JPS6187700A - Peptide-containing substance immobilized material - Google Patents

Abstract

PURPOSE:The titled immobilized material useful for diagnosis of as a bioreactor for agriculture, producible simply at low cost, obtained by immobilizing a functional peptide-containing substance to zeolite as a carrier by chemical bond. CONSTITUTION:Zeolite is heated, sufficiently dried, ground, granulated, and treated with a silane coupling agent such as gamma-aminopropyltriethoxysilane, etc., to give zeolite treated with aminosilane. Then it is treated with glutaraldehyde, and a functional peptide-containing substance (e.g., beta-galactosidase, etc.) such as enzyme, antigen, antibody, etc., is immobilized to the zeolite by chemical bond, to give the aimed immobilized material.

Description

【発明の詳細な説明】 ０）　産業上の利用分野 この発明紘、ペプチド含有物質固定化物に関する。さら
に詳しくは、酵素、抗原、抗体等の機能性ペプチド含有
物質を担体に固定化してなシ診断用や産業用のバイオリ
アクターとして有用なペプチド含有物質固定化物に関す
る。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION 0) Industrial Application Field This invention relates to a peptide-containing substance immobilized product. More specifically, the present invention relates to an immobilized peptide-containing substance useful as a diagnostic or industrial bioreactor in which a functional peptide-containing substance such as an enzyme, an antigen, or an antibody is immobilized on a carrier.

（ロ）従来技術 最近、酵素、抗原、抗体等の機能性ベグデド含有物質を
担体に固定化してなる固定化物が種々提案されており、
ことに診断用や産業用のバイオリアクターとして酵素等
の生体触媒を固定化した、所謂固定化酵素が用いられる
ようＫなっている。(B) Prior art Recently, various immobilized products have been proposed in which functional Begde-containing substances such as enzymes, antigens, and antibodies are immobilized on carriers.
In particular, so-called immobilized enzymes, in which biocatalysts such as enzymes are immobilized, are increasingly being used in diagnostic and industrial bioreactors.

かような固定化酵素における固定化方式Ｋｉｔ種々の方
式があプ、担体の中に酵素を物理的に混入して固定化し
たもの、担体をマイク霞カプセル化してこの中に酵素を
物理的に保持したもの、酵素を膜状の担体間に密着保持
したもの、化学結合により酵素を担体に固定したもの等
が知られている。There are various types of immobilization kits for such immobilized enzymes. Some examples include those in which the enzyme is retained, those in which the enzyme is closely held between membrane-like carriers, and those in which the enzyme is immobilized on the carrier by chemical bonding.

これらのうち、化学結合により直接的に担体に固定化し
た固定化酵素は、通常、担体としてガラス粒子やガラス
膜を用い、この表面を強欲や強アルカリで処理して水酸
基を導入し、この水酸基を利用しシランカップリング剤
等を用いて酵素を結合固定することＫよシ得られておシ
、これ以外にも金属アルコキシドの加水分解で生じる金
属水酸化物系の多孔性ゲル体を用い、この水臥基を用い
て同様に酵素を結合固定する方法も知られている。Among these, immobilized enzymes that are directly immobilized on a carrier by chemical bonding usually use glass particles or glass membranes as the carrier, and treat the surface with greed or strong alkali to introduce hydroxyl groups. In addition to this, it is possible to bind and immobilize enzymes using a silane coupling agent, etc. In addition, using a metal hydroxide-based porous gel body produced by hydrolysis of metal alkoxides, A method for similarly bonding and immobilizing an enzyme using this hydrophilic group is also known.

しかしながら、かような固定化酵素においては、水竺基
を含む担体自体を前述のごとく予め化学処理により作製
する必要が“あり、また、このような化学処理全社てい
るため食品用のバイオリアクターとして用いる際、安全
性の面で適切かどうかの問題があった。However, in such immobilized enzymes, it is necessary to prepare the carrier itself containing the aqueous group in advance by chemical treatment as described above, and since all companies use such chemical treatment, it is difficult to use bioreactors for food. When using it, there was a question of whether it was appropriate in terms of safety.

ｅ）　発明の目的　　゛ 仁の発明の上記問題点に鑑みなされたものであり、よシ
簡便に製造できてコストが低く、かつ食品用のバイオリ
アクターのごとき高度の安全性が要求される分野にも好
適なペプチド含有物質固定化物を提供しようとするもの
である。e) Purpose of the invention This invention was created in view of the above-mentioned problems of Jin's invention, and is easy to manufacture, low cost, and applicable to fields that require a high degree of safety, such as food bioreactors. The present invention also aims to provide a suitable peptide-containing substance immobilized product.

に）発明の構成 かくしてこの発明によれば、酵素、抗原、抗体等の機能
性ペプチド含有物質を担体に化学結合により固定化して
なる固定化物において、担体としてセビオライトを用い
たことを特徴とするペプチド含有物質固定化物が提供さ
れる。B) Structure of the Invention According to the present invention, there is provided an immobilized product in which a functional peptide-containing substance such as an enzyme, an antigen, or an antibody is immobilized on a carrier by chemical bonding, which is characterized in that Seviolite is used as the carrier. An immobilized substance containing substance is provided.

この発明に用いるセビオライトとは一般的に二次成鉱物
として天然鉱物から産生される繊維性を持つた粘土状の
ケイ隈マグネシウム塊を示すものであり、組成式で通常
、Ｃ０Ｈｔ）４ｃＯＨ）ａ）ｄＪｌａｓｉ　ｒｔｏｚｏ
　・６〜８Ｈ２０もしくはＭｓｒ、Ｈｌ（Ｓｉ　４０１
１　）ｓ・３Ｈ１０又はＳ　ｌ　＋ｚＭｇ　５ｏｓｏ　
（ＯＨ）４で示されるものである。Seviolite used in this invention generally refers to a fibrous clay-like silica magnesium lump produced from natural minerals as a secondary mineral, and has a compositional formula of C0Ht)4cOH)a). dJlasi rtozo
・6~8H20 or Msr, Hl (Si 401
1) s・3H10 or S l +zMg 5oso
It is represented by (OH)4.

上記セビオライトを担体として用いることにより、この
発明のペプチド含有物質固定化物が得られる。この際、
セビオライト社適宜粒状や膜状等の所望の影態に成形さ
れた後、ペプチド含有物質の固定化に供される。この場
合、セピオライトを物理的に成形してそのｔま固定化の
担体として用いることもできるが、通常、加熱により充
分に乾燥処理されたものを用いるのが好ましい。ことに
吸着水や結晶水を加熱により充分に除去したものを用い
るのが、得られた担体ひいて社固定化物の脆さが改善さ
れ実用的な固定化物とすることができる点好ましい。か
かる熱処理は通常、４５０〜５５０℃下で行なうのが適
している。４５０℃未満では長時間熱処理を行なっても
充分な乾ａ（脱水）を行なうことができず、また５５０
℃を越えると、セビオライト中に存在する水酸基の量が
低減してしまうので適していない。通常、４５０〜５５
０℃下で３〜４時間程度行なうのが最も好ましい。なお
、このような熱処理の温度や時間を２整することにより
、担体の固さを成形や用途に応じて適宜設定することが
できる。充分に乾燥処理されたセピオライトは容易に破
砕して粒状化することができ、粒子状の固定化物を得る
際に最も・好ましい担体である。By using the above Seviolite as a carrier, the peptide-containing substance immobilized product of the present invention can be obtained. On this occasion,
After being shaped into a desired shape such as a granule or a film by Seviolite, it is used for immobilization of a peptide-containing substance. In this case, sepiolite can be physically shaped and used as a carrier for immobilization, but it is usually preferable to use one that has been sufficiently dried by heating. In particular, it is preferable to use a carrier from which adsorbed water and water of crystallization have been sufficiently removed by heating, since this improves the brittleness of the resulting carrier and thus the immobilized product, thereby making it possible to obtain a practical immobilized product. Such heat treatment is usually suitably carried out at a temperature of 450 to 550°C. At temperatures below 450°C, sufficient drying (dehydration) cannot be achieved even if heat treatment is performed for a long time;
If the temperature exceeds .degree. C., the amount of hydroxyl groups present in Seviolite will be reduced, so it is not suitable. Usually 450-55
It is most preferable to carry out the reaction at 0° C. for about 3 to 4 hours. Note that by adjusting the temperature and time of such heat treatment, the hardness of the carrier can be appropriately set depending on the molding and use. Sufficiently dried sepiolite can be easily crushed and granulated, and is the most preferred carrier for obtaining particulate immobilized products.

かようなセピオライトへのペプチド含有物質の固定化け
、通常、カップリング剤を用いて行なうのが適している
。例えば酵素を固定化するに当りてはシランカップリン
グ剤〔例えば、ｒ−アミノプロピルトリエトキシシ７ｙ
Ｓｒ−クロログ認ピルトリメトキシシラン、ビニルトリ
エトキシシラン、ｒ−グリシドキシグロビルトリメトキ
シシラン、Ｎ−β−（アミノエチル）−１−アミノプロ
ピルトリメトキ７７ラン等〕を用いるのが好適であり、
γ−アミノプロピルトリエトキシシランを用いるのが好
ましい。これらを用いた固定化は、例えばこれらの水溶
液にセピオライトを添加するか接触保持させて該シラン
カップリング剤をセピオライト中の水酸基と反応させて
導入し、次いで二官能性の固定化剤（例えば、グルタル
アルデヒド等）の水溶液で処理した後、所望の酵素の水
溶液を接触させることにより酵素をセビオライト中のシ
ランカップリング剤残基との化学結合により固定化する
ことによって行なうことができる。ただし、場合によっ
ては所謂臭化シアン活性化法のようにカップリング剤を
介さずして直接固定化することも可能である。It is usually suitable to immobilize a peptide-containing substance onto such sepiolite using a coupling agent. For example, when immobilizing enzymes, silane coupling agents [e.g., r-aminopropyltriethoxy 7y
It is preferable to use Sr-chloropyltrimethoxysilane, vinyltriethoxysilane, r-glycidoxyglobiltrimethoxysilane, N-β-(aminoethyl)-1-aminopropyltrimethoxysilane, etc. ,
Preferably, γ-aminopropyltriethoxysilane is used. For immobilization using these, for example, sepiolite is added to these aqueous solutions or kept in contact with them, the silane coupling agent is introduced by reacting with the hydroxyl group in sepiolite, and then a bifunctional immobilization agent (for example, After treatment with an aqueous solution of glutaraldehyde, etc.), the enzyme is immobilized by chemical bonding with the silane coupling agent residue in Seviolite by contacting with an aqueous solution of the desired enzyme. However, in some cases, it is also possible to directly immobilize without using a coupling agent, such as in the so-called cyanogen bromide activation method.

このようＫして得られるペプチド含有物質固定化物は、
実用上の充分な活性を発現するものである＠かかる活性
は、セピオライトの有する豊富な水酸基と他の粘土鉱物
に比して大きな比表面積（２３０〜２６　Ｇ　’／、　
）　Ｋよジペプチド含有化合物が効Ｍｇ良く、ビ・つ多
薫くＴ電化でき±九めと考えられ、これ以外（もセピオ
ライトの細孔（、５０〜３００Ａ）の分布が２００Ａ付
近に集中していることにより固定化及び固定化された物
質の基質等への作用が効率良く行なわれる点によるもの
と考見られる。The peptide-containing substance immobilized product obtained by K in this way is
This activity is due to the abundant hydroxyl groups of sepiolite and its large specific surface area (230 to 26 G'/,
) K-dipeptide-containing compounds have good Mg effect and are thought to be able to produce T-electrification with a strong Bi-tsuta aroma. This is thought to be due to the fact that the immobilization and the action of the immobilized substance on the substrate etc. are carried out efficiently.

（ホ）実施例 以下、この発明を実施例により説明する。(e) Examples This invention will be explained below with reference to Examples.

（シランカップリング剤の導入） セビオライト塊を約４５０℃で１８０分加熱処理して充
分乾燥させ、これを破砕してメツシュω〜１２００粒状
化した。この粒状セピオライト５０ｆを、塩酸によりｐ
Ｈ３，５に調整されたｒ−７ミノプロビルトリエトキシ
シラン（シランカップリング剤）の５容′Ｊｔチ溶液１
０００　ｍｌ中に加え、ｐＨが３以下になった後ｒ−ア
ミノプロピルトリエトキシシランをさらに加えてｐＨが
３〜４となるように調製し、８５℃のオイルパス中で還
流下、約２時間ゆるやかに攪拌した。(Introduction of Silane Coupling Agent) The Seviolite lump was heat-treated at about 450° C. for 180 minutes, sufficiently dried, and crushed to form mesh ω~1200 particles. This granular sepiolite 50f was purified by hydrochloric acid.
5 volumes of r-7 minoprobyltriethoxysilane (silane coupling agent) adjusted to H3,5'Jt solution 1
After the pH became 3 or less, r-aminopropyltriethoxysilane was further added to adjust the pH to 3 to 4, and the mixture was heated under reflux in an oil path at 85°C for about 2 hours. Stir gently.

反応後の粒状セビオライトをメンブランフィルタにより
口遇し、５００（１ｗＩｔの水及び２００−のアセトン
で洗浄し、１２０℃下２時間乾燥させた。The granular Seviolite after the reaction was filtered through a membrane filter, washed with 500 (1 wt) water and 200 wt acetone, and dried at 120° C. for 2 hours.

（酵素の固定化） 上記で得られたアミノシラン化セビオライトに、２５容
量チのグルタルアルデヒド１０−にリン酸ナトリウム緩
衝液を加えて作製したグルタルアルデヒド溶液１００−
を加えてマグネテックスター２でｐＨを約６に調節し９
９１０分間攪拌し、その後３０分間脱気しウォーターバ
スインキュベータ（３０℃）で２０分間攪拌した。その
後、ｐＨ７のリン酸ナトリウム緩衝液５０００−で口過
し、半日間減圧状態で放置した。(Immobilization of Enzyme) A glutaraldehyde solution 100-100% was prepared by adding sodium phosphate buffer to 25 volumes of glutaraldehyde 10-100% to the aminosilanized Seviolite obtained above.
and adjust the pH to about 6 using Magnetech Star 2.
The mixture was stirred for 910 minutes, then degassed for 30 minutes, and stirred in a water bath incubator (30° C.) for 20 minutes. Thereafter, the mixture was washed with a sodium phosphate buffer solution of pH 7, 5000-mL, and left under reduced pressure for half a day.

このようにして得られたグルタルアルデヒド処′理のア
ミノシラン化セビオライト１００岬を、β−ガラクトシ
ダーゼ（４０ｑ）のリン酸ナトリウム緩衝液溶液（ＰＨ
７，０）５ｓｇ中に加え、湯せん（３０℃）で５時間ゆ
つ〈シと振盪させて固定化反応を行なうむとＫより、β
−ガラクトシダーゼをセビオライトに固定化してなるこ
の発明の固定化酵素（ビーズ状）を得た。The aminosilanized Seviolite 100 cape treated with glutaraldehyde thus obtained was added to a solution of β-galactosidase (40q) in sodium phosphate buffer (PH
7,0) When the immobilization reaction is carried out by adding 5sg of K and shaking in a hot water bath (30℃) for 5 hours, β
- The immobilized enzyme of the present invention (in the form of beads) was obtained by immobilizing galactosidase on Seviolite.

このようにして得られた固定化酵素の活性を評価するた
め下！己の条件でのグルコース生成量をグルコース計に
より測定した。To evaluate the activity of the immobilized enzyme thus obtained, see below! The amount of glucose produced under the own conditions was measured using a glucose meter.

（条　件） 基質：１５７−の乳糖のリン酸ナトリウム緩衝液−２０
０ｍｇ　　、　　　ｐＨ６，６ 反応温度　＝　３０℃ 固定化酵素使用量　：　１００岬 この結果を、第１図に示した０このように上記固定化酵
素は、乳糖に作用してグルコースとガラクトースに加水
分解させる良好な酵素活性を有していることが判る。(Conditions) Substrate: 157-lactose sodium phosphate buffer -20
0 mg, pH 6,6 Reaction temperature = 30°C Amount of immobilized enzyme used: 100 caps The results are shown in Figure 1. 0 Thus, the above immobilized enzyme acts on lactose to hydrolyze it into glucose and galactose. It is found that it has good enzyme activity.

に）発明の効果 以上述べたように、この発明の固定化物は、従来のよう
に担体自体を化学的処理等によりアらかじめ作製してお
くことなくペプチド含有物質を直接固定化してなるもの
であり、より簡便に製造できるものである。さらに、用
いる担体自体、天然の鉱物であって従来の担体に比して
安全性を充分に備えたものであシ、食品用のバイオリア
クター等５つ亮貢り安全εで・畏すさ？Ｌる分野ず二も
好１に・夏用することができる。しかもこの担体は一般
的に、非常に安価に入手できるものであり、簡便な製造
法とも相俟って非常に安価な固定化物が得られるという
利点を備えたものである０B) Effects of the Invention As mentioned above, the immobilized product of the present invention is one in which a peptide-containing substance is directly immobilized without preparing the carrier itself in advance by chemical treatment, etc. as in the past. Therefore, it can be manufactured more easily. Furthermore, the carrier itself is a natural mineral and is much safer than conventional carriers. It can be used in both summer and summer areas. Moreover, this carrier is generally available at a very low cost, and combined with a simple manufacturing method, it has the advantage of producing a very cheap immobilized product.

【図面の簡単な説明】[Brief explanation of drawings]

第１図Ｌ１この発明の一実施例のβ−ガラクトシダーゼ
固定化酵素の活性を例示するグラフである０ パパ餐′−Figure 1 L1 is a graph illustrating the activity of the β-galactosidase immobilized enzyme of one embodiment of the present invention.

Claims (2)

【特許請求の範囲】[Claims] （１）酵素、抗原、抗体等の機能性ペプチド含有物質を
担体に化学結合により固定化してなる固定化物において
、 担体としてセピオライトを用いたことを特徴とするペプ
チド含有物質固定化物。(1) A peptide-containing substance immobilized product comprising a functional peptide-containing substance such as an enzyme, antigen, or antibody immobilized on a carrier by chemical bonding, characterized in that sepiolite is used as the carrier. （２）担体が、加熱により乾燥処理されたセピオライト
からなる特許請求の範囲第１項記載の固定化物。(2) The immobilized product according to claim 1, wherein the carrier is made of sepiolite that has been dried by heating.