JPS62224298A - 加水分解酵素検知用組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔渚業上の利用分野〕 本発明は、液体中の加水分解酵素（ｈｙｄｒｏｌｙｚｌ
ｎｇ＠ｎｚｙｍｅ　）の検知用および分析用、特に生物
学的液体中のアミラーゼの臨床分析用の改良された組成
物および碧゛素に関する。

〔従来の技術〕

加水分解酵素例えばアミラーゼの検知および分析用とし
て各種の技術が使用されている。１つの有用な技術は、
検知可能材料例えは着色材料ま友は染料材料を結合して
有するデンプンを含む湿式化学分析技術である。その分
析は米国特許３．６９４．３１８号明細書に記載されて
いる。その分析では、染色化デンｆ（予め形成した染料
ま九は染色形成体を化学的に結合させて有するデンプン
）を液体媒備中に溶解または懸濁させる。続いて、試験
すべき試料をその液体媒気中に加えると、試験試料中に
存在するアミラーゼがデンプンを加水分解し、染料の放
出が起きる。次に、加水分解されなかったデンプンを除
去して分離し、存在するアミラーゼ量は、放出された染
料量の関数として決定する。

この染色化デンプン分析は、米国特許 第４．１４４．３０６号明細書にも記載されているよう
に、乾式試験要素中に導入された。その特許明細書の要
素は、（１）検知可能材料例えは染料を結合して有する
非拡散性デンプンを含有する試薬層と（１１）検知可能
材料を受は取るようにし念記録層とを含んでなる。供試
液体試料を試薬層に与えると、試料中のアミラーゼがデ
ンプンを加水分解し、染料を結合して有する低分子集多
糖類単位に分解する。その分子ｆが非拡散性デンプンの
分子量よりも小さくなるので、染料含有低分子量多軸類
単位は記録層に拡散し、そこで色素形成量すなわち試料
中のアミラーゼ量を決定することができる。

〔発明が解決しようとする問題点〕

加水分解酵素検知用の多糖類系組成物を含有する前記の
や累のように、加水分解酵素例えはアミラーゼの分析用
の乾式試験要素は、それらが使い易く、そして迅速で信
頼性の高い結果が祷られるので非常に成功した。しかし
ながら、その試験夷素を雰囲気条件下で１週間以上の期
間に亘って保存すると、新しく調製した要素または冷蔵
厚で貯蔵した要素と比較して、ｆ！Ｊｆ素濃度全濃度に
予測する傾向がある。本発明は、雰囲気条件下で貯蔵さ
れた較素における酵素濃度の過剰予測（ｏｖｅｒｐｒｅ
ｄｌｅ−ｔｌｏｎ）の問題を処理するものである。

〔問題点を解決するための手段〕

染色化デンプンのように多糖類を使用する多糖類系分析
における酵素濃度の過剰予測の間融は、イオン化可能水
素少なくとも１個を有するメチレン基を力＃＆二／Ｉ／
２個の間にもつ１，３−ジオンを安定剤として検知用組
成物中に含有させることによりて解決される。

本発明の組成物は乾式試験要素中に配合するのが有利で
ある。特に好ましい試験徴集は、試薬領域と記録（ｒｅ
ｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ　）領域とからなる。この要素は
、非拡散性多糖類と前記の１．３−ジオンとを含む。前
記のジオンと多糖類とを要素中の別別の領域ま九は層の
中に存在させることができるが、それらを試薬領域また
は層中に一緒にすることが好ましい。その試薬領域また
は層は拡散領域または層であると考えることができる。

非拡散性多糖類は供試加水分解酵素の存在下で相互作用
によシ、その非拡散性多糖類に付着されていた検知可能
材料を含む拡散性材料を提供する。前記夫素の記録領域
は、この拡散性材料を受容するようになっている。

加水分解酵素検知用として有用な多糖類はデンプンであ
る。このようなｒ７ｆンは当業界で周知であり、各種の
起源例えはポテト、トウモロコシ、タピオカ、小麦、稲
、スィートポテトからのデンプンまたは他の起源から得
ることができる。水溶性デンプンおよび水不溶性デンプ
ンの両者を使用することができる。本発明の乾式試験要
素中で使用する場合には、その多糖類は前記要素中で非
拡散性となるのに充分に多い分子量をもつべきである。

加水分解酵素検知用として有用な検知可能材料は多数の
周知の検知可能材料例えば放射性材料および着色材料例
えは有色染料（ｃｈｒｏｍｏｇ＠ｎ１ｅｄｙｅ　）また
は螢光染料であることができる。有用な検知可能材料は
米国特許第４．１４４．３０６号明細書に記載されてい
る。好ましい染料は、着色染料例えＨＤｒ１ｍａｒｉｎ
＠Ｒｅｄ　Ｚ２Ｂ　にュージャージー州ハノーバーの５
ａｎｄｏｚ社から市販）および前記米ｌ特許第４，１４
４，３０６号明細書に記載の各種のハロゲン化シアヌル
染料である。多糖類例えばデンプンに前記の検知可能材
料を付着させる技術は当業界において周知である。その
ような技術は米国特許第３，５７９，３２２号および第
３，６９４，３１８号各明細曹に記載されている。

本発明の組成物は、イオン化可能水素少なくとも１個を
もつメチレン基を力に？ニル２個の間に有する前記１．
３−ジオンを安定剤として含有する。

これらの１．３−ジオンとしては、β−ジケトン、β−
ケトエステル、β−ケトアルデヒドおよびβ−ジアルデ
ヒドが含まれる。前記の１．３−ジオンの例としては、 ツメトン（５，５−ジメチル−１，３−シ臆＃７）、ｌ
−ベンゾイルアセトン、 １−フェニル−２，４−ペンタンジオン。

１−（２−フリル）−１，３−ブタンジオンが含まれる
。

本発明において有用な１，３−ジオンの好ましい（式中
、Ｈ′はイオン化男能水累であり、ＲはＨ、アルキル、
アリールま次は−ＣＯ−Ｒであり、Ｒ１およびＲは各々
独立にＨ、アルキル、アリール、−ＯＲ’　もしくは複
素環式環であるかまたは一緒になって５負もしくは６負
の炭素環式環を完成するのに必姿な原子であシ、ＲはＨ
、アルキルまたはアリールであり、そしてＲはアルキル
ま几はアリールである） の構造をもつ。

１．３−ジオンのｐＫａが約９以上でおる場合に。

Ｈ′で表される水素は一般にイオン化可能である。

当業界において周知であるとおり、Ｈ′担持炭素原子に
隣接する容易に水利可能なカル〆ニルまたはＨ′の周り
の立体障害の高水準のような成る条件によってＨ′のイ
オン化度を変えることができる。

Ｒ，Ｒ１Ｒ、ＲおよびＲは、Ｈ′で表される水素がイオ
ン化可能である限り、置換または非置換の任意のアルキ
ルまたはアリールであることができる。アルキル基は好
ましくは炭素原子１〜６個をもち、例えばメチル基、エ
チル基、プロピル基、ブチル基、インプロピル基等であ
る。有用なアリール基の例としてはフェニル基、トリル
基、メトキシフェニル基等が含まれる。

ＲとＲは一緒になって核中に炭素原子５個または６個を
もつ炭素環式環を完成するのに必要な原子を表わすこと
もできる。炭素環式環の例としてはシクロペンタン、シ
クロヘキサン、シフローンテン、シクロヘキセン等が含
まれる。

Ｒ，Ｒ，Ｒ，ＲおよびＲで表される前記の基はすべて、
Ｈ′で表巧れる水素がイオン化可能である限り、置換さ
れていないかまたは例えばアルキル基（例えばメチル基
、エチル基、ブチル基、ヘキシルＩＩＳ等）、アリール
基（例えばフェニル基、トリル基、メトキシフェニル基
、ヘキサデシルオキシフェニル基、ナフチル基等）、シ
アノ基およヒカルハルコキシ基（例えばカルボメトキシ
基、カルボエトキシ基、カルボエトキシ基等）等の基に
よって置換されていることができる。

本発明で有用な１，３−ジオンの特に好ましい群は、構
造式 ％式％ 〔式中、Ｒ５およびＲ８は各々水素；アルキル（例えば
メチル、エチル、ブチル等）；アリール（例えばフェニ
ル、トリル、ナフチル等）；シアノ；およびカルゲアル
コキシ（例えは力Ａ／〆メトキシ、カル〆エトキシ等）
からなる群から選んだ基であり、そしてＲ６およびＲ７
は各々水素、アルキル（例えばメチル、エチル、ブチル
、アミル等）、およびアリール（例えばフェニル、メト
キシフェニル、エトキシフェニル、ヘキサデシルオキシ
フェニル、トリル、ナフチル等）からなる群から選はれ
る〕 で表される炭素環式１．３−ジオンである。

本発明で有用な炭素環式１，３−ジオンの例としては以
下のものが含まれる。

（１）５．５−７メチルシクロヘキサンー１，３−ジオ
ン（２）　５−　フェニルシクロヘキサン−１，３−ジ
オン（３）５−（ｐ−メトキシフェニル）シクロヘキサ
ン−１，３−ジオン （４）４−シアノ−５−７エニルシクロへキチン−１，
３−ジオン （５）５（ｏ−デシルオキシフェニル）シクロヘキサン
−１，３−ジオン （６）５−（０−ヘキサデシルオキシフェニル）シクロ
ヘキサン−１，３−ジオン （７）シクロヘキサン−１，３−ジオン（ｓ）　４　、
６−ジカルポエトキシー５−メチルシクロヘキサン−１
，３−ジオン （９）４．６−シメチルー５−フェニルシクロヘキサン
−１，３−ジオン αａ４，６−ジシアツー５．５−ジメチルシクロヘキサ
ン−１，３−ジオン α］）４−フェニ／Ｉ／−５．５−ジエチルシクロヘキ
プ′ンーｌ、３−ジオン （６）５−メｆｋ−５−フェニルシクロヘキサン−１．
３−ジオン ０シクロインテン−１，３−ジオン α４４．４−）メチルシクロペンタン−１，３−ジオン
炭素環式１．３−ジオンおよびそれらの調製のその他の
説明は米国特許第３，４４７，９２６号明細書に記載が
ある。

検知可能材料を付着して有する多糖類および１．３−ジ
オンは、４素濃度の過剰予測に関して本発明の有利な減
少を提供する任意の比率で組合せることができる。少量
の１，３−ジオンでも若干の効果が発止するので、その
ような少量を含む組成物は本発明の範囲内に含まれる。

具体的な望ましい濃度は、特定の使用する多糖類および
１，３−ジオンに依存し、既知の酵素濃度をもつ試料で
その試料を試験することによって容易に決定することが
できる。１．３−ジオンの好ましい濃度は多糖類１００
重景重量対してジオンｌ−４０重士部の範囲である。本
発明の特に好ましい１．３−ジオンはジメドン（すなわ
ち５，５−ジメチル−１，３−シクロヘキサンジオン）
である。ジメドンの好ましい濃度は多糖類１００重量部
に対してジメドン２〜２０重月゛部の範囲である。

本発明の組成物は、前記の多糖類および１，３−ジオン
の他にバインダー、不活性粒子状材料および緩衝剤と一
緒に使用することができる。バインダーは前記米国特許
第４，１４４，３０６号明細書に記載の試薬担体のいず
れであってもよいが、特に好ましいバインダーの群は吟
方性多孔性ポリマー例えはプラッシ、ト・ポリマーであ
る。各種の微孔Ｔフィルターは（または部分的に）プラ
ッシュト・ポリマー組成物例えばＭｉｌｌｌｐｏｒｅ社
の各種膜フィルターであシ、それらは特許文献例えば米
国特許第２，７８３，８９４号および第２．７７２．３
２２号各明細書に記載されている。プラッシュト・ポリ
マーの多孔度は、本発明の非拡散性多糖類がそれを通過
して拡散しないが、前記の拡散性材料が拡散するもので
ある。

本発明の不活性粒子状材料は、任意の材料例えば顔料、
珪藻土または微結晶コロイド状材料例えば微結晶セルロ
ースであることができる。特に好ましい不活性粒子状材
料は、光反射性顔料例えば硫酸バリウム、二酸化チタン
、酸化亜鉛および酸化鉛である。その粒度は、プラッシ
ュト・ポリマーの多孔度と適合させるように選択する。

組成物中に含有させる顔料の量は大幅に変化し、一般に
はバインダーの重量を基準として５〜２，０００％であ
る。

加水分解酵素例えばアミラーゼの染色化デンプン分析に
おいては、ｐｉ（を適当な範囲に維持するために緩衝剤
を使用するのが好ましい。好ましい緩衝剤は−４を６〜
８の範囲に維持するものである。

前記の緩衝剤としては、トリエタノールアミンおよびリ
ン酸２水素ナトリウムが含まれる。他の適当な緩衝剤は
当業界において周知である。具体的な代表的緩衝剤組成
物の部分的な列挙が、Ｇｏｏｄ、Ｂｌｏｅｈｅｍｌｓｔ
ｒｙ　、　５　、　ｐ、４６７（１９６６）に記載され
ている。

本発明の組成物は、１種以上の試薬領域および記録領域
をもつ試験要素中で有利に使用することができる。前記
の要素は、試薬領域（ま之は複数）と記録領域（ま几は
複数）との間に、ｌｓ以上の緩衝剤領域を含んでいるこ
ともできる。前記の要素は自己支持的であることもでき
るが、支持体上にあるのが好ましい。添付図面において
、第１図は本発明の試験要素を示しており、それは支持
体（２）、記録層（６）および試薬層（１０）をもって
いる。第２図は、支持体（１４）、記録層（１８）、緩
衝剤層（２２）および試薬層（２６）をもつ本発明の試
験要素を示す。

前記の試薬領域は前記の多糖類および１．３−ジオンを
含んでなシ、好ましくは透過性および多孔質である。透
過度（多孔度からも次らされる透過度を含む）は、各種
の担体、マトリクスまたはバインダー、例えば前記米国
特許第４，１４４，３０６号明細書に記載の多孔質非繊
維質材料ま次は繊維質材料の存在によって達成すること
ができる。本発明の好ましい透過性バインダーは、前記
の群のプラッシュト・Ｉリマーである。不活性粒子状材
料例えば微結晶セルロースを分散させて含むポリマーバ
インダーも多孔質担体として有用である。

光反射の目的に、顔料粒子を試薬領域中に配合すること
ができる。

前記の記録領域は前記米国特許第４，１４４，３０６号
明細書に記載されている。

有用な要素は、臨床分析技術で周知の他の領域を含むこ
とができる。それらの他の領域としては、拡散領域、輻
射封鎖領域（反射領域を含む）、フィルター領域、下塗
り層等が含まれる。これらの領域の組成および要素中で
の位置は当業界において公知であり、米国特許第３，９
９２，１５８号および前記米国特許第４．１４４．３０
６号各明細書に記載されている。

本発明で有用な多層要素は当業界において周知の各種の
ラミネート技術ま九はコーチング技術、例えばハンド・
コーチング、ブレード・コーチング、ビーズ・コーチン
グ、またはディプ・コーチングによって調製することが
できる。コーチング技術およびラミネート技術並びに支
持体材料については前記米国特許第４，１４４，３０６
号明！ｌＢ書に記載がある。

〔実施例〕

以下、実施例によって本発明を更に具体的に説明する。

実施例１ 本発明に従って、第２図に示す配置をもつアミラーゼ分
析用要素をポリエチレンテレフタレート支持体上に調製
した。更に、前記の要素は、試薬層と記録層との間に、
０．５４０１７ｍ　で被覆したポリビニルピロリドンの
下塗９層をもってい念。

試薬層は以下の被覆量で検値した。

Ｂ　ａ　ＳＯ４粒子　　　　　　　　　　８３．６１１
７ｍ２Ｔｒｌｔｏｎ　Ｘ−４０５界面活性剤　　　　　
２．５１／／ｍ２アミロペクチン染色う′ンプン　　　
　　　　　　２．５１１層ｍ２ゾメドン　　　　　　　
　　　　　　　０．１１７ｍ２緩衝剤層は以下の被覆量
で抜機した。

ゼラチン　　　　　　　　　　　　　２．７２７ｍ２Ｔ
ｒｌｔｏｎ　Ｘ−４０５界面活性剤　　　　　０．１　
ｆ／／ｍ’トリエメトリルアミン　　　　　　　２．１
１７ｍ２Ｈ５ＰＯ４０，７φ２ 記録層は以下の被覆量で被覆した。

ゼラチン　　　　　　　　　　　　　１．９１層ｍ２Ｔ
ｒ　Ｉ　ｔ　ｏｎ−Ｘ−４０５界面活性剤　　　　　０
．　ｌ　ｌ／ｍ２Ｎ　ａ　Ｈ２ＰＯａ　　　　　　　　
　　　　　　Ｏ−２１７’ｒｎ　２比較用として、記録
層中にジメドンが存在しないこと以外は前記要素と同じ
要素を調製し次。

両方の要素調製物（ジメドンを含むものおよび含まない
もの）の試料を各種の条件下で各種の期間〔２２℃／相
対湿度（ＲＨ）８０％で１週間、２２’Ｃ／ＲＨ８０俤
で３週間、０７／ＲＨ５０％で３週間、および２２℃／
ＲＨ８０％で６週間〕老化させた。

既知のアミラーゼ濃度を含む血清系対照溶液を使用して
、前記の老化要素および新鮮な要素を試験した。この比
較試験の結果を第３図および第４図に示す。第３図はジ
メドンを含まない本発明の範囲外の犬素の結果を示し、
第４図はジメドンを含む本発明の要素の結果を示す。第
３図および第４図のグラフは、新鮮な要素、２２℃７８
０％ＲＨで１週間老化させた要素、２２℃／８０％ＲＨ
で３週間老化させｆｃ要素、−１８℃１５０チＲＨで３
週間老化させ九要素および２２℃７８０％ＲＨで６週間
老化させた要素に関して、試験液体中のアミラーゼの実
際の濃度の関数として、記録層に放出される染料の速度
を示すものである。第３図に示すとおり、ジメドンを含
有しない本発明の範囲外の要素は、第４図の不発明の要
素と比較して、２２℃／８０　％　ＲＨで老化させた後
のアミラーゼの濃度を過剰予測する、有意に大きな傾向
を示す。本発明の要素の改良され次性能を第５図にも示
す。第５図はアミラーゼ濃度１０４Ｕ／／、１８４Ｕ／
ｌおよび７３５　Ｕ／ｌにおける偏差チ（要素が、実際
のアミラーゼ濃度を過剰予測または過小予測する百分率
）を示す棒グラフである。第５図は、本発明の要素（ジ
メドンを含有するもの）では試料中のアミラーゼ濃度を
過剰予測する傾向が有意に減少することを示している。

ジメドンの代りに第１表に示す成分を使用して、実施例
１と同様に本発明による要素を調製した。

第　　１　表 実施例　　　　　　成　　分 ３　　　　ｌ−ベンゾイルアセトン ４　　　　　１−フェニル−２，４−ペンタンジオン５
　　　　　　ト（２−フリル）−１，３−ブタンジオン
試条層中にジオンを含有しない対照と共に前記の吸累を
２２℃／８０％ＲＨで１６日間保存し、アミラーゼ濃度
４４　Ｕ／ｌおよび７４６　Ｕ／ｌの貯液で試験を行な
っ几。各要素の偏差％（実施例１で定義したもの）を第
２表に示す。

、ｒ＋、−ｊ、、、、！、。

第２表 対照　　　　　１６４　　　　　　　　　３．９３　　
　−０．５　　　−６ ４　　　−８　　　−２．４ ５　　　１１．７　　　−０．６ 第２表の結果は、本発明の範囲外の対照用要素と比較し
て、本発明の要素により、アミラーゼ濃度の過剰予測の
傾向が大幅に減少することを示している。

〔発明の効果〕

加水分解酵素検知用の前記組成物は正確な分析結果を提
供する。更に、前記の組成物は、乾式試験要素中に配合
して雰囲気条件下で１週間以上保存し念場合でも正確な
結果をもならし、従って、雰囲気条件下で保存した場合
における酵素濃度の過剰予測の問題が回避される。

【図面の簡単な説明】

第１図は支持体上に試薬層と記録層とを含んで々る本発
明の詳細な説明図である。 第２図は、支持体上に試薬層と緩衝剤層と記録層とを含
んでなる本発明の詳細な説明図である〇第３図および第
４図は雰囲気条件下で貯蔵後の酵素濃度の過剰予測が本
発明の要素では減少する傾向があることを示すグラフで
あって、第３図は本発明の範囲外の要素が酵素濃度を過
剰予測する傾向を示し、そして第４図は本発明の条ぶで
は酵素濃度の過剰予測の傾向が減少することを示してい
る。 第５図は２週間の保存でジメドンが偏差に与える効果を
示す棒グラフであって、本発明の％累では酵素濃度の過
剰予測の傾向が減少することを示している。 ２．１４・・・支持体：６，１８・・・記録層；１０゜
２０・・・試薬層；２２・・・緩衝剤層ＦＩＧ、　／ ＦＩ６．２

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、１，３−ジオンの２個のカルボニルの間に、イオン
   化可能水素少なくとも１個を含むメチレン基を有する１
   ，３−ジオンを、安定剤として有する多糖類を含んでな
   る、加水分解酵素検知用組成物。