JPS62278988A - 酵素もしくは微生物反応方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３、発明の詳細な説明 〔産業上の利用分野〕 本発明は、酵素もしくは微生物を用いて基質を生成物へ
変換せしめる方法に関するものである。

〔従来の技術およびその問題点〕

近年、酵素あるいは微生物を触媒として用いるバイオリ
アクターの開発が盛んに行われているが、それらの反応
で取り扱われている化合物はほとんどすべて水溶性であ
り、従って水溶液系での反応が主である。しかしながら
、水に難溶か、もしくは不溶な化合物で有用な反応は数
多（ある。例えば、リパーゼによる油脂の加水分解、油
脂の改質、油脂の合成や種々のエステル合成反応、また
プロテアーゼを利用した人工甘味料アスパルテームの合
成等にみられる種々のペプチド合成反応などにおいて、
これらグリセライドや脂肪酸及びペプチドは一般に水に
難溶である。従って、通常反応は微細なエマルションと
し、所定分解率に達した後反応を停止して生成物を２相
に分離して回収する回分操作となる。また連続的に酵素
あるいは微生物反応を行わせる方法として、固定化酵素
あるいは固定化微生物をカラムに充填し、基質溶液を連
続的に供給する方法が知られているが、この場合におい
てもあらかじめ非水溶液相と水相を混和して供給するこ
とが必要であり、反応終了後には再び２相に分離する必
要がある。

このように、互いに溶は合わない２相分散系・での反応
においては、反応後の酵素あるいは微生物の分離回収は
勿論、生成物の回収においても２相に分離する必要があ
り、この方法としては、一般に静置分離、遠心分離、あ
るいは膜による分離等の方法が挙げられるが、反応後に
これらの分離工程を組み合わせた場合システム的に複雑
となり、またコスト的にも負担が大きくなり、工業化の
際には問題がある。

（問題点を解決するための手段〕 本発明者らは、上記の問題点を解決すべく鋭意検討を重
ねた結果、前述のような２相系の反応においても高い反
応率を維持しながら同時に生成物の分離をも行うことが
できる画期的な反応方法を見出し本発明に到った。

即ち、本発明は、非水溶液相と水相とが上下２Ｎに分離
して存在する反応器において、非水溶液相と水相とが混
和しない部分を残しながら非水溶液相と水相とをその界
面近傍で混和することにより、基質としての非水溶液及
び水を、あるいは、非水溶液相及び／又は水相の中に存
、　　在する基質を、酵素もしくは微生物によって生成
物に変換せしめ、混和しない部分の非水溶液相及び／又
は水相中に存在する生成物を取り出すことを特徴とする
酵素もしくは微生物反応方法を提供するものである。

尚、本発明において非水溶液とは水に難溶もしくは不ン
容の疎水性ン容液のことである。

本発明を更に詳しく、本発明の好適実施態様を示した図
面に基づいて説明する。

−例としてＡ＋Ｂ−Ｃ＋Ｄ　（Ａ、Ｂはそれぞれ基質で
、Ｃ，Ｄはそれぞれ生成物である。今Ａ及びＣは水溶性
、Ｂ及びＤは水不溶性とする。

で表される酵素あるいは微生物反応系について第１図を
用いて説明する。１は内部にドラフトチューブを有する
反応槽である。この反応器内に基質Ａ（水相）と基質Ｂ
（非水溶液相）をそれぞれ基質（水相）貯槽１１、基質
（非水溶液相）貯槽１２より一定の比率で仕込み下層に
なる水相をドラフトチューブ３内の攪拌羽根２０により
巻き上げ、エマルションとして酵素あるいは微生物と効
率良く接触せしめ酵素あるいは微生物反応を行わせるも
のである。ここに４は基質（非水溶液相）供給ノズル、
６は生成物（非水溶液相）貯槽、７はせき、８は限外濾
過膜、９は水相膜処理用貯槽、１０は生成物（水相）貯
槽である。

第１図の場合、基質と酵素あるいは微生物の接触効率を
上げ、しかもこれら酵素あるいは微生物を吸着等により
効率良く反応器内に保持するため充填材２をドラフトチ
ューブの外側に充填しているが、充填材を用いなくても
これらの）　条件が満たされるならば特に充填材等を使
用する必要はない。

また、反応器の上部、下部にそれぞれじゃま仮５，１７
を設けると、液の完全混合を防止し非水？８液相と水相
とが分離した状態の部分を形成できるので好ましい。

本発明の方法を用いれば反応と同時に生成物の分離を行
うことができるので回分操作は勿論連続的に生成物を抜
き出しながら基質を供給する連続反応あるいは半連続反
応を行うことも可能である。

本反応器の場合、反応に使用した酵素あるいは微生物の
大部分は反応器内に保持されるが、酵素あるいは微生物
を更に効率良く回収再利用するためには水相に溶解して
いる酵素あるいは微生物を濃縮回収することが好ましい
。これには限外濾過膜を用いるのが好ましい。使用する
限外濾過膜は、酵素あるいは微生物を通過させないもの
であれば材質、形状等特に限定するものではなく、例え
ば酢酸セルロース膜、ポリアクリロニトリル膜、ポリス
ルホン膜、ポリアミド膜等どのような材質のものでも使
用でき、また形状についても平膜状、管状、スパイラル
状、中空糸状等どのような形状のものでも使用できる。

限外濾過膜の分画分子量については反応に使用する酵素
あるいは微生物により異なり酵素あるいは微生物の透過
が阻止できる孔径を有しておればよく特に限定するもの
ではないが、一般に３０００〜５００００程度のものが
好ましい。限外濾過により酵素あるいは微生物を含まな
い水相を連続的に抜き出し、酵素あるいは微生物の濃縮
液は連続的にあるいは半連続的に反応系内へ戻してやれ
ばよい。

尚、酵素あるいは微生物のほとんどが反応器内に保持さ
れ水相への溶解が無視できるならば限外濾過による酵素
あるいは微生物の分離の必要はない。また、あらかじめ
種々の方法で酵素あるいは微生物を固定化した固定化酵
素あるいは固定化微生物を充填することも可能で、この
場合も限外濾過による酵素回収工程は必要ない。

あるいはまた限外濾過工程を省略して、水相に溶解した
酵素あるいは微生物分に相当するフレッシュな酵素ある
いは微生物を添加する方法も可能である。

本発明の方法を用いれば特別な前処理を行うことな（、
反応器内に酵素あるいは微生物を保持し効率良くこれら
酵素あるいは微生物の回収再利用が可能である。酵素あ
るいは微生物は、特別な前処理を行うことなく、充填材
に吸着等により保持させるか、又はあらかじめ種々の方
法で固定化処理をした固定化酵素あるいは固定化微生物
を充填するか、あるいはまたこれら充填物を用いること
なくフリーな状態で用いる等の方法があるが、何れの方
法を用いるかはｆ４素及び微生物の特徴、あるいは反応
条件等により適当に選択すればよい。

第１図のようなドラフトチューブ３及び攪拌羽根２０を
用いる場合のドラフトチューブの径は特に限定されるも
のではな（目的とする反応により径を決定すればよいが
、反応槽の径の５〜９０％の径であれば好ましく用いら
れる。また攪拌羽根の回転速度は、反応器中の下層がう
まく巻き上げられて非水溶液相と水相との界面近傍で混
和が起こり、しかも反応器上部と下部に、非水溶液相と
水相とが混和しない部分が残るように設定すればよい。

第１図に示した如く充填材を用いる場合について、その
充填材の形態は特に限定されるものではなく、通常一般
に充填材として用いられるラシヒリング、レッシングリ
ング、ベルルサドル、インタロックスサドル、ポールリ
ング等の充填材や円筒状にしたネットなどを充填しても
よい。材質も特に限定されるものではなく、金属、石型
、プラスチック製のもの等を用いることができる。また
固定化酵素あるいは固定化微生物を充填する場合でも、
固定化方法は特に限定されるものではなく、通常使われ
ている担体結合法、架橋法、包括法あるいは、これらを
適当に組み合わせた福分法等、いずれの方法でもよく、
適当に選択すればよい。

また、反応器中の下層をうまく巻き上げる方法としては
、第１図に示したドラフトチューブ方式の他に、例えば
、第２図に示した如く、反応器中の上下２層の界面近傍
の下方より窒素ガス等の不活性気体を吹き込む方法、第
１図の如きドラフトチューブ内を窒素ガス等の不活性気
体を通過させる方法、あるいはドラフトチューブを用い
ずに、界面近傍を単に攪拌してやる方法などが挙げられ
、界面近傍で上層と下層が混和される方法であればどの
ような方法でもよく、反応系に通した方法を採用すれば
よい。

本発明の特徴は、反応器中の上下２層を、その界面近傍
で混和させて酵素もしくは微生物反応を行わせ、反応器
中の上層部及び下層部には混和されない部分を残したま
まで反応を行わせるので、反応と同時に非水溶′液相と
水相をそれぞれ独立に取り出すことができ、生成物を分
離できることである。従って連続的に基質等を加えなが
ら同時に生成物を得ることができる。また、連続的に反
応を行えるので、反応器内の各成分の濃度を一定に維持
することができ、これは、酵素の安定性等を考慮した場
合に非常に有利である。

本発明の方法を用いて油脂の加水分解を行う場合につい
て以下に述べる。この場合、基質は油脂及び水、酵素は
リパーゼ、反応生成物は脂肪酸及びグリセリンである。

本発明者らは、リパーゼを用いた油脂の加水分解に際し
ては、生成物であるグリセリンの濃度がリパーゼの安定
性に大きく寄与していることを見出している。

本発明者らの研究によれば、反応系内の水相中のグリセ
リン濃度が１０〜４０重量％の範囲内にあるとき、酵素
が安定化され、好ましく油脂の加水分解が進行する。本
発明の方法は、反応器内の各種成分の濃度を一定に保つ
ことが容易であり、従ってリパーゼによる油脂の加水分
解に好ましく適用される。

本発明の方法をリパーゼによる油脂の加水分解に適用す
る場合には、油脂及び水の供給比率は以下の方法により
計算して決定しグリセリン濃度を最適条件に推持するこ
とができる。例えば、反応系内の水相中のグリセリン濃
度を２０ｗ　ｔ％に維持しようとする場合、 連続あるいは半連続供給する油脂ｍ　＝　Ｘ（ｋｇ／ｈ
ｒ）〃　　　　　〃　　　　　水量＝　Ｙ（ｋｇ／ｈｒ
）油脂分解率＝７７（％）、油脂の分子量＝１水の分子
量＝　１８．グリセリンの分子量＝９２とすると、 の式が成立し、０式よりＸとＹの比を決定できる。仮に
、Ｍ　＝９００　、η＝９５％とすると■弐より Ｘ　　／　　Ｙ＝１．８４ となる。このようにして、油脂／水の連、涜あるいは半
連続供給比率を決定する。

本発明の方法は、非水溶液相と水相の２相系で反応を行
う種々の酵素反応、微生物反応に適用でき、前述のリパ
ーゼによる油脂の加水分解反応以外にも、リパーゼによ
るトリグリセリド合成、トリグリセリドのエステル交換
反応、あるいはサーモライシンによるカルボベンジルオ
キシ−１−アスパラギン酸とＴ−フェニルアラニンメチ
ルエステルからの人工甘味料アスパルテーム（アスパル
チルフェニルアラニンメチルエステル）の合成などのよ
うなプロテアーゼによるペプチドの合成反応等に適用で
きるが、これらに限定されるものではない。

本発明のもう１つの特徴は、使用する酵素あるいは微生
物の形態として、あらかじめ種々の方法で固定化したい
わゆる固定化酵素あるいは固定化微生物を用いてもよい
が、特別な固定化処理を行わなくても適当な充填材を充
填すること、あるいはこれら充填材を用いなくても酵素
あるいは微生物をある程度反応器内に保持することがで
きることである。また水相に溶解した酵素あるいは微生
物も限外濾過膜により容易に回収できるので特に複雑な
固定化処理を行わなくても効率良く回収再利用ができる
。

本発明で用いる酵素あるいは微生物は必ずしも高度に精
製されているものである必要はなく、抽出液や部分精製
品、またあるいは醗酵液も用いることができる。

本発明によるバイオリアクターは、第１図あるいは第２
図で示したように１槽のみで使用してもよいがさらに効
率的に反応を行うためには多段反応としてもよい。

〔実施例〕

以下、本発明の実施例について説明するが、本発明はこ
れら実施例に限定されるものではない。

実施例−１ 第１図に示した反応システムによりリパーゼによる大豆
油の加水分解を行った。リパーゼによる油脂の加水分解
では、第１図、第２図において４は油脂供給ノズル、６
は脂肪酸溶液貯槽、９はグリセリン水溶液膜処理用貯槽
、ｌｏはグリセリン水貯槽、１１は水貯槽、１２は油脂
貯槽となる。

反応槽１に予め大豆油を酵素分解した分解脂肪酸（脂肪
酸含有率８５％）１ｋｇ、２０−ｔ％グリセリン水１　
ｋｇ及びキャンディダシリンドラセより生産したリパー
ゼ（３２００００単位／ｇ）２ｇを加えて反応槽を３０
℃に保ちながら反応を行った。

反応槽の径とドラフトチューブ３の径の比率はｌＯ：６
である。また攪拌羽根は第１図に示したようなリボン型
羽根２０を用い周速は約０．５ｍ／秒として攪拌を行っ
た。

この反応槽１に油脂貯槽１２からポンプ１３により５０
　ｇ　／ＨＲの流量で大豆油（脂肪酸含有率０％）を反
応槽下部から連続供給し、また水貯槽１１よリボンプ１
４を用いて２５ｇ／ＩＩＲの流量で水を反応槽上部から
連続的に供給した。即ち反応槽内での大豆油の平均滞留
時間が２０時間、そして水相中のグリセリン濃度が約２
０％に保つことができるようにそれぞれ反応槽内へ供給
した。反応槽内では下層の水がドラフトチューブにより
一旦巻き上げられ、ドラフトチューブ外側の充填層を水
滴が通過する間にリパーゼと油と水が接触し加水分解反
応が行われる。

一方、反応槽の上部と下部にそれぞれじゃま板５．１７
を設けることにより、その上側と下側ではほとんど水を
含まない脂肪酸あるいはほとんど油を含まない甘木が得
られる。この様にして脂肪酸は供給した大豆油の量だけ
連続的にオーバーフローにより抜き出し、甘木は反応槽
下部からポンプ１５により連続的に抜き出し、一旦貯槽
９に貯めた後、限外濾過膜８により水相に溶解している
酵素を濃縮回収し、グリセリン水の抜き出し量が２５ｇ
／ＩＩＲとなるように調製しながら反応を行った。本実
施例では限外濾過膜としてポリアクリロニトリル膜（分
画分子１３００００）を用いて半連続的に酵素の濃縮を
行い再び反応槽へもどした。

このような反応装置を用いて大豆油、水の連続供給及び
脂肪酸溶液、グリセリン水溶液の連続抜き出しを行いな
がら反応を継続した。

２０時間（反応槽内での平均滞留時間に等しい）後、脂
肪酸溶液貯槽６から脂肪酸溶液を採取して酸価及びけん
化価を測定したところ、酸価＝１７０、けん化価＝１９
４が得られた。下式より加水分解率を計算したところ８
６％であった。

けん化価 尚、グリセリン水？８液貯槽１０のグリセリン水のグリ
セリン濃度は２０−ｔ％であった。

同様に大豆油の供給開始後４０時間後、６０時間後、８
０時間後、１００時間後の分解率及びグリセリン濃度を
測定したところ第１表の如くであった。

第　　　１　　　表 このように１００時間の連続反応を行っても酵素は全く
失活せず、大豆油の分解率も８５〜８６％を維持し、水
相中のグリセリン濃度も１８〜２０％に維持できた。

一方、脂肪酸溶液貯槽６に得られる脂肪酸溶液中の水分
は０．５％以下であった。また、限外濾過膜を透過した
グリセリン水は品質的にも良好なグリセリン水が得られ
た。このように本反応システムを用いることにより、反
応と生成吻の分離を同時に行いながらしかも効率良く酵
素を回収再利用し高分解率を維持できることがわかった
。

実施例−２ 実施例−１と同様の装置を用い、初期仕込み大豆油分解
液、２０ｗｔ％グリセリン水溶液及び酵素仕込量も実施
例−１と同じにし、ポンプ１３及び１４による大豆油及
び水の連続添加量を以下のように変更し、大豆油の平均
滞留時間を４０時間とした。

大豆油添加量２５ｇ／ｌｌＲ１水添加量１２．５ｇ／Ｈ
Ｒ脂肪酸溶液の抜き出しはオーバーフローでグリセリン
水の抜き出し量は１２．５　ｇ　／ｌ（Ｒとなるように
調製しながら連続分解を行った。反応時間毎の大豆油の
加水分解率及びグリセリン濃度を測定したところ第２表
のようになった。

第　　　２　　　表 このように滞留時間を４０時間とすると約９０％の分解
率が得られることがわかった。

実施例−３ 実施例−１では反応槽内の水をドラフトチューブ内の攪
拌羽根により水を巻き上げて加水分解反応を行わせたが
、本実施例では攪拌の代わりに第２図に示した如く、反
応槽の下部より窒素ガス吹き込みノズル２２から窒素を
吹き込み水滴を油相内に巻き上げ、充填層に保持されて
いるリパーゼと油と水を接触させて加水分解反応を行わ
せた。反応槽上部にはロート状のじゃま板を設け、窒素
を捕集し、じゃま板の上側では液の混合が起こらないよ
うに配慮しである。

初期仕込み大豆油分解液、２０ｖ　Ｌ％グリセリン水溶
液及び酵素仕込み量及び大豆油の平均滞留時間は実施例
−１と同様にし、窒素吹込み量は１００　ｍ７／ｗｉｎ
で大豆油の連続加水分解を行った。

反応時間毎の大豆油の加水分解率及びグリセリン濃度を
測定したところ第３表のようになった。

第　　　３　　　表 このように、反応の下部から窒素を吹き込む方法でも第
１図に示した様な攪拌方法と同様の攪拌効果が得られ、
８５〜８６％の分解率が維持でき、実施例−１の場合と
同様効率良く脂肪酸溶液相とグリセリン水相の分離が行
えることがわかった。

実施例−４ 実施例−１，２，３では、反応器１槽のみでの連続加水
分解であるが、本実施例では、効率良く高分解率を得る
ため、第１図に示した反応器を２槽用いて２段の連続加
水分解を行った。

この場合、大豆油と水は向流となる様に供給した。即ち
、大豆油は先ず１段目の反応器から供給し、得られた脂
肪酸溶液を再び２段目の反応器に供給し、−力水は反応
器内のグリセリン濃度が約２０％となる様に配慮しなが
ら供給した。

大豆油は５０　ｇ　／ＩＩＲで供給し、水は１段目の反
応器にはフレッシュ水と２段目の反応器から回収したグ
リセリン水を混合し約１５％としたグリセリン水を３ｇ
／ＨＲの流量で供給し、２段目には１段目の反応器から
回収したグリセリン水と新たにフレッシュな水を混合し
て２０　ｇ　／ＩＩＲの流量で供給した。

反応時間毎の大豆油の加水分解率及びグリセリン濃度を
測定したところ第４表のようになった。

第　　　４　　　表 このように多段反応とすることにより効率よく油脂の加
水分解が行えることがわかった。

〔発明の効果〕

本発明の酵素もしくは微生物反応方法は、基質を生成物
に変換せしめながら同時に生成物を取り出す操作を行い
得る方法であり、各種反応条件をコントロールしたり、
反応を連続化することが極めて容易であり、工業化に有
利である。

【図面の簡単な説明】

第１図、第２図はそれぞれ本発明の反応システムの例の
模式図である。 １・・・反応槽 ２・・・充填材 ３・・・ドラフトチューブ ４・・・基質（非水溶液相）供給ノズル５・・・上部じ
ゃま板 ６・・・生成物（非水溶液相）貯槽 ７・・・せき ８・・・限外濾過膜 ９・・・水相膜処理用貯槽 １０・・・生成物（水相）貯槽 １１・・・基質（水相）貯槽 １２・・・基質（非水溶液相）貯槽 １３〜１６・・・ポンプ １７・・・下部じゃま板 １８〜１９・・・パルプ ２０・・・攪拌羽根 ２１・・・攪拌用モーター

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　非水溶液相と水相とが上下２層に分離して存在する
   反応器において、非水溶液相と水相とが混和しない部分
   を残しながら非水溶液相と水相とをその界面近傍で混和
   することにより、基質としての非水溶液及び水を、ある
   いは、非水溶液相及び／又は水相の中に存在する基質を
   、酵素もしくは微生物によって生成物に変換せしめ、混
   和しない部分の非水溶液相及び／又は水相中に存在する
   生成物を取り出すことを特徴とする酵素もしくは微生物
   反応方法。 ２　酵素もしくは微生物が、特別な前処理を行うことな
   く充填材に吸着もしくは保持され、あるいは、予め種々
   の固定化方法により固定化担体に固定化されて反応器中
   の非水溶液相と水相との界面近傍に設置されている特許
   請求の範囲第１項に記載の方法。 ３　界面近傍での混和をドラフトチューブ内の攪拌羽根
   を用いて行う特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ４　界面近傍での混和を、該界面近傍下方より不活性気
   体を吹き込み、下層を巻き上げることによって行う特許
   請求の範囲第１項に記載の方法。 ５　基質が水及び油脂であり、酵素がリパーゼである特
   許請求の範囲第１項に記載の方法。 ６　反応系内の水相中のグリセリン濃度を１０〜４０重
   量％の範囲内に維持して反応を行うことを特徴とする特
   許請求の範囲第５項に記載の方法。