DK173151B1

DK173151B1 - Fremgangsmåde til oprensning af enkeltkædet og dobbeltkædet vævsplasminogenaktivator

Info

Publication number: DK173151B1
Application number: DK198702337A
Authority: DK
Inventors: Mitsuyoshi Morii; Masaharu Ohoka; Toshihiko Suzuki; Katsuyuki Suzuki; Nobuhiro Kawashima; Noriko Morii; Kunizo Mori
Original assignee: Mitsui Chemicals Inc
Priority date: 1986-05-07
Filing date: 1987-05-07
Publication date: 2000-02-14
Also published as: EP0245100A2; NO871883D0; US4898825A; FI96211B; FI871948A; AU590840B2; NO173287B; FI96211C; EP0245100B1; NO871883L; EP0245100A3; AU7241887A; CA1284961C; NO173287C; DK233787D0; DK233787A; DE3780506D1; FI871948A0; DE3780506T2

Description

i DK 173151 B1

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til oprensning af enkeltkædet og/eller dobbeltkædet vævsplasminogenaktiva-5 tor (i det følgende betegnet henholdsvis sc-TPA og dc-TPA) fra en blanding indeholdende sc-TPA og dc-TPA.

tPA (vævsplasminogenaktivator) er et protein, der produceres i væv fra højere dyr, og som tjener til at aktivere plasminogen, der er en præcursor for plasmin, som er et 10 proteolytisk enzym, der er specifikt over for fibrin, og det er nu blevet bragt i fokus som et potentielt thrombolytisk middel.

tPA eksisterer i to molekylforroer, enkeltkædet tPA og dobbeltkædet tPA, som har samme molekylvægt (ca. 70 000 15 dalton), og det opnås som en blanding ved almindelige fremgangsmåder til fremstilling af tPA. Den dobbeltkædede form har ca. 10 gange højere aktivitet ved aktivering af plasminogen end den enkeltkædede form (EP patentansøgning publikation nr. 112 122 A). Det er imidlertid kendt, at 20 sc-TPA har en kraftigere bindingskapacitet over for fibrin end dc-TPA, og når det en gang er bundet til fibrin omdannes det hurtigt til dc-TPA (D.C. Rijken et al., J. Biol. Chem. 257, 2920-2925, 1982). For at opnå en effektiv behandling af thromboser med tPA, er det derfor 25 nødvendigt at opnå en øget bindingskapacitet af tPA til fibrin ved størkning af blod under anvendelse af en tPA-blanding, som indeholder en større mængde sc-TPA, eller ved at anvende et præparat, der kun indeholder sc-TPA.

Under disse forhold og også for at undersøge egenskaberne * 30 og funktionerne af tPA mere fuldstændigt har der været et stort behov for forbedrede fremgangsmåder til opnåelse af kun den enkeltkædede form og til særskilt isolering af 2 DK 173151 Bl den enkeltkædede og den dobbeltkædede form fra en blanding af disse.

En kendt fremgangsmåde til fremstilling af tPA omfatter f.eks. dyrkning af celler, der oprindeligt er i stand til 5 at producere tPA eller er manipuleret til at indeholde tPA-genet, og efterfølgende isolering af tPA fra de dyrkede celler og/eller fra dyrkningssupernatanten.

F.eks. er der i ovenænvte EP patentansøgning publikation nr. 112 122 A beskrevet en fremgangsmåde til oprensning 10 af tPA under anvendelse af en Erythrina-trypsininhibitor (i det følgende benævnt som ETI) eller en immobiliseret Kunits-inhibitor, som produceres i frø af Erythrina latissima og andre Erythrina-planter, og som fungerer som inhibitor over for trypsin, plasmin og tPA, men ikke over 15 for urokinase. Ved denne fremgangsmåde overvejes der imidlertid ikke en separat isolering af sc-TPA fra dc-TPA.

Ved en kendt fremgangsmåde til fremstilling af sc-TPA sættes en proteinaseinhibitor, såsom Aprotinin, til et 20 dyrkningsmedium for at undertrykke omdannelse af tPA fra enkeltkædet til dobbeltkædet form (D.C. Rijken et al.r J.

Biol. Chem., 256, 7035-7041, 1981).

Ved en anden fremgangsmåde til oprensning af sc-TPA anvendes et immobiliseret monoklonalt antistof, som 25 specifikt adsorberer sc-TPA (katalogiseret af BioPool, Sverige). Denne fremgangsmåde er imidlertid ringere end fremgangsmåden med ETI med hensyn til adsorptionsevnen over for tPA og stabiliteten af den anvendte søjle. Endvidere og uhensigtsmæssigt kan der ved denne frem-30 gangsmåde ikke fjernes en urenhed, som er et protein med en molekylvægt på 110 000 ± 20 000 dalton og som potentielt virker som et antigen og reagerer med et anti-human-tPA-antistof.

DK 173151 Bl 3 I forbindelse med forskellige undersøgelser af fremgangsmåder til oprensning af tPA fra et rå-tPA-præparat ved fremstilling af tPA, har fire af de foreliggende opfindere søgt patent på en opfindelse, der omfatter en frem-5 gangsmåde til isolering og fjernelse af et protein, der har en molekylvægt på 110 000 ± 20 000 dalton, og som reagerer med et anti-human-tPA-antistof, som produceres i et dyrkningsmedium, der indeholder føtalt kalveserum, og en fremgangsmåde til dyrkning af transformerede celler, 10 der er frembragt ved genmanipulation, og selektiv adskillelse af humancelleafledt tPA fra værtscelleafledt tPA (DK patentansøgning nr. 3696/86).

I forbindelse med omfattende undersøgelser af forskellige egenskaber af sc-TPA og dc-TPA har det vist sig, at disse 15 to tPA-former varierer i deres affinitet over for ETI, og nærværende opfindelse er fremkommet som et resultat af denne opdagelse.

Et formål med den foreliggende opfindelse er at tilvejebringe en fremgangsmåde til effektiv og let isolering af 20 sc-TPA og dc-TPA fra en blanding af disse.

Et andet formål med nærværende opfindelse er at tilvejebringe en fremgangsmåde til isolering af sc-TPA og/eller dc-TPA fra et rå-tPA-præparat, som indeholder sc-TPA og dc-TPA.

25 Disse formål opnås ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen til særskilt oprensning af sc-TPA og dc-TPA, som er særegen ved, at (a) en blanding indeholdende sc-TPA og dc-TPA bringes i nær kontakt med en søjle, der bærer en immobiliseret 30 Erythrina-trypsininhibitor som affinitetsmiddel til adsorption af disse tPA'er på søjlen, 4 DK 173151 Bl (b) søjlen behandles med et elueringsmiddel med et pH på 4,5-6,0 til selektiv eluering af enkeltkædet tPA, og (c) søjlen behandles med et elueringsmiddel med et pH på mindre end 4,5 til selektiv eluering af dobbeltkædet tPA.

5 I et aspekt af den foreliggende opfindelse kan en af de to former isoleres eksklusivt eller begge former kan isoleres fra den anden og oprenses om ønsket.

I et andet aspekt af den foreliggende opfindelse kan sc-TPA og/eller dc-TPA isoleres og oprenses mere effektivt 10 ved at sætte guanidin- eller amidinderivater, såsom arginin eller benzamidin, til det elueringsmiddel, der anvendes til eluering af tPA fra en søjle.

Den foreliggende opfindelse kan anvendes uafhængigt af den celletype, der producerer tPA. Mere præcist kan sc-15 TPA og/eller dc-TPA isoleres fra alle slags pattedyrsceller, såsom melanomaceller og normale humanceller eller fra celler, hvori der er inkorporeret human-tPA-gen ved genmanipulering. Ydermere gør den foreliggende opfindelse det muligt at isolere og oprense sc-TPA og dc-TPA fra et 20 medium med tilsat serum ligesom fra et serumfrit medium, dvs. uafhængigt af en bestanddel i dyrkningsmediet.

I et aspekt af den foreliggende opfindelse føres en blanding indeholdende sc-TPA og dc-TPA gennem en søjle, som bærer immobiliseret ETI, for at adsorbere tPA, derpå 25 elueres sc-TPA med et elueringsmiddel med et pH på 4,5- 6,0, og dernæst elueres dc-TPA med et elueringsmiddel med et pH, som er lavere end 4,5.

I et andet aspekt af den foreliggende opfindelse føres en blanding indeholdende sc-TPA og dc-TPA gennem en søjle, 30 som bærer immobiliseret ETI, og derpå behandles søjlen, hvis der kun ønskes sc-TPA, med et elueringsmiddel med et 5 DK 173151 B1 pH på 4,5-6,0, og hvis der kun ønskes dc-TPA, med et elueringsmiddel med et pH på mindre end 4,5. Der kan således isoleres og oprenses enten sc-TPA eller dc-TPA, som det ønskes.

5 I et andet aspekt af den foreliggende opfindelse kan ovennævnte fremgangsmåde til isolering og oprensning mere effektivt udføres ved at tilsætte et amidinderivat eller et guanidinderivat, såsom arginin og benzamidin, som et tilsætningsstof til elueringsmidlet. Der kan f.eks. altid 10 opnås et elueringsmønster med tilstrækkelig skarp(e) aktivitetstop(pe) for tPA under forskellige elueringsfor-hold, som indbefatter variationer i søjlestørrelse og lignende.

Foretrukne eksempler på en bærer til ETI-immobilisering 15 ifølge den foreliggende opfindelse indbefatter uopløselig agarose, dextran, cellulose, polyacrylamid og polyethy-lenglycidylmethacrylatpolymer. Foretrukne eksempler på en fremgangsmåde til ETI-immobilisering indbefatter traditionelt kendte fremgangsmåder, såsom en typisk fremgangs-20 måde til binding af ETI til en bærer, der er præaktiveret med bromcyanid, en carboimidokoblingsfremgangsmåde, hvorved en fri aminogruppe bindes til en fri carboxylgruppe, og en glutaraldehydkoblingsfremgangsmåde, hvorved en aminogruppe bindes til en bærer, der forudgående er omdannet 25 til en aminoalkylform. Et andet eksempel på en immobiliseret ETI-bærer er en, der er periodat-aktiveret, hvori en aldehydgruppe, der er dannet deri, reagerer med en aminogruppe i ETI ved et pH på 4-6 til dannelse af en Schiff-base, og derpå reduceres med natriumborhydrid 30 eller natriumcyanborhydrid. Ydermere kan et materiale til en bærer omdannes til et hydrazid-succinylderivat, hvori en carboxylligand skal bindes til en aminogruppe gennem EDC (l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid) eller gennem diazotering. Cellulosefibre og -partikler skal 6 DK 173151 B1 omdannes til hydrazidderivater og kan anvendes i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge Parikh et al.

(Methods in Enzymology 34, 77-102, udgivere; W.B. Jakobi og Wilcheck, Academic Press, N.Y.). Polyakrylamidpar-5 tikler kan bindes direkte ved hjælp af en glutaraldehyd-koblingsmetode eller gennem diazotering af et p-amino-benzamidoethylderivat eller et hydrazidderivat.

De elueringsmidler, som kan anvendes til eluering af tPA ifølge opfindelsen, indbefatter de syreopløsninger, som 10 har pH-værdier på under 6, vandopløselige saltopløsninger og pufferopløsninger.

Foretrukne eksempler på en sådan syreopløsning indbefatter de, som indeholder mindst én syre, der udvælges fra syregruppen bestående af citronsyre, oxalsyre, 15 mælkesyre, ravsyre, eddikesyre, phthalsyre, glutaminsyre, asparaginsyre, adipinsyre, phosphorsyre og saltsyre.

Foretrukne eksempler på en vandopløselig saltopløsning indbefatter de vandige opløsninger, som indeholder mindst ét salt, der udvælges fra saltgruppen omfattende natrium-20 chlorid, kaliumchlorid, lithiumchlorid, ammoniumchlorid, bariumchlorid, calciumchlorid, magnesiumchlorid, natriumsulfat, ammoniumsulfat, kaliumnitrat, kaliurathiocyanat, natriumthiocyanat og ammoniumthiocyanat.

Ydermere indbefatter foretrukne eksempler på en 25 pufferopløsning en natriumphosphatpuffer, en kaliumphos-phatpuffer, en Veronalpuffer, blandinger i en kombination, såsom natriumphosphat-phosphorsyre, kaliumphosphat-phosphorsyre, citronsyre-natriumcitrat, ravsyre-borat, mælkesyre-natriumlactat, eddike-natriumacetat, oxalsyre-30 natriumoxalat, glycin-saltsyre og kaliumhydrogenphthalat-natriumhydroxid.

7 DK 173151 B1

Disse elueringsmidler kan yderligere indeholde ét eller flere vandopløselige, organiske opløsningsmidler.

Foretrukne koncentrationer af et tilsætningsstof, der består af et amidinderivat eller et guanidinderivat, som 5 skal anvendes til eluering af tPA, varierer fra 1 mM til stoffets maksimale opløselighed. Ved et pH på mellem 4,5 og 6,0 mindskes den anvendelige koncentration f.eks. i forbindelse med fremgangsmåden ved pH 4,5, medens en højere koncentration er nødvendig i forbindelse med 10 fremgangsmåden ved til pH 6,0.

En udførelsesform af den foreliggende opfindelse omfatter, at en cellekultursupernatant, der indeholder human-tPA, føres gennem en ETI-søjle for at adsorbere tPA, at uønskede proteiner fjernes ved vask, at sc-TPA efterføl-15 gende indvindes fra søjlen ved anvendelse af et elue-ringsmiddel med et pH på fra 4,5 til 6,0 og et tilsætningsstof, og at dc-TPA derpå indvindes ved at ændre elueringsmidlets pH til under 4,5.

Det er inden for fagområdet kendt, at et amidinderivat 20 eller et guanidinderivat bindes kompetitivt til et aktivt center af en trypsinlignende protease til dissociering af et en2yminhibitorkompleks. Det er imidlertid en fuldstændig ny fremgangsmåde at anvende dette fænomen ved et så specifikt mål som isolering af sc-TPA og dc-TPA under de 25 mest egnede isoleringsforhold.

Hvis det udgangsmateriale, som skal behandles ifølge opfindelsen, eventuelt indeholder små mængder uønskede stoffer, såsom trypsinlignende enzymer osv., kan disse stoffer adsorberes eller desorberes fra ETI og virke som 30 interfererende faktorer ved oprensningsproceduren ifølge nærværende opfindelse. Følgeligt anbefales om nødvendigt en forbehandling til fjernelse af disse uønskede stoffer.

DK 173151 Bl 8

Fremgangsmåden ved denne fjernelse udføres ved at anvende en immobiliseret soyabønnetrypsininhibitor (i det følgende omtalt som STI) eller en anden inhibitor af Kunitstypen, som produceres i soyabønnefrø, og som har en 5 molekylvægt, der svarer til ETI, og en aminosyresekvens, der er 80% eller mere homolog med ETI.

STI svarer meget til ETI med hensyn til specificitet, men inhiberer ikke tPA. En kombineret anvendelse af disse to inhibitorer resulterer i en selektivitet, der kan 10 sammenlignes med den, som opnås ved anvendelse af et monoklonalt immobiliseret anti-human-tPA-antistof. Denne fremgangsmåde omfatter, at en cellekultursupernatant, som indeholder human-tPA, føres gennem en immobiliseret STI-søjle for at binde en del af den lille mængde af uønsket 15 proteinaser, som er inkluderet i dyrkningssupernatanten, at den resulterende udstrømning derpå føres gennem en immobiliseret ETI-søjle for at binde tPA, at ETI-søjlen vaskes for at fjerne uønskede proteiner, og til slut at sc-TPA og dc-TPA adskilt isoleres og oprenses ved at 20 ændre eluaternes pH.

I overensstemmelse med et vigtig aspekt ved den foreliggende opfindelse tilvejebringes der en fremgangsmåde, som er anvendelig uafhængig af den celletype, som indeholder tPA. For at være mere præcis gør den 25 foreliggende opfindelse det muligt at isolere og oprense sc-TPA og/eller dc-TPA fra en hvilken som helst celletype, såsom melanomaceller, normale humanceller og de celler, der er transformeret med human-tPA-gen ved hjælp af genmanipulering. Ydermere er det ifølge 30 nærværende opfindelse også muligt at isolere og oprense sc-TPA og/eller dc-TPA fra en kultursupernatant med serum ligesom fra en kultursupernatant uden serum, dvs. uafhængigt af en bestanddel i dyrkningsmediet.

9 DK 173151 B1 I overensstemmelse med et andet aspekt af den foreliggende opfindelse tilvejebringes der en fremgangsmåde, som passende kan anvendes på ethvert ønsket trin ved isolering og oprensning af sc-TPA og/eller dc-TPA ved 5 forskellige behandlinger eller fremstillingsprocedurer for tPA. F.eks. udføres isolering og oprensning af det ønskede sc-TPA og/eller dc-TPA ved at dyrke de celler, som er i stand til at producere tPA, således at de producerer tPA, og derpå behandle en resulterende blan-10 ding afledt fra kulturen ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse. En blanding afledt fra kulturen betyder en råekstrakt af kulturceller, en cellefri dyrk-ningssupernatant eller et behandlet materiale af disse. Enhver af disse vælges efter behov.

15 Andre vigtige aspekter ved den foreliggende opfindelse vil fremgå af den efterfølgende beskrivelse af udførelsesformer til oprensning af human-tPA.

Eksempel 1

En søjle, der bærer et immobiliseret affinitetsmiddel, 20 ETI eller STI, og som skal anvendes i de efterfølgende eksempler, fremstilles på følgende måde.

I overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge Joubert et al. (Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 362, 531-538, 1981), opsamles og forbehandles Erythrina latissima-frø.

25 Malede og affedtede frø blev ekstraheret natten over ved 10 °C med en 0,5 M NaCl-opløsning. Opløsningen med frøene blev centrifugeret for at indvinde supernatanten, og det påtænkte stof blev opsamlet fra supernatanten ved at udfælde det med ammoniumsulfat. Det således indvundne 30 stof blev udsat for kromatografi successivt på "Sephadex® G-50" (Pharmacia Fine Chemicals), DEAE-cellu-lose (Phoenix Chemicals) og DEAE-"Sepharose®" (Pharmacia Fine Chemicals). Det endelige oprensede præparat udviste 10 DK 173151 B1 et enkelt bånd med en tilsyneladende molekylvægt på 22 000 dalton, når det blev udsat for elektroforese i en 15% polyakrylamidgel indeholdende 0,1% natriumdodecyl-sulfat (SDS).

5 26 mg af det oprensede produkt blev bundet til 5 ml bromcyanid-aktiveret agarose ("Sepharose®”, Pharmacia Pine Chemicals), der var ækvilibreret med en phosphat-puffer, pH 7,4, der indeholdt 0,4 M NaCl, 0,1% ’’Triton® X-100" (Wako Jun-yaku Co-, Japan) og 0,02% natriumazid 10 som stabilisator, og blev endelig pakket i plastik-éngangssprøjter til dannelse af en 5 ml søjle (der i det følgende refereres til som ETI-"Sepharose®’’-søjle).

25 mg kromatografisk rent STI (fra Sigma Co.) blev bundet til 5 ml bromcyanid-aktiveret agarose, der var ækvili-15 breret med en phosphatpuffer, pH 7,4, der indeholdt 0,4 M NaCl og 0,1% ’’Triton® X-100", og blev endelig pakket i plastik-éngangssprøjter til dannelse af en 5 ml søjle (i det følgende omtalt som STI-"Sepharose®"-søjle).

Eksempel 2 20 21 dyrkningssupernatant fra humanmelanomaceller (Bowes, ATCC CRL 1224 G361) indeholdende 10% varmeinaktiveret (ved 56 °C i 30 min) føtalt kalveserum og 20 KIU (kalli-kreininhibitor-enheder)/ml aprotinin blev stabiliseret med 0,02% "Tween 80" (Wako Jun-yaku Co., Japan) og 0,4 M 25 NaCl og sat på en STI-"Sepharose®”-søjle.

Gennemløbet fra STI-søjlen blev opsamlet, og den plasmi-nogenafhængige fibrinolytiske aktivitet blev bestemt. Der blev observeret ca. 98% af den aktivitet, som var sat på søjlen. Gennemløbet blev stabiliseret med 1,0 M NaCl 30 (endelig koncentration), og derpå sat på en ETI-" Sepharose® "-søjle.

11 DK 173151 B1

Gennemløbet fra ETI-søjlen blev opsamlet, og den plasmi-nogenafhængige fibrinolytiske aktivitet blev bestemt. Der blev observeret ca. 10% af den aktivitet, som var sat på søjlen. Ved zymografi med et anti-human-tPA-antistof 5 efter SDS-polyakrylamidgel-elektroforese udviste gennemstrømningen to fraktioner af plasminogenaktivator, én med en molekylvægt på 110 000 ± 20 000 dalton, og en anden med en molekylvægt på 70 000 dalton. Efter at hele gennemløbet var ført gennem søjlen, blev den vasket med 10 20 gange søjlevolumenet af en væske indeholdende 1,0 M

NaCl og 0,2% "Tween 80". Den indvundne væske havde ca. 5% af den aktivitet, som var sat på søjlen, og ved zymografi blev der observeret to plasminogenaktivatorfraktioner, én med en molekylvægt på 110 000 ± 20 000 dalton, og en 15 anden med en molekylvægt på 70 000 dalton.

De proteiner, der var adsorberet på søjlen, blev elueret ved at påsætte en lineær pH-gradient på fra 5,0 til 3,0 under anvendelse af 0,2 M citronsyrepuffere indeholdende 0,15 M NaCl.

20 Ved denne eluering blev der observeret to aktivitetstoppe, hvor den ene top eluerede ved et pH på mellem 5,2 og 4,5 og den anden ved et pH på mellem 4,5 og 3,7. Disse to fraktioner udviste en fælles molekylvægt på 70 000 dalton ved SDS-polyakrylamidgel-elektroforese. Aktivite-25 ten af disse fraktioner var tilsammen ca. 80-85% af den aktivitet, der var sat på søjlen.

Disse to fraktioner blev efter reduktion med β-mercap-toethanol udsat for SDS-polyakrylamidgel-elektroforese, og dernæst en sølvfarvningsanalyse. Det blev fastlagt, at 30 den fraktion, som eluerede ved et pH på fra 5,2 til 4,5, udviste et bånd svarende til en molekylvægt på 70 000 dalton eller et langsomt migrererende bånd på gelen efter reduktion, hvorimod den fraktion, der blev elueret ved et 12 DK 173151 B1 pH på fra 4,5 til 3,7, udviste et bånd med en molekylvægt på fra 30 000 til 4 0 000 dalton, hvorimod båndet med en molekylvægt på 70 000 dalton forsvandt efter reduktion.

Ud fra dette resultat identificeres den tPA, som elueres 5 med pufferen ved et pH på mellem 5,2 og 4,5, som sc-TPA, og den tPA, som elueres ved et pH på mellem 4,5 og 3,7, som dc-TPA.

Eksempel 3 2 1 dyrkningssupernatant af humanføtale forhudsceller 10 ("Flow 7000" (Flow Laboratories Inc., USA)) indeholdende 10% varmeinaktiveret (56 °C, 30 min) føtalt kalveserum og 20 KIU/ml aprotinin, blev stabiliseret med 0,02% "Tween 80" og 0,4 M NaCl og sat på en STI-"Sepharose®"-søjle på samme måde, som beskrevet i eksempel 2.

15 Gennemløbet fra STI-søjlen blev opsamlet, og den plasmi-nogenafhængige fibrinolytiske aktivitet blev bestemt. Der blev observeret ca. 98% af den aktivitet, der var sat på søjlen. Gennemløbet blev stabiliseret med 1,0 M NaCl (endelig koncentration), og derpå sat på en ETI-20 "Sepharose® "-søjle.

Gennemløbet fra ETI-søjlen blev opsamlet, og den plasmi-nogenafhængige fibrinolytiske aktivitet blev bestemt. Der blev observeret ca. 45% af den aktivitet, der var sat på søjlen. Ved zymografi med et anti-human-tPA-antistof 25 efter SDS-polyakrylamidgel-elektroforese blev der som plasminogenaktivator i gennemløbet observeret flere fraktioner eller bånd, nogle få bånd med en molekylvægt på ca. 100 000 dalton, flere bånd med en molekylvægt på fra ca. 50 000 til 70 000 dalton og et bånd nær 35 000 30 dalton.

ETI-"Sepharose®"-søjlen blev vasket med 20 gange søjlevolumenet af 0,1 M NH^HCO^, pH 7,5, indeholdende 1,0 M

DK 173151 Bl 13

NaCl og 0,2% "Tween 80". Den indvundne væske havde ca. 5% af den aktivitet, der var sat på søjlen, og udviste samme zymografiske bånd, som beskrevet ovenfor.

Elueringen blev udført på samme måde, soro beskrevet i 5 eksempel 2, med undtagelse af, at der blev anvendt puffere indeholdende 0,15 M NaCl og 0,1 M glycin, pH 4,5 og pH 3,5.

Som et resultat blev der opnået et elueringsmønster svarende til det ifølge eksempel 2. Aktiviteten i 10 fraktioner var tilsammen ca. 40 til 50% af den aktivitet, som var sat på søjlen. Disse to fraktioner udviste en fælles molekylvægt på 70 000 dalton ved SDS-polyakryl-amidgel-elektroforese. Disse to fraktioner blev efter reduktion med β-mercaptoethanol, udsat for SDS-polyakryl-15 amidgel-elektroforese og derpå en sølvfarvningsanalyse.

Det viste sig, at den fraktion, der blev elueret med en puffer med pH 4,5, havde en molekylvægt på 70 000 dalton, og der var ingen ændring i molekylvægt eller et ret langsomt migrerende bånd på gelen efter reduktion, 20 hvorimod den fraktion, der blev elueret med en puffer med pH 3,5, udviste et molekylvægtsbånd på fra 30 000 til 40 000 dalton men ingen bånd svarende til et bånd for molekylvægten 70 000 dalton efter reduktion. Ud fra dette resultat identificeres den tPA, som elueres ved pH 4,5, 25 som sc-TPA, og den tPA, som elueres ved pH 3,5, som dc-TPA.

Eksempel 4 2 1 dyrkningssupernatant fra musefibroblastceller transformeret med human tPA-gen (DK patentansøgning nr.

30 5719/86), suppleret med 2% varmeinaktiveret (56°C, 30 min) føtalt kalveserum og 20 KIU/ml aprotinin blev stabiliseret med 0,02% "Tween 80" og 0,4 M NaCl og sat på en STI-"Sepharose®"-søjle.

14 DK 173151 B1

Gennemløbet fra STI-søjlen blev opsamlet, og den plasmi-nogenafhængige fibrinolytiske aktivitet blev bestemt. Der blev observeret ca. 98% af den aktivitet, der sat på søjlen. Gennemløbet blev stabiliseret med 1,0 M NaCl 5 (endelig koncentration) og derpå sat på en ETI-" Sepharose® "-søjle.

Gennemløbet fra ETI-søjlen blev opsamlet, og den plasmi-nogenafhængige fibrinolytiske aktivitet blev bestemt. Der blev observeret ca. 10% af den aktivitet, der var sat på 10 søjlen. Ved zymografi med et anti-human-tPA-antistof efter SDS-polyakrylamidgelelektroforese udviste gennemløbet to plasminogenaktivatorfraktioner, én med en molekylvægt på 110 000 ± 20 000 dalton, og en anden med en molekylvægt på 70 000 dalton. Efter at have ført hele 15 gennemløbet gennem søjlen, blev den vasket med 20 gange søjlevoluntenet af en væske indeholdende 2,0 M NaCl og 0,2% "Tween 80". Den indvundne væske havde ca. 5% af den aktivitet, som var sat på søjlen og udviste to plasminogenaktivatorfraktioner ved zymografi, én med en 20 molekylvægt på 110 000 + 20 000 dalton, og en anden med en molekylvægt på 70 000 dalton.

De proteiner, der var adsorberet på søjlen, blev elueret med 0,2 M natriumphosphatopløsninger indeholdende 0,15 M NaCl, pH 4,5 og pH 3,5. Der blev opnået et eluerings-25 mønster i lighed med det ifølge eksempel 2. Aktiviteten i de resulterende to fraktioner var tilsammen ca. 80% af den aktivitet, som var sat på søjlen. Disse to fraktioner udviste en fælles molekylvægt på 70 000 dalton ved SDS-polyakrylamidgelelektroforese.

30 Disse to fraktioner blev efter reduktion med β-mercap-toethanol udsat for SDS-polyakrylamidgel-elektroforese og derpå sølvfarvningsanalyse. Det viste sig, at eluatet med opløsningen med pH 4,5 udviste et bånd med en molekylvægt 15 DK 173151 B1 på 70 000 dalton og således ingen ændring i molekylvægt eller et ret langsomt migrerende bånd på gelen efter reduktion, hvorimod eluater med opløsningen med pH 3,5 udviste et bånd med en molekylvægt på fra 30 000 til 5 40 000 dalton, men ingen bånd svarende til båndet med en molekylvægt på 70 000 dalton efter reduktion. Ud fra dette resultat, blev det bekræftet, at den tPA, der elueres ved pH 4,5, er sc-TPA, og den tPA, der elueres ved pH 3,5, er dc-TPA.

10 Eksempel 5 2 1 dyrkningssupernatant af humanmelanomaceller (Bowes, ATCC CRL 1224 G361) indeholdende 10% varmeinaktiveret (56 °C, 30 min) føtalt kalveserum og 20 KIU/ral aprotenin blev stabiliseret med 0,02% "Tween 80" og 1 M NaCl og sat på 15 en ETI-"Sepharose®"-søjle.

Gennemløbet fra søjlen blev opsamlet, og den plasminogen-afhængige fibrinolytiske aktivitet blev bestemt. Der blev observeret ca. 10% af den aktivitet, der var sat på søjlen. Der blev ved zymografi med et anti-human-tPA-20 antistof efter SDS-polyakrylamidgelelektroforese fundet to plasminogenaktivatorfraktioner i gennemløbet, en med en molekylvægt på 110 000 ± 20 000 dalton og en anden med en molekylvægt på 70 000 dalton.

Efter at hele gennemløbet var ført gennem søjlen, blev 25 den vasket med 20 gange søjlevolumenet af en væske indeholdende 2 M NaCl og 0,2% "Tween 80". Den indvundne væske havde ca. 5% af den aktivitet, som var sat på søjlen, og udviste ved zymografi to plasminogenaktivatorfraktioner, én med en molekylvægt på 110 000 i 20 000 dalton og en 30 anden med en molekylvægt på 70 000 dalton.

; De proteiner, der var adsorberet på søjlen, blev elueret ved at påsætte en lineær pH-gradient på fra 6,5 til 3,0 DK 173151 Bl 16 med anvendelse af 0,2 M veronal-puffere indeholdende 0,2 M benzamid og 0,15 M NaCl.

Ved denne eluering blev der observeret to aktivitetstoppe, én top elueret ved pH i området fra 6,0 til 4,5, 5 og den anden ved pH i området fra 4,5 til 3,5. Disse to fraktioner udviste en fælles molekylvægt på 70 000 dalton ved SDS-polyakrylamidgel-elektroforese. Aktiviteten af disse fraktioner var tilsammen ca. 80-85% af den aktivitet, der blev sat på søjlen.

10 Disse to fraktioner blev efter reduktion med β-mercapto-ethanol udsat for SDS-polyakrylamidgelelektroforese og derpå sølvfarvningsanalyse. Det viste sig, at den fraktion, der blev elueret ved pH i området fra 6,0 til 4,5, udviste et bånd med en molekylvægt på 70 000 dalton og 15 ingen ændring i molekylvægten eller et ret langsomt migrerende bånd på gelen efter reduktion, hvorimod den fraktion, der blev elueret ved pH i området fra 4,5 til 3,5, udviste et bånd med en molekylvægt på fra 30 000 til 40 000 dalton, hvorimod båndet med en molekylvægt på 20 70 000 dalton forsvandt efter reduktion. Ud fra dette identificeres den tPA, der blev elueret med pufferen ved pH på mellem 6,0 og 4,5, som sc-TPA, og den tPA, der blev elueret ved pH på mellem 4,5 og 3,5, som dc-TPA.

Eksempel 6 25 21 dyrkningssupernatant fra humanføtale forhudsceller ("Flow 7000") indeholdende 10% varmeinaktiveret (56 °C, 30 min) føtalt kalveserum og 20 KIU/ml aprotinin blev stabiliseret med 0,02% "Tween 80" og 1 M NaCl og sat på en ETI-"Sepharose®"-søjle.

30 Gennemløbet fra ETI-søjlen blev opsamlet, og den plasmi-nogenafhængige fibrinolytiske aktivitet blev bestemt. Der blev observeret ca. 45% af den aktivitet, som var sat på søjlen.

17 DK 173151 B1

Ifølge zymografi med et anti-human-tPA-antistof efter SDS-polyakrylamidgelelektroforese udviste gennemløbet ad-5 skillige fraktioner eller bånd for plasminogenaktivato-ren, nogle få bånd med molekylvægte nær 100 000 dalton, flere bånd med molekylvægte nær 50 000 til 70 000 dalton og et bånd med en molekylvægt nær 35 000 dalton.

ETI-Sepharosesøjlen blev derpå vasket med 20 gange 10 søjlevolumenet af 0,1 M dinatriumphosphat-natriumhy-droxid-puffer, pH 9,5, indeholdende 2,0 M NaCl. Den indvundne væske havde ca. 5% af den aktivitet, som var sat på søjlen, og udviste ved zymografi samme bånd som beskrevet ovenfor.

15 Eluering blev udført med en 0,1 M natriumphosphat-phos-phorsyre-opløsning indeholdende 0,3 M arginin og 0,15 M NaCl (pH 5,5) og en 0,2 M citronsyrepuffer (pH 3,0) indeholdende 0,15 M NaCl.

Som resultat blev der opnået to fraktioner fra eluatet 20 med puffere med forskellige pH-værdier. Aktiviteten i fraktionerne var tilsammen fra ca. 40 til 50% af den aktivitet, der var sat på søjlen. Disse to fraktioner udviste en fælles molekylvægt på 70 000 dalton ved SDS-polyakrylamidgelelektroforese.

25 Disse fraktioner blev efter reduktion med β-mercapto-ethanol udsat for SDS-polyakrylamidgelelektroforese og derpå sølvfarvningsanalyse. Det viste sig, at eluatet med pufferen med pH 5,5 udviste et bånd med en molekylvægt på 70 000 dalton og ingen ændring i molekylvægt eller et ret 30 langsomt migrerende bånd på gelen efter reduktion, hvorimod eluatet med pufferen med pH 3,0 udviste et bånd med en molekylvægt på fra 30 000 til 40 000 dalton, DK 173151 Bl 18 hvorimod båndet svarende til båndet med en molekylvægt på 70 000 dalton forsvandt efter reduktion.

Ud fra dette resultat blev den tPA, der blev elueret ved pH 5,5, identificeret som sc-TPA, og den tPA, der blev 5 elueret ved pH 3,0, som dc-TPA.

Eksempel 7 2 1 dyrkningssupernatant fra musefibroblastceller, der var transformeret med human-tPA-gen (DK patentansøgning nr. 5719/86), suppleret med 2% varmeinaktiveret (56 °C, 10 30 min) føtalt kalveserum og 20 KIU/ml aprotinin blev stabiliseret med 1 M NaCl og sat på en ETI-"Sepharose®"-søjle.

Gennemløbet fra ETI-søjlen blev opsamlet, og den plasmi-nogenafhængige fibrinolytiske aktivitet blev bestemt. Der 15 blev observeret ca. 10% af den aktivitet, som var sat på søjlen. Ved zymografi med et anti-human-tPA-antistof efter SDS-polyakrylamidgelelektroforese udviste gennemløbet to plasminogenaktivatorfraktioner, én med en molekylvægt på 110 000 ± 20 000 dalton og den anden med en 20 molekylvægt på ca. 70 000 dalton. Efter at have ført hele gennemløbet gennem søjlen, blev den vasket med 20 gange søjlevolumenet af en 2 M NaCl-opløsning. Den indvundne væske havde ca. 5% af den aktivitet, der var sat på søjlen, og udviste ved zymografi to bånd for plasminogen-25 aktivator, ét med en molekylvægt på 110 000 i 20 000 dalton og et andet med en molekylvægt på ca. 70 000 dalton.

De proteiner, der var adsorberet på søjlen, blev derpå elueret med 0,1 M natriumphosphatpuffer (pH 6,0) indehol-30 dende 0,5 M benzamidin og 0,15 M NaCl og med 0,1 M

citronsyrepuffer (pH 3,0) indeholdende 0,15 M NaCl. Der blev opnået to forskellige fraktioner i to forskellige 19 DK 173151 B1 eluater. Aktiviteten i de resulterende to fraktioner var tilsammen ca. 80% af den aktivitet, som var sat på søjlen. Disse to fraktioner udviste en fælles molekylvægt på 70 000 dalton ved SDS-polyakrylamidgelelektroforese.

5 Disse to fraktioner blev efter reduktion med β-mercapto-ethanol udsat for SDS-polyakrylamidgelelektroforese og derpå sølvfarvningsanalyse. Det viste sig, at eluatet med pufferen med pH 6,0 udviste et bånd med en molekylvægt på ca. 70 000 dalton og ingen ændring i molekylvægt eller et 10 ret langsomt migrerende bånd på gelen efter reduktion, hvorimod eluatet med pufferen med pH 3,0 udviste et bånd med en molekylvægt på fra 30 000 til 40 000, men intet bånd svarende til molekylvægten på ca. 70 000 dalton efter reduktion.

15 Ud fra dette resultat blev den tPA, der elueres ved pH

6,0, identificeret som sc-TPA, og den tPA, der elueres ved pH 3,0, som dc-TPA.

Eksempel 8 2 1 dyrkningssupernatant fra kinesisk hamster-ovariecel-20 ler, der var transformeret med human-tPA-gen (CHO-celle, C1271, ATCC CRL 1616) suppleret med 10% varmeinaktiveret (56 °C, 30 min) føtalt kalveserum og 40 KIU/ml aprotinin blev stabiliseret med 1 M NaCl og sat på en ETI-”Sepharo-se®”-søjle med et volumen på 5 ml, som var blevet 25 ækvilibreret med en 0,05 M natriurophosphatpuffer (pH 7,5) indeholdende 1,0 M NaCl. Søjlen blev derpå vasket med 0,05 M Na2HP04 (pH 9,5) indeholdende 2,0 M NaCl og 10 mM arginin.

Hele gennemløbet fra ETI-søjlen havde ca. 10% af den 30 plasminogenafhængige fibrinolytiske aktivitet, som var sat på søjlen, og udviste ved zymografi et bånd med en 20 DK 173151 B1 molekylvægt på 110 000 ± 20 000 dalton og et bånd med en molekylvægt på ca. 70 000 dalton.

De proteiner, der blev adsorberet på søjlen, blev først elueret med 0,05 M ^2^0^-NaOH-puffer (pH 4,5) indehol-5 dende 0,01 M arginin og 0,1 M NaCl. Den fibrinolytiske aktivitet i eluatet var ca. 60% af den aktivitet, der var sat på søjlen. De proteiner, der var tilbage på søjlen, blev elueret med en 0,1 M citronsyrepuffer (pH 3,0) indeholdende 0,1 M NaCl. Der blev indvundet ca. 25% af 10 den aktivitet, der var sat på søjlen. Disse to fraktioner udviste en fælles molekylvægt på 70 000 dalton ved SDS-polyakrylamidgel-elektroforese.

De eluerede fraktioner blev efter reduktion med β-mercap-toethanol udsat for SDS-polyakrylamidgelelektroforese og 15 derpå sølvfarvningsanalyse. Det viste sig, at eluatet med pufferen med pH 4,5 udviste et bånd med en molekylvægt på ca. 70 000 dalton og ingen ændring i molekylvægt eller et ret langsomt migrerende bånd på gelen efter reduktion, hvorimod eluatet med pufferen med pH 3,0 udviste et bånd 20 med en molekylvægt på fra 30 000 til 40 000 dalton, men båndet med en molekylvægt på ca. 70 000 dalton forsvandt efter reduktion.

Ud fra dette resultat blev det bekræftet, at den tPA, der elueres ved pH 4,5, var sc-TPA, og den tPA, der elueres 25 ved pH 3,0, var dc-TPA.

Ud fra forsøgsresultaterne viste forholdet mellem pH og argininkoncentrationen til eluering af sc-TPA sig at være som følger: ved pH 4,5, 1-50 mM; ved pH 5,0, 0,03 M eller mere; ved pH 5,5, 0,10 M eller mere; og ved pH 6,0, 0,2 M 30 eller mere.

21 DK 173151 B1

T

Eksempel 9 ► 1 mol NaCl (endelig koncentration) blev sat til 2 1 dyrk-ningssupernatant fra humanføtale fosterhindeceller (FL, ATCC CCL-62), der var transformeret med et human-tPA-gen 5 associeret med humancytomegalovirus (HCMV) som en promotor for human-tPA-ekspression. Celledyrkningssupernatan-ten blev derpå udsat for oprensning af enkeltkædet tPA og dobbeltkædet tPA under anvendelse af en ETI-søjle, på samme måde, som beskrevet i eksempel 8.

10 Den fibrinolytiske aktivitet i de fraktioner, der blev elueret ved pH 4,5 og 3,0, var ca. 7 0% henholdsvis ca.

15% af den aktivitet, som var sat på søjlen.

Eksempel 10 Værtsceller, Saccharomyces cerevisiae, der var transfor-15 meret med human-tPA-gen, blev dyrket ifølge en traditionel fremgangsmåde ("Principles and Practice of Recombinant DNA Research with Yeast" i The Molecular Biology of Yeast Saccharomyces: Metabolism and Gene Expression, side 603-636, Cold Spring Harbor Laboratory, 20 Cold Spring Harbor, N.Y., 1982).

Cellerne blev nedbrudt med glaskugler og blev ekstraheret i 0,05 M natriumphosphatpuffer (pH 7,5) indeholdende 1 M NaCl og 0,02% "Tween 80". Den filtrerede ekstrakt blev udsat for tPA-oprensning på samme måde som beskrevet i 25 eksempel 6.

Eluatet med pufferen med pH 5,5 havde en molekylvægt på 70 000 dalton, der ikke blev ændret ved reduktion udført som i de ovenstående eksempler 2-8, og det udviste en aktivitet på 85% af den, der var sat på søjlen. Eluatet 30 med pufferen med pH 3,0 fik en ændret molekylvægt (70 000 dalton) ved reduktion, dvs. båndet med en molekylvægt på DK 173151 B1 22 70 000 dalton forsvandt, og der fremkom i stedet et bånd med en molekylvægt på fra 30 000 til 40 000 dalton. Der blev observeret ca. 10% af den aktivitet, som var sat på søjlen.

Claims

1. Fremgangsmåde til særskilt oprensning af enkeltkædet vævsplasminogenaktivator (tPA) og dobbeltkædet vævsplas-minogenaktivator, kendetegnet ved, 5 (a) at en blanding indeholdende enkeltkædet og dobbelt kædet tPA, bringes i nær kontakt med en søjle, der bærer en immobiliseret J?rythrina-trypsininhibitor som affinitetsmiddel til adsorption af disse tPA'er på søjlen, (b) at søjlen behandles med et elueringsmiddel med et pH 10 på 4,5-6,0 til selektiv eluering af enkeltkædet tPA, og (c) at søjlen behandles med et elueringsmiddel med et pH på mindre end 4,5 til selektiv eluering af dobbeltkædet tPA.

2. Fremgangsmåde til oprensning af enkeltkædet tPA fra 15 en blanding, der indeholder enkeltkædet tPA, kendetegnet ved, at en blanding indeholdende enkeltkædet tPA bringes i nær kontakt med en søjle, der bærer en immobiliseret ffrythrina-trypsininhibitor som affinitetsmiddel, og at enkeltkædet tPA, der er blevet adsorberet på søjlen, 20 elueres selektivt med et elueringsmiddel med et pH på 4,5-6,0.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at elueringsmidlet indeholder et amidinderivat eller guanidinderivat.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at elueringsmidlet indeholder amidinderivatet eller guani-dinderivatet i en koncentration på mindst 1 mM.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at amidinderivatet er benzamidin. DK 173151 B1

6. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at guanidinderivatet er arginin.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at blandingen hidrører fra en kultur af tPA-produce- 5 rende celler.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, at cellerne er melanomaceller eller humanføtale forhudsceller.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, at 10 cellerne er rekombinante celler, der er transformeret ved indførelse af et human-tPA-gen.

10. Fremgangsmåde ifølge krav 9, kendetegnet ved, at cellerne er kinesisk hamster-ovarieceller, humanføtale fosterhindeceller, gærceller eller musefibroblastceller.