JPS63500334A - フローサイトメーター用の生物細胞による散乱光測定装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 浄書（内容に変更なし） フローサイトメーター用の　生物細胞による　散乱光測定装置本発明は、該対物 鏡の照明部に円すい形の暗視野を与えるような視野中央部阻止物を有する高開孔 数（顕微鏡）対物鏡と、該暗視野内に入党口及び−次対物鏡の対物面と一致した 対物面を持った二次対物鏡とから成るフローサイトメーターによる生物細胞又は 微粒子からの散乱光の２角度成分同時測定装置に係る。

更に詳細には、本装置は、細胞や微粒子が一つづＮフローサイトメーターの測定 域を通る時、２種の異る散乱角度領域で該生物細胞又は微粒子による光散乱のの ような細胞又は微粒子の持つ個々の特性に左右されるので、本装置は前記の特性 の異る細胞又は微粒子の特性化及び同定に利用できる。

フローサイトメトリーは、細胞生物学や薬学の程々の分野並に殆ど凡ての非生物 微粒子の測定等広汎な用途のある測定法である。フローサイトメーターで、層流 によって運ばれる各微粒子が１つづ又高光度の励起子からの測光信号が測定され る。該微粒子はいわゆるハイドロダイナミック・フォーカシングによって流体の 流れの中に集められる。測定出来る測光信号とは、１）細胞又は微粒子による蛍 光、　２）細胞又は微粒子による散乱光　３）細胞又は微粒子による光吸収であ る。特にこれらの信号中　１）２）が非常に有益であることが認められている。

フローサイトメーターの代表的な応用例としては、細胞中のＤＮＡ、蛋白質のよ うな個々の成分の含有量測定がある、このためには細胞は夫々の成分と特別に且 つ定量的に結合する蛍光染料で染着する。本装置の励起光焦点を通る各細胞はこ うして蛍光パルスを発生する。この光は適当な光学系で集光され、光検知器で記 録される。細胞の染料量に比例、従って夫々の細胞成分に比例した電気パルスが この検知器で測定され、Ｍ　ＣＡ　（＝ｍｕｌｔｉｃｈａｎｎｅｌ　ｐｕｌｓｅ 　ｈｅｉｇｈｔ　ａｎａｌｙｚｅｒ　）のような電子記録計で大きさ別に集計さ れる。このような方法で１秒間に数１０００個の細胞が高精度で測定できる。こ のようにして、細胞数を夫々の成分含有量の函数として示すヒストグラムが得ら れる。

細胞が本装置の焦点を通過する時細胞によって散乱される励起光は２次検知器で 記録される。その散乱角によって、この信号は細胞の構造や密度同様その断面積 又は容積等の情報を伝える。

フローサイトメーターの中には、励起光源としてレーザーを使っているものもあ る。この装置では微粒子を運ぶ流体はレーザービーム中を通り、微粒子の放つ蛍 光と散乱光は、レーザービームと直角に設けた２つの別々の光学系で検知される 。この種のフローサイトフローサイトメーターでは、普通、レーザービームに種 々の角度で設けた検知器で大・小雨散乱角の散乱光が測定できる。直径１〜３０ ミクロンの生物細胞と類似の大きさと屈折率を持った微粒子では散乱角の小さい 散乱光は微粒子表面での屈折力に支配されるので微粒子の大きさの尺度と見なす ことができる。一方、約１０’以上の角度の散乱光は光の波長より小さいサイズ の構造に吸収される。フローサイトメーターによる大小両角度の散乱光の同時測 定は、異った生物細胞、特に白血球のような異種白面細胞の同定法として極めて 有益であることが立証されている。

これと違ったフローサイトメーターに、例えば水銀灯のような高圧アーク灯を励 起光源として使ったものもある。このタイプの装置は、レーザー形よりも装置費 用が安価になるという他、幾つがのすぐれた利点を持っている。しかしこの種の ランプ型フローサイトメーターでは、異る領域の散乱角の散乱光の測定が不可能 とされている。これは、励起光が開孔数の高い顕微鏡を通って運ばれること及び フロ・−チャンバーが散乱光測定に適していないという事実に基づくものである 。

公知のフローチャンバー（ノルウェー％許第１４４．００２号）と、暗視野検知 用の新システム（ノルウェー特許第１４５，１７６号）とを組合せたものはこの ランプ型フローサイトメーターでも散乱光の測定が可能となる。本発明はこのシ ステムを更に発展させたもので、２種の異る領域の散乱角を持つ散乱光の同時検 知が可能となった。

本発明は生物細胞による散乱光のもつ以下の３種、の特性に基づくものである。

即ち、１）１０’以下の小散乱角の散乱光の強さは他の凡ての散乱光の強さの和 よりもずっと大きい。２）小散乱角の散乱光は主として細胞表面（輪郭）からの 回折によって発生する。３）１５°以上の大きな散乱角の散乱光は、例えばその 構造が光の波長より小さい亜顕微鏡的構造からの散乱光で占められていて、この 散乱光は散乱角とははｙ無関係である。

本発明によれば、前述の装置は、暗視野が望遠鏡（１０）による２次対物鏡（１ ）の映像面の後に再生され、その結果、該暗視野の中央部の光が鏡によって光検 知器に反射され、こうして別の光検知器に達する該暗視野の周辺部の光とは区別 することを特徴としている。

本発明による本装置のもう一つの特徴は、以下に示す請求の範囲と同様に添付図 に見られる以下の説明からも自明である。

第１図は、本発明に基く装置がどのようにして２種の散乱角を持つ散乱角の検知 を可能とするかを示している。

第２図は、暗視野の異った部分がどのようにして異った散乱角の光を放つかを示 している。

散乱光は、微粒子流（６）にランプ（５）からの励起光を集中させる１次対物鏡 （４）の暗黒化材（視野中央部阻止物）（３）により生じる暗視野内を通って２ 次対物鏡（１）で測定される。この２次対物鏡（１）は微粒子の映像がスリンｌ −（７）上に作られるように微粒子流（６）に焦点を合せろ。スリット（７）は 微粒子流を含まない対物面の他の部分かノの反射を抑制し、それによって測定の 信号・ノイズ比を向上させる働きをする。微粒子流（６）の暗視野映像即ち散乱 光で見られる微粒子流が接眼鏡（９）を通して観察できるようにスリット（７） の後に４５°傾斜鏡（８）を挿入してもよい。これは凡てノルウェー特許第１４ ５，１７６号に記載されており、スリット（７）のすぐ後に光検知器も取付けら れている。

第２図に示すように、暗視野の別の所には別の散乱角の光がある。従って、暗視 野の周辺部はα。＋α２の角度範囲に亘る散乱光を含み、暗視野の中央部即ち光 軸のすぐ近くの領域はα１〜α３の角度範囲の光を含んでいる。視野阻止物（３ ）の大きさは、α１がα２よりも１〜２°大きくなるようにする。α２は２次対 物鏡（１）の開口数により決まる。対物鏡（１）の開口数の適当値はＮ、Ａ、＝ 　０．４で、この時１．α２二１８°となる。スリット（７）の後に設けられた 望遠鏡（１０）は、対物鏡（１）の開口部の映像（瞳孔）（１１）を無限大にす る。このことは望遠鏡（１０）を出た円すい光束（１２）が暗視野（２）の再生 となることを意味している。こうし℃、この光束（１２）内の光の強さの角度分 布は暗視野（２）の角度分布と一致することになる。約１５°より大きい角度に 散乱した光を持つ光束（１２）の中央部は対物鏡（１）の光軸と４５°の角度の ついた鏡（１３）で、光束（１２）の残部と識別される。この鏡の上に達する光 は反射されて光検知器（１４）に達し、このようにして約１５°より大きい角度 の散乱光が計測される。他方、残りの光は他の検知器（１５）に達し、このよう にして主として小角度に散乱された光が検知される。フローサイトメーターの測 定域を通る各細胞又は微粒子は、こうして２つの検知器（１４）と（１５）のい づれかで電気パルスに変換される。これらのパルスは本発明の目的である散乱光 の２つの成分を表わしている。

゛国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）対物鏡（４）の明視野中に暗視野（２）を作らせる視野中央部阻止物（３ ）を有する高開口数の対物鏡（４）と、該暗視野中の開口映像（瞳孔）と１次対 物鏡（４）の対物面と一致した対物面とを有する２次対物鏡（１）とより成る生 物細胞又は微粒子よりの散乱光の２つの角度成分同時測定用のフローサイトメー ター装置において、該暗視野（２）の中央部が鏡（１３）によつて第１光検知器 （１４）に反射され、こうして第２光検知器（１５）上に達した該暗視野周辺部 の光と分離するように望遠鏡（１０）で２次対物鏡（１）の映像面の後に暗視野 （２）を再生させることを特徴とするフローサイトメーター装置。 （２）請求の範囲第１項に記載されたフローサイトメーター装置において、暗視 野部（２）が対物鏡（１及び４）の光軸と一致する対称軸を持ち、該暗視野部（ ２）がこの対称軸の周囲少くとも１５°の角度まで拡がつていることを特徴とす るフローサイトメーター装置。 （３）請求の範囲第１項に記録されたフローサイトメーター装置において、対物 鏡（４）が強い光源（５）からの光を対物面に集光し、この対物面を微細層流に より搬送される生物細胞又は微粒子を通過させることを特徴とするフローサイト メーター装置。 （４）請求の範囲第１項に記載されたフローサイトメーター装置において、調節 可能なスリツト（７）が該対物鏡（１）の映像面に設けられ、該スリツト（７） が、微粒子流が対物鏡（１及び４）の共通光軸を通る時、該微粒子流の映像を含 む対物鏡（１）によつて生じる映像のその部分を覆うように設けられたことを特 徴とするフローサイトメーター装置。 （５）請求の範囲第１項に記載されたフローサイトメーター装置において、対物 鏡（１）の対物面から見られる該対物鏡（１）の接眠開孔（瞳孔）（１１）が、 暗視野（２）によつて拡大された角度より１〜２°小さく、こうして該暗視野（ ２）内に完全に納まるような角度（α２）内に拡がつていることを特徴とするフ ローサイトメーター装置。 （６）請求の範囲第１項に記載されたフローサイトメーター装置において、望遠 鏡（１０）がスリツト（７）の後に位置し、光強度の再度分布が暗視野部（２） 内で観察されるものと正確に一致するように光束を拡げる望遠鏡の後で対物鏡（ １）の開口映像（瞳孔）（１１）を無限大とすることを特徴とするフローサイト メーター装置。