JPS62192663A - 免疫反応物定量用多層分析要素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は抗原または抗体などの抗原・抗体反応をする免
疫反応物を定量する多層分析要素に関するものである。

（従来技術） 抗原抗体反応は互いに対応する抗原または抗体のみに特
異的に反応・結合する免疫反応であり。

生体内微量物質の検出、自己免疫疾患の診断など臨床検
査に広く利用されている。これらの操作は熟練を要する
ためルーティン化した臨床検査では、より簡便な操作で
再現性よく測定する方法が望まれている。また大量処理
のためには自動操作化も可能なようにｗｌ、量試料で短
時間の内に分析できる方法が望まれる。

このような簡便で自動操作化可能な抗原量測定方法とし
て多層分析要素を用いた測定方法が本出願人により既に
提案されている（特開昭５７−２００８６２、特開昭５
９−７７３５６）。特開昭５７−２００８６２に記載の
多層分析要素は、固定化抗体を含有する反応層と親水性
高分子からなる検出層とを重ねたものである。この反応
層に被検物たる抗原と所定量の標識抗原との混合物を添
加すると、反応層中の固定化抗体との間の競争的抗原抗
体反応により固定化抗体と結合しなかった抗原と標識抗
原のみが検出層に移行することになる。この検出層に移
行した標識抗原を光学的に検出することにより被検物の
抗原量を測定するものである。

特開昭５９−７７３５６記載の多層分析要素は螢光標識
抗原を含有する展開層と、多孔質媒体からなる保液量の
大きな分配層と、固定化抗体を含有する反応層とを順次
重ねたものである。被検物たる抗原を展開層に滴下する
と、この抗原は展開層中の螢光標識抗原と共に分配層に
移動し保液される。反応層に抗体がなければ抗原と標識
抗原は分配層と反応層の保液量比に応じた量だけしか反
応層に移動し得ないが、反応層には予め固定化抗体があ
るため反応層の保液量に応じた量よりも抗体と結合した
抗原と標識抗原の量の分だけ多く反応層に移行する。従
って抗原と標識抗原との間の競争的抗原抗体反応により
、被検物たる抗原の量は反応層の螢光強度の減少として
測定できるというものである。

これらの多層分析要素は分析操作を簡素化し、自動操作
化を可能にする点で画期的なものであった。しかし両要
素とも抗原に標識された色素や螢光色素を直接検出する
ものであるため、検出感度を高めるのは原理的に限界が
あった。

そこで、検出感度を上げる方法としてエンザイムイムノ
アッセイを応用することが考えられる。

この方法は抗原（または抗体）を酵素標識し、抗原抗体
反応をした（またはしなかった）抗原（または抗体）に
標識された酵素の活性を検出するものである。この方法
では抗体と結合した酵素標識抗原（Ｂ）と抗体と未結合
の酵素標識抗原（Ｆ）とを分子ｉｌｌ！（いわゆるＢ／
Ｆ分＃）するか、またはＢ、Ｆで活性が変化する酵素系
が必要となる。

Ｂ／Ｆ分離を必要としない系としては、補酵素とアポ酵
素との親和性が、補酵素に予め結合した抗原に抗体が結
合することにより減少することを利用したものが知られ
ている（特開昭５５−２９９７）。また同じ（または異
なる）担体に固定相を分離して酵素と抗体とを結合した
複合物と、抗原と酵素阻害剤（または酵素活性化剤）と
の結合物とを組合せて、競争的抗原抗体反応で抗体に結
合しない抗原に標識された酵素阻害剤等が酵素と結合し
て酵素活性を低下（または活性化）させる系も知られて
いる（特開昭５８−２０９９９４）。これらはいずれも
被検物たる未標識抗原の量を、酵素活性の阻害率または
活性化率により測定するものであり、原理的に感度が低
く、感度を上げるためには酵素反応時間を長イしなけれ
ばならないという不都合があった。

従ってエンザイムイムノアッセイを適用した多層分析要
素には、要素内で実質的にＢ／Ｆ分離でき、短時間で感
度よく定量できるものが望まれる。

（発明の目的） 本発明はこのような事情に鑑みなされたものであり、抗
原または抗体などの免疫反応物を少量の試料で簡便かつ
短時間に感度良く定量でき、自動操作化にも適した免疫
反応物定量用多層分析要素を提供することを目的とする
。

（発明の構成） 本発明はこれらの目的を達成するため、被免疫反応物（
抗原または抗体）と酵素基質とをそれぞれ担体に固定化
した反応層で、被検物たる免疫反応物（抗体または抗原
）と、この免疫反応物と酵素との複合体とを競争反応さ
せ、固定化被免疫反応物と結合しなかった免疫反応物・
酵素複合体のみを固定化基質と反応させ、この結果生じ
る酵素反応生成物を検出層に移動させ、発色検出試薬に
より検出するようにした。

すなわち本発明の目的は、水不透過性透光性支持体と、
この支持体の片面に設けられた親水性高分子をバインダ
ーとして含有する発色試薬層と、この発色試薬層を被覆
する多孔性媒体からなる反応層とを備え、前記反応層は
、不溶性担体に固定された被免疫反応物と、別の不溶性
担体に固定された酵素基質とを含有し、前記発色試薬層
は、前記反応層内で前記酵素基質より生成される酵素反
応生成物を検出して発色する検出試薬を含有しているこ
とを特徴とする免疫反応物定量用多層分析要素により達
成される。

（作用） 固定化被免疫反応物（抗原または抗体）と固定化基質と
は反応層内で空間的に離れて存在する。

そのため、酵素と結合した免疫反応物（抗体または抗原
）が固定化被免疫反応物と結合すると、もはや酵素は固
定化基質に近付くことができず酵素反応を起こさない。

ここで被検物たる免疫反応物（酵素で標識されていない
）が併せて添加されると、競争反応により固定化被免疫
反応物に結合できなかった免疫反応物・酵素複合体は固
定化基質に近付くことができ、酵素反応が可能となる。

こうして生じた酵素反応生成物は検出層（発色試薬層）
へ浸透・移動する。これを検出試薬で発色させ、透光性
支持体を介して比色測定する。

（第１実施態様） 第１図は本発明の一実施態様による免疫反応物定量用多
層分析要素の断面図である。

符号１０は透光性支持体であり、この支持体上には親水
性高分子からなる発色試薬層１２、多孔性媒体からなる
反応層１４が順次積層されている。反応層１４は水不溶
性担体に固定された抗体、別の水不溶性担体に固定され
た酵素基質とを含有する。発色試薬層１２には反応層１
４で生じた酵素反応生成物を検出して発色する検出試薬
を含有する。さらに本実施態様の反応層１４は色を遮蔽
するルチル型またはアナターゼ型等の酸化チタンの微粒
子を併せて分散含有している。

反応層１４に含有される酵素基質と発色試薬層１２に含
有される検出試薬はこの多層分析要素に滴下される抗原
と酵素によって定まる。すなわち酵素反応生成物の量が
発色色素量として検出できる検出試薬が適用できるよう
な酵素・基質・検出試薬の組合せを用いる。

次に本発明による多層分析要素の各構成物質について説
明する。

支持体 支持体１０は、光透過性（透明な）水不透過性物質、す
なわち波長的２００ｎｍから約９００ｎｍの範囲内の少
なくとも一部の波長範囲の電磁輻射線を投下させる物質
であればよく、例えばポリエチレンテレフタレート、ビ
スフェノールＡのポリカルボネート、ポリスチレン、セ
ルロースエステル（セルロースジアセテート、セルロー
ストリアセテート、セルロースアセテートプロピオネー
ト等）等のポリマーの平滑な表面を有するフィルム状（
シート状）または平板状の公知の支持体を用いることが
できる。その厚さは約５０ｇｍから約１　ｍ　ｍ　、好
ましくは約８０Ｊ、Ｌｍから約３００゜ｍの範囲である
。

この支持体の中には必要に応じて二酸化チタン微粒子、
硫酸バリウム微粒子、カーボンブラック等を分散含有さ
せて光学的性能を調節することができる。支持体の表面
には必要に応じて公知の下塗層を設けて支持体の上に設
けられている発色試薬層と支持体との接着を強固にする
ことができる。

多孔性媒体 反応層１４を構成する多孔性媒体は、これに点着される
試料液中の抗原、抗体、酵素等と実質的に反応せず、抗
体または基質を固定化する担体を保持できるものであれ
ばよく、繊維質多孔性シートまたは非繊維質多孔性シー
トを用いることができる。

繊維質多孔性シートとして、織物生地、編物生地、有機
ポリマー繊維パルプ含有抄造紙および濾紙、ガラス繊維
バルブ含有抄造紙および濾紙、繊維質不織布等を用いる
ことができる。

織物生地としては、特開昭５５−１６４３５６、同６０
−２２２７７０等に記載の展開層用の平織物が好ましく
、平織物のうちでは細布生地。

金山生地、ブロード生地、ボブリン生地等が好ましい。

織物生地を構成する糸としては紡績糸（加捻糸）が好ま
しい。織物生地の糸の太さは綿紡績糸番手で表わして約
２Ｏ５から約１５０５、好ましくは約４０３から約１２
Ｏ３相当の範囲、または絹糸デニールで表わして約３５
Ｄから約３００Ｄ、好ましくは約４５Ｄから約１３０Ｄ
の範囲、織物生地の厚さは約１１００１Ｌから約５００
ｇｍ、好ましくは約１２０ｇ、ｍから約３５０　Ｊｉ、
ｍの範囲、織物生地の空隙率は約４０％から約９０％、
好ましくは約５０％から約８５％の範囲である。

編物生地としては、特開昭６０−２２２７６９、同６０
−２２２７７０等に記載の展開層用の経（たて）メリヤ
ス編生地が好ましく、経メリヤス編生地のうちではトリ
コット編生地、ラッシェル編生地、ミラニーズ編生地、
ダブルトリコット編生地が好ましい。編物生地を構成す
る糸としては紡績糸（加捻糸）が好ましい。編物生地の
糸の太さは綿紡績糸番手で表わして約４０Ｓから約ｌ５
ＯＳ、好ましくは約６Ｏ８から約１２０Ｓ相当の範囲、
または絹糸デニールで表わして約３５Ｄから約１３００
、好ましくは約４５Ｄから約９０Ｄの範囲、編物生地の
編成工程時のゲージ数としては約２０から約５０の範囲
、編物生地の厚さは約１００ｇｍから約６００７ｚｍ、
好ましくは約１５０ルｍから約４００ルｍの範囲、編物
生地の空隙率は約４０％から約９０％、好ましくは約５
０％から約８５％の範囲である。

抄造紙、濾紙、不織布、に用いられる繊維質素材として
は、ガラスｌａ維１石綿等の無機繊維、木綿、麻、絹等
の天然有機繊維、銅アンモニアレーヨン、セルロースア
セテート、部分ホルマール化ポリビニルアルコール、ポ
リエチレン、ポリエステル類（例えばポリエチレンテレ
フタレート等）等の半合成ｆＩｊ、ｍ、合成繊維が用い
られる。

また、繊維質素材としては、太さが０．１−５ｇｍで長
さが５００〜４０００ｐｍの範囲にあることが好ましい
。

有機ポリマーｌｊｌｉｍパルプ含有抄造紙としては。

特開昭５７−１４８２５０等に記載のポリエチレン繊維
だけのパルプからの抄造紙、およびポリエチレン繊ａ（
３０〜７０％）とセルロース繊維等に天然繊維の混合バ
ルブからの抄造紙が好ましい。紙の厚さは約８０ｇｍか
ら約４００ｇｍ、好ましくは約１１００ｐから約２５０
ＪＬｍの範囲、紙の空隙率は約２０％から約８０％、好
ましくは約５０％から約７０％の範囲である。

ｆａ＃Ｉ質多孔性シートのうち織物生地および編物生地
（以下、両者をあわせて布ということがある）は水洗等
の脱脂処理により少なくとも糸製造時または布製造時に
供給または付着した油脂類を実質的に除去した布を用い
る。抄造紙および抄造濾紙は油脂類を実質的に付着して
いないものを用いる。繊維質多孔性シートは特開昭５７
−６６３５９等に記載の物理的活性化処理（好ましくは
グロー放電処理、またはコロナ放電処理）をその片面ま
たは両面に施すか、あるいは特開昭５５−１６４３５６
、同５７−６６３５９、同５７−１４８２５０等に記載
の界面活性剤、好ましくはノニオン性界面活性剤水溶液
の含浸処理、塗布またはスプレィ処理することができる
。

セルロースアセテート等のセルロースエステル、ナイロ
ン−６、ナイロン−６６等のポリアミド、ビスフェノー
ルＡのポリカルボネート等からなるメンブレンフィルタ
（プラッシュポリマ一層）、第９回プラスチックフィル
ム研究会講座講演要旨集（高分子学会、　１９８４年２
月２２日発行）　　、Ｍｅｍｂｒａｎｅ、Ｉｎｃ、カタ
ログ（１！９８２年７月発行）等に記載のポリエチレン
微多孔性膜、ポリプロピレン　微多孔膜等のポリオレフ
ィン微多孔ｌり、特公昭５３−２１６７７、米国特許３
，９９２，１５８等に記載のポリマーミクロビーズ、ガ
ラスミクロビーズ、珪藻土等の微粒子が親木性ポリマー
バイングーに保持されてなる連続微空隙含有多孔性層、
特開昭５５−９０８５９に記載のポリマーミクロビーズ
が水で膨潤しないポリマー接着剤で点接触状に接着され
てなる連続微空隙含有多孔性層（三次元格子状粒状構造
物層）等の非繊維質等方的多孔性層等を用いることがで
きる。

非繊維質多孔性シートの空隙サイズは約２０ｎｍから約
３０　、ｇｍ、好ましくは約５０ｎｍから約１０ＪＬｍ
の範囲、空隙率は約２０％から約９０％、好ましくは約
４０％から約８５％の範囲である、厚さは約２０ＪＬｍ
から約５００　ｇ、ｍ、好ましくは約８０ｇｍから約３
５０　ｐｍの範囲である。

非繊維質多孔性シート中には全血中のヘモグロビンの赤
色等の反射光学濃度測定の光学的妨害排除のために特公
昭５３−２１６７７、米国特許３．９９２，１５８．特
開昭５５−９０８５９等に記載の方法に従って光遮蔽性
微粒子及び（または）光反射性微粒子をいずれか１層ま
たは２層に含有させることができる。３次元格子状粒状
構造物層を用いる場合には光遮蔽性及び（または）光反
射性微粒子が接着剤で点接触状に接着されてなる３次元
格子状粒状構造物層を用いることができる。光遮蔽性及
び（または）光反射性微粒子の例として二酸化チタン微
粒子、硫酸バリウム微粒子、カーボンブラック、アルミ
ニウム微粒子または微小フレーク等がある。これらのう
ちでは二酸化チタン微粒子、硫酸バリウム微粒子が好ま
しい。

非繊維質多孔性シート層には公知の界面活性剤、好まし
くはノニオン性界面活性剤を含浸保持させることができ
る。これにより水性液体試料の拡散、浸透、通過が均一
になる。

担体 抗体または酵素基質を固定する担体は、水不溶性で、抗
原抗体反応や酵素反応に影響を与えないものであり、抗
体または基質を固定化し得る官能基を有するもの、また
このような官能基を導入できるものであればよい。

一般にはアガー、アガロース、デキストランなどの多糖
類；ポリアクリルアミド、または重合可能なエチレン系
モノマーの重合（もしくは共重合）により形成されたラ
テックス；セルロースパウダーなどの非繊維質微粒子状
物質を用いる。この内でも、アガー、アガロースのよう
な非繊維質微粒子状物質は、反応層の厚さ当りの保液量
を増大させることができるために好ましい。

なお担体を繊維質素材で構成して、これを抄いて得られ
る抄造紙を反応層１４としての多孔性シートとしてもよ
い。

担体と抗体または基質との結合・固定は特開昭５３−７
２３７、同５３−７２３８、同５３−７２３９などに記
載の公知技術により行なうことができる。例えばカルポ
ニルジイミダンール処理によるアシル化処理を含む方法
、ＣＮＢｒ（ブロムシアン）による活性化処理を含む方
法、さらにはグルタルアルデヒド等の官能基架橋剤によ
る処理を含む方法などがある。

被検物たる抗原の特異抗体を用いる。常法により得られ
る抗体でよいが、モノクローナル抗体を用いればより感
度が向上する。

発色試薬層 発色試薬層１２は水を吸収して膨潤する親水性高分子を
バインダー成分とする層で、反応層で生成された酵素反
応生成物を検出して発色する検出試薬を含む。この発色
試薬層は吸水層としても機能する層である。

発色試薬層に用いられる親水性高分子は水吸水時の膨潤
率が３０°Ｃで約１５０％から約２０００％、好ましく
は約２５０％から約１５００％の範囲の高分子である。

親水性高分子の具体例としての特開昭５９−１７１８６
４、特開昭６０−１１５８５９等に開示の酸処理ゼラチ
ン、脱イオンゼラチン等のゼラチン、フタル化ゼラチン
、ヒドロキシアクリレートグラフトゼラチン等のゼラチ
ン誘導体、特開昭５９−１７１８６４、特開昭６０−１
１５８５９等に開示のアガロース、プルラン、プルラン
誘導体、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、
ポリビニルピロリドン等がある。これらの親木性高分子
は単独で、あるいは２種以上を組合せて用いることがで
きる。発色試薬層には一般的にはゼラチンまたはゼラチ
ン誘導体が好ましいが、被検物が抗体である場合や、被
検物を抗原とする場合でも、この抗原が蛋白質である場
合等には、蛋白誘導体のゼラチン以外の親水性高分子、
ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール等を用いる
のが好ましい。

発色試薬層の乾燥時の厚さは約３ＡＬｍから約５０ｇｍ
、好ましくは約５ｐＬｍから約３０１Ｌｍの範囲、被覆
量では約３ｇ／ｍｌから約５０ｇ／ｒｎ’の範囲、好ま
しくは約５　ｇ／ｒｎ’から約３０ｇ／ｍ”の範囲であ
る。発色試薬層には公知のｐＨ緩衝剤、有機カルボン酸
、酸性ポリマー、塩基性ポリマー等を含有させて使用時
（分析操作実施時）のｐＨを調節することができる。さ
らには発色試薬層には公知の媒染剤、ポリマー媒染剤等
を含有させることができる。発色試薬層は実質的に透明
であることが好ましいが、必要に応じて発色試薬層中に
二酸化チタン微粒子、硫酸バリウム微粒子、カーボンブ
ラック等を少量分散含有させて光学的性能を調節するこ
とができる。

なお発色試薬層と支持体との間には吸水層を設けること
ができる。吸水層は発色試薬層と同様な親木性高分子を
主成分とする層で、その乾燥時の厚さは約ＩＪＬｍから
約１００ｇｍ、好ましくは約３ｇｍから約３０７ｐｍの
範囲、被覆量では約１　ｇ／ｍ″から約１００ｇ／ｍ’
の範囲、好ましくは約３　ｇ／ｒｒｆから約３０ｇ／ｍ
’の範囲である。吸水層には公知のｐＨ１衝剤、有機カ
ルボン酸、酸性ポリマー、塩基性ポリマー等を含有させ
て使用時（分析操作実施時）のｐＨを調節することがで
きる。吸水層にの媒染剤、ポリマー媒染剤、塩基性ポリ
マーまたは酸性ポリマーを含有させた場合には、検出層
としても機能する。

酵素−基質−検出試薬 反応層１４に含有される酵素基質と、発色試薬層に含有
される検出試薬は、この多層分析要素で分析する抗原に
標識する酵素との関係で定まる。

すなわち酵素反応生成物量が発色色素量として検出でき
る検出試薬が適用できるような酵素・基質拳検出試薬の
組合せを用いる。

検出試薬例１ 抗原の標識酵素にβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、基質にガ
ラクトースオリゴマーを用いた場合には、ガラクトース
オキシダーゼとベルオキダーゼと発色試薬組成物との組
合せを検出試薬とすることができる。ガラクトースオキ
シダーゼはガラクトースオリゴマーの酵素反応生成物（
分解物）であるＤ−ガラクトースを脱水素し、その副生
成物としてＨ２Ｏ２を生成する。ペルオキシダーゼの作
用によりこのＨ２０２と発色試薬組成物とが反応し、呈
色物質（色素）が生成される。なおガラクト−スオキシ
ダーゼはガラクトースオリゴマーとも反応するが、本発
明ではこのガラクトースオリゴマーが固定化基質として
反応層に隔離されているから、発色試薬層内でのＤ−ガ
ラクトースを検出する邪魔にはならない。

抗原を標識するβ−Ｄ−ガラクトシダーゼとしては馬場
、和国、北村、奥田編著「臨床酵素ハンドブックＪ　　
Ｇ’１１談社、１９８２年）　、Ｔ、　Ｅ、　Ｂａｒｍ
ａｎ著ｒＥｎｚｙｍｅ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ　Ｊ　　（Ｓ
ｐｒｉｎｇｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ、　　１９６９年）等に
記載のβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ（ＥＣ３，２，１，２
３）を用いることができる。特にＤｉｐｌｏｃ。

ｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ起源のβ−Ｄ−ガラク
トンダーゼが好ましい。

ガラクトースオキシダーゼとしては、馬場、和国、北村
、奥田編著「臨床酵素ハンドブックＪ（講談社、　１９
８２年）、丸尾、田宮監修「酵素ハンドブック」　（朝
倉書店、　１９８２年）　、　Ｔ、Ｅ、Ｂａｒｍａｎ著
ｒＥｎｚｙｍｅ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ　Ｊ　（Ｓｐｒｉｎ
ｇｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ、１９６９年）等に記載のＰｏ１
ｙｐｏｒｕｓ　ｃｉｒｃｉｎａｔｕｓ、　Ｄａｃｔｙｌ
ｉｕｍ　ｄｅｎｄｏｒｏｉｄｅｓ等微生物起原のガラク
トースオ超厚ダーゼ（ＥＣ１，１，１，４８）を用いる
ことができる。ガラクトースオキシダーゼは必要に応じ
てその補酵素、　Ｃｕ２°イオンとともに用いることが
できる。分析操作時にｐＨ１３，５からｐＨ８，０、好
ましくはｐＨ６，８からｐＨ７，５の範囲に維持される
ようにガラクトースオキシダーゼが含有される層または
その隣接層等に公知のｐＨＷ衝剤を含有させることがで
きる。ガラクトースオキシダーゼの含有量は通常多層分
析要素１ｍ″当り約ｌ千Ｕから約１０万Ｕ、好ましくは
約２千Ｕから約５万Ｕの範囲である。

ペルオキシダーゼとしては、馬場、和国、北村、奥田編
著［臨床酵素ハンドブック」　（講談社、　１９８２年
）、丸尾、田宮監修「酵素ハンドブック」　（朝倉書店
、　１９８２年）　、　Ｔ、Ｅ、Ｂａｒｍａｎ著ｒＥｎ
ｚｙｍｅ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ　Ｊ　（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ
　Ｖｅｒｌａｇ、１９８９年）、特公昭５Ｇ−４５５９
９，特公昭５７−５５２０等に記載の植物超厚および動
物超厚のペルオキシダーゼ（ＥＣ１，１１゜１．７）、
特公昭５８−５０３５等に記載の微生物起原のペルオキ
シダーゼ（ＥＣ１，１１，１，７）を用いることができ
る。これらのうちでは植物超厚または微生物起原の非特
異的ペルオキシダーゼが好ましい。

好ましいペルオキシダーゼの例として、西洋わさびペル
オキシダーゼ、大根ペルオキシダーゼ、　Ｃ。

ｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ［、Ｃｕｒ＋ｒｕｌａｒｉａ属の
微生物から抽出したペルオキシダーゼがある。

分析操作時にｐＨ５，０からｐＨ８，０、好ましくはｐ
Ｈ６，０からｐＨ７，ｏの範囲に維持されるようにペル
オキシダーゼが含有される層またはその隣接層等に公知
のｐＨＲ衝剤を含有させることができる。ペルオキシダ
ーゼの含有量は通常多層分析要素１　ｍ’当り約１千Ｕ
から約１０万Ｕ、好ましくは約２千Ｕから約６万Ｕの範
囲である。

ペルオキシダーゼは必要に応じて特公昭５５−２５８４
０等に記載のへキサシアノ鉄（ＩＩ）酸イオンを含む化
合物またはへキサシアノ鉄（ＩＩ　）酸イオンヲ放出し
うる化合物とともに用いることができる。

発色試薬組成物は、Ｈ２０２とペルオキシダーゼとの存
在下において呈色物質（色素）を形成するものであって
、酸化発色色素（ロイコ色素）を含むもの（特公昭５８
−４５５９９　、同５８−１８８２８等に記載）、酸化
カップリングにより呈色物￥１（色素）を形成するもの
（ｒＡｎｎａｌｅｓ　ｏｆ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ　Ｊ　　、　８．２４−２７（１９Ｈ）、
　　米国特許第３，９９２，１５８、特公昭５５−２５
８４０．同５１３−４５５９９．同５８−１８Ｅｉ２８
．特開昭５９−５４９６２等に記載）、自己カップリン
グ等により発色または変色する色素前駆体化合物（特公
昭５８−４５５９９　、同５８−１８８２８等に記載）
等を用いることができる。

好ましい発色試薬組成物の例として次の化合物がある。

水素供与体（色原体）とカプラーの組合せ；［水素供与
体］４−アミノアンチピリン、４−アミノ−２−メチル
−３−フェニル−１−（２゜４．６−）リクロロフェニ
ル）−３−ピラゾリン−５−オン等の４−アミノアンチ
ピリンホモログまたは誘導体 ［カプラー３１，７−シヒドロキシナフタレン、１−ヒ
ドロキシナフタレン−２−スルホン酸ナトリウム（また
はカリウム）等の１−ヒドロキシナフタレン誘導体 トリアリールイミダゾール系ロイコ色素；４．５−ビス
［４−（ジエチルアミノ）フェニル］　−２−（４−ヒ
ドロキシ−３，５−ジメトキシフエニル）イミダゾール
、４−（ジメチルアミノ）フェニル−２−（４−ヒドロ
キシ−３，５−ジメトキシフェニル）−５−フェネチル
イミダゾール等 色素１１０駆体化合物； ジアニシジン、４−メトキシ−１−ナフトール等 検出試薬例２ 検出試薬としてガラクトースデヒドロゲナーゼとＮＡＤ
とＮＡＤＨ検出試薬との組合せを用いてもよい。ガラク
トースデヒドロゲナーゼは、固定化基質の分解物、Ｄ−
ガラクトースを脱水素して、その際ＮＡＤをＮＡＤＨに
還元する。従っこのＮＡＤ減少量またはＮ　Ａ　Ｄ）ｌ
生成量を測定することにより標識酵素の酵素反応生成物
の量を測定できる。

ＮＡＤまたはＮＡＤＨの量を比色定量する呈色試薬組成
物の例として、Ｃ１１ｎｉｃａ　Ｃｈｉｍｉｃａ　Ａｃ
ｔａ。

１２、　ｚｌｏ（１８，、Ｕ）　、特開昭５９−４４８
５８　、同５９−８８０９７　ニ記載のラクテートデヒ
ドロゲナーゼ活性測定用呈色試薬組成物、Ｃ１１ｎｉｃ
ａ　Ｇｈｉｍｉｃａ　Ａｃｔａ、　２８，４３１（１９
？０）、特開昭５０−４４８９４　、同５７−２０８９
９８　、同５８−４４６５８　。

同５９−８８０９７記載のアスパルテートアミノトラン
スフェラーゼ活性測定用呈色試薬組成物、アラニンアミ
ノトランスフェラーゼ活性測定用呈色試薬組成物、特公
昭４Ｂ−！３９８８に記載のクレアチンキナーゼ活性測
定用呈色試薬組成物、特開昭４９−１１３ｉ９５゜同５
９−４４８５８．同５９−８８０９７記載のタレアチン
ホスホキナーゼ活性測定用呈色試薬組成物、米国特許３
゜７９１．９３３に記載のテストステロン活性測定用呈
色試薬組成物およびアンドロステロン活性測定用呈色試
薬組成物、特公昭５６−３！３１３３７に記載のアミラ
ーゼ活性測定用呈色試薬組成物、特公昭５３−２１８７
７に記載のグリセロール分析用呈色試薬組成物、特開昭
５０−１２６４９４．同５３−２４８８３、特公昭５１
３−３８１９９に記載のトリグリセリド分析用呈色試薬
組成物等がある。

これらの内では、遊離ＮＡＤＨ量を特公昭５６−３８１
９９．同５６−４６７９９に記載されたように、テトラ
ゾリウム塩を用いてジアホラーゼ存在下、ホルマザン色
素を生成させ比色定量するのが有利である。

ガラクトースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１，１，１，４８
）。

ＮＡＤは公知のものを用いることができる。

迭辿」シ１銑ｌ 抗原の標識酵素にβ−Ｄ−グルコシダーゼ、基質にグル
コースオリゴマーを用いた場合には、検出試薬例１．２
のガラクトースオキシダーゼをグルコースオキシダーゼ
に代えたものを用いることができる。

β−Ｄ−グルコシダーゼＣＥＣ３，２，１，２１）は従
来公知のものを用いることができる。

グルコースオリゴマーはβ−Ｄ−グルコースよりなるオ
リゴマーが最も好ましく、次いで２−デオキシ−Ｄ−グ
ルコースが好ましい。

グルコースオキシダーゼとしては、馬場、和国、北村、
奥田編著「臨床酵素ハンドブック」（講談社、　１９８
２年）、丸尾、田宮監修「酵素ハンドブック」　（朝食
書店、　１９８２年）　、　Ｔ、Ｅ、Ｂａｒｍａｎ著ｒ
Ｅｎｚｙｍｅ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ　Ｊ　（Ｓｐｒｉｎｇ
ｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ、１９８９年）等に記載のＡｓｐｅ
ｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ、　Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕ
ｍｎｏｔａｔｕｍ、　Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ａｍａ
ｇａｓａｋｉｅｎｓｅ等微生物起原のグルコースオキシ
ダ超厚（ＥＣ１，Ｃ３，４）を用いることができる。グ
ルコースオキシダーゼは必要に応じてその補酵素ＦＡＤ
　、鉄イオンとともに用いることができる。分析操作時
にｐＨ４，０からｐＨ８，０、好ましくはｐＨ５，０か
らｐＨ６，５の範囲に維持されるようにグルコースオキ
シダーゼが含有される層またはその隣接層等に公知のｐ
Ｈ緩衝剤を含有させることができる。グルコースオキシ
ダーゼの含有量は通常多層分析要素１ｍ’当り約１千Ｕ
から約１０万Ｕ、好ましくは約２千Ｕから約５万Ｕの範
囲である。

爽区区粂上１ 抗原の標識酵素にβ−アミラーゼ（ＥＣ３，２，１，２
）を、基質にデンプンを用いた場合には、特公昭５８−
３９ｆ３３７に記載のアミラーゼ活性測定用呈色試薬組
成物を検出試薬としてもよい。

なおこの場合デンプンとして水不溶性デンプンを用いれ
ば、この不溶性デンプン自体を担体かつ固定化基質とす
ることができ、本発明はこのようなものも包含する。

致１１ 本発明の一体型多層分析要素には液体試料を適用しての
分析操作実施時のｐＨ値を６．５から８．０゜好ましく
は　７．０　　から７．５の範囲の所望の値に緩衝でき
る公知の緩衝剤から適宜選択して含有させることができ
る。

用いうる緩衝剤としては、日本化学会編「化学便覧　基
礎編」　（東京、丸首■、　１９８１３年発行）１３１
２−１３２０頁、Ｒ，Ｍ、Ｃ，Ｄａｗｓｏｎ　ｅｔ　ａ
ｔ編ｒＤａｔａ　ｆｏｒＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｒｅ
５ｅａｒｃｈＪ第５ｅａｒｃｈＪｒｄ　ａｔ　ｔｈｅＣ
ｌａｒｅｎｄｏｎ　Ｐｒｅｓｓ、１９６９年発行）　４
？Ｅｉ−５０８頁、ｒＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙＪ　５
，４６？頁以降（１９６６年）　　、　　ｒＡｎａｌｙ
ｔｉｃａｌ　ＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙＪ１０４．３０
０−３１０頁（１９８０年）等に記載のｐＨ緩衝剤系が
ある。

ｐＨ４，５から８．０の範囲のｐＨＷ衝剤の具体例とし
てトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ
）を含む緩衝剤：燐酸塩を含む緩衝剤；ホウ酸塩を含む
緩衝剤；クエン酸またはクエン酸塩を含む緩衝剤；グリ
シンを含む緩衝剤；リンゴ酸；コハク酸；マロン酸；酒
石酸；グルタル酸；３，３−ジメチルグルタル酸；、Ｎ
、Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃ
ｉｎｅ）　　；　Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン
−Ｎ”−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）　。

およびこれらのいずれかと必要により組合せられる酸、
アルカリまたは塩がある。好ましい緩衝剤の具体例とし
て、リンゴ酸；コハク酸；マロン酸；酒石酸；３，３−
ジメチルグルタル酸；燐酸二水素カリウム−燐酸水素二
ナトリウム；　Ｔｒｉｓ−ホウ酸ナトリウム；　Ｔｒｉ
ｓ−ホウ酸ナトリウムーＥＤＴＡ−２Ｎａ塩；　Ｔｒｉ
ｓ−クエン酸；酢酸−酢酸ナトリウム；クニン酸−燐酸
二水素ナトリウム；　Ｂｉｃｉｎｅ　；）！ＥＰＥＳ等
がある。

一体１多層分析要素の製造方法 本発明の乾式多層分析要素は前述の諸特許明細書に記載
の公知の方法により調製することができる。

本発明の多層分析要素は一辺約１５ｍｍから約３０ｍｍ
の正方形またはほぼ同サイズの円形等の小片に裁断し、
特公昭５７−２８３３１　、実開昭５６−１４２４５　
、特開昭５７−８３４５２　、実開昭５８−３２３５０
　、特表昭５８−５０１１４４等に記載のスライド枠に
収めて化学分析スライドとして用いることが、製造、包
装、輸送、保存、測定操作等の観点で好ましい。使用目
的によっては、長いテープ状でカセットまたはマガジン
に収めて用いたり、または小片を開口のあるカードに貼
付または収めて用いることなどもできる。

一体−１層　析戸素による被検物　ｔｊ法木本発明多層
分析要素は前述の諸特許明細書等に記載の操作と同様の
操作により水性液体試料中の被検物（抗原）の定量分析
ができる。

まず被検物たる抗原と同じまたは少なくとも１以上の共
通する抗原決定決定基を有する抗原を用意し、この抗原
と酵素との結合体を作る。この結合体は前記した抗体と
担体とを結合する従来技により作ることができる。

この抗原酵素複合体の水溶液と、被検物たる抗原を含む
全血、血漿、血清等の水性液体試料を混合し、この混合
液を約５ｇ１〜約３０．１、好ましくは８〜１５．１を
反応層１４に点着する。点着した多層分析要素を約５ｇ
１〜約４０°Ｃの範囲の−・定温度で、好ましくは３７
°Ｃ近傍の一定温度で１〜１０分間インキュベーション
すると、競争的抗原抗体反応で抗体に結合しなかった抗
原に結合された酵素のみが固定化基質を分解し、この分
解物は発色試薬層１２に浸透・移動し、検出試薬を発色
させる。こうして試料液中の抗原量は、発色試薬層１２
で生成した呈色物質（色素）量を透光性支持体１０を通
して反射光学ミ誕度を測定することにより、比色法の原
理から定量することができる。なお本実施態様では色を
遮蔽する微粒子を反応層１４に分散含有させたので、全
血などの有色試料液との混合液を用いて発色試薬層に侵
入できない赤血球等によって反射光学濃度の測定が妨害
されることはない。

（第２実施態様） 第２図は本発明の第２実施態様による多層分析要素であ
る。この実施態様では、反応層２４は、担体に固定され
た抗体を含有する第１反応層２４Ａと、担体に固定され
た酵素基質を含有する第２反応層２４Ｂとからなり１発
色試薬層２２の上面を第２反応層２４Ｂ、第１反応層２
４Ａの順に積層している。

前記第１実施態様では同一反応層１４内に固定化抗体と
固定化基質を混在させ、抗原・抗体間の親和力が極めて
大きいことを利用して抗原・酵素複合体を固定化抗体と
の結合する方向に乎衡をずらし、実質的にＢ／Ｆ分離す
るものであった。

これに対し第２実施態様は第１反応層２４Ａの固定体、
抗体に結合しなかった抗原・酵素複合体のみを第２反応
層２４Ｂ内の固定化基質と反応させるものであり、物理
的なり／Ｆ分離を達成するものである。従って親和力の
差を利用した第１実施態様にくらべて、より完全にＢ／
Ｆ分離ができ、検出感度がさらに向上する。

なお第２実施態様の多層分析要素の各構成物質は第１実
施態様と同じものを用いることができる。

（第３実施態様） 第１実施態様の反応層１４には予め抗原・酵素複合体を
含有させてもよい。この場合には被検物たる水性液体試
料をそのまま反応層１４に点着すればよく、さらに簡便
に抗原量を定量測定することができる。

なお水性液体試料点着前は、反応層１４は乾燥保持され
ているから、反応層１４内で抗原・酵素複合体中の酵素
と固定化基質とが反応することはない。′７５２実施態
様のように反応層２４を第１反応層２４Ａと第２反応層
２４Ｂとの２層にする場合は、固定化基質が含まれてい
ない第１反応層２４Ａのみに抗原・酵素複合体を含有さ
せておくのが好ましい。

（第４実施態様） 第１実施態様の発色試薬層１２に予め抗原・酵素複合体
を含有させてもよい。

この場合は、反応層１４に点着された水性液体試料が発
色試薬層１２に浸透し、この発色試薬層１２から反応層
１４へ抗原・酵素複合体が移動する。すなわち、被検物
たる抗原は抗原・酵素複合体よりも早く固定化抗体と接
触することができ、単なる競争的抗原抗体反応の場合よ
りも優位に固定化抗体と結合できる。

従ってこの第４実施態様によれば、より簡便に抗原量を
測定できるばかりでなく、Ｓ／Ｎ比に優れ、より鋭敏に
抗原を検出することが可能となる。

（第５実施態様） 第３，４実施態様のようにより簡便に測定するため、抗
原拳酵素複合体を含有する展開層を反応層１４または第
１反応層２４Ａの上面に設けてもよい。

この場合の展開層は、その上面に点着された水性液体試
料が展開層内を単位面積当り一定容量に分配されて反応
層１４または第１反応層２４Ａに浸透・到達し、この反
応層１４または第１反応層２４Ａに単位面積当り一定容
量の割合で供給する作用（展開作用またはメータリング
作用）を有するものであればよい。

展開層には、前記多孔性媒体に用いられる繊維質多孔性
シートや非繊維質多孔性シート等を用いることができる
。とくに織物、編物からなる布を点着する水性液体試料
の量を厳密に一定にする必要がなく、さらに簡便な操作
になるという効果もある。

以上の各実施態様では反応層と発色試薬層とを別の層と
したが、反応層と発色試薬層とを同一層にしてもよい。

例えば固定化抗体と固定化基質を保持する布に検出試薬
を含有するゼラチン等の親水性高分子を含浸・保持させ
たり、あるいは検出試薬を含浸・保持させたりすること
により反応層と発色試薬層を同一層にすることができる
。

以上の実施態様では被検物を抗原とした場合の抗原定量
方法とその多層分析要素について説明したが、被検物を
抗体とした場合には、上記実施態様において固定化抗体
の代りに固定化抗原を、酵素と抗原との複合体の代りに
酵素と抗体との複合体を用いればよく、本発明はこれら
も包含するものである。

以下実施例により本発明をより詳細に説明する。

（実施例１） （１）　Ｔ４−ＭＥＭ　Ｉ　Ｄ　Ａの調製Ｔ４（チロキ
シン）を抗原として用いる。低分子であるＴ４を酵素と
結合させるため、また効率よく抗Ｔ４抗体をつくるため
スペーサを導入したＮ−メチル−Ｎ−力ルボキシメチル
グリシルチロキシンメチルエステル（Ｔ４−　ＭＥ　Ｍ
　Ｉ　Ｄ　Ａ）を調製する。

チロキシンメチルエステル塩酸塩２　ｇ’ｔ　１５ｍ　
９゜のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解し、これ
に５００ｐｕのトリエチルアミンを加え一１５°Ｃに冷
却下で、クロロギ酸イソブチル４６０ｇ１を添加反応さ
せた。１０分後に、この溶液にＮ−メチルイミノニ酢酸
０．５５ｇをテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）５ｍＭに溶
解したものを加え、ｏ′ｃで１ｏ分間、さらに室温３０
分間反応させた後、減圧濃縮した。この残存を５０ｍ　
ｌのＴＨＦに溶解し、さらに酢酸エチル１５０ｍ文を加
え、振とう攪拌し、酢酸エチル層を分取した。これを蒸
留水で３回、飽和食塩水で１回洗浄し、酢酸エチル層を
無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた
残存を２０ｚｎＱのＴＨＦに溶解し、ｎ−へキサンを少
量加え結晶化させた。結晶を濾別し減圧乾燥したところ
２．３ｇの標品を得た（収率６８％）。

（２）抗Ｔａ（チロキシン）血清の調製上記（１）テ調
製り、りＴ４−ＭＥＭＩ　ＤＡ　１００ｍｇを乾燥した
Ｄ　Ｍ　Ｆ　２．０ｍ　ｌに溶解し、これにＮ−ヒドロ
キシコハク酢イミド１５ｍｇ加え、さらに２５ｍｇの１
−エチル−３−（３−ジメチルアミンプロピル）カルボ
ジイミド（ＥＣＤＩ）を水冷下に加え、４°Ｃで一夜反
応させた。この反応液を水冷下、牛血清アルブミン（マ
イルス・ラボラトリーズ製、フラツジ、７Ｖ）１００ｍ
ｇを含む　０．０５Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９，０）　２０
ｍ文中に滴下し、反応させた。この反応液を同じ緩衝液
に対し２日間透析（２ＭＸＡ回）し、さらに蒸留水に対
し２日間（２ｕＸＡ回）透析を行ない脱塩したのち凍結
乾燥し、固形分１３０ｍ　ｇを得た。この固形分を赤外
吸収スペクトルおよび塩酸加水分解後アルカリ中で紫外
吸収スペクトル測定したところ、牛血清アルブミン１分
子に対し約２０個の７４−ＭＥＭ　Ｉ　Ｄ　Ａがハブテ
ンとして導入されたいることがわかった。

上記方法で得られた乾燥固形分を用い常法に従いウサギ
に免疫処理し、抗チロキシン（抗Ｔ４　）血清を得た。

（３）Ｔ４−β−ガラクトシダーゼ複合体の調製（１）
で調製したＴ４−　Ｍ　Ｅ　Ｍ　Ｉ　Ｄ　Ａ　５０ｍｇ
をＤＭＦ２ｍ文に溶解し、これを−１５°ｃ（ミ冷却下
、クロロ蟻酸イソブチルｌＪＬ文とトリエチルアミン８
ｇｌを加え混合した。β−Ｄ〜ガラクトシダーゼ（Ｅ、
Ｃ：ｏｌｉ由来：　Ｓｉｇｍａ社製）　２．０　ｇを５
０　ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ８，５）　１０ｍ文に溶解し
、水冷下でこれにＴ４−ＭＥＭＩ　ＤＡ反応物を滴下反
応させた。２時間反応後、反応液を２０ｍＭ炭酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ８，５）に−・夜４°Ｃで透析し、さ
らに蒸留水で１日透析脱塩した。この脱塩溶液をセファ
ロースＣＬ−４Ｂ　（ファルマシア・ファインケミカル
ズ社製）を用いてクロマトグラフィーを行いＴ４−β−
ガラクトシダーゼ分画を得た。溶出には５０　ｍＭ燐＃
緩衝液（ｐＨ７，０）を用いた。

（４）抗Ｔ４抗体固定化アガロースの調製水冷下、抗チ
ロキシン（Ｔ４）抗血清１．５ｍ　ｌに飽和硫安溶液１
ｍ文を添加して、ＩｇＧ分画を硫安沈殿させた。得られ
たＩｇＧ分画を透析脱塩して抗Ｔ４抗体とした。

アガロースとしてセファロースを用いた。

ＣＮＢｒ活性下セファロース４Ｂ（ファルマシア働ファ
インケミカルズ社製）１５ｇを水１００ｍＡで膨潤させ
、グラスフィルタ上で０．０ＯＩＮ塩酸２見で洗浄した
。次に、　０．１Ｍ重炭酸緩衝液（ｐＨ８，５、０，５
ＭＮａＣＩ含有）３０ｍＪｌに溶解した上記抗Ｔ４抗体
１ｇＧフラクションを、洗浄済のＣＮＢｒ活性化セファ
ロース４Ｂに加え、４℃にて攪拌下１６時間反応させた
。反応後、グラスフィルタ上で反応液を除去し、次に１
Ｍエタノールアミン（塩酸でｐＨ８〜８．５に調製）５
０ｍ文を加え、再び４°Ｃにて２〜５時間反応させた。

次いでグラスフィルタ上で０．１Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ４，
０（ＩＭＮａＣＩ含有）と０．１Ｍホウ酸緩衝液ｐＨ８
，０（ＬＭＮａＣｌ含有）で交互に３回ずつ洗浄した。

洗浄後、０．１Ｍグリシン緩衝液ｐＨ９，０（０，１Ｍ
Ｎａ引および０．１％アジ化ナトリウム含有）により１
ｍｉ中に、アガロース乾燥型ｆｆ１２００ｇｇ含有する
ように懸濁液を調製した。

（５）ガラクトースオリゴマー固定化アガロース常法（
生化学実験講座　４巻、日本生化学全編）により、ガラ
クトースのオリゴマーを合成した。

このオリゴマーを（４）と同様の方法によりＣＮＢｒ活
性化セファロース４Ｂと反応させ、アガロース（セファ
ロース）に固定化したガラクトースオリゴマーを調製し
た。さらにこの液を蒸留水で希釈し、１ｍ文中に乾燥重
量２００ＪＬｇのアガロースを含有するように調製した
。

（Ｅｉ）Ｔａの分析 下記の組成からなる発色液および試料液を調製した。

・発色液 オルトフェニレンジアミン　　　２　ｍｇ／ｍ１Ｈ２０
２０，０３％ を含む０．１Ｍ　　Ｔｒｓ−ＨＣＩ緩衝液　（ｐＨ８，
５）。

・試料液 ヒト血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ社製）ｌ　ｍｇ／ｍ１ １−アニリノナフタレン−８−スルホン酸ナトリウム　
　　　　　　　　　　　　　１　ｍｇ／ｍ１Ｔ４−β−
ガラクトシダーゼ　　１０ルｇ　／ｍ１Ｔ４　　　　　
　　　　　　０〜２　ＩＬｇ／ｍｌを含む０．１Ｍ　　
Ｔｒｓ−ＨＣＩ緩衝液　（ｐＨ８，５）。

（４）で調製した抗Ｔ４抗体固定化アガロース懸濁液２
ｍＭ、（５）で調製したガラクトースオリゴマー固定化
アガロース懸濁液２ｍＪ１．上記発色液０．５ｍＪ１お
よび上記試料液０．５ｍＪＬを混合して反応液とした。

なおガラクトースオリゴマー固定化アガロース懸濁液の
代わりに、同濃度のガラクトースオリゴマー水溶液を用
いたものを比較用反応液とした。

この反応液と比較用反応液を２５°Ｃ下、６０分間転転
倒台して反応させた。２Ｎ硫酸２ｍＭを加えて反応を停
止し、蛋白沈殿、アガロース等を遠心分離（３０００ｒ
ｐｍ、２０分）して、その上清の４９０ｎｍにおける吸
光度を測定した。その結果を以下の表に示す。

０　　　　　　　　０．３５　　　０．６８０．０４　
　　　　０．３８　　　０．６９０．１２　　　　　０
．４２　　　０．７００．３６　　　　　０．４８　　
　０．７０２．０　　　　　　０．５２　　　０．７２
このように抗体と酵素基質双方が固定化されると、抗原
・酵素複合体の酵素活性が減少すること、すなわち固定
化抗体に結合した抗原会酵素複合体（Ｂ）と未結合の抗
原・酵素複合体（Ｆ）とを物理的にＢ／Ｆ分離しなくて
も、これらは微視的にＢ／Ｆ分離でき、同−溶液内にＢ
／Ｆ分敲したものとして検出できることが示された。

また競争的抗原抗体反応により生じる酵素活性の差とし
て、抗原を検出できることが示された。

（実施例２） （１）検出シート（試′層）の作製 ゼラチン用の下塗処理を施した厚さ１８５　ｇｍの無色
透明ポリエチレンテレフタレー）　（ＰＥＴ）フィルム
上に下記組成からなるガラクトース定量用の試薬層を乾
燥後の厚さがおよそ１５ｇｍになるように塗布した。

ガラクトースオキシダーゼ　　　２重量部ペルオキシダ
ーゼ　　　　　　　１重量部１．７−シヒドロキシナフ
タレン　　５重量部４−アミノアンチピリン　　　　　
５重量部アルカリ処理ゼラチン　　　２００重量部ノニ
オンＨＳ２１０（日本油脂■製セフ剤：ポリオキシエチ
レンオクチルフェニルエーテル）２重帯部 この試薬層の上に更に乾燥ゼラチン１に対して二酸化チ
タン微粉末８（重量比）の割合で混合された水分散液を
用いて色遮蔽層を乾燥後の厚さがおよそ１５ｇｍになる
ように塗布し、更にその旧に０．２％ノニオン界面活性
剤（Ｈ３２１０）を含むゼラチン層を乾燥後の厚さが約
５ｇｍになるように塗布し、検出シート（発色試薬層）
とした。

（２）反応シート（反応層）の作製 ガラス繊維濾紙ＧＡ−１００（東洋濾紙製）２ｇを３ｍ
ｍ角に切って、４００ｍＭの水中でホモゲナイザー（日
本精機製）にかけて分散させた（１５０００ｒｐｍ、　
１０分間）。分散物を２　ｍ　／　ｍ角及び１ｍ／ｍ角
のステンレス製メツシュで順にこしわけ、１　ｍ　／　
ｍメツシュ上のガラス繊維を０．１Ｍグリシ７５衝液ｐ
Ｈ９，０（０，５ＭＮａＣ１含有）５００ｍｌに分散さ
せた。この液の一定容量を取り、メンブレンフィルター
でガラス繊維をこしとり、水切り乾燥後、秤量してガラ
ス＃Ｉｌ維濃度（ｍ　ｇ／ｍｆＬ）を測定した。

上記の分散液からガラス繊維３０　ｍ　ｇを含む容量を
ビーカーにはかり取り、これに実施例１の（４）で調製
した抗Ｔ４抗体固定化アガロース懸濁液１ｍ文および実
施例１の（５）で調製したガラクトースオリゴマー固定
化アガロース懸濁液１ｍ４Ｑをよく混合し、この混合液
をメンブレンフィルター濾過器（フィルター二ミリボア
社製ＨＡＷＰＯ，４５７ｐｍ孔径、４７ｍｍφ）上に展
開、抄紙し反応シート（反応層）とした。

なお抗Ｔ４抗体固定化アガロースのかわりに７ガロース
（セファロース４Ｂ）を用いたものを比較用検出シート
とした。

（３）多層分析要素の作製 （１）、（２）で作製した反応シート及び検出シートを
直径１２ｍｍの円に裁断した後、検出シートのＰＥＴフ
ィルムとは反対側に反応シートを重ね、多層分析要素を
作製した。

さらに比較用反応シートを用いて同様に比較用多層分析
要素を作製した。

（４）工り立見！ 下記の成分を含有するＯ、１Ｍグリシンン緩衝液（ｐＨ
８）を作り試料液とした。

ヒト血清アルブミン（Ｓｉｇａ＋ａ社製）１ｍｇ／ｍｕ
ｌ−アニリノナフタレン−８−スルホン酸ナトリウム　
　　　　　　　　　　　１　ｍ　ｇ　／　ｍ文Ｔ４−β
−ガラクトシダーゼ複合体 ５０絡ｇ／ｍ文 Ｔ　ａ　　　　　　　　　　　　Ｏ〜ｌ　ＯＪｊ、ｇ　
／　ｍ　１この試料液１００ル文を（３）で作製した多
層分析要素に点着し、この多層分析要素を３７°Ｃで８
分間インキュベーション後、ＰＥＴフィルム側から中心
波長５００ｎｍの可視光で反射光学濃度を測定した。

測定結果を第３図に示す。本実施例の多層分析要素は図
中の工で示されるようにＴ４ｅ度変化に対応して反射光
学濃度が変化し、Ｔ４を定量するための検量線を作成す
ることができた。このように本発明の多層分析要素を用
いることによりＢ／Ｆ分離操作をすることなくＴ４　を
きわめて短時間で測定できた。また従来発明のように酵
素活性の阻害率等を測定するのではなく、酵素活性その
ものから定量するので検出感度に優れている。

なお第３図のＩＩ　（黒丸）は比較用多層分析要素の実
験結果である。

（発明の効果） 以りのように本発明の免疫反応物定量用多層分析要素は
、被免疫反応物（抗体または抗原）と基質とを別の担体
に固定化・含有した反応層で被検物たる免疫反応物（抗
原または抗体）と、この免疫反応物と酵素との複合体と
を競争反応させ固定化被免疫反応物と結合しなかった免
疫反応物・酵素複合体の酵素活性のみを測定するように
したので、少量の試料で筒便かつ短時間に感度よく免疫
反応物を定量測定することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の一実施態様による多層分析要素の断面
図、第２図は他の実施態様による多層分析要素の断面図
、第３図は実施例のＪｌ１１定結果を示す図である。 １０．２０・・・透光性支持体、 １２．２２・・・親水性高分子をバインダーとして含有
する発色試薬層 １４．２４・・・多孔性媒体からなる反応層。 特許出願人　富士写真フィルム株式会社代　理　人　弁
理士　山　１）文　雄 第３図 Ｔ４濃度兜９ｂｎｌ）

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. （１）水不透過性透光性支持体と、この支持体の片面に
   設けられた親水性高分子をバインダーとして含有する発
   色試薬層と、この発色試薬層を被覆する多孔性媒体から
   なる反応層とを備え、 前記反応層は、不溶性担体に固定された被免疫反応物と
   、別の不溶性担体に固定された酵素基質とを含有し、 前記発色試薬層は、前記反応層内で前記酵素基質より生
   成される酵素反応生成物を検出して発色する検出試薬を
   含有していることを特徴とする免疫反応物定量用多層分
   析要素。
2. （２）前記反応層が、前記酵素基質と反応する酵素と免
   疫反応物との複合体を含有していることを特徴とする特
   許請求の範囲第１項記載の免疫反応物定量用多層分析要
   素。
3. （３）前記発色試薬層が、前記酵素基質と反応する酵素
   と免疫反応物との複合体を含有していることを特徴とす
   る特許請求の範囲第１項記載の免疫反応物定量用多層分
   析要素。
4. （４）前記反応層の上面は、前記酵素基質と反応する酵
   素と免疫反応物との複合体を含有する展開層で被覆され
   ていることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の免
   疫反応物定量用多層分析要素。
5. （５）前記免疫反応物が抗原であり、前記被免疫反応物
   が抗体である特許請求の範囲第１〜４項のいずれかに記
   載の免疫反応物定量用多層分析要素。
6. （６）前記免疫反応物が抗体であり、前記被免疫反応物
   が抗原である特許請求の範囲第１〜４項のいずれかに記
   載の免疫反応物定量用多層分析要素。
7. （７）前記反応層が、不溶性担体に固定化された被免疫
   反応物を含有する第１反応層と、不溶性担体に固定化さ
   れた酵素基質を含有する第２反応層とからなり、前記発
   色試薬層の上を第２反応層、第１反応層の順に被覆して
   いる特許請求の範囲第１、３、４項のいずれかに記載の
   免疫反応物定量用多層分析要素。
8. （８）前記反応層が、前記酵素基質と反応する酵素と免
   疫反応物との複合体および不溶性担体に固定化された被
   免疫反応物を含有する第１反応層と、不溶性担体に固定
   化された酵素基質を含有する第２反応層とからなり、前
   記発色試薬層の上を第２反応層、第１反応層の順に被覆
   している特許請求の範囲第２項に記載の免疫反応物定量
   用多層分析要素。
9. （９）前記免疫反応物が抗原であり、前記被免疫反応物
   が抗体である特許請求の範囲第７項または第８項に記載
   の免疫反応物定量用多層分析要素。
10. （１０）前記免疫反応物が抗体であり、前記被免疫反応
    物が抗原である特許請求の範囲第７項または第８項に記
    載の免疫反応物定量用多層分析要素。
11. （１１）前記反応層が、色を遮蔽する微粒子を含有して
    いる特許請求の範囲第１〜６項のいずれかに記載の免疫
    反応物定量用多層分析要素。
12. （１２）前記第２反応層が、色を遮蔽する微粒子を含有
    している特許請求の範囲第７〜１０項記載の免疫反応物
    定量用多層分析要素。
13. （１３）前記多孔性媒体が、繊維質多孔性媒体である特
    許請求の範囲第１〜１２項のいずれかに記載の免疫反応
    物定量用多層分析要素。
14. （１４）前記多孔性媒体が、非繊維質多孔性媒体である
    特許請求の範囲第１〜１２項のいずれかに記載の免疫反
    応物定量用多層分析要素。
15. （１５）前記多孔性媒体が、前記不溶性担体によって構
    成されている特許請求の範囲第１〜１２項いずれかに記
    載の免疫反応物定量用多層分析要素。