JPS58190388A - Preparation of substance for promoting propagation of bifidobacterium - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To carry out preferentially sugar ioversion reaction and to enable the preparation of oligosaccharide in high yield, by feeding a lactose solution having a specific concentration at a specified space velocity to a column packed with a carrier to which beta-galactosidase is immobillized, treating it with the enzyme. CONSTITUTION:Lactose is treated with beta-galactosidase produced by Aspergillus oryzae, to prepare a substance for promoting the propagation of Bifidobacterium, consisting of oligosaccharide as an active ingredient. In this method, beta- galactosidase immobilized on a carrier is used, and the lactose concentration of the lactose solution to be treated is 10-36wt%, and the pH is preferably 3.0- 7.0. The lactose solution is fed at 10-70/hr space velocity to a column packed with the carrier to which beta-galactosidase is immobilized to carry out enzymic treatment. Namely, in the competitive hydrolysis reaction and sugar ionversion reaction in the treatment of lactose with beta-galactosidase, the latter is done preferentially, so that oligosaccharide is obtained in high yield.

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ビフィドバクテリウム菌の増殖促進物質の製
造法に関するものである。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates to a method for producing a substance that promotes the growth of Bifidobacterium.

ビフィドバクテリウム菌の増殖促進物質としては従来様
々のものが報告されているが、その一つに、本発明者ら
が発明し特許出願中のもの（特開昭５５−１０４８８５
として公開されている）がある。この増殖促進物質は、
アスペルギルス・オリゼの生産したβ−がラクトシグー
ゼでラクトースを処理することにより得られ、一般式　
ＧａＬ（Ｇａｌ）ｎ−Ｇｌｃ　　（但し式中Ｇａｌはガ
ラクトース残基、Ｇｌｃはグルコース残基、ｎは１〜４
の整数を、それぞれあられす）で示されるオリゴ糖を有
効成分とするものである（以下この明細書では上記特定
のオリゴ糖を意味する言葉として「オリゴ糖」という言
葉を用いる）。Various substances have been reported as growth-promoting substances for Bifidobacterium, one of which is the one invented by the present inventors and pending a patent application (Japanese Patent Laid-Open No. 55-104885).
(published as ). This growth-promoting substance is
β- produced by Aspergillus oryzae is obtained by treating lactose with lactosigase, and the general formula
GaL(Gal)n-Glc (wherein, Gal is a galactose residue, Glc is a glucose residue, and n is 1 to 4
The active ingredient is an oligosaccharide represented by an integer of , respectively.

上記酵素処理の際に起こる反応は、β−ガラクトシダー
ゼによるラクトースの加水分解と糖転位であり、オリゴ
糖は糖転位反応により、ラクトースから生成するもので
ある。加水分解と糖転位とは並行して起こるから、β−
ガラクトシダーゼでラクトースを処理すると、オリゴ糖
だけでなく、加水分解生成物であるグルコースおよびガ
ラクトースも同時に生成し、しかも−たん生成したオリ
ゴ糖も、酵素処理を続けると徐々に加水分解されて単糖
を与える。したがって、回分式の酵素処理によりオリゴ
糖を製造するとオリゴ糖の収率が最大になる処理時間が
あり、この時点で処理を打切ることになるが、それでも
オリゴ糖の対糖収率は２０％程度にとどまる。The reactions that occur during the enzyme treatment are lactose hydrolysis and sugar transfer by β-galactosidase, and oligosaccharides are produced from lactose by the sugar transfer reaction. Since hydrolysis and sugar rearrangement occur in parallel, β-
When lactose is treated with galactosidase, not only oligosaccharides but also the hydrolysis products glucose and galactose are simultaneously produced. Furthermore, as the enzyme treatment continues, the oligosaccharides produced are gradually hydrolyzed into monosaccharides. give. Therefore, when oligosaccharides are produced by batch enzymatic treatment, there is a processing time at which the yield of oligosaccharides reaches its maximum, and at this point the processing must be discontinued, but the yield of oligosaccharides based on sugars is still 20%. It remains to a certain extent.

本発明の目的は、ラクトースのβ−ガラクトシダーゼ処
理における上記競合する二つの反応のうち糖転位反応を
優先させ、オリゴ糖をなるべ（高い収率で取得する方法
を提供することにある。An object of the present invention is to provide a method for obtaining oligosaccharides at a high yield by giving priority to the sugar transfer reaction among the two competing reactions described above in the treatment of lactose with β-galactosidase.

上記目的を達成することに成功した本発明は、アスペル
ギルス・オリゼの生産したβ−ガラクトシダーゼでラク
トースを処理してオリゴ糖を有効成分とするとフィトバ
クテリウム菌の増殖促進物質を製造する方法において、
β−ガラクトシダーゼとして担体に固定されたものを用
い、被処理ラクトース溶液のラクトース濃度を１０〜３
６％（重量％、以下の文において同じ）とし、β−ガラ
クトシダーゼが固定された担体を充填したカラムに上記
ラクトース溶液を空間速度１０〜７０／Ｈｒで供給して
酵素処理を行うことを特徴とするものである。The present invention, which has succeeded in achieving the above object, provides a method for producing a growth-promoting substance for Phytobacterium by treating lactose with β-galactosidase produced by Aspergillus oryzae and using oligosaccharide as an active ingredient.
Using β-galactosidase immobilized on a carrier, the lactose concentration of the lactose solution to be treated was adjusted to 10 to 3.
6% (by weight, the same in the following sentences), and the enzyme treatment is carried out by supplying the above lactose solution at a space velocity of 10 to 70/Hr to a column packed with a carrier on which β-galactosidase is immobilized. It is something to do.

固定化したβ−ガラクトシダーゼを用い、かつ上記のよ
うな特定の条件で処理を行う本発明の方法によれば、固
定化した酵素を使用する酵素処理につき一般的に認めら
れる効果、すなわち酵素の反復使用が可能になるととも
に被処理物について酵素の失活処理や分離処理が不要に
なるといった効果が奏されるのはもちろんのこと、精製
処理の大幅な負担軽減、しく安価にオリゴ糖を製造する
ことが可能になる。According to the method of the present invention, which uses immobilized β-galactosidase and performs the treatment under the specific conditions described above, the effect generally observed in enzyme treatments using immobilized enzymes, that is, the repetition of enzymes, can be improved. Not only can it be used, but it also has the effect of eliminating the need for enzyme deactivation and separation treatments for the processed material, as well as greatly reducing the burden of purification and producing oligosaccharides at a cheaper price. becomes possible.

本発明の製法において用いる固定化β−ガラクトシダー
ゼは、イオン交換樹脂等の樹脂に酵素を固定する常法に
従って調製したものでよく、担体の種類や酵素の固定方
法に制限はない。The immobilized β-galactosidase used in the production method of the present invention may be prepared according to a conventional method of immobilizing the enzyme on a resin such as an ion exchange resin, and there are no restrictions on the type of carrier or the method of immobilizing the enzyme.

固定化β−ガラクトシダーゼｌこよるラクＹ−スの処理
は、カラム法により行う。Treatment of LacY-su with immobilized β-galactosidase is carried out by a column method.

処理を行うに当っては被処理溶液中のラクトースの濃度
と通液速度が重要である。In carrying out the treatment, the concentration of lactose in the solution to be treated and the rate of liquid passage are important.

ラクトース濃度は１０〜３６％　、望ましくは３０〜３
６％とする。これよりもラクトース濃度が低いときは加
水分解による単糖類の生成率が大きくなり、オリゴ糖の
生成率をも上回るようになるから、収率に関しては回分
式よりも有利とは言えな（なってしまう（後記実験例２
参照）。したがって、牛乳のような１氏濃度ラクトース
溶液はそのままでは本発明の方法において被処理液とす
ることができない。一方ラクトース濃度がに記範囲をこ
えて高いときは、過飽和状態となるため、ラクトースが
送液管中で析出することがある。Lactose concentration is 10-36%, preferably 30-3
6%. When the lactose concentration is lower than this, the production rate of monosaccharides by hydrolysis increases and even exceeds the production rate of oligosaccharides, so it cannot be said that it is more advantageous than the batch method in terms of yield. Put it away (experiment example 2 below)
reference). Therefore, a 1 degree centigrade lactose solution such as milk cannot be used as a liquid to be treated in the method of the present invention. On the other hand, when the lactose concentration is higher than the above range, the liquid becomes supersaturated and lactose may precipitate in the liquid pipe.

また通液速度は、被処理液のｒ＋Ｈや濃度によっても異
なるが、空間速度（ＳＶ）として１０〜７０／Ｈｒ、望
ましくは２０〜Ｓｏ／Ｈｒとしなければならない。これ
上りもｓ■が小さいときは、ラクトース濃度が低い場合
と同様に、加水分解反応が着しくなって単糖類の生成率
が大きくなる（後記実験例１参照）。反対にＳＶが大き
すぎると、加水分解率と比べた場合の糖転位率が悪くな
るわけではないが、糖転位率の絶対値が低下してオリゴ
糖の収率が悪くなる。Although the liquid passing rate varies depending on the r+H and concentration of the liquid to be treated, the space velocity (SV) must be 10 to 70/Hr, preferably 20 to So/Hr. In addition, when s■ is small, the hydrolysis reaction becomes more severe and the production rate of monosaccharides increases, as in the case where the lactose concentration is low (see Experimental Example 1 below). On the other hand, if the SV is too large, the sugar rearrangement rate will not become worse when compared to the hydrolysis rate, but the absolute value of the sugar rearrangement rate will decrease and the yield of oligosaccharides will deteriorate.

ラクトース濃度および通液速度以外の処理条件には特に
制限がないが、被処理液のｐＨは３．０〜７．０範囲に
あることが望ましい。Although there are no particular limitations on the treatment conditions other than the lactose concentration and the liquid flow rate, it is desirable that the pH of the liquid to be treated is in the range of 3.0 to 7.0.

以下実験例お１び実施例を示して本発明を説明するが、
各側において用いた固定化酵素は、スチレン−ジビニル
ベンゼン共重合体系多孔質陰イオン交換樹脂Ｒ−８ＸＯ
１（三菱化成工業社製）に、アスペルギルス・オリゼが
生産したβ−ガラクトシダーゼをグルタルアルデヒド法
により共有結合で結合させたものであって、樹脂１ｍｌ
当りの結合酵素量（基質として０−ニトロフェニル−β
・ＤＪ’ラクトピラ／シトを用い、温度３７℃、ｐＨ４
，５にて測定）は４６０９単位、活性効率は０．０９１
のものである。なお固定に用いたβ−ガラクトシダーゼ
は、回分式の牛乳処理に使用した場合、ラクトースを１
００％加水分解する能力を有するものである。また酵素
処理生成物の分析は高速液体クロマ）グラフィー（カラ
ム：ウォーターズ社製糖分析専用のマイクロボングバッ
ク／カーボハイドレート　；溶媒系：アセ）二ＭＪル／
水＝　７０　／　３０ｖ／ｖ　；検出：示差屈折計によ
る）または薄層クロマトグラフィー（メルク社製シリカ
ゲル６０プレート　；展開溶媒：イソプロパ／−ル／水
＝　８０／　２０ｖ／ｖ　；発色剤：硫酸）により行な
った。The present invention will be explained below with reference to Experimental Example 1 and Examples.
The immobilized enzyme used on each side was a porous anion exchange resin R-8XO based on styrene-divinylbenzene copolymer.
1 (manufactured by Mitsubishi Chemical Industries, Ltd.) with β-galactosidase produced by Aspergillus oryzae covalently bonded by the glutaraldehyde method.
amount of bound enzyme (0-nitrophenyl-β as substrate)
・Using DJ' Lactopira/Cyto, temperature 37°C, pH 4
, 5) is 4609 units, activity efficiency is 0.091
belongs to. Note that the β-galactosidase used for fixation was used for batch milk processing.
It has the ability to hydrolyze 0.00%. In addition, enzyme-treated products can be analyzed using high-performance liquid chromatography (column: Waters Micro Bongvac/carbohydrate; solvent system: acetate);
Water = 70/30v/v; detection: by differential refractometer) or thin layer chromatography (Merck silica gel 60 plate; developing solvent: isopropyl/water = 80/20v/v; color former: sulfuric acid) I did it.

以下実験例および実施例を示して本発明を説明する。The present invention will be explained below with reference to experimental examples and examples.

実験例　１ 固定化β−ガラクトシダーゼ２０Ｉｌ１１を内径１６＋
＋＋ｍ、高ＫＩＯｃＩ１１のカラムに充填し、外套に３
７°Ｃの温水を循環させなが呟これに３６％ラクｔ−ス
溶液を供給し、カラム通過液を分析してオリゴ糖の収率
（原料のラクトースに対する重量％）を調べる。一部の
実験においては単糖類の生成率も調べる。Experimental example 1 Immobilized β-galactosidase 20Il11 with an inner diameter of 16+
++m, packed into a column with high KIOcI 11 and coated with 3
A 36% lactose solution was supplied while circulating hot water at 7°C, and the liquid passing through the column was analyzed to determine the yield of oligosaccharides (% by weight based on the lactose of the raw material). In some experiments, the production rate of monosaccharides is also examined.

ラクトース溶液の１１）（およびＳｖを種々変更して上
記実験を行なった結果をまとめて、表１に示した。Table 1 summarizes the results of the above experiments conducted with various changes in lactose solution 11) (and Sv).

実験例　２ ラクトース溶液のｐＨを５．０、ＳＶヲ２０／Ｈｒｌ：
Ｉｌ定Ｌ、濃度を種々変更したほかは実験例１の場合と
同様にして、固定化β−ガラクトシグーゼによるラフ・
・ドースの処理を行なった。処理後の糖組成は、表２の
とおりであった。Experimental example 2 pH of lactose solution is 5.0, SV 20/Hrl:
Rough treatment with immobilized β-galactosigase was carried out in the same manner as in Experiment 1 except that the Il constant L and concentration were variously changed.
- Processed the dose. The sugar composition after treatment was as shown in Table 2.

表２ 被処理液ラクトース濃度　　オリゴ糖　　　　単糖類５
　　　　　　　０　　　　　１００ １０　　　　　　　９．０　　　　７０．１２５　　　
　　　　１４．６　　　　４１．２３６　　　　　　　
１７．５　　　　　３９．３実施例　１ 実験例１で用いたのと同様の固定化β−〃ラクトシダー
ゼのカラムに、マツキルベインバッファーでｐＨを３．
５に調整した３６％ラクトース溶液を５Ｖ２０／Ｈｒで
供給した。Table 2 Lactose concentration in treated liquid Oligosaccharide Monosaccharide 5
0 100 10 9.0 70.125
14.6 41.236
17.5 39.3 Example 1 A column of immobilized β-lactosidase similar to that used in Experimental Example 1 was adjusted to pH 3.0 with pine kilvain buffer.
A 36% lactose solution adjusted to 5V was supplied at 5V20/Hr.

オリゴ糖濃度が６．４％の通過液が得られ、原料ラクト
−又に対するオリゴ糖の収率は１７．８％であった。A pass-through solution with an oligosaccharide concentration of 6.4% was obtained, and the yield of oligosaccharides based on the raw material lacto-saccharide was 17.8%.

カラム通過液からイオン７換樹脂および活性炭を用いて
精製されたオリゴ糖は、３糖類な主成分とし、ガラクト
ース−〃ラクトース間結合はβ−１，６結合が王であり
、ガシンｒ−スーグルフース閤結合はβ−１，４結合が
主であって、これらの点において、またビフィドバクテ
リウム菌の増殖を促進する作用において、回分式の酵素
処理により得られるオリゴ糖と比べて特に異なるところ
はなかった。The oligosaccharide purified from the column-passing liquid using ion heptaconverting resin and activated carbon has a trisaccharide as its main component, and the β-1,6 bond is the predominant bond between galactose and lactose. The main linkages are β-1,4 bonds, and in these respects and in the ability to promote the growth of Bifidobacterium, there is a particular difference between oligosaccharides obtained by batch enzyme treatment. There wasn't.

代理人　弁理士　板　井　−朧Agent Patent Attorney Itai - Oboro

Claims (1)

【特許請求の範囲】[Claims] アスペルギルス・オリゼの生産したβ−ガラクトシダー
ゼでラクトースを処理して一般式　ＧａＬ（Ｇａｌ）ｎ
−Ｇｌｃ　　（但し式中Ｇａｌはガラクトース残基、Ｇ
ｌｃはグルコース残基、ｎは１〜４の整数を、それぞれ
あられす）で示されるオリゴ糖を有効成分とするビフィ
ドバクテリウム菌の増殖促進物質を製造する方法におい
て、β−ガラクトシダーゼとして担体に固定されたもの
を用い、被処理ラクト−人溶液のラクトース濃度を１０
〜３６重量％とし、β−ガラクトシダーゼが固定された
担体を充填したカラムに上記ラクトース溶液を空間速度
１０〜７０／Ｈｒで供給して酵素処理を行うことを特徴
とするビフィドバクテリウム菌の増殖促進物質の製造法
。By treating lactose with β-galactosidase produced by Aspergillus oryzae, the general formula GaL(Gal)n
-Glc (However, in the formula, Gal is a galactose residue, G
lc is a glucose residue, n is an integer from 1 to 4, respectively) In a method for producing a Bifidobacterium growth-promoting substance containing an oligosaccharide as an active ingredient, Using a fixed lactose solution, the lactose concentration of the lactose solution to be treated was reduced to 10
Proliferation of Bifidobacterium bacteria, characterized in that enzyme treatment is performed by supplying the above lactose solution at a space velocity of 10 to 70/Hr to a column packed with a carrier on which β-galactosidase is fixed at ~36% by weight. Method of manufacturing accelerator substances.