリドーマコロニーが形成された場合をクローン
として取り出した。酵素抗体法によりＶＨＲＣ−ＬＣＲ
細胞に対して反応し、正常ヒト肺線維芽細胞に対して反
応しない抗体を分泌しているハイブリドーマクローンを
選択した。Next, the selected hybridomas were cloned by the limiting dilution method. That is, 50 cells/d! Or 1
The cells were diluted to 0 cells/d, dispensed into 96-well microplates pre-seeded with feeder cells (0.1 d each per culture plate, and cultured in l-IT medium for 2 weeks). When one hybridoma colony was formed in one well, it was taken out as a clone. VHRC-LCR by enzyme antibody method
Hybridoma clones were selected that secreted antibodies that reacted with cells but did not react with normal human lung fibroblasts.

更に、これらのクローンのうち、ヒト肺腺癌組織に反応
するクローンを凍結切片の免疫パーオキシダーゼ染色に
より選択した。つまり、ヒトの肺癌、その他の臓器癌及
び正常組織を手術材料により得、その４ＩＩＩＲ凍結切
片を作製した。アセトン固定後、ハイブリドーマクロー
ンの培養上清を加え、室温で３０分反応させた。よく洗
った後、ビオチン標識抗マウスＴＯＧ抗体（γ鎖、λ鎖
、に鎖と反応する）と室温で３０分反応させた。更に洗
浄後、アビジンとビオヂン標識西洋ワ１ノビパーオ↑シ
ダーゼを加え室温で１時間反応させ、よく洗った後基質
として０．５ＩＰｊ／Ｉｄのジアミノベンチジンと０．
０１％Ｈ２Ｏ２を含む５０ｍＭ　ｔ−リス−塩酸緩衝液
（ｐＨ７，０）を加え発色させた。Furthermore, among these clones, clones that reacted with human lung adenocarcinoma tissues were selected by immunoperoxidase staining of frozen sections. That is, human lung cancer, other organ cancers, and normal tissues were obtained using surgical materials, and 4IIIR frozen sections thereof were prepared. After fixation with acetone, the culture supernatant of the hybridoma clone was added and allowed to react at room temperature for 30 minutes. After thorough washing, the cells were reacted with a biotin-labeled anti-mouse TOG antibody (reacts with γ and λ chains) for 30 minutes at room temperature. After further washing, avidin and biodin-labeled horseradish 1 novipero sidase were added and allowed to react at room temperature for 1 hour. After thorough washing, 0.5 IPj/Id of diaminobenzidine and 0.5 IPj/Id of diaminobenzidine were added as substrates.
A 50mM t-Lis-HCl buffer (pH 7.0) containing 01% H2O2 was added to develop color.

このようにして、肺胞■型上皮、細気管支上皮。In this way, the alveolar type epithelium, the bronchiolar epithelium.

気管支腺漿液細胞、甲状腺瀘胞細胞１食道上皮。Bronchial gland serous cells, thyroid follicular cells 1 Esophageal epithelium.

噴門腺細胞、膵管上皮、尿細管上皮、膀胱移行上皮、子
宮内膜、肺腺癌、肺扁平上皮癌、肺小細胞癌、胃・十二
指賜乳頭部・胆管・膵・結腸・直腸・甲状腺・乳腺の腺
癌９食道扁平上皮癌には反応するが、気管支上皮、胃表
層粘Ｈｐ細胞、幽門腺。Cardiac gland cells, pancreatic duct epithelium, renal tubular epithelium, bladder transitional epithelium, endometrium, lung adenocarcinoma, lung squamous cell carcinoma, lung small cell carcinoma, stomach, duodenal papilla, bile duct, pancreas, colon, rectum, thyroid・Adenocarcinoma of the mammary gland 9 Although it responds to esophageal squamous cell carcinoma, it responds to bronchial epithelium, gastric surface mucinous Hp cells, and pyloric gland.

十二指腸上皮、結腸上皮、直腸十皮、肝細胞、膵外分泌
細胞、膵内分泌細胞、腎糸球体細胞、子宮頚部扁平上皮
細胞、皮膚上皮、子宮扁平上皮癌。Duodenal epithelium, colon epithelium, rectal decathelium, hepatocytes, pancreatic exocrine cells, pancreatic endocrine cells, renal glomerular cells, cervical squamous cells, skin epithelium, uterine squamous cell carcinoma.

肝細胞筋には反応しないモノクローナル抗体を産生する
ハイブリドーマが得られ、これをＫＬ−６細胞と名付け
、その産生ずるモノクローナル抗体をＫＬ−６抗体と命
名した。A hybridoma producing a monoclonal antibody that does not react with hepatocyte muscle was obtained and was named KL-6 cells, and the monoclonal antibody produced thereby was named KL-6 antibody.

４）　モノクローナル抗体の作製 （ａ）　　ｉｎ　ＶｉｔｒＯ培養法 １０５個／ｍｌ！のハイブリドーマを培養液（完全ＲＰ
ＭＩ培地）で増殖限界（２×１０６個／ｄ）になるまで
培養し、その培養上清を回収した。（但し、以下の方法
によりＩＯＧ分画にして使用することもできる。即ち、
培養上清を４０％飽和硫安で沈澱させた後、ｐｌ＋　７
．８の２０１１１Ｍリン酸緩衝液で平衡化したジエヂル
アミノ■プルセルロ−スカラム過させ不純物を除去して
用いる。） （ｂ）　ｉｎ　ｖｉｖｏ移ＩＩｉ！Ｉ払ハイブリドーマ
を移植するＢΔＬ　Ｂ　／　Ｃマウスにあらかじめ（５
〜１０日前）　　２，６，１０．１４−テトラメヂルペ
ンタデカンを腹腔中に０．　５ｍｌ！注射しておく。次
にハイブリドーマ５×１０６個を腹腔内に移植する。移
植されたマウスを３週間飼育すると、腹腔内にハイブリ
ドーマの腫瘍が形成され、腹部が肥大してくる。この結
果、腹水及び血清中に高Ｉ！！度のモノクローナル抗体
が生成され、それらを採取した。この腹水及び血清中に
は目的のモノクローナル抗体以外に、マウス自身に由来
する多クローン性抗体が含まれているが、それらはヒト
の組織とは反応しないために、特に分離しないで用いた
。（また、４）の（ａ）に示した方法によりＩＣＪＧ分
画にして使用できる。） ５）　ｔツクローナル抗体ＫＬ−６の特ｆ１ａ）正常肺
組織との反応性 Ｋ　Ｌ−６抗体と正常肺組織との反応性を免疫パーオキ
シダーゼ染色により調べた３、Ｋ　Ｌ．　−　６抗体＝
　　２　１　　− は■型肺胞十皮，細気管支上皮，気管支腺漿液細胞と反
応したが、■型ＩＭｉ胞上皮，気管支上皮，気管支腺粘
液細胞，間質とは反応しなかった。4) Preparation of monoclonal antibodies (a) In VitrO culture method 105 antibodies/ml! Hybridomas were grown in culture medium (complete RP
MI medium) until the growth limit (2 x 106 cells/d) was reached, and the culture supernatant was collected. (However, it can also be used as an IOG fraction by the following method. Namely,
After precipitating the culture supernatant with 40% saturated ammonium sulfate, pl+7
．． It is used after removing impurities by passing it through a dietylaminopurcellulose column equilibrated with 20111M phosphate buffer (No. 8). ) (b) In vivo transfer IIi! Transplant the I-paid hybridoma into BΔL B/C mice in advance (5
~10 days ago) 2,6,10.14-tetramedylpentadecane was administered intraperitoneally. 5ml! Give it an injection. Next, 5 x 106 hybridomas are implanted intraperitoneally. When the transplanted mouse is kept for three weeks, a hybridoma tumor is formed in the abdominal cavity and the abdomen becomes enlarged. As a result, high I! ! Several monoclonal antibodies were generated and collected. In addition to the monoclonal antibody of interest, the ascites and serum contained polyclonal antibodies derived from the mouse itself, but since they did not react with human tissue, they were used without being isolated. (Also, it can be used as an ICJG fraction by the method shown in 4) (a). ) 5) Characteristics of t-clonal antibody KL-6 f1a) Reactivity with normal lung tissue The reactivity between KL-6 antibody and normal lung tissue was investigated by immunoperoxidase staining 3. −6 antibodies=
21- reacted with type ■ alveolar decathelium, bronchiolar epithelium, and bronchial gland serous cells, but did not react with type ■ IMi cell epithelium, bronchial epithelium, bronchial gland mucus cells, and interstitium.

ｂ）間質性肺炎の肺組織との反応性 ＫＬー６抗体は特発性間質性肺炎の肺組織における間質
性肺炎及び線維化部位において、再生した肺胞■型上皮
に反応したが、間質の膠原線維。b) Reactivity with lung tissue of interstitial pneumonia The KL-6 antibody reacted with regenerated alveolar ■-type epithelium in interstitial pneumonia and fibrotic sites in lung tissue of idiopathic interstitial pneumonia. Interstitial collagen fibers.

線雑芽細胞，炎症細胞には反応しなかった。It did not react with lineal miscellaneous blast cells or inflammatory cells.

Ｃ）肺以外の正常組織との反応性 ＫＬ−６抗体は、甲状腺ｉ＆１胞上皮，食道上皮。C) Reactivity with normal tissues other than lungs KL-6 antibody is thyroid I & 1 cell epithelium, esophageal epithelium.

噴門腺細胞，膵管上皮，尿細管」−皮，膀胱移行上皮，
子宮内膜細胞と反応したが、胃表層粘膜細胞。Cardiac gland cells, pancreatic ductal epithelium, renal tubule skin, bladder transitional epithelium,
Reacted with endometrial cells, but gastric superficial mucosal cells.

幽門腺細胞．十二指腸士皮．結腸上皮，直腸上皮。Pyloric gland cells. Duodenal skin. Colonic epithelium, rectal epithelium.

肝細胞，膵外分泌・内分泌細胞，腎糸球体細胞。Hepatocytes, pancreatic exocrine/endocrine cells, renal glomerular cells.

子宮頚部扁平上皮，皮膚上皮．赤面法，白血球とは反応
しなかった。Cervical squamous epithelium, skin epithelium. It did not react with the blush method or white blood cells.

ｄ）癌組織との反応性 Ｋ　Ｌ　−６抗体は肺腺癌、肺扁平上皮癌、肺小細胞癌
、胃癌、乳頭部癌、胆管癌、膵癌、結腸癌。d) Reactivity of K L-6 antibody with cancer tissue is lung adenocarcinoma, lung squamous cell carcinoma, lung small cell carcinoma, gastric cancer, papillary carcinoma, cholangiocarcinoma, pancreatic cancer, and colon cancer.

直腸癌、甲状腺乳頭状腺癌、乳癌、腎癌１食道扁平上皮
癌と反応したが、子宮頚部扁平上皮癌、肝細胞癌とは反
応しなかった。It reacted with rectal cancer, papillary thyroid adenocarcinoma, breast cancer, renal cancer, and esophageal squamous cell carcinoma, but did not react with cervical squamous cell carcinoma or hepatocellular carcinoma.

ｅ）モノクローナル抗体ＫＬ−６と反応する細胞抗原 ＫＬ−６抗体と反応する細胞を過ヨーソ酸、ノイラミニ
ダーゼ、プロテアーゼで処即後、ＫＬ−６抗体と反応さ
せることにより、細胞抗原の生化学的性状を調べた。９
６穴マイクロ培養プレートにＶＨＲＣ−ＬＣＩｔ細胞を
増殖限界になるまで培養後、０．２５％ゲルタールアル
デヒドで固定し、よく洗った後、１　、１０．１００ｍ
Ｍの過ヨーソ酸、　０．０１，０．１．ｌｕ（単位）／
−のノイラミニダーゼを加え３０分間反応させた後洗浄
し、ＫＬ−６抗体と１時間反応させた。洗浄後、ｉ、Ｑ
Ｘ　１０　　ＣｐＨｌの　　Ｉ−標識ヤギ抗マウス免疫
グロブリンを加え１時間反応させた後、洗浄後、１００
ｐの０，２Ｎ水酸化ナトリウムで細胞を可溶化してポリ
スチレンチューブに移して、ガンマ−カウンターで放射
活性を測定した。その結果、未処理のものに比べて、過
ヨーソ酸、ノイラミニダーゼで処理した細胞に対するＫ
　Ｌ　−６抗体の結合は低下しており、ＫＬ−６抗体の
反応する細胞抗原は末端にシアル酸を有する糖鎖抗原で
あることがわかった。また、５×１０６個のＶＨＲＣ−
ＬＣＲ細胞を０，２５％プロナーゼと３０分間反応させ
た後洗浄し、０５−のＫ　Ｌ　−６抗体を３０分間反応
させ、洗浄後、１０／ｕのＦＩＴＣ（フルオレセイン　
イソヂオシアネート）標識ヤギ抗マウスＩ　ＯＧ　　Ｆ
　（ａｂ’）　２７ラグメン１−と３０分間反応させた
。洗浄後１％パラホルムアルデヒドで固定し、蛍光顕微
鏡で蛍光を観察したところ、プロナーゼで処理した細胞
は未処理の細胞に比べて蛍光が減弱していた。従って、
細胞上のＫＬ−６抗体反応抗原は蛋白部分も有している
ことがわかった。以上のことより、ＫＬ−６抗体の反応
する細胞抗原は糖蛋白で、抗原決定基は末端にシアル酸
を有する糖鎖であることが判明した。e) Cell antigen that reacts with monoclonal antibody KL-6 Cells that react with KL-6 antibody are treated with periodic acid, neuraminidase, and protease, and then reacted with KL-6 antibody to determine the biochemical properties of the cell antigen. I looked into it. 9
After culturing VHRC-LCIt cells in a 6-well microculture plate until the proliferation limit was reached, they were fixed with 0.25% geltaraldehyde, washed thoroughly, and then placed at 1, 10.100 m
M periodic acid, 0.01,0.1. lu (unit)/
- Neuraminidase was added and reacted for 30 minutes, washed, and reacted with KL-6 antibody for 1 hour. After washing, i, Q
After adding I-labeled goat anti-mouse immunoglobulin of X 10 CpHl and reacting for 1 hour, after washing,
Cells were solubilized with 0.2N sodium hydroxide, transferred to a polystyrene tube, and radioactivity was measured using a gamma counter. As a result, the K for cells treated with periodic acid and neuraminidase was higher than that of untreated cells.
The binding of the L-6 antibody was reduced, and it was found that the cell antigen with which the KL-6 antibody reacts is a sugar chain antigen having sialic acid at the end. In addition, 5 x 106 VHRC-
LCR cells were reacted with 0.25% pronase for 30 minutes, washed, reacted with 05-KL-6 antibody for 30 minutes, washed, and then treated with 10/u FITC (fluorescein
Isodiocyanate) labeled goat anti-mouse I OG F
(ab') 27 Reacted with lagmen 1- for 30 minutes. After washing, the cells were fixed with 1% paraformaldehyde and the fluorescence was observed using a fluorescence microscope. As a result, the fluorescence of the pronase-treated cells was attenuated compared to the untreated cells. Therefore,
It was found that the KL-6 antibody-reactive antigen on cells also has a protein portion. From the above, it was revealed that the cell antigen with which the KL-6 antibody reacts is a glycoprotein, and the antigenic determinant is a sugar chain having a sialic acid at the end.

ｆ）モノクローナル抗体ＫＬ−６と反応する可溶性抗原
の分子量 Ｋ１−６抗体の反応する可溶性抗原の分子量の測定のた
めには、癌性胸水をセファ［１−ス４Ｂでゲル濾過し、
得られた各フラクション中の可溶性抗原間を後述するサ
ンドイッチ酵素抗体法で定量化して決定した。その結果
、Ｋ　Ｌ−６抗体の反応する可溶性抗原の分子量は少な
くとも１００万以上であることが判明した。f) Molecular weight of soluble antigen that reacts with monoclonal antibody KL-6 To measure the molecular weight of soluble antigen that reacts with K1-6 antibody, cancerous pleural effusion was gel-filtered with Sepha[1-S4B].
The soluble antigen content in each fraction was quantified and determined using the sandwich enzyme antibody method described below. As a result, it was found that the molecular weight of the soluble antigen with which the K L-6 antibody reacts is at least 1 million or more.

６）　　ＫＬ−６抗体の反応する血清中可溶性抗原（Ｋ
Ｌ−６抗原）の定量 ａ）　　ＫＬ−６抗原の定量のためのサンドイッチ酸素
抗体法 血清中のＫＬ−６抗涼の定量のために、サンドイッチ酵
素抗体法をおこなった。同相としてポリスチレンど一ズ
を用いたが、まずビーズを５０埒／ｄの精製ＫＬ−６抗
体溶液（０，２５Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７，５）に浸し、
３７℃で１時間インキコベートした後、１０分間氷水中
で冷却しＩＣものを抗体吸着ビーズとして使用した。精
製Ｋ　ｉ−６抗体の酵素標識法は過ヨーソ酸法を用いた
。すなわち、５ＩＰＪの西洋ワサビパー第４〕シダーゼ
を１＃Ｉｌ！の０．３Ｍ炭酸緩衝液ｐＨ８，１に溶解し
た液に０．１−のＩＸ　１−フルオロ−２，４〜ジニト
ロベンゼン　エタノール溶液を加え、２０分間インキュ
ベート後、０．０１Ｍ炭酸緩衝液ｐＨ９，５に透析した
。透析後１ｄの０．０６Ｍ過ヨーソ酸を加え３０分間反
応させた後、更に１ｄの０、１６Ｍ　ｘブレングリコー
ルを加えて６０分間反応させ、再び０．０１Ｍ炭［衝液
１）８９．５に透析した後、同じ緩衝液で平衡化した５
ｍｇの精！１ＩＫＬ−６抗体溶液と混合して室温で反応
させた。３時間後、５■の水素化ホウ素ナトリウムを加
え、４℃で一夜静置した。その後ＰＢＳに透析して、更
にセファデックスＧ　−２００カラムでゲル濾過しで得
られた最初のピークをパーオキシダーゼ標識ＫＬ−６抗
体として使用した。6) Serum soluble antigen (K
Quantification of KL-6 antigen) a) Sandwich oxygen antibody method for quantification of KL-6 antigen A sandwich enzyme antibody method was performed for the quantification of KL-6 anti-ryo in serum. Polystyrene beads were used as the same phase. First, the beads were immersed in a purified KL-6 antibody solution (0.25 M phosphate buffer pH 7.5) at 50 m/d.
After incubating at 37°C for 1 hour, the mixture was cooled in ice water for 10 minutes and the IC mixture was used as antibody-adsorbing beads. The periodic acid method was used for enzyme labeling of the purified K i-6 antibody. That is, 5 IPJ of horseradish par No. 4] sidase to 1 #Il! Add 0.1-IX 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene ethanol solution to the solution dissolved in 0.3M carbonate buffer pH 8.1, and after incubating for 20 minutes, dissolve in 0.01M carbonate buffer pH 9.5. was dialyzed. After dialysis, 1 d of 0.06M periodic acid was added and reacted for 30 minutes, then 1 d of 0,16M x brene glycol was added and reacted for 60 minutes, and dialyzed again against 0.01M charcoal [buffer 1] 89.5. and then equilibrated with the same buffer.
The essence of mg! 1IKL-6 antibody solution and reacted at room temperature. After 3 hours, 5 μ of sodium borohydride was added, and the mixture was left standing at 4° C. overnight. Thereafter, it was dialyzed against PBS, and the first peak obtained by gel filtration with a Sephadex G-200 column was used as a peroxidase-labeled KL-6 antibody.

測定手順は、まずＫＬ−６抗体吸盾ヒーズを入れたガラ
スチューブに、プロティンバッファー（１０％正常ウサ
ギ血清、０．１％牛血清アルブミン。The measurement procedure is as follows: First, add protein buffer (10% normal rabbit serum, 0.1% bovine serum albumin) to a glass tube containing KL-6 antibody absorbent.

０．１５Ｍ　　Ｐ　Ｂ　Ｓ　　Ｉｌｌ　６．４）で４０
倍に希釈した検体を０，３ｄ加え、３７℃で３時間イン
キコベートした。40 at 0.15M PBS Ill 6.4)
A sample diluted twice was added for 0.3 d, and incubated at 37° C. for 3 hours.

その後生食で３回洗浄し、プロティンバッファーで１０
０倍に希釈したバーオキシダー１標識Ｋ　Ｌ　−６抗体
を０．３ｄ加え、１６から２０時間インキ１ベートした
。洗浄後、ビーズをポリスヂレンチューブに移し、０．
３〆の０ＰＤＡ溶液（０，３％ｏ−ｐｈｅｎｙｉｅｎｅ
ｄｉａｍｉｎｅ　ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、　
０．０２％　＠２Ｑ２゜０．０５Ｍ　Ｃ１ｔｒａｔｅ　
ｂｕｆｆｅｒ　ｐＨ４，０）を加え３０分間反応させた
後１ｄの２ＮＰＡ酸を加え反応を停止させ、吸光度０Ｄ
４９２を測定した。Afterwards, it was washed 3 times with saline, and then washed with protein buffer for 10 minutes.
Veroxider 1-labeled K L-6 antibody diluted 0 times was added for 0.3 d, and the ink was incubated for 16 to 20 hours. After washing, transfer the beads to a polystyrene tube and incubate at 0.
3.0 PDA solution (0.3% o-phenyene
diamine dihydrochloride,
0.02% @2Q2゜0.05M C1trate
buffer (pH 4,0) and reacted for 30 minutes, then 1 d of 2NPA acid was added to stop the reaction, and the absorbance was 0 D.
492 was measured.

標準検体として、毎回、肺癌による癌性胸水を１６０倍
希釈したものを６４０／ｄとし、第１図に示すこと＜　
０．２，４，８，１６，３２，６４ｕ／ｄの７点を使っ
て標準曲線を描き、検体の定ａをおこなった。As a standard sample, a 160-fold dilution of cancerous pleural effusion caused by lung cancer was used as 640/d, as shown in Figure 1.
A standard curve was drawn using seven points of 0.2, 4, 8, 16, 32, and 64 u/d, and the sample was determined.

ｂ）健常者、各種悪性！ｌｆｒ瘍思考、良性肺疾患患者
及び他の炎症竹疾患患音の血清中ＫＬ−６抗原値の分布 第２図に示すごとく、健常者８０名のＫＬ−６抗原値は
２１８±１５２　ｕ／ｍｅ　（平均（ｍ１士標準偏差（
ＳＤ））であり、ｍ＋２ＳＤ値５８２０／ｄをｃｕｔ　
ｏｆｆ値とした。癌患者での陽性率は、肺癌３２％（３
２／９９）　。b) Healthy people, various malignancies! Distribution of serum KL-6 antigen levels in patients with LFR ulcers, benign lung disease patients, and patients with other inflammatory bamboo diseases As shown in Figure 2, the KL-6 antigen level in 80 healthy subjects was 218 ± 152 u/me. (Average (m1 standard deviation (
SD)) and cut m+2SD value 5820/d
It was set as the off value. The positive rate for cancer patients is 32% (32%) for lung cancer.
2/99).

胃癌Ｏ％（０／１９）　、大賜癌０χ（０／８）、肝細
胞病０％（０／８）、膵癌４４％（４／９）　、乳癌７
５％（６／８）であった。Gastric cancer 0% (0/19), Otama cancer 0% (0/8), hepatocellular disease 0% (0/8), pancreatic cancer 44% (4/9), breast cancer 7
It was 5% (6/8).

良性肺疾患でのＫ　Ｌ−６抗原値は第３図に示しである
が、陽性率は肺胞性肺炎１０％（２／２１）、慢性気管
支炎０％（０／１５）、気管支喘息１１％（１／９）　
、肺気腫４０％（４／１０）、気管支拡張症４０％（２
１５）　、肺結核４３％（９／２１）、びまん性汎細気
管支炎４０％（４／１０）。The K L-6 antigen values in benign lung diseases are shown in Figure 3, and the positive rate was 10% (2/21) for alveolar pneumonia, 0% (0/15) for chronic bronchitis, and 11% for bronchial asthma. (1/9)
, emphysema 40% (4/10), bronchiectasis 40% (2/10)
15), pulmonary tuberculosis 43% (9/21), diffuse panbronchiolitis 40% (4/10).

間質性肺炎５８％（２９１５０）であった。Interstitial pneumonia was 58% (29,150).

肺以外の炎症性疾患におけるに１−−−６抗原値は第４
図に示しであるが、陽性率は慢性肝炎１１％（１／９）
、肝硬変１８％（２／１１）、膵炎０％（０／１４）、
胆のう炎θ％（０／７）であった。1--6 antigen values in inflammatory diseases other than the lungs are the fourth
As shown in the figure, the positive rate for chronic hepatitis was 11% (1/9).
, liver cirrhosis 18% (2/11), pancreatitis 0% (0/14),
Cholecystitis θ% (0/7).

Ｃ）間質性肺炎患者における血清中Ｋ　Ｌ−６抗原値 前述した如く間質性肺炎５０例の検討では血清中ＫＬ−
６抗原の陽性率が５８％と高率であったが、病因別に分
類すると、その陽性率は第５図に示すごとく、特発性間
質性肺炎６７％（１８／２７）　、膠原病性肺疾患４４
％（４／９）　、サルコイド−シス４０％（２１５）、
過敏性肺臓炎１００％（２／２）　、放射線肺臓炎及び
薬剤性肺臓炎５０％（３／６）　、じん肺０％（０／１
）であった。C) Serum KL-6 antigen value in patients with interstitial pneumonia As mentioned above, in the study of 50 cases of interstitial pneumonia, the serum KL-6 antigen value was
The positive rate for 6 antigens was high at 58%, but when classified by etiology, the positive rate was 67% (18/27) for idiopathic interstitial pneumonia, collagen disease lung Disease 44
% (4/9), sarcoidosis 40% (215),
Hypersensitivity pneumonitis 100% (2/2), radiation pneumonitis and drug-induced pneumonitis 50% (3/6), pneumoconiosis 0% (0/1)
)Met.

間質性肺炎２８例における血清中Ｋ　Ｌ　−６抗原値と
血清中１［）　）ｌ　（ｌａｃｔｉｃ　ｄｅｈｙｄｒｏ
ｇｅｎａｓｅ）活性を比較検討すると、第６図に示すご
とく、両者の間に有意の相関はみとめず、陽性率は、Ｌ
ＤＨ値１１％（３／２７）であったのに対し、ＫＬ−６
抗原値は５７％（１６／２８）であり、ＫＬ−６抗原の
方が明らかにずぐれた５ｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙを示した
。Serum KL-6 antigen levels and serum 1[))l (lactic dehydro
As shown in Figure 6, no significant correlation was found between the two activities, and the positive rate was
While the DH value was 11% (3/27), KL-6
The antigen value was 57% (16/28), and KL-6 antigen showed clearly superior sensitivity of 5.

間質性肺炎の活動性を評価しつるとされている６７Ｇａ
−クエン酸シンチグラムの施行されていた１５例の間質
性肺炎について、Ｋ　Ｌ　−６抗原値を検討したところ
、第７図に示すごとり６７Ｇａの肺集積像をみとめた１
０例のＫＬ−６抗原陽性率は８０％（８／１０）であっ
たのに対し、６７Ｇａの集積像をみとめなかった５例で
はＫＬ−６抗原の陽性者をみとめず、雨音の間には強い
相関がみとめられた。67Ga, which is said to be used to evaluate the activity of interstitial pneumonia
- When we examined the KL-6 antigen levels in 15 cases of interstitial pneumonia for which citrate scintigraphy had been performed, we observed an accumulation of 67Ga in the lungs, as shown in Figure 7.
The KL-6 antigen positive rate in 0 cases was 80% (8/10), whereas in the 5 cases in which 67Ga accumulation images were not found, no KL-6 antigen positives were found, and the A strong correlation was observed.

経過観察をおこなった間質性肺炎１２例のＫ　Ｌ　−６
抗原値の推移を第８図に示しである。自他覚所見の改善
をみとめ、間質性肺炎の軽快傾向を示した１例ではＫＬ
−６抗原値の低下を示した。臨床上、活動性にあまり変
化をみとめなかった６例でのＫｌ　−６抗原値の変動は
同様に僅少であった。KL-6 of 12 cases of interstitial pneumonia with follow-up observation
Figure 8 shows the changes in antigen values. KL was used in one case where subjective and objective findings improved and interstitial pneumonia showed a tendency to remit.
-6 antigen level decreased. Clinically, in the six cases in which little change in activity was observed, the fluctuations in Kl-6 antigen values were similarly small.

臨床上増悪傾向を示した５例、これらはすべて肺癌症例
であり、放射線療法がおこなわれて放射線肺臓炎をおこ
した症例であるが、肺臓炎をおこした後のＫ１−６抗原
値は全綱において増加していた。The five cases that showed clinical signs of worsening were all lung cancer cases, and radiation pneumonitis was caused by radiation therapy, but the K1-6 antigen levels after pneumonitis were the same for all types. There was an increase in

以上のことから、血清Ｋ　Ｌ　−６抗原は、間質性肺炎
の活動性の指標として有用であることは明白である。From the above, it is clear that serum K L-6 antigen is useful as an indicator of interstitial pneumonia activity.

（発明の効果） 本発明の間質性肺炎診断用試薬を用いた場合、間質性肺
炎患者の病態の活１．ＩＪ　ｔ／Ｉを鋭敏に診断するこ
とができる。(Effects of the Invention) When the reagent for diagnosing interstitial pneumonia of the present invention is used, the clinical condition of patients with interstitial pneumonia can be improved in 1. IJ t/I can be acutely diagnosed.

【図面の簡単な説明】[Brief explanation of the drawing]

第１図はＫｌ　−６抗原の標準曲線を示すグラフ、第２
図は血清中に１−６抗原値の分布を示す図、第３図は良
性肺疾患患者の血清中ＫＬ−６抗原値の分布を示す図、 第４図は肺疾患以外の良性疾患患者の血清中ＫＬ−６抗
原値の分布を示す図、 第５図は病因別に分類した間質性肺炎患者の血清中ＫＬ
−６抗原値の分布を示す図、 第６図は間質性肺炎患者の血清中ＫＬ−６抗原値と血清
中Ｌ　Ｄ　ｌ−１値との相関関係を示す図、第７図は６
７Ｇ　ａ−シンチグラムにょる間質性肺炎患者の血清中
ＫＬ−６抗現値の分布を示す図、第８図は間質性肺炎患
者の血清中ＫＬ−６抗原値の推移を示す図である。 第１図 ＫＬ−６推榛ｔ＋Ｕチ頗報 ＫＬ−６＊葡（ＭＪｒｆＬ　／ｍｌ　／開１十ま 伐巻例 第８区 師￥遼に＄邸１ｂ訪鼾辷清中ＫＬ−６看ｌ騒１ｒ　　　
攻　　　−ｔｌ　　　俊 イＸ′ＩＬ　　　　　喉例Figure 1 is a graph showing the standard curve for Kl-6 antigen;
The figure shows the distribution of 1-6 antigen values in serum, Figure 3 shows the distribution of KL-6 antigen values in serum of patients with benign lung disease, and Figure 4 shows the distribution of KL-6 antigen values in serum of patients with benign diseases other than lung disease. A diagram showing the distribution of serum KL-6 antigen values. Figure 5 shows serum KL in patients with interstitial pneumonia classified by etiology.
-6 antigen value distribution; Figure 6 is a diagram showing the correlation between serum KL-6 antigen value and serum LD l-1 value in patients with interstitial pneumonia;
Figure 8 shows the distribution of serum KL-6 antigen levels in patients with interstitial pneumonia as determined by 7G a-scintigram. be. Figure 1 KL-6 promotion t+Uchi news KL-6 1r
Attack -tl Shun'i X'IL Throat example

Claims (1)

【特許請求の範囲】[Claims] ヒト肺胞II型上皮、細気管支上皮及び気管支腺漿液細胞
に反応するＩｇＧ＿１クラスに属するモノクローナル抗
体ＫＬ−６を含むことを特徴とするヒト間質性肺炎診断
用試薬。A reagent for diagnosing human interstitial pneumonia, characterized in that it contains a monoclonal antibody KL-6 belonging to the IgG_1 class that reacts with human alveolar type II epithelium, bronchiolar epithelium, and bronchial gland serous cells.