JPS62259585A

JPS62259585A - 一本鎖ｔ−ＰＡと二本鎖ｔ−ＰＡを分離する方法

Info

Publication number: JPS62259585A
Application number: JP10320086A
Authority: JP
Inventors: Mitsuyoshi Morii; 森井　光義; Masaharu Ooka; 大岡　正治; Nobuhiro Kawashima; 伸広川嶋; Noriko Suzuki; 則子鈴木; Toshihiko Suzuki; 俊彦鈴木
Original assignee: Mitsui Toatsu Chemicals Inc
Current assignee: Mitsui Toatsu Chemicals Inc
Priority date: 1986-05-07
Filing date: 1986-05-07
Publication date: 1987-11-11
Anticipated expiration: 2010-08-30
Also published as: JPH0779692B2; ZA873049B

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、−末鎖ｔ−ＰＡ　（組織プラスノーゲンアク
チベーター）及び二本鎖ｔ−ＰＡを含有する混合物より
一本鎖ｔ−ＰＡ及び二本鎖ｔ−ＰＡを分離精製する方法
に関する。

本発明において、［！ＴＩ即ち、［エリスリナ・ラティ
シマ（まめ科植物Ｅｒｙｔｈｒｉｎａ　Ｌａｔｉｓｓｉ
ｍａ、広葉エリスリナ）及び他のエリスリナ種の種子中
に生成し、かつトリプシン、プラスミン及びｔ−ＰＡの
阻害剤であるが、ウロキナーゼには作用しない型の固定
化クニソツ型阻害剤」を使用する。

この阻害剤をｔ−ＰＡの精製に適用することは公知（特
開昭５９−１１８７１７号）であるが本発明におけるよ
うにこのものについて二種の緩衝液を使い分けるとどう
なるかということは知られていない。

我々は、ｔ−ＰＡ活性を有する物質について種々研究を
重ねた結果、それが−末鎖・二本鎖からなることを知り
、これらを別々に分離、精製する必要から本発明の方法
を創作するに至った。

一本６Ｊｔ−ＰＡだけを取得する公知の方法としては、
細胞培養する際に蛋白質分解酵素阻害剤を添加し、さら
に培養液から分離精製する工程を蛋白分解酵素阻害剤の
存在下に行う方法がある。しかし、この方法では一本鎖
ｔ−ＰＡから二本鎖ｔ−ＰＡへの移行を完全に阻止する
ことはできないので手段としては不充分なものでしかな
い。

ｔ−ＰＡを分離精製する工程で一本鎖ｔ−ＰＡと二本鎖
ｔ−ＰＡが分離できる手段としては、−末鎖ｔ−ｐ＾を
特異的に結合する固定化モノクローナル抗体を用いた方
法も知られている。しかしながら固定化モノクローナル
抗体を用いる精製法はｔ−ＰＡに対する吸着能力、使用
時の安定性及び実用性の面で充分な再現性ある方法とは
言えず、抗ヒ）　ｔ−ＰＡ抗体に反応する分子量１１万
±２万ダルトンの蛋白質との分離ができない欠点がある
。

本発明の方法によればｔ−ＰＡにつきその一本鎖と二本
鎖の分離が実現されるが、被験試料によっては少量のト
リプシン様酵素が挟雑している場合があり、これがＥＴ
Ｔに対して吸脱着することにより本発明の分離について
擾乱因子となりうる。これの為には予めこの挟雑物の除
去を前処理として行っておくとよい。

この除去方法としては、ＳＴＩ即ちＥＴＴと分子量がほ
ぼ同じで、アミノ酸配列も８０％以上の相同性を有する
大豆の種子に生成するクニソッ型阻害剤を（固定化して
）使用すればよい。

ＳＴＩは特異性の面でＥＴＴと類似しているが、ＳＴＩ
はｔ−ＰＡを阻害しない。この為、両者を組み合わせて
使用すると固定化抗ヒトｔ−ｐ＾モノクローナル抗体と
同様の選択性をもたせることができる。即ちヒ）　ｔ−
ＰＡを含む細胞培養液を固定化ＳＴＩカラムに通過させ
、培養液中に含まれる微量の不純蛍白分解酵素のうちＥ
ＴＩに結合する型の蛋白分解酵素を結合除去し、非吸着
溶液をＥＴＩカラムに通過させてｔ−ＰＡを吸着させ、
次いで不純蛍白質を洗浄除去して後、溶出溶媒のｐＨを
変化させることにより一本鎖及び二本鎖ｔ−ＰＡが別々
に分離溶出されるのである。

本発明は、ｔ−ＰＡを含む細胞の種類に関係なく適用可
能である。つまり、メラノーマ細胞、ヒト正常細胞及び
遺伝子組み換え技法を用い、ヒｌ−ｔ−ＰＡ遺伝子を組
み込んだ細胞のいずれからも一本鎖、二本ＩＪｊｔ−Ｐ
Ａの分離精製が可能である。その上、培養培地の組成に
かかわらず、つまり血清添加培地からも血清無添加培地
と同様に一本鎖と二本鎖ｔ−Ｐ＾の分離精製が可能であ
る。

以下ヒトｔ−ｐ＾を例にとって説明する。

〔実施例〕

実施例１親和試薬（ＥＴＩ試削）の調整：本発明で用いるＥＴＩ試剤は、以下のようにしてセファ
ローズカラムに調製して用いた。

エリスリナラティシマ種子をジョヘール（Ｊｏｕ−ｂｅ
ｒｔ）らの方法に従って採集し加工した。種子をすりつ
ぶし、脱脂し、０．５モル／　ＪＮａＣ１水溶液により
１０℃で一夜抽出した。

抽出物を遠心分離し、目的物を硫酸アンモニウム沈澱に
より上澄みから回収し、続いてセファデックスＧ５０、
ＤＥＡ−セルロースおよびＤＥＡ−セファローズのクロ
マトグラフィーにかけた。

最終精製物は、０．１χドデシル硫酸ナトリウム（ＳＯ
５）含有１５％ポリアクリルアミドゲルの電気泳動に付
した場合、みかけ分子１ｉ２２．ｏｏｏドルトンの単一
バンドとして移動した。

精製物（２６ｍｇ）を市販臭化シアン活性化アガロース
５ｍｌに通常方法で結合させた。

親和試薬は、ＮａＣｌ　０．４モル／　Ｉｌ、　０．１
Ｘ　ＴｒｉｔｏｎＸ−１００および０．０２％ナトリウ
ムアジド安定剤を含むＰＨ７，４のリン酸緩衝液に対し
て平衡化させた。

この親和試薬を使い捨てプラスチックシリンジの円筒で
造られた５ｍｌのカラムに充填した。

親和試薬（ＳＴＩ試剤）の調製：又前処理で用いるＳＴＩ試剤の調製は、以下のようであ
る。

５ＴＩ−セファローズの調製二人豆種子より前記のＥＴ
Ｉの場合と同様に磨砕、抽出、硫安沈澱、クロマトグラ
フ精製により精製したクニッツ型阻害剤（ＳＴＩ）２５
ｍｇを得て市販の臭化シアン活性化アガロース５ｍｌに
通常の方法で結合させた。

親和試薬は、ＮａＣ１Ｏ，４モル／１０．１χＴｒｉｔ
ｏｎＸ−１００を含むｐｌ＋７．４のリン酸緩衝液に対
して平衡化させた。この親和試薬を使い捨てプラスチッ
クシリンジの円筒で造られた５ｍ１Ｏカラムに充填した
。

これらを使用し、−重鎖及び二本鎖ｔ−ＰＡを精製した
。

例えば、ボウズ（Ｂｏｗｅｓ）メラノーマ細胞培養液（
１０％熱不活性（５６℃、３０分間）胎児牛血清及び２
０ＫＩＵ／ｍｌのアブロチンを含む）２ｆｆをＴｗｅｅ
ｎ８０（０，０２％）及び食塩（０，４モル／ｌ）で安
定化後、５ＴＩ−セファローズカラムに適用した。

流出液を集め、プラスミノーゲン依存フィブリン溶解活
性を測定したところ、カラムに適用された活性の約９８
％が確認された。この両分に食塩を終濃度１．０モル／
１になるように加え安定化後、ＥＴＩ−セファローズカ
ラムに適用した。

流出液を集め、プラスミノーゲン依存フィブリン溶解活
性を測定した。カラムに適用された活性の約１０％が確
認された。この両分をＳＯＳポリアクリルアミドゲル電
気泳動後のザイモグラフイーで調べると、ブラスミノー
ゲンアクチベークーとして１１万±２万ダルトン及び７
万ダルトンの二種類が確認された。全溶液をＥＴＩ−セ
ファローズカラムに通過させた後、２０倍カラム容量の
０．２％Ｔｗｅｅｎ８０を含む１．０Ｍ食塩水でカラム
を洗った。この方法により、カラムに適用された活性の
約５％が検出され、ザイモグラフ上で１１万±２万及び
７万ダルトンのバンドがプラスミノーゲンアクチベータ
ーとして確認された。

吸着した蛋白質は、０．１５Ｍ　ＮａＣｌを含む０．２
Ｍクエン酸緩衝液を用い、ｐＨ５，ｓからｐＨ３，０ま
でのりニア−グラジェント法で溶出した。

この方法によりｐｌ＋５．２からｐｌ＋４．５の範囲で
一つのピークが得られ、ｐＨ４，５からｐ）１３．７の
範囲でもう一つのピークが得らた。この二つの分画をあ
わせるとカラムに適用した活性の８０−８５χを示した
。

メルカプトエタノールで還元した試料をポリアクリルア
ミドゲル電気泳動後の≦艮染色で調べた結果、ＰＨ５，
２からｐＨ４，５の範囲で溶出されるものは還元しても
分子量に変化はなく、７万ダルトンを示したが、ｐＨ４
，５からｐｌ（３，７の範囲で溶出されるものは還元す
ると７万ダルトンのバンドは消失し３万から４万ダルト
ン付近にバンドが確認された。この結果から、ｐｌ（５
，２からｔｅｌ（４，５の範囲で溶出されるｔ−ＰＡは
一本鎖ｔ−ｐへであり、ｐＨ４，５からｐＨ３，７の範
囲で溶出されるｔ−ＰＡは二本鎖ｔ−ｐ＾であることが
確認された。

実施例２人胎児***細胞培養液〔１０％０％熱不活性６℃、３０
分間）胎児牛血清及び２０ＫＩＵ／ｍｌのアプロチンを
含む）２６をＴｗｅｅｎ８０（０，０２％）及び食塩（
０，４モル／β）で安定化後、５ＴＩ−セファローズカ
ラムに通用した。

流出液を集め、プラスミノーゲン依存フィブリン溶解活
性を測定した。カラムに適用された活性の約９８％が確
認された。この両分に食塩を終濃度１．０モル／１にな
るように加え安定化後、ＥＴＩ−セファローズカラムに
適用した。

流出液を集め、プラスミノーゲン依存フィブリン溶解活
性を測定した。カラムに適用された活性の約４５％が確
認された。この両分をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電
気泳動後のザイモグラフィーで調べると、ブラスミノー
ゲンアクチベーターとして１０万ダルトン付近に２〜３
本、５〜７万ダルトン付近に２〜３本、３万５千ダルト
ン付近に１本のバンドが確認された。

ｔ−ＦＡを吸着したＥＴｒ−セファローズカラムの洗浄
に１．ＯＭ　ＮａＣ１及び０．２χＴｗｅｅｎ８０を含
む２０倍カラム容量の０．ＩＭ　ＮＨＪＣ（ｈ　ＰＨ７
，５の緩衝液でカラムを洗った。

この方法によりカラムに適用された活性の約５％が検出
され、ザイモグラフで上記と同じバンドが確認された。

溶離緩衝液には０．１５Ｍ　ＮａＣ１を含むＯ，ＬＭグ
リシン塩酸緩衡液でｐｌ（４，５及びｐＨ３，５のもの
を用いて溶出した点のみをそれぞれ実施例１の場合と異
にし、他は全く同様におこなったところ次の結果を得た
。

分離されたｐＨの異なる２種の分画をあわせるとカラム
に適用された活性の４０−５０χを示した。メルカプト
エタノールで還元した試薬をポリアクリルアミドゲル電
気泳動後の銀染色で調べると、ｐＨ４，５で溶出される
ものは還元しても分子量に変化はなく、７万ダルトンを
示したが、Ｐ）１３．５で溶出されるものは還元すると
７万ダルトンのバンドは消失し３万から４万付近にバン
ドが確認、された。

この結果から、ｐＨ４，ｓで溶出されるｔ−ＰＡは一本
鎖ｔ−ＰＡであり、ｐＨ３，ｓで溶出されるｔ−ＰＡは
二本鎖を−ＰＡであることが確認された。

実施例３ヒトｔ−ＰＡ遺伝子を組み込んだマウス繊維芽細胞の培
養液〔２％熱不活性（５６℃、３０分間）胎児牛血清及
び２０ＫＩＵ／ｍｌのアブロチンを含む）２ｊ２をＴｗ
ｅｅｎ８０　（０、０２％）及び食塩（０，４モル／１
）で安定化ｆｅ、５ＴＴ−セファローズカラムに適用し
た。

流出液を集め、プラスミノーゲン依存フィブリン溶解活
性を測定した。カラムに適用された活性の約９８％が確
認された。この両分に食塩を終濃度１．０モル／ｌにな
るように加え安定化後、ＥＴｒ−セファローズカラムに
適用した。

流出液を集め、プラスミノーゲン依存フィブリン溶解活
性を測定した。カラムに適用された活性の約１０％が確
認された。この両分をＳＯＳポリアクリルアミドゲル電
気電気移動後イモグラフイーで調べると、プラスミノー
ゲンアクチヘーターとして１１万±２万ダルトン及び７
万ダルトンの二種類が確認された。全溶液をＥＴｒ−セ
ファローズカラムに通過させた後、２０倍カラム容量の
０．２χＴｗｅｅｎ８０を含む２．０Ｍ食塩水でカラム
を洗った。この方法により、カラムに適用された活性の
約５％が検出され、ザイモグラフ上で１１万±２万及び
７万ダルトンのバンドがプラスミノーゲンアクチベーク
ーとして確認された。

吸着した蛋白質は、０．１５Ｍ　ＮａＣ］を含む０．２
Ｍリン酸ナトリウム溶液ｐＨ４，５及びｐｌ（３，５を
用いて溶出された。

この２つの分画をあわせるとカラムに適用された活性の
約８０％を示した。メルカプトエタノールで還元した試
薬をポリアクリルアミドゲル電気泳動後の銀染色で調べ
ると、ｐＨ４，５で溶出されるものは還元しても分子量
に変化はなく、７万ダルトンを示したが、ｐＨ３，５で
溶出されるものは還元すると７万ダルトンのバンドは消
失し３万から４万付近にバンドが確認された。この結果
から、ｐＨ４，５で溶出されるｔ−ＰＡは一本鎖ｔ−Ｐ
Ａであり、ｐｌ＋３．５で溶出されるｔ−ＰＡは二本鎖
ｔ−ＰＡであることが確認された。

特許出願人　三井東圧化学株式会社手続補正書印発）昭和６２年８月６日特許庁長官　小　川　邦　夫　殿１、事件の表示昭和６１年特許願第１０３２００号２、発明の名称一本鎖ｔ−ＰＡと二本鎖ｔ−ｐ＾を分離する方法３、補
正をする者事件との関係　　特許出願人住所　東京都千代田区霞が関三丁目２番５号名称（３１
２）　　三井東圧化学株式会社５、補正の対象明細書の特許請求の範囲の欄および発明の詳細な説明の
欄６、補正の内容（１）明細書の特許請求の範囲を別紙のように補正する
。

（２）明細書、第２頁、第６〜８行目に「我々は、ｔ−
ＰＡ活性を・・・途中省略・・・二本鎖からなることを
知り、」とあるのをｒｔｐ＾活性を有する物質には一本
鎖ｔＰＡと二本鎖ｔＰＡが存在しＪと訂正する。

（３）同じく、第２頁、第１３行目の「がある。」を「
がある（Ｄ、Ｃ，Ｒｉｊｋｅｎ　ｅｔ　ａｌ＋　Ｊ、Ｂ
ｏｉｌ、Ｃｈｅ＋ｎ、　２５６　＋７０３５〜７０４１
．１９８１）。」と訂正する。

（４）同じく、第２頁、第２０行目の「知られている。

」を［知られている（Ｂｉｏ−Ｐｏｏｉ社カタログ（Ｓ
ｗｅｄｅ−ｎ）。」と訂正する。

（５）同じく、第３頁、第１４行目の「８０％以上の」
を削除する。

（６）同じく、第４頁、第１０〜１１行目の「ヒト正常
細胞」を「ヒト正常細胞、」と訂正する。

（７）同じく、第４頁、第１２〜１３行目の「−重鎖、
二本鎖ｔ−ＰＡＪを「−重鎖ｔ−ＰＡと二本鎖ｔ−ＰＡ
　Ｊと訂正する。

（８）同じく、第４頁、第１５行目の「一本積」を「一
本４１ｔ−ｐＡ」と訂正する。

（９）同じく、第４頁、第１７行目の［以下ヒ１−ｔ−
ＰＡを例にとって説明する。」を［以下、本発明を実施
例により具体的に説明する。」と訂正する。

００）同じく、第５頁、第４行目の「加工した。」を［
加工した（Ｊｏｕｂｅｒｔ　ｅｔ　ａｌ＋Ｈｏｐｐｅ−
５ｅｙｌｅｒ’ｓ　Ｚ、Ｐ−ｈｙｓｉｏｌ、ｃｈｅｍ、
、　３６２．５３１〜５３８．１９８１）　、　Ｊと訂
正する。

（１１）同じく、第５頁、第７〜８行目の「抽出物を遠
心分離し・・途中省略・・・上澄みから回収し、」を「
その上澄液を硫酸アンモニウムで塩析し、その沈澱物を
回収し、ｊと訂正する。

（１２１同じく、第５頁、第１５行目の１２６ｍＨを’
　２５ｍｇＪと訂正する。

以上別紙「２、特許請求の範囲１）−末鎖ｔＰＡ　と二本鎖ｔＰＡを倉↓ソＩ髪背ｄ忙
査ニ一旦、ＥＴＩを担持した川」１上」Ｕ棟瀘」して−
これらｔＰＡことを特徴とする一本鎖ｔＰＡと二本鎖ｔ
ＰＡを分離する方法。

広」

Claims

【特許請求の範囲】

一本鎖ｔ−ＰＡ及び二本鎖ｔ−ＰＡを含有する混合物を
、一旦ＥＴＩを担持しているカラムを通してこれらｔ−
ＰＡを保持し、その後、ｐＨ４．５を境としてこれより
酸性側である液及びアルカリ性側である液によってこれ
らｔ−ＰＡをそれぞれ溶離させることを特徴とする一本
鎖ｔ−ＰＡと二本鎖ｔ−ＰＡを分離する方法。