JPS62259585A - 一本鎖t−PAと二本鎖t−PAを分離する方法 - Google Patents
一本鎖t−PAと二本鎖t−PAを分離する方法Info
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- JPS62259585A JPS62259585A JP10320086A JP10320086A JPS62259585A JP S62259585 A JPS62259585 A JP S62259585A JP 10320086 A JP10320086 A JP 10320086A JP 10320086 A JP10320086 A JP 10320086A JP S62259585 A JPS62259585 A JP S62259585A
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- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、−末鎖t−PA (組織プラスノーゲンアク
チベーター)及び二本鎖t−PAを含有する混合物より
一本鎖t−PA及び二本鎖t−PAを分離精製する方法
に関する。
チベーター)及び二本鎖t−PAを含有する混合物より
一本鎖t−PA及び二本鎖t−PAを分離精製する方法
に関する。
本発明において、[!TI即ち、[エリスリナ・ラティ
シマ(まめ科植物Erythrina Latissi
ma、広葉エリスリナ)及び他のエリスリナ種の種子中
に生成し、かつトリプシン、プラスミン及びt−PAの
阻害剤であるが、ウロキナーゼには作用しない型の固定
化クニソツ型阻害剤」を使用する。
シマ(まめ科植物Erythrina Latissi
ma、広葉エリスリナ)及び他のエリスリナ種の種子中
に生成し、かつトリプシン、プラスミン及びt−PAの
阻害剤であるが、ウロキナーゼには作用しない型の固定
化クニソツ型阻害剤」を使用する。
この阻害剤をt−PAの精製に適用することは公知(特
開昭59−118717号)であるが本発明におけるよ
うにこのものについて二種の緩衝液を使い分けるとどう
なるかということは知られていない。
開昭59−118717号)であるが本発明におけるよ
うにこのものについて二種の緩衝液を使い分けるとどう
なるかということは知られていない。
我々は、t−PA活性を有する物質について種々研究を
重ねた結果、それが−末鎖・二本鎖からなることを知り
、これらを別々に分離、精製する必要から本発明の方法
を創作するに至った。
重ねた結果、それが−末鎖・二本鎖からなることを知り
、これらを別々に分離、精製する必要から本発明の方法
を創作するに至った。
一本6Jt−PAだけを取得する公知の方法としては、
細胞培養する際に蛋白質分解酵素阻害剤を添加し、さら
に培養液から分離精製する工程を蛋白分解酵素阻害剤の
存在下に行う方法がある。しかし、この方法では一本鎖
t−PAから二本鎖t−PAへの移行を完全に阻止する
ことはできないので手段としては不充分なものでしかな
い。
細胞培養する際に蛋白質分解酵素阻害剤を添加し、さら
に培養液から分離精製する工程を蛋白分解酵素阻害剤の
存在下に行う方法がある。しかし、この方法では一本鎖
t−PAから二本鎖t−PAへの移行を完全に阻止する
ことはできないので手段としては不充分なものでしかな
い。
t−PAを分離精製する工程で一本鎖t−PAと二本鎖
t−PAが分離できる手段としては、−末鎖t−p^を
特異的に結合する固定化モノクローナル抗体を用いた方
法も知られている。しかしながら固定化モノクローナル
抗体を用いる精製法はt−PAに対する吸着能力、使用
時の安定性及び実用性の面で充分な再現性ある方法とは
言えず、抗ヒ) t−PA抗体に反応する分子量11万
±2万ダルトンの蛋白質との分離ができない欠点がある
。
t−PAが分離できる手段としては、−末鎖t−p^を
特異的に結合する固定化モノクローナル抗体を用いた方
法も知られている。しかしながら固定化モノクローナル
抗体を用いる精製法はt−PAに対する吸着能力、使用
時の安定性及び実用性の面で充分な再現性ある方法とは
言えず、抗ヒ) t−PA抗体に反応する分子量11万
±2万ダルトンの蛋白質との分離ができない欠点がある
。
本発明の方法によればt−PAにつきその一本鎖と二本
鎖の分離が実現されるが、被験試料によっては少量のト
リプシン様酵素が挟雑している場合があり、これがET
Tに対して吸脱着することにより本発明の分離について
擾乱因子となりうる。これの為には予めこの挟雑物の除
去を前処理として行っておくとよい。
鎖の分離が実現されるが、被験試料によっては少量のト
リプシン様酵素が挟雑している場合があり、これがET
Tに対して吸脱着することにより本発明の分離について
擾乱因子となりうる。これの為には予めこの挟雑物の除
去を前処理として行っておくとよい。
この除去方法としては、STI即ちETTと分子量がほ
ぼ同じで、アミノ酸配列も80%以上の相同性を有する
大豆の種子に生成するクニソッ型阻害剤を(固定化して
)使用すればよい。
ぼ同じで、アミノ酸配列も80%以上の相同性を有する
大豆の種子に生成するクニソッ型阻害剤を(固定化して
)使用すればよい。
STIは特異性の面でETTと類似しているが、STI
はt−PAを阻害しない。この為、両者を組み合わせて
使用すると固定化抗ヒトt−p^モノクローナル抗体と
同様の選択性をもたせることができる。即ちヒ) t−
PAを含む細胞培養液を固定化STIカラムに通過させ
、培養液中に含まれる微量の不純蛍白分解酵素のうちE
TIに結合する型の蛋白分解酵素を結合除去し、非吸着
溶液をETIカラムに通過させてt−PAを吸着させ、
次いで不純蛍白質を洗浄除去して後、溶出溶媒のpHを
変化させることにより一本鎖及び二本鎖t−PAが別々
に分離溶出されるのである。
はt−PAを阻害しない。この為、両者を組み合わせて
使用すると固定化抗ヒトt−p^モノクローナル抗体と
同様の選択性をもたせることができる。即ちヒ) t−
PAを含む細胞培養液を固定化STIカラムに通過させ
、培養液中に含まれる微量の不純蛍白分解酵素のうちE
TIに結合する型の蛋白分解酵素を結合除去し、非吸着
溶液をETIカラムに通過させてt−PAを吸着させ、
次いで不純蛍白質を洗浄除去して後、溶出溶媒のpHを
変化させることにより一本鎖及び二本鎖t−PAが別々
に分離溶出されるのである。
本発明は、t−PAを含む細胞の種類に関係なく適用可
能である。つまり、メラノーマ細胞、ヒト正常細胞及び
遺伝子組み換え技法を用い、ヒl−t−PA遺伝子を組
み込んだ細胞のいずれからも一本鎖、二本IJjt−P
Aの分離精製が可能である。その上、培養培地の組成に
かかわらず、つまり血清添加培地からも血清無添加培地
と同様に一本鎖と二本鎖t−P^の分離精製が可能であ
る。
能である。つまり、メラノーマ細胞、ヒト正常細胞及び
遺伝子組み換え技法を用い、ヒl−t−PA遺伝子を組
み込んだ細胞のいずれからも一本鎖、二本IJjt−P
Aの分離精製が可能である。その上、培養培地の組成に
かかわらず、つまり血清添加培地からも血清無添加培地
と同様に一本鎖と二本鎖t−P^の分離精製が可能であ
る。
以下ヒトt−p^を例にとって説明する。
実施例1
親和試薬(ETI試削)の調整:
本発明で用いるETI試剤は、以下のようにしてセファ
ローズカラムに調製して用いた。
ローズカラムに調製して用いた。
エリスリナラティシマ種子をジョヘール(Jou−be
rt)らの方法に従って採集し加工した。種子をすりつ
ぶし、脱脂し、0.5モル/ JNaC1水溶液により
10℃で一夜抽出した。
rt)らの方法に従って採集し加工した。種子をすりつ
ぶし、脱脂し、0.5モル/ JNaC1水溶液により
10℃で一夜抽出した。
抽出物を遠心分離し、目的物を硫酸アンモニウム沈澱に
より上澄みから回収し、続いてセファデックスG50、
DEA−セルロースおよびDEA−セファローズのクロ
マトグラフィーにかけた。
より上澄みから回収し、続いてセファデックスG50、
DEA−セルロースおよびDEA−セファローズのクロ
マトグラフィーにかけた。
最終精製物は、0.1χドデシル硫酸ナトリウム(SO
5)含有15%ポリアクリルアミドゲルの電気泳動に付
した場合、みかけ分子1i22.oooドルトンの単一
バンドとして移動した。
5)含有15%ポリアクリルアミドゲルの電気泳動に付
した場合、みかけ分子1i22.oooドルトンの単一
バンドとして移動した。
精製物(26mg)を市販臭化シアン活性化アガロース
5mlに通常方法で結合させた。
5mlに通常方法で結合させた。
親和試薬は、NaCl 0.4モル/ Il、 0.1
X TritonX−100および0.02%ナトリウ
ムアジド安定剤を含むPH7,4のリン酸緩衝液に対し
て平衡化させた。
X TritonX−100および0.02%ナトリウ
ムアジド安定剤を含むPH7,4のリン酸緩衝液に対し
て平衡化させた。
この親和試薬を使い捨てプラスチックシリンジの円筒で
造られた5mlのカラムに充填した。
造られた5mlのカラムに充填した。
親和試薬(STI試剤)の調製:
又前処理で用いるSTI試剤の調製は、以下のようであ
る。
る。
5TI−セファローズの調製二人豆種子より前記のET
Iの場合と同様に磨砕、抽出、硫安沈澱、クロマトグラ
フ精製により精製したクニッツ型阻害剤(STI)25
mgを得て市販の臭化シアン活性化アガロース5mlに
通常の方法で結合させた。
Iの場合と同様に磨砕、抽出、硫安沈澱、クロマトグラ
フ精製により精製したクニッツ型阻害剤(STI)25
mgを得て市販の臭化シアン活性化アガロース5mlに
通常の方法で結合させた。
親和試薬は、NaC1O,4モル/10.1χTrit
onX−100を含むpl+7.4のリン酸緩衝液に対
して平衡化させた。この親和試薬を使い捨てプラスチッ
クシリンジの円筒で造られた5m1Oカラムに充填した
。
onX−100を含むpl+7.4のリン酸緩衝液に対
して平衡化させた。この親和試薬を使い捨てプラスチッ
クシリンジの円筒で造られた5m1Oカラムに充填した
。
これらを使用し、−重鎖及び二本鎖t−PAを精製した
。
。
例えば、ボウズ(Bowes)メラノーマ細胞培養液(
10%熱不活性(56℃、30分間)胎児牛血清及び2
0KIU/mlのアブロチンを含む)2ffをTwee
n80(0,02%)及び食塩(0,4モル/l)で安
定化後、5TI−セファローズカラムに適用した。
10%熱不活性(56℃、30分間)胎児牛血清及び2
0KIU/mlのアブロチンを含む)2ffをTwee
n80(0,02%)及び食塩(0,4モル/l)で安
定化後、5TI−セファローズカラムに適用した。
流出液を集め、プラスミノーゲン依存フィブリン溶解活
性を測定したところ、カラムに適用された活性の約98
%が確認された。この両分に食塩を終濃度1.0モル/
1になるように加え安定化後、ETI−セファローズカ
ラムに適用した。
性を測定したところ、カラムに適用された活性の約98
%が確認された。この両分に食塩を終濃度1.0モル/
1になるように加え安定化後、ETI−セファローズカ
ラムに適用した。
流出液を集め、プラスミノーゲン依存フィブリン溶解活
性を測定した。カラムに適用された活性の約10%が確
認された。この両分をSOSポリアクリルアミドゲル電
気泳動後のザイモグラフイーで調べると、ブラスミノー
ゲンアクチベークーとして11万±2万ダルトン及び7
万ダルトンの二種類が確認された。全溶液をETI−セ
ファローズカラムに通過させた後、20倍カラム容量の
0.2%Tween80を含む1.0M食塩水でカラム
を洗った。この方法により、カラムに適用された活性の
約5%が検出され、ザイモグラフ上で11万±2万及び
7万ダルトンのバンドがプラスミノーゲンアクチベータ
ーとして確認された。
性を測定した。カラムに適用された活性の約10%が確
認された。この両分をSOSポリアクリルアミドゲル電
気泳動後のザイモグラフイーで調べると、ブラスミノー
ゲンアクチベークーとして11万±2万ダルトン及び7
万ダルトンの二種類が確認された。全溶液をETI−セ
ファローズカラムに通過させた後、20倍カラム容量の
0.2%Tween80を含む1.0M食塩水でカラム
を洗った。この方法により、カラムに適用された活性の
約5%が検出され、ザイモグラフ上で11万±2万及び
7万ダルトンのバンドがプラスミノーゲンアクチベータ
ーとして確認された。
吸着した蛋白質は、0.15M NaClを含む0.2
Mクエン酸緩衝液を用い、pH5,sからpH3,0ま
でのりニア−グラジェント法で溶出した。
Mクエン酸緩衝液を用い、pH5,sからpH3,0ま
でのりニア−グラジェント法で溶出した。
この方法によりpl+5.2からpl+4.5の範囲で
一つのピークが得られ、pH4,5からp)13.7の
範囲でもう一つのピークが得らた。この二つの分画をあ
わせるとカラムに適用した活性の80−85χを示した
。
一つのピークが得られ、pH4,5からp)13.7の
範囲でもう一つのピークが得らた。この二つの分画をあ
わせるとカラムに適用した活性の80−85χを示した
。
メルカプトエタノールで還元した試料をポリアクリルア
ミドゲル電気泳動後の≦艮染色で調べた結果、PH5,
2からpH4,5の範囲で溶出されるものは還元しても
分子量に変化はなく、7万ダルトンを示したが、pH4
,5からpl(3,7の範囲で溶出されるものは還元す
ると7万ダルトンのバンドは消失し3万から4万ダルト
ン付近にバンドが確認された。この結果から、pl(5
,2からtel(4,5の範囲で溶出されるt−PAは
一本鎖t−pへであり、pH4,5からpH3,7の範
囲で溶出されるt−PAは二本鎖t−p^であることが
確認された。
ミドゲル電気泳動後の≦艮染色で調べた結果、PH5,
2からpH4,5の範囲で溶出されるものは還元しても
分子量に変化はなく、7万ダルトンを示したが、pH4
,5からpl(3,7の範囲で溶出されるものは還元す
ると7万ダルトンのバンドは消失し3万から4万ダルト
ン付近にバンドが確認された。この結果から、pl(5
,2からtel(4,5の範囲で溶出されるt−PAは
一本鎖t−pへであり、pH4,5からpH3,7の範
囲で溶出されるt−PAは二本鎖t−p^であることが
確認された。
実施例2
人胎児***細胞培養液〔10%0%熱不活性6℃、30
分間)胎児牛血清及び20KIU/mlのアプロチンを
含む)26をTween80(0,02%)及び食塩(
0,4モル/β)で安定化後、5TI−セファローズカ
ラムに通用した。
分間)胎児牛血清及び20KIU/mlのアプロチンを
含む)26をTween80(0,02%)及び食塩(
0,4モル/β)で安定化後、5TI−セファローズカ
ラムに通用した。
流出液を集め、プラスミノーゲン依存フィブリン溶解活
性を測定した。カラムに適用された活性の約98%が確
認された。この両分に食塩を終濃度1.0モル/1にな
るように加え安定化後、ETI−セファローズカラムに
適用した。
性を測定した。カラムに適用された活性の約98%が確
認された。この両分に食塩を終濃度1.0モル/1にな
るように加え安定化後、ETI−セファローズカラムに
適用した。
流出液を集め、プラスミノーゲン依存フィブリン溶解活
性を測定した。カラムに適用された活性の約45%が確
認された。この両分をSDSポリアクリルアミドゲル電
気泳動後のザイモグラフィーで調べると、ブラスミノー
ゲンアクチベーターとして10万ダルトン付近に2〜3
本、5〜7万ダルトン付近に2〜3本、3万5千ダルト
ン付近に1本のバンドが確認された。
性を測定した。カラムに適用された活性の約45%が確
認された。この両分をSDSポリアクリルアミドゲル電
気泳動後のザイモグラフィーで調べると、ブラスミノー
ゲンアクチベーターとして10万ダルトン付近に2〜3
本、5〜7万ダルトン付近に2〜3本、3万5千ダルト
ン付近に1本のバンドが確認された。
t−FAを吸着したETr−セファローズカラムの洗浄
に1.OM NaC1及び0.2χTween80を含
む20倍カラム容量の0.IM NHJC(h PH7
,5の緩衝液でカラムを洗った。
に1.OM NaC1及び0.2χTween80を含
む20倍カラム容量の0.IM NHJC(h PH7
,5の緩衝液でカラムを洗った。
この方法によりカラムに適用された活性の約5%が検出
され、ザイモグラフで上記と同じバンドが確認された。
され、ザイモグラフで上記と同じバンドが確認された。
溶離緩衝液には0.15M NaC1を含むO,LMグ
リシン塩酸緩衡液でpl(4,5及びpH3,5のもの
を用いて溶出した点のみをそれぞれ実施例1の場合と異
にし、他は全く同様におこなったところ次の結果を得た
。
リシン塩酸緩衡液でpl(4,5及びpH3,5のもの
を用いて溶出した点のみをそれぞれ実施例1の場合と異
にし、他は全く同様におこなったところ次の結果を得た
。
分離されたpHの異なる2種の分画をあわせるとカラム
に適用された活性の40−50χを示した。メルカプト
エタノールで還元した試薬をポリアクリルアミドゲル電
気泳動後の銀染色で調べると、pH4,5で溶出される
ものは還元しても分子量に変化はなく、7万ダルトンを
示したが、P)13.5で溶出されるものは還元すると
7万ダルトンのバンドは消失し3万から4万付近にバン
ドが確認、された。
に適用された活性の40−50χを示した。メルカプト
エタノールで還元した試薬をポリアクリルアミドゲル電
気泳動後の銀染色で調べると、pH4,5で溶出される
ものは還元しても分子量に変化はなく、7万ダルトンを
示したが、P)13.5で溶出されるものは還元すると
7万ダルトンのバンドは消失し3万から4万付近にバン
ドが確認、された。
この結果から、pH4,sで溶出されるt−PAは一本
鎖t−PAであり、pH3,sで溶出されるt−PAは
二本鎖を−PAであることが確認された。
鎖t−PAであり、pH3,sで溶出されるt−PAは
二本鎖を−PAであることが確認された。
実施例3
ヒトt−PA遺伝子を組み込んだマウス繊維芽細胞の培
養液〔2%熱不活性(56℃、30分間)胎児牛血清及
び20KIU/mlのアブロチンを含む)2j2をTw
een80 (0、02%)及び食塩(0,4モル/1
)で安定化fe、5TT−セファローズカラムに適用し
た。
養液〔2%熱不活性(56℃、30分間)胎児牛血清及
び20KIU/mlのアブロチンを含む)2j2をTw
een80 (0、02%)及び食塩(0,4モル/1
)で安定化fe、5TT−セファローズカラムに適用し
た。
流出液を集め、プラスミノーゲン依存フィブリン溶解活
性を測定した。カラムに適用された活性の約98%が確
認された。この両分に食塩を終濃度1.0モル/lにな
るように加え安定化後、ETr−セファローズカラムに
適用した。
性を測定した。カラムに適用された活性の約98%が確
認された。この両分に食塩を終濃度1.0モル/lにな
るように加え安定化後、ETr−セファローズカラムに
適用した。
流出液を集め、プラスミノーゲン依存フィブリン溶解活
性を測定した。カラムに適用された活性の約10%が確
認された。この両分をSOSポリアクリルアミドゲル電
気電気移動後イモグラフイーで調べると、プラスミノー
ゲンアクチヘーターとして11万±2万ダルトン及び7
万ダルトンの二種類が確認された。全溶液をETr−セ
ファローズカラムに通過させた後、20倍カラム容量の
0.2χTween80を含む2.0M食塩水でカラム
を洗った。この方法により、カラムに適用された活性の
約5%が検出され、ザイモグラフ上で11万±2万及び
7万ダルトンのバンドがプラスミノーゲンアクチベーク
ーとして確認された。
性を測定した。カラムに適用された活性の約10%が確
認された。この両分をSOSポリアクリルアミドゲル電
気電気移動後イモグラフイーで調べると、プラスミノー
ゲンアクチヘーターとして11万±2万ダルトン及び7
万ダルトンの二種類が確認された。全溶液をETr−セ
ファローズカラムに通過させた後、20倍カラム容量の
0.2χTween80を含む2.0M食塩水でカラム
を洗った。この方法により、カラムに適用された活性の
約5%が検出され、ザイモグラフ上で11万±2万及び
7万ダルトンのバンドがプラスミノーゲンアクチベーク
ーとして確認された。
吸着した蛋白質は、0.15M NaC]を含む0.2
Mリン酸ナトリウム溶液pH4,5及びpl(3,5を
用いて溶出された。
Mリン酸ナトリウム溶液pH4,5及びpl(3,5を
用いて溶出された。
この2つの分画をあわせるとカラムに適用された活性の
約80%を示した。メルカプトエタノールで還元した試
薬をポリアクリルアミドゲル電気泳動後の銀染色で調べ
ると、pH4,5で溶出されるものは還元しても分子量
に変化はなく、7万ダルトンを示したが、pH3,5で
溶出されるものは還元すると7万ダルトンのバンドは消
失し3万から4万付近にバンドが確認された。この結果
から、pH4,5で溶出されるt−PAは一本鎖t−P
Aであり、pl+3.5で溶出されるt−PAは二本鎖
t−PAであることが確認された。
約80%を示した。メルカプトエタノールで還元した試
薬をポリアクリルアミドゲル電気泳動後の銀染色で調べ
ると、pH4,5で溶出されるものは還元しても分子量
に変化はなく、7万ダルトンを示したが、pH3,5で
溶出されるものは還元すると7万ダルトンのバンドは消
失し3万から4万付近にバンドが確認された。この結果
から、pH4,5で溶出されるt−PAは一本鎖t−P
Aであり、pl+3.5で溶出されるt−PAは二本鎖
t−PAであることが確認された。
特許出願人 三井東圧化学株式会社
手続補正書印発)
昭和62年8月6日
特許庁長官 小 川 邦 夫 殿
1、事件の表示
昭和61年特許願第103200号
2、発明の名称
一本鎖t−PAと二本鎖t−p^を分離する方法3、補
正をする者 事件との関係 特許出願人 住所 東京都千代田区霞が関三丁目2番5号名称(31
2) 三井東圧化学株式会社5、補正の対象 明細書の特許請求の範囲の欄および発明の詳細な説明の
欄 6、補正の内容 (1)明細書の特許請求の範囲を別紙のように補正する
。
正をする者 事件との関係 特許出願人 住所 東京都千代田区霞が関三丁目2番5号名称(31
2) 三井東圧化学株式会社5、補正の対象 明細書の特許請求の範囲の欄および発明の詳細な説明の
欄 6、補正の内容 (1)明細書の特許請求の範囲を別紙のように補正する
。
(2)明細書、第2頁、第6〜8行目に「我々は、t−
PA活性を・・・途中省略・・・二本鎖からなることを
知り、」とあるのをrtp^活性を有する物質には一本
鎖tPAと二本鎖tPAが存在しJと訂正する。
PA活性を・・・途中省略・・・二本鎖からなることを
知り、」とあるのをrtp^活性を有する物質には一本
鎖tPAと二本鎖tPAが存在しJと訂正する。
(3)同じく、第2頁、第13行目の「がある。」を「
がある(D、C,Rijken et al+ J、B
oil、Che+n、 256 +7035〜7041
.1981)。」と訂正する。
がある(D、C,Rijken et al+ J、B
oil、Che+n、 256 +7035〜7041
.1981)。」と訂正する。
(4)同じく、第2頁、第20行目の「知られている。
」を[知られている(Bio−Pooi社カタログ(S
wede−n)。」と訂正する。
wede−n)。」と訂正する。
(5)同じく、第3頁、第14行目の「80%以上の」
を削除する。
を削除する。
(6)同じく、第4頁、第10〜11行目の「ヒト正常
細胞」を「ヒト正常細胞、」と訂正する。
細胞」を「ヒト正常細胞、」と訂正する。
(7)同じく、第4頁、第12〜13行目の「−重鎖、
二本鎖t−PAJを「−重鎖t−PAと二本鎖t−PA
Jと訂正する。
二本鎖t−PAJを「−重鎖t−PAと二本鎖t−PA
Jと訂正する。
(8)同じく、第4頁、第15行目の「一本積」を「一
本41t−pA」と訂正する。
本41t−pA」と訂正する。
(9)同じく、第4頁、第17行目の[以下ヒ1−t−
PAを例にとって説明する。」を[以下、本発明を実施
例により具体的に説明する。」と訂正する。
PAを例にとって説明する。」を[以下、本発明を実施
例により具体的に説明する。」と訂正する。
00)同じく、第5頁、第4行目の「加工した。」を[
加工した(Joubert et al+Hoppe−
5eyler’s Z、P−hysiol、chem、
、 362.531〜538.1981) 、 Jと訂
正する。
加工した(Joubert et al+Hoppe−
5eyler’s Z、P−hysiol、chem、
、 362.531〜538.1981) 、 Jと訂
正する。
(11)同じく、第5頁、第7〜8行目の「抽出物を遠
心分離し・・途中省略・・・上澄みから回収し、」を「
その上澄液を硫酸アンモニウムで塩析し、その沈澱物を
回収し、jと訂正する。
心分離し・・途中省略・・・上澄みから回収し、」を「
その上澄液を硫酸アンモニウムで塩析し、その沈澱物を
回収し、jと訂正する。
(121同じく、第5頁、第15行目の126mHを’
25mgJと訂正する。
25mgJと訂正する。
以上
別紙
「2、特許請求の範囲
1)−末鎖tPA と二本鎖tPAを倉↓ソI髪背d忙
査ニ一旦、ETIを担持した川」1上」U棟瀘」して−
これらtPAことを特徴とする一本鎖tPAと二本鎖t
PAを分離する方法。
査ニ一旦、ETIを担持した川」1上」U棟瀘」して−
これらtPAことを特徴とする一本鎖tPAと二本鎖t
PAを分離する方法。
広」
Claims (1)
- 一本鎖t−PA及び二本鎖t−PAを含有する混合物を
、一旦ETIを担持しているカラムを通してこれらt−
PAを保持し、その後、pH4.5を境としてこれより
酸性側である液及びアルカリ性側である液によってこれ
らt−PAをそれぞれ溶離させることを特徴とする一本
鎖t−PAと二本鎖t−PAを分離する方法。
Priority Applications (10)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP10320086A JPH0779692B2 (ja) | 1986-05-07 | 1986-05-07 | 一本鎖t−PAと二本鎖t−PAを分離する方法 |
ZA873049A ZA873049B (en) | 1986-05-07 | 1987-04-28 | Methods for purification of single-chain and double-chain tissue plasminogen activator |
US07/043,746 US4898825A (en) | 1986-05-07 | 1987-04-29 | Methods for purification of single-chain and double-chain tissue plasminogen activator |
CA000536036A CA1284961C (en) | 1986-05-07 | 1987-04-30 | Methods for purification of single-chain and double- chain tissue plasminogen activator |
AU72418/87A AU590840B2 (en) | 1986-05-07 | 1987-05-01 | Methods for purification of single-chain and double-chain tissue plasminogen activator |
FI871948A FI96211C (fi) | 1986-05-07 | 1987-05-04 | Menetelmä yksisäikeisen kudosplasminogeeniaktivaattorin (tPA) ja kaksisäikeisen tPA:n puhdistamiseksi ja eristämiseksi |
NO871883A NO173287C (no) | 1986-05-07 | 1987-05-06 | Fremgangsm}te for rensing av enkeltkjedet og dobbeltkjedet vevplasminogenaktivator |
EP87304077A EP0245100B1 (en) | 1986-05-07 | 1987-05-07 | Purification of single-chain and double-chain tissue plasminogen activator |
DK198702337A DK173151B1 (da) | 1986-05-07 | 1987-05-07 | Fremgangsmåde til oprensning af enkeltkædet og dobbeltkædet vævsplasminogenaktivator |
DE8787304077T DE3780506T2 (de) | 1986-05-07 | 1987-05-07 | Reinigung des einkettigen und zweikettigen gewebeplasminogenaktivators. |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP10320086A JPH0779692B2 (ja) | 1986-05-07 | 1986-05-07 | 一本鎖t−PAと二本鎖t−PAを分離する方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS62259585A true JPS62259585A (ja) | 1987-11-11 |
JPH0779692B2 JPH0779692B2 (ja) | 1995-08-30 |
Family
ID=14347873
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP10320086A Expired - Fee Related JPH0779692B2 (ja) | 1986-05-07 | 1986-05-07 | 一本鎖t−PAと二本鎖t−PAを分離する方法 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH0779692B2 (ja) |
ZA (1) | ZA873049B (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH02503635A (ja) * | 1988-09-28 | 1990-11-01 | ベーリンガー・マンハイム・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング | 原核生物中で発現されたプラスミノゲン活性化因子の調製物 |
JPH03500724A (ja) * | 1989-02-07 | 1991-02-21 | ベーリンガー・マンハイム・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング | 組織プラスミノーゲン活性化因子の誘導体 |
-
1986
- 1986-05-07 JP JP10320086A patent/JPH0779692B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1987
- 1987-04-28 ZA ZA873049A patent/ZA873049B/xx unknown
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH02503635A (ja) * | 1988-09-28 | 1990-11-01 | ベーリンガー・マンハイム・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング | 原核生物中で発現されたプラスミノゲン活性化因子の調製物 |
JPH03500724A (ja) * | 1989-02-07 | 1991-02-21 | ベーリンガー・マンハイム・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング | 組織プラスミノーゲン活性化因子の誘導体 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH0779692B2 (ja) | 1995-08-30 |
ZA873049B (en) | 1988-02-24 |
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Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |