JPS6185190A - バシルスにおける発現および分泌方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　）において機
能的なポリペプチドを発現および分泌させる新規な方法
からなり、その実施のためのベクターおよび形質転換体
を含む。このベクターは、転写および翻訳活性化配列、
ならびに、所望によりスタフィロコッカス・アウレウス
（５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）ヌク
レアーゼ遺伝子の信号ペプチド暗号化配列および機能的
ポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列をも含む。こ
のベクター成分を、形質転換によってポリペプチドが発
現され、所望により分泌されるようにライゲーション（
結紮）する。

本発明は、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　）およびその
他の宿主細胞において、有用なポリペプチドを発現およ
び分泌させる方法、ならびに関連するベクターを提供す
るものである。本発明以前には、バシルス（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ　）における組換えＤＮＡ技術の開発および発展
は遅れており、適当な発現方法およびベクターの一般的
欠如のため、特に困難とされてきた。この発現方法およ
びベクターの欠如は、１つには、外来性転写および翻訳
開始信号がバシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　）にはうまく
認識されないせいてあると説明できる。したがって、よ
く知られているｃｒｐ（ホールウェル、Ｒ，Ａ、（Ｈａ
ｌｌｅｗｅｌｌ、Ｒ，Ａ、）およびＳ、エムテージ（Ｓ
、　Ｅｍｔａｇｅ　）　、　１９８０　、　　ジー７　
（Ｇｅｎｅ　）９　：　２７　）、Ｉａｃ　（ギヤラン
ト、Ｌ。

（Ｇｕａｒａｎｔｃ　、　Ｌ、　）等、　１９８０　、
セ／Ｌ、　（Ｃｅ１ｌ　）　２０　：５４３およびロバ
ーツ、　Ｔ、Ｍ、（Ｒｏｂｅｒｔｓ、　”Ｉ’、Ｍ、　
）等、　１９７９　、ブロク・ナト・アカド・サイ（Ｐ
ｒｏｃ。

Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｊ、）ＵＳＡ　７６　：５５９
６）、ＩＰＰ（ジー、　Ｎ、　（Ｌｅｅ、　Ｎ、）等、
１９８１．ジエー・オブ、バクテリオ／Ｌ／　（Ｊ、　
ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　）１４６　：８６１、ッ
に：−ヘル、　Ｌ、Ｊ、　（Ｚｗｉｅｂｅｌ、　Ｌ、Ｊ
、　）等、　１９８１゜ジエー・オブ　／Ｘ＋　クテリ
オ／ｌ／　（Ｊ、　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）１４
５　：６５４およびナタムラ、　Ｋ、　（Ｎａｔａｍｕ
ｒａ、　Ｋ、）およびＭ、イノウニ（Ｍ、Ｉｎｏｕｙｅ
）、１９７９．セル（Ｃｅｌｌ　）　１８　：１１０９
　）およびバクテリオファージλＰＬ（ブロム、　Ｃ，
（Ｄｅｒｏｍ、　Ｃ，）等、　１９８２　、ジー　７　
（Ｇｅｎｅ　）　１７　：　４５、／１ｚ−ｔ−一ト、
　Ｅ、（Ｒｅｍａｕｔ　。

Ｅ、）等、１９８１．ジーン（Ｇｅｎｅ）１５（１）：
８１およびベルナー／Ｉ／　、　Ｈ，（Ｂｅｒｎａｒｄ
　、　Ｈｏ）等、　１９７９　。

ジーン（Ｇｅｎｅ　）　５　：　５９　）転写および翻
訳指令プロモーター系は、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
　）中では機能しない。よって、少数の薬物耐性遺伝子
を除けば、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　）中では外来
性遺伝子は殆んど発現されておらず、実用的な真核生物
遺伝子は全く発現されていない。

現在利用できる転写および翻訳信号を認識するバシルス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　）の能力は極めて限られているた
め、遺伝子の発現を指令する新しい配列の開発か必要で
ある。発現についての幾つかの初期の試みには、Ｂ、リ
チェニフオ／Ｌ／　ミス（Ｂ、　Ｉｉｃｈｅｎｉｆｏｒ
ｍｉｓ）のβ−ラクタマーゼ遺伝子（欧州特許事務局公
開第００３６２５９に開示されている）ならびにＢ。

ステアロテルモフイ／ｌ／　ス（Ｂ、　ｓｃｅａｒｏｔ
ｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）り およびＢ、アミロ１久エフアシエンス（Ｂ、　ａｍｙｌ
ｏ−１ｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ　）のα−アミラーゼ遺
伝子（各々欧州特許事務局公開第００５７９７６および
ダーウエント・アブストラクト（Ｄｅｒｗｅｎｔ　Ａｂ
ｓｔｒａｃｔ　）〔ベルギー特許出願第ＢＥ８９１−６
５９’：］第３７３２３Ｅ／１９に開示されている）の
、Ｂ、サブティリス（Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ　）にお
けるクローンおよび発現が含まれる。Ｂ、サブティリス
（Ｂ、　ｓｕｂＥｉｌｉｓ）ｖｅｇプロモーターおよび
翻訳信号の改良（米国特許出願筒４５８，７９２（英国
公開第２１３３７９７に相当する）に開示されている）
も、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　）中でのへテロロー
ガスポリペプチドの発現を指令するのに有用であること
が示された。

サラニ、ハルハ等（パルバ（Ｐａ１ｖａ　）等、　１９
８３　。

ジー７（Ｇｅｎｅ）２２：２２９およびパルハ（Ｐａｌ
ｖり等、ｘｃ＋ｓ２．ブロク・ナトル・アカド・サイ（
Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）ＵＳ
Ａ　７９　：　５５８２）は、Ｂ、アミロリクエファ’
／　ｘ　７　ス（Ｂ、　ａｍｙｌｏｌ　１ｑｕｅ−ｆａ
ｃｉｅｎｓ　）のα−アミラーゼ遺伝子から得た転写、
翻訳および分泌信号を使用することにより、Ｂ、サブテ
ィリス（Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ）において外来性遺伝
子産物を発現および分泌させることに成功した。１１当
り大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）β−ラクタマーゼ約２０
りおよびヒトインターフェロン５００μノが、培ｅ上清
から得られた。モスバック（モスバック（Ｍｏｓｂａｃ
ｋ）等、１９８３．ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ　）３０
２：５４３）は、ラットの「プロインシュリン様」活性
をクローンし、約１０μｆ／ｌという低レベルで活性の
発現をさせた。サウングーズ（サウンダーズ（５ａｕｎ
ｄｅｒｓ　）等、１９８４．ジエー・バクテリオＢ、　
（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）　１５７　：　７１８）
は、スタフィロコッカス・アウレウ７．　（５ｔａｐｈ
ｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）のβ−ラクタマー
ゼを、Ｂ、サブティリス（Ｂ、５ｕｂ−ｔｉｌｉｓ　）
の総蛋白質の１％として発現させたと報告している。通
常Ｓ、アウレウス（Ｓ、ａｕｒｅｕｓ　）において分泌
されるβ−ラクタマーゼ蛋白質は、Ｂ。

サブティリス（Ｂ、　ｇｕｂｔｉｌｉｓ　）においては
分泌されず、細胞に結合していた。さらに、フェアウェ
ザ−（フェアウェザ−（Ｆａｉｒｗｅａｔｈｅｒ　）等
、　１９８３、インフエク・イムノ（Ｉｎｆｅｃ、Ｉｍ
ｍｕｎ、　）　４１　：　１１１２）はＢ、サブティリ
ス（Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ　）の上滑中に５．アウレ
ウス（Ｓ、　ａｕｒｅｕｓ　）のα−ヘモリジンを検出
したか、このクローンされた遺伝子は配列が決定されて
おらず、α−ヘモリジン蛋白質については殆んど知られ
ていない。

物理的および生化学的に最も広範に研究されている酵素
の１つであるスタフィロコッカスのヌクレアーゼは、ス
タフィロコッカス　アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏ
ｃｃｕｓ　ａｕｒｃｕｓ　）によって産生され、分泌さ
れる。この酵素は、近年大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）に
おいてクローンされ、発現された（ジョートル（５１１
０ｒｔｌｅ　）　、ジー７　（Ｇｅｎｅ）２２　：１８
１　）か、その発現は期待にはずれて低く、この蛋白は
、明らかに有効なプロセシングがなされなかった。ここ
に開示するように、信号ペプチドな′らびにヌクレアー
ゼＡおよびＢ暗号化領域を含むスタフィロコッカスのヌ
クレアーゼ遺伝子かバシルス・サブティリス（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ　５ｕｂｃｉｌｉｓ　）中にクローンされ、発
現され、分泌され、そして適当にプロセシングされるこ
とが示された。生化学的に活性なヌクレアーゼは比較的
高レベルで発現され、ウェスタン・プロッティングによ
る分析により、このヌクレアーゼは培地中に分泌され、
プロセシングされて低分子量蛋白質（ヌクレアーゼＡ）
となり、一方、細胞内（または細胞に結合している）物
質はプロセシングを受けず、高分子量ヌクレアーゼとし
て存在することが証明された。スタフィロコッカスのヌ
クレアーゼ遺伝子の転写、翻訳および分泌信号は、バシ
ルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　）において完壁に機能的であ
り、故にスタフィロコッカスのヌクレアーゼまたはその
他の商業的に重要なポリペプチドの発現および分泌に使
用することができる。この事は、当技術分野における著
しい進歩を示すものであり、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ　）およびその他のグラム陽性微生物に対して使用で
きる発現および分泌方法ならびにベクターの早急な必要
性を満たす助けとなる。

バシルス・サブティＩＪ　ｘ　（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５
ｕｂｔｉｌｉｓ）における遺伝子のクローンおよび生成
物の発現は、この微生物か非病原性であり、エンドトキ
シンを産生せず、かつ遺伝子産物を増殖培地中に分泌で
きるため、非常に有利である。さらに、Ｂ、サブティリ
ス（Ｂ、５ｕｂｔｉｌ　ｉｓ　）は広範に研究がなされ
ており、グラム陽性微生物の中では遺伝的研究について
の原型である。これらの重要な利点を商業的に開拓でき
るため、本発明に係る方法および発現ベクターは、特に
重要となる。

本発明の理解を助けるため、以下に用語を定義する。

組換えＤＮＡ発現ベクター：１またはそれ以上の新たな
りＮＡ上セグメント付加することのできる、またはそれ
らが既に付加されたＤＮＡ分子からなる、任意の複製す
る、または組み込まれる物質であって、プラスミドを包
含するがこれに限定されない。

形質転換：受容宿主細胞へのＤＮＡの導入。

形質転換体：形質転換を受けた受容宿主細胞。

制限フラグメント：１またはそれ以上の制限酵素の作用
によって生成した、任意の線状ＤＮＡ０転写活性化配列
：　ＤＮＡから伝令ＲＮＡ（ｍ−ＲＮＡ）への転写を指
令するＤＮＡ配列。

翻訳活性化配列二ｍ−ＲＮＡからポリペプチドへの翻訳
を指令するＤＮＡ配列であって、翻訳開始コドンをコー
ドしているヌクレオチドトリブレットを含む。

機能的ポリペプチド：回収可能な、生物学的に活性な、
全てへテロローガスもしくはホモローガスなポリペプチ
ドもしくは前駆体、ヘテロローガスポリペプチドおよび
ホモローガスポリペプチドの一部分もしくは全体からな
る、回収可能な、生物学的に活性なポリペプチド、また
は、特異的に開裂することのできる、ヘテロローガスポ
リペプチドおよび生物学的に不活性化するホモローガス
ポリペプチドからなる、回収可能な、生物学的に不活性
な融合ポリペプチド。

融合遺伝子産物：ホモローガスもしくは異なるヘテロロ
ーガスポリペプチドの一部分または全体と融合する、回
収可能な、ヘテロローガスポリペプチド。

以下の図面は、後に詳述する本発明の理解に役立つであ
ろう。

第１図ニブラスミドｐＯＷ４４０　（５，７ｋｂ　）の
制限サイト地図。

第２図ニブラスミドｐＯＷ４４８（９，５ｋｂ）の制限
サイト地図。

第３図ニブラスミドｐＯＷ３４１　（５，３ｋｂ）の制
限サイト地図。

具体的には、本発明は、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　
）において機能的ポリペプチドを発現する方法であって
、 ａ）バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　）宿主細胞中で選択
でき、かつ複製可能である組換えＤＮＡ発現ベクター（
ここで該ベクターは、 １）スタフィロコッカス・アウレウス（５ｔａｐｈｙｌ
ｏ−ｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　）ヌクレアーゼ遺伝
子の転写および翻訳活性化配列、および、 ２）機能的ポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列、 を含む）によって該宿主細胞を形質転換し、そして、 ｂ）該ポリペプチドの発現に適切な条件下で、この形質
転換された細胞を培養することからなる方法を提供する
ものである （ただし、１）機能的ポリペプチド配列と転写および翻
訳活性化配列は、直接隣接し、翻訳読み取り枠内にあっ
て該機能的ポリペプチドの発現のために配置されており
、そして、２）該機能的ポリペプチドのＮ−末端アミノ
酸かメチオニンである時、この機能的ポリペプチド配列
は、該末端アミノ酸をコードしているヌクレオチドトリ
プレットを欠く　）。

本発明は、さらに、 ａ）組換えＤＮＡ発現ベクターか、さらに信号ペプチド
暗号化配列を含み、かつ、 ｂ）形質転換された細胞を、該機能的ポリペプチドの発
現および分泌に好適な条件下で培養することからなる上
記の方法を提供するものである、（ただし、１）信号ペ
プチドのＮ−末端アミノ酸かメチオニンである時、この
信号ペプチド暗号化配列は、該アミノ酸をコードしてい
るヌクレオチドトリプレットを欠き、かつ、該信号ペプ
チド暗号化配列は、発現のために、該転写および翻訳活
性化配列の下流に、これと直接隣接して翻訳読み取り枠
内に位置しており、２）該信号ペプチド暗号化配列によ
ってコードされている信号ペプチドのＣ−末端をコード
しているヌクレオチドトリプレットは、機能的ポリペプ
チド配列の上流に、これと直接隣接して翻訳読み取り枠
内に位置しており、そして　３）この機能的ポリペプチ
ド配列は、該機能的ポリペプチドのＮ−末端アミノ酸を
コードしているヌクレオチドトリプレットを含んでいる
）。

さらに本発明は、関連する組換えＤＮＡ発現ベクターお
よび形質転換体をも提供する。

本発明方法は、スタフィロコッカスのヌクレアーゼまた
はその池の機能的ポリペプチドのいずれかを、バシルス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　）において発現および分泌させる
ことをコードしている、組換えＤＮＡ発現ベクターを組
み立てることにより、例示できる。上記のヌクレアーゼ
遺伝子は、プラスミドＰＦＯＧ３０１　（ジョートル（
５ｈｏｒｔｌｅ）　、　１９８３）のスタフィロコッカ
スヌクレアーゼ遺伝子含有〜１．４ｋｂ　Ｈｐａ　ＩＩ
　７　ラグメントを、Ｂａｍ　ｌ−Ｉ　Ｉ　７ラグメン
トに変換する様にクローンした。実際のクローニングは
、プラスミドｐＢＲ３２２および単離したプラスミドｐ
ＦＯＧ３０１のＨｐａ［フラグメントの両Ｂａｍ１−１
エサイトを１．フレナラ（Ｋｌｅｎｏｗ）酵素を使用し
て埋め、次いて、末端の揃った（平滑末端の）得られた
フラグメントをライゲーションすることによって実施し
た。全てのＡｐ　クローンを、発色板試験（ｃｈｒｏｍ
ｏｇｅｎｉｃ　ｐｌａｔｅ　ｔｅｓｔ）によって、ヌク
レアーゼの産生についてスクリーニングした。

およそ１５％が、陽性のヌクレアーゼ活性の徴候を示し
た。ヌクレアーゼ陽性のクローンから得られたプラスミ
ドは、元のＨｐａ［フラグメントと同じ大きさの、特有
のＢａｍ１−ＩＩフグラメントを含むことがわかった。

プラスミドｐＯＷ５０と命名した、このようなプラスミ
ドの１つを、Ｂａｍ１−ＩＩ消化し、得られたフラグメ
ントを、同様に消化したプラスミドＰ　ＯＷ４３０とラ
イゲーションした。プラスミドｐＯＷ４４０と命名した
得られたプラスミドは、スタフィロコッカスのヌクレア
ーゼの転写、翻訳、分泌および構造暗号化配列を含んで
いる。プラスミドｐＯＷ４４０は、ハ’／　／ｌ／　ス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　）において、機能的であり、また
スタフィロコッカスのヌクレアーゼの発現および分泌を
コードしているので、本発明方法の例示のために簡単に
使用できる。

プラスミドｐＯＷ４４０の制限す・「ト地図を、添付の
第１図に示す。

さらに本発明は、ヒトのプロインシュリンの発現および
分泌をコードしている組換えＤＮＡ発現ベクターを組み
立てることによって例示できる。

これは、プラスミドｐＯＷ３４０の〜、２９５ｋｂＢ　
ａｍ　ｌ−Ｉ　ＩフラグメントヲＢｇｌ［−消化プラス
ミドｐＯＷ６５０にライゲーションすることによって実
施した。ｐＯＷ３４１と命名した得られたプラスミドを
、次にＥｃｏＲＩ消化し、同様に消化したプラスミドｐ
ＯＷ４３０とライゲーションして、所望のプラスミドｐ
ＯＷ４４８を生成した。プラスミドｐＯＷ４４８は、翻
訳読み取り枠内で、スタフィロコッカス　アウレウス（
５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　）ヌク
レアーゼ遺伝子の転写および翻訳活性化配列ならひに信
号ペプチド暗号化配列と共有結合しているヒトインシュ
リンの構造遺伝子を含む。プラスミドｐＯＷ４４８は、
大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）およびバシルス（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ　）の両者において機能的であり、またヒトの
プロインシュリン生成物の発現および分泌をコードして
いるため、本発明方法の例示に簡単に使用できる。プラ
スミドｐＯＷ４４８およびｐＯＷ３４１の制限サイト地
図を、各々添付の第２図および第３図に示す。

本発明の例示に用いる出発物質および成るベクターは、
容易に入手でき、または既知の方法に従って組み立てる
ことかできる。例えばプラスミドｐＯＷ４４０は、ノー
ザン・ジージョナル・リサーチ・ラボラトリ−（Ｎｏｒ
ｔｈｅｒｎ　Ｒｅｇｉｏｎａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ　）　（ヘオリア、イリノイス）ニ寄
託すれ、永久ストックカルチャーコレクションの一部と
なっている菌株、バシルス・サブティリス（ＢａＣ１１
１ｕｌｌ　５ｕｂｔｌｌ　Ｉｓ　）　Ｍ　Ｉ　１１２／
　Ｐｏｗ４４　Ｑから得ることができる。この菌株は、
受理番号ＮＲＲＬＢ−１５８８７の下で、該プラスミド
の好ましい供給源および保存形態として入手できる。出
発物質プラスミドｐＯＷ３４０は、１）ＤＮＡリンカ−
配列：ＡＡ（Ｊ　　しＡＡ　　ｆｌｕ　　（Ｊｕｌ　　
ｔｙｌＬｚ　　ＡＡＬ、　　　５〔式中、Ａはデオキシ
アデニルであり、Ｇはデオキシグアニルであり、Ｃはデ
オキシシトシルであり、Ｔはチミジルである〕、２）プ
ラスミドｐＮＭ５８７．４−４０）　〜、２７　ｋｂ　
ＨｐｈＩ　−ＸｈＯＩＩ　７５グメント、および３）Ｂ
ａｍＨｉ−消化プラスミドｐｕｃＢ、をライゲーション
することによって組み立てる。

プラスミドＰＮＭ５８７．４−４は、ノーザン・ジージ
ョナル・リサーチ・ラボラトリ−（Ｎｏｒｔｈｅｒｎｌ
ｃｅｇｉｏｎａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ　）　（ペオリア。

イリノイズ）に寄託され、ストックカルチャーコレクシ
ョンの一部となっている菌株、大腸菌（Ｅ。

ｃｏｌｉ）Ｋ１２ＪＡ２２１／ＰＮＭ５８７．４−４か
ら得ることができる。これは、該プラスミドの好ましい
供給源および保存形態として、受理番号ＮＲＲＬＢ−１
５８１２の下で入手できる。プラスミドｐＵＣ８は、ベ
セスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ
　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　）　
（私書箱６００９、ガイサーズバーグ、メリーランド）
から市販品を入手できる。上のリンカ−配列は、既知の
装置、例えばアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌ
ｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）　　（フォスター・シ
ティ。

カルフォルニア）のＤＮＡ合成機３８０Ａを使用して常
法により合成することができ、または、イタｙ　−１（
Ｉｔａｋｕｒａ　）等、　１９７７　、サイエンス（Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ）１９８　：１０５６および’）　Ｌ／７
　（Ｃｒｅａ）等。

１９７８、ブロク・ナト・アカド・サイ（Ｐｒｏｃ、Ｎ
ａｔ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）ＵＳＡ７５　：５７６５の方法
に従って合成できる。

プラスミドｐＯＷ６５０出発物質は、プラスミドｐＯＷ
４４０の〜　６５ｋｂＸｈＯｎフラグメントをＢａｍ）
ｉ　Ｉ／　Ｂａｌ　■消化プラスミドｐＫＣ７にライゲ
ーションすることによって組み立てる。プラスミドｐＫ
Ｃ７は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ
ン（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌ　ｔｕｒｅ　
Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）（ロックビル、メリーランド）
から得られ、受理番号ＡＴＣＣ３７０８４の下で、制限
なく入手できる。プラスミドｐＯＷ４３０出発物質は、
バシルス（Ｂａｃｉｌ　ｌｕｓ　）−機能的な複製起源
、および、さらにバシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　）中て
の使用に好適な選択マーカーをも含む、クローニングベ
クターである。プラスミドｐＯＷ４３０は、受理番号Ｎ
ＲＲＬＢ−１５８３３の下で、前記のノーザン・ジージ
ョナル・リサーチ・ラボラトリ−（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　
Ｒｅ−ｇｉｏｎａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ　）　ニ寄託されテいる菌株であるハシレス・
サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ　）
　Ｍ　［１１２／ＰＯ〜Ｖ４３０がら得ることができる
。

例示プラスミドｐＯＷ４４８は、）＼シルス（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ　）におけるヒトプロインシュリン生成物の発
現および分泌をコードしている。分泌は、プロインシュ
リンをコードしているこのベクターが、さらにスタフィ
ロコッカス・アウレウス（５ｔａｐｈｙｌｏ−ｃｏｃｃ
ｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　）のヌクレアーゼ信号ペプチドを
もコードしているために起こる。信号ペプチドは、しば
しば新たに合成されたポリペプチドを含み、ポリペプチ
ドを細胞膜を越えて輸送する際に機能すると信じられて
いるアミノ酸の短いリーダー領域である。典型的には信
号ペプチドは、輸送中に、新たに合成されたポリペプチ
ドから開裂し、所望の機能的ポリペプチドを培地中に遊
離させる。当業者には、本発明は前記のヌクレアーゼ信
号ペプチド暗号化配列の使用に限定されず、多様な分泌
信号ペプチド配列を代わりに使用できることか理解でき
るであろう。このような分泌暗号化配列には、Ｂ、７ミ
ロリクイ７７　シー１−７７．　（Ｂ、　ａｍｙｌｏｌ
　１ｑｕｉ　−ｆａｃｉｅｎｓ　）　（７）α−アミラ
ーゼ信号ペプチド配列（パルバ（Ｐａ１ｖａ　）等、１
９８１　、ジーン（Ｇｅｎｅ）１５：４３およびパルバ
（Ｐａ１ｖａ　）等、１９８２．ブＣ１−ナト・アカド
　サイ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）ＵＳ
Ａ７９　：５５８２に開示）、Ｂ、セレウス（Ｂ。

ｃｅｒｅｕｓ　）のβ−ラクタマーゼ・タイプエ信号ペ
プチド配列（スローマ（Ｓｌｏｍａ　）およびグロス（
Ｇｒｏｓｓ）、　ｘｃ＋ｓａ、ヌクレイツク、　アシｘ
−しｘ　（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　）
　１１　：　４９９７ならびにメゼス（Ｍｅｚｅｓ　）
等、１９８３．ＦＥＢＳレト（ＦＥＢＳＬｅｔｔ、）１
６１　：１９５ｉＣ開示）、Ｂ、サブティリス（Ｂ、５
ｕｂｔｉｌｉｓ　）のレバンシュクラーゼ信号ペプチド
配列（フォレット（Ｆｏｒｒｅｔ　）等、１９８４．バ
イオケム・バイオフィズ・レス・コム（Ｂｉｏｃｈｅｍ
。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍ、　）　１１９
　：　７９５に開示）およびＢ、アミロリクエファシェ
ンス（Ｂ、ａｍｙｌｏｌ　ｉ　−ｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ
　）のサブティリシン信号ペプチド配列（ウェルズ（Ｗ
ｅｌｌｓ）等、１９８３．　ヌクレイツク・アシズ−Ｌ
／ス（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）１１　
ニア９１１に開示）か含まれるが、これらに限定される
訳ではない。上の分泌暗号化配列は、Ｓ、アウレウス（
Ｓ　、　ａｕｒｃｕｓ　）ヌクレアーゼ遺伝子の転写お
よび翻訳活性化配列に、また、機能的ポリペプチドを暗
号化する配列にも、適当にライゲーションできる。

得られた発現および分泌配列は、本発明をさらに例示す
るベクターを組み立てるために、「カセット」として使
用できる。

当業者には、スタフィロコッカス（５ｃａｐｈｙｌｏ−
ｃｏｃｃｕｓ　）ヌクレアーゼ遺伝子の転写および翻訳
活性化配列は、機能的ポリペプチドを暗号化する配列に
直接ライゲーションすることもできるということが理解
できるであろう。このような組み立てでは信号ペプチド
暗号化配列か欠けているため、適当な形質転換により、
細胞内で生成物が発現される結果となる。このような条
件の下では、機能的ポリペプチドは宿主細胞内に蓄積し
、培地中に分泌されないであろ°う。このようにして産
生された生成物は、発酵工業において広く用いられる常
套の抽出および精製技術（メンッズ・オブ・エンサイモ
ロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｅｎｙ、ｙｍｏｌｏｇ
ｙ　）　ＸＸＩＩおよびＸＸＸＩＶ　（アカデミツク・
プレス、ニューヨーク、ニューヨーク）ならびにＥＩ’
Ｏ公開番号０１１１８１４、セクション５．６）によっ
て単離することができる。加えて、陽イオンもしくは陰
イオン交換、サイジングレジン、または結合抗体（親和
）を含む標鴎的なりロマトグラフィー、または遠心分離
のごとき、その他の精製技術も使用できる。

機能的ポリペプチドを発現するがこれを分泌しない上記
ベクターは、ＡＴＧ翻訳開始信号か、３′末端における
制限酵素の認識配列内に含まれるよう、本発明に係る転
写および翻訳活性化配列を合成的に再組み立てすると、
最もうまく組み立てられる。酵素Ｎｃｏ１．　ＮｄｅＩ
、　Ｓｐｈ■およびＮ５ｉＩ（またはこれらのイソシゾ
−ｖ　−（ｉ　ｓｏｓｃｈｉｚｏｍｅｒ　）　）は、こ
のような配列を認識する。これらは市販のものを入手で
きる。次いで、このような合成的に組み立てたフラグメ
ントを、これらの酵素のうちの１個に対する唯一のサイ
トを含んでいるプラスミドベクター（例えは、ｐＢＲ３
２８およびｐＯＷ４３０は、共に唯一のＮｃｏＩサイト
を有し、がっ、それぞれ大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）お
よびＢ、サブティリス（Ｂ、ｓｕｂ口１ｉｓ）中で複製
する）中に挿入する。

上流（５）末端は別の制限酵素認識サイト（例えば１ｉ
ｃｏＲＪまたはＢａｍＨ工）に挿入される。この組換え
プラスミドによるライゲーションおよび形質転換は、唯
一のＮｃｏＩ制限サイトを再生産するであろう。次に機
能的ポリペプチドの為の暗号化配列を、ライゲーション
およびバクテリア細胞への形質転換の際にこの機能的ポ
リペプチド暗号化配列か、発現にとって適切な方向およ
び読み取り枠に配置されるよう、合成リンカ−および精
製フラグメントの結合によって組み立てる。より具体的
には、ＮｃｏＪおよびＨｐｈ　■末端を有するリンカ−
１例えは、 ５’　　ＣＡＴＧ−１′−ｒ’ｃ　　Ｇ−ＩＴ　Ａノル
ＣＣＡＡ　　ＣＡＣＴＴＧ　　Ｔ　　３’Ｉｌｌ　　Ｉ
ｌｌ　　　Ｉｌｌ　　　Ｉｌｌ　　　Ｉｌｌ　　　ｌ１
１３　　　　　ＡＡＧ　ＣＡＡ　丁ＦＣ，ＧＴＴＧＴＧ
　ＡＡＣ５’を、プラスミドＰＮＭ５８７．４−４の唯
一の〜、２７ｋｂ　ｌ−１ｐｈ　ニーＸｈｏ　ＩＩ　　
フラグメントとライゲーションし、次いて、Ｎｃｏ■お
よびＢａｍ１−１工の互い違い（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ　
）末端を認識するよう制限処理した適当なベクターと結
合することにより、ヒトプロインシュリン暗号化配列を
ベクター中に挿入することかできる。当業者は、適当な
サイトを有する、かなり多数のプラスミドベクターを選
ひ出すことができるであろう。代わりに、分泌機能を妨
害する、信号ペプチド暗号化配列内での簡単な、利用で
きる制限サイトの選択を行なうこともできる。

適切なリンカ−の挿入により、融合遺伝子産物を発現す
るための暗号化配列のライゲーションか可能となる。ス
タフィロコッカスの信号配列の始めから約３０塩基対に
位置するＮｄｅ　エサイトは、このような組み立てのた
めに簡便に使用できる。

本発明は著しく用途か広く、組換えＤＮＡ発現ベクター
中にコードされるいかなる機能的ポリペプチドの生産に
対しても適用できる。好ましい組換えＤＮＡ発現ベクタ
ーはプラスミドであるが、バクテリオファージおよびそ
の他の有用なベクターも、当業者にとっては明らかであ
ろう。さらに、特に例示したスタフィロコッカスのヌク
レアーゼおよびヒトのプロインシュリ、ン暗号化配列の
代わりに、機能的ポリペプチドを暗号化する、さまさま
な配列を使用することができる。かかる配列は、天然に
存在する配列、天然に存在しない配列、そして一部は天
然に存在し、一部は合成または天然に存在しないもので
ある配列を包含する。より詳細には、代表的な配列は、
ヒトインシュリンＡ鎖、ヒトインシュリン８鎖、非ヒト
インシュリンＡ鎖、非ヒトインンユリンＢ鎖、ヒト成長
ホルモン、非ヒト成長ホルモン、中成長ホルモン、豚成
長ホルモン、ヒトインターフェロン、非ヒトインターフ
ェロン、ウィルス性抗原、ウロキナーゼ、ヒトの組織プ
ラスミノーゲン活性化因子、インターロイキン■、イン
ターロイキンＩＩ、成長ホルモン放出因子、任意のホル
モン、任意の酵素または研究もしくは商業的価値を有す
る事実１全てのその他のポリペプチドを暗号化できる。

本発明に係る組換えＤ　Ｎ　Ａ発現ベクターおよび方法
は、その使用が単一の種または菌株に限定される訳では
ない。逆に、本ベクターおよび方法は広範に適用でき、
多くの種類の宿主細胞、とりわけバシルス（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ　）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃ
ｏｃｃｕｓ　）および大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ　）の非制
限菌株への使用に利用できる。非制限菌株は、常法およ
び当分野で周知の原理（ロモブスカヤ（Ｌｏｍｏｖｓｋ
ａｙａ）　）等、１９８０　、ミクロバイオロジカルレ
ビューズ（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃ２１　Ｒｅｖｉ
ｅｗｓ　）　４４　：２０６）の拡張によって、バシル
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　）および他の菌株から容易に選
択かつ分離できる。非制限菌株の宿主細胞は制限酵素を
欠き、したがって形質転換の際プラスミドＤＮＡを切断
または劣化しない。本発明においては、本発明に係るベ
クターのいかなる制限サイトをも切断しない制限酵素を
含有する宿主細胞も、非制限性とみなすこととする。

本発明に係る方法およびベクターを特に有用に使用でき
る、好ましいバツルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　）（７）非
制限菌株の宿主細胞は、例えは、Ｂ、サブティリス（Ｉ
ｓ　　５ｕｂｔｉｌｉｓ　）、Ｂ、サブティリス（１３
，５ｕｂｔ　ｉｌ　ｉｓ　）Ｍｌ１１２、Ｂ、サブティ
リス（Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ　）　５Ｒ２２、Ｌｌ、
スリンキニンシス（Ｂ、　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ
　）、！３．スリンギエンシス・ヴアル　イスラエリエ
ンノス（Ｂ、　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　ｖａｒ、
　１ｓｒａｅｌｉｅｎｓｉｓ　）、Ｂ。

セレウス（Ｂ、　ｃｅｒｅｕｓ　）、Ｂ、アントラシス
（Ｂ。

ａｎｔｈｒａｃｉｓ　）、１３．ピリフォルミス（Ｂ、
　ｐｉｌｉｆｏｒｍｉｓ　）、ｔｓ、トロピクス（Ｂ、
　ｔｒｏｐｉｃｕｓ　）、Ｂ、アルベイ（Ｂ。

ａｌｖｅｉ　）、１３．メガテリウム（Ｂ、　ｍｅｇａ
ｔｅｒｉｕｍ　）、Ｂ、プミＪＬ／　ス（Ｂ、ｐｕｍｉ
ｌｕｓ　）、Ｂ、リチェニフオルミス（Ｂ、　Ｉｉｃｈ
ｃｎｉｆｏｒｍｉｓ　）、Ｂ、ポリミクサ（Ｂ。

ｐｏｌ　ｙｍｙｘａ　）、Ｂ、７セラ７　ス（Ｂ、ｍａ
ｃｅｒａｎ５　）、Ｂ。

サーキュラ７　ス（Ｂ、ｃｉｒｃｕｌａｎｓ　）、Ｂ、
ステア０１ｋｒ＋チル％　７　イ／ｌ／　ス（Ｂ、　ｓ
ｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ　）、Ｂ。

コアギュラ７　ス（Ｂ、ｃｏａｇｕｌａｎｓ　）、Ｂ、
フィルムス（Ｂ、　ｆｉｒｍｕｓ　）、Ｂ、ブレビ７、
　（Ｂ、ｂｒｅｖｉｓ　）、Ｂ、スフ了エリクス（Ｂ、
　５ｐｈａｅｒｉｃｕｓ　）、Ｂ、バステウリー（Ｂ、
ｐａｓｔｅｕｒｉｉ　）、Ｂ、　７アステイデイオサｘ
　（ｒ３゜［ａｓｔｉｄｉｏｓｕｓ　）、Ｂ、ラルバエ
（Ｂ、１ａｒｖａｅ　）、８゜レンテイモルブス（Ｂ、
　Ｉｅｎｔｉｍｏｒｂｕｓ　）、１３．アピア／ｌ／　
ｙ、　（Ｂ、　ａｐｉａｒｕｓ　）、Ｂ、アミロリクイ
ファソエシス（Ｂ、ａｍｙｌｏｌ　１ｑｕｉｆａｃｉｅ
ｎｓ　）、Ｂ、ラテロスポラス（Ｂ、１ａｔｅｒｏｓｐ
ｏｒｕｓ　）、およびＢ５ボピラｘ　（Ｂ。

ｐｏｐｉｌｌａｅ　）の非制限細胞を含む。

本発明に係る方法およびベクターか有用に使用できる好
ましいスタフィロコッカス（５ｔａｐｈγ１Ｏ−ｃｏｃ
ｃｕｓ　）類の非制限菌株の宿主細胞は、例えは、Ｓ、
７’７レウス（Ｓ、ａｕｒｅｕｓ）、Ｓ、カルノサス（
Ｓ。

ｃａｒｎｏｓｕｓ　）、Ｓ、ｃビデルミディス（Ｓ、ｅ
ｐｉｄｅｒ−ｍｉｄｉｓ　）、およびＳ、サブロフイテ
イクス（Ｓ。

５ａｐｒｏｐｈｙｔ　１ｃｕｓ　）の非制限細胞を含む
。本発明は、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　）およびス
タフィロコッカス（５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　）
に使用が限られる訳ではなく、種々の大腸菌（Ｅ、　ｃ
ｏｌｉ　）宿主細胞にも使用できる。

好ましい大腸菌（Ｅ、ｃｏｌ　ｉ　）宿主細胞には、大
腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）Ｋ１２、大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ
　）Ｋ１２　ＪＡ２２］、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）Ｋ１
２１４Ｂ１０１、大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌ　ｉ）１〜１２
ｃ６００、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）Ｋ１２Ｃ６００Ｍｋ
−Ｒｋ−１大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）Ｋｌ　２Ｃ６０
０Ｍｌ（＋Ｒｋ−および大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ　）Ｋｌ
　２λ■３０８が含まれるか、これらに限定される訳で
はない。

本発明の態様は全て有用であるが、幾つかの本発明に係
る発現ベクターか好ましい。即ち、好ましいベクターは
、プラスミドｐＯＷ４４０およヒｐＯＷ４４８であり、
好ましい形質転換体はパシルス・サブティリｘ　（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌ　ｉｓ　）　Ｍｌ　１１２
７ｐ４４０、Ｂ、サブティリス（Ｂ、　５ｕｂｔｉｌ　
ｉｓ　）　Ｍｌ　ｌ　ｌ　２／′ＰＯ〜Ｖ４４８、Ｂ、
サブティリス（Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ　）ＳＲ２２／Ｐ
Ｏ〜Ｖ４４８および１３．サブティリス（Ｂ。

５ｕｂｔｉｌｉｓ　）　５Ｒ２２／ＰＯ〜■４４０であ
る。この好ましい群の中でも、プラスミドｐＯＷ４４８
および形質転換ＫＢ、サブティリス（Ｂ、　５ｕｂｊｉ
ｌｉｓ　）　５Ｒ２２／ｐＯＷ４４８が最も好ましい。

本発明に係る組換えＤＮＡ発現ベクターおよび形質転換
体は広範な用途を有し、特にバシルス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ　）中での使用のための発現手段の必要性を満たす助
けとなる。したかつて本発明は、現在大腸菌（Ｅ、ｃｏ
ｌｉ）中で生合成されているものを含む一連の重要な物
質を、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　）中で遺伝的発現
および分泌させることを可能にする。

この事は、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　）の大規桧発
酵は大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）の発酵より良く知られ、理
解されているため、極めて好都合である。事実、大腸菌
（Ｅ、ｃｏｌｉ）の商業的発酵は、今尚、多分に実験的
であり、困難を伴う。本発明は、例えばヒトインンユリ
ンＡ鎖、ヒトインシュリン１３鎖、ヒトプロインシュリ
ン、成長ホルモン等のような化合物（このうち幾つかは
現在大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）中で生合成されている）を
バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　）中で別途生産する方法
を提供することにより、この問題を克服するものである
。なぜなら本ベクターは非常に用途が広く、事実上いか
なる機能的ポリペプチドをもコードするＤＮＡ配列を提
供することかできるからである。このように、本発明は
宿主の選択における融通性を与え、また、ポリペプチド
およびその他の遺伝子産物の生合成および分泌にバシル
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　）を用いる手段を提供する。

本発明の形質転換体がポリペプチド産物を分泌する能力
は、商業上有利である。例えば、ポリペプチドの単離お
よび精製は、宿主細胞の溶菌的破壊をすることなく、発
酵の間に連続的に行なうことかできる。さらに、分泌は
、天然に存在するプロテアーゼ酵素による蛋白分解的劣
化から遺伝子産物を保護してくれる。微生物が、保護さ
れていない外来性ポリペプチドを迅速に消化する酵素を
産生ずるのは周知の事である。本発明に係る分泌方法は
、蛋白分解的劣化の起こる前に、これを受は易いポリペ
プチドを宿主細胞から排除する手段を提供することによ
って、この問題を克服する。

さらに、細胞内での蓄積に伴なう起こり得る細胞の死滅
、を含む有害な影響が、分泌により防かれるため、宿主
細胞は、生成する遺伝子産物の有毒性からも守られる。

各々プラスミドｐＯＷ４３０、ｐＯＷ４４０およびＰＮ
Ｍ５８７．４−４の供給源としてのバシルス・サブティ
リス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ　）Ｍｌ　
１１２／ｐＯＷ４３０、Ｂ、サブティリス（Ｂ、ｓｕｂ
ｔｉｌｉｓ）ＭＩｌ１２／ｐＯＷ４４０およびＥ、コリ
（Ｅ、　ｃｏＪｉ）Ｋ１２ＪＡ２２１／ｐＮＭ　５８７
．４−４は、幾つかの異なる培地のいずれかを用いて多
くの方法で培養できる。培地中に好ましい炭水化物は、
例えば、糖蜜、グルコース、デキストリンおよびグリセ
ロールを含み、窒素源は例えば大豆粉、アミノ酸混合物
、およびペプトンを含む。栄養無機塩類も添加し、これ
には、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウ
ム、リン酸、塩素、硫酸イオンなどを生成することので
きる通常の塩類が含まれる。他の微生物の成長および増
殖に必要なよう番乙必須微量元素もまた添加する。この
ような微量元素は、他の培地構成成分の添加に付随する
不純物として、通常供給される。

バシルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔ
ｉｌ　ｉｓ　）Ｍ１１１２／ｐＯＷ４３０およびＢ、サ
ブティリス（Ｂ。

ｓｕｂｔｉｌｉｓ）Ｍ１１１２／ｐＯＷ４４０は、約５
〜８．５という比較的広いｐＨ範囲の下に、約２５°〜
４５℃の温度範囲で、好気的培養条件下に増殖する。し
かしながら、最大量のプラスミドｐＯＷ４３０およびｐ
ＯＷ４４０を生成させるためには、培地のｐＨを約７で
開始し、培地温度を約３７℃に保つことか望ましい。こ
のような条件下にバシルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ　　５ｕｂｔｉｌｉｓ　）　Ｍｌ　１１２／　ｐ
ＯＷ４３０およびＢ、サブティリス（Ｂ、　５ｕｂｔｉ
ｌ　ｉｓ　）　Ｍ１１１２、／ｐＯＷ４４０を培養する
と、当分野で周知の技術によってこれらのプラスミドを
簡単に分離できる、貯蔵器としての細胞が得られる。

大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）Ｋ１２ＪＡ１１２／ｐＮＭ５８
７．４−４は、約６．５〜８という比較的広いｐＨ範囲
の下に、約２５°〜４０℃の温度範囲で、好気的培養条
件下に増殖する。培地は約ＰＨ７，２で開始し、培地の
温度を約３７℃に維持するのか望ましい。

このような条件下に大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ　）細胞を培
養すると、当分野で周知の技術によってこのプラスミド
を各々分離できる、貯蔵器としての細胞が得られる。

本発明をさらに例示し、詳説するために、以下の非限定
的実施例を供する。本発明の説明および本発明を構成す
るための実際の操作を、適当な箇所に記載する。

実施例１　バシルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｂｃｉｌｉｓ）Ｍ１１１２／Ｐｏｗ４４０の培養ク
ロラムフェニコール２０μ２／−を含有スル滅菌したペ
ナツセイ（Ｐｅｎａｓｓａｙ　）ブロス（ディフコ（Ｄ
ｉｆｃｏ））　　にバシルス・サブティリス（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓｓｕｂ【１ｌｉｓ　）Ｍｌ　ｌ　１２／ｐＯＷ
４４０　（ＮＲＲＬ　Ｂ　−１５８８７）菌株を接種し
、得られた初期培養物を激しく通気しながら３７℃で約
１２時間増殖させることにより、上記菌株の生長培養体
を調製する。

次いでこの初期培養物の約２〜５％容量を、新たな滅菌
ペナツセイ（Ｐｅｎａｓｓａｙ）ブロスに加え、培養物
が濁る（クレット・サマーソン（Ｋｌｅｔｔｓ　ｕｍｍ
ｅ　ｒ　ｓ　ｏｎ　）比色計（クレット・Ｍｆｇ、　Ｇ
ｏ、、　Ｉｎｃ。

ニューヨーク、ニューヨーク）ニフィルター＃６０を付
けて約３００〜５００クレツト（Ｋｌｅｔｔ）単位）ま
で３７°Ｃで増殖させる。全アッセイを周囲温度で実施
する以外はカトレカサス（Ｃｕａｔｒｅｃａｓａｓ）等
、　１９６７　、　Ｊ、パイオル・ケム（Ｊ　、Ｂｉｏ
ｌ　、　Ｃｈｅｍ。

）２４２：１５４１の方法と実質的に同様にして、細胞
抽出物および培地をヌクレアーゼ活性についてアッセイ
する。スタフィロコッカスのヌクレアーゼは高収量で産
生じ、細胞および培養基からも常法により単離できた。

実施例２　プラスミドｐＯＷ４４８およびバシル７、−
サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ　
）Ｍｌ　１１２／ｐＯＷ４４８の組み立て Ａ、プラスミドｐＯＷ６５０および大腸菌（Ｅ。

ｃｏｌｉ）ＪＡ２２１／ｐＯＷ６５０の組み立て１、プ
ラスミドｐＯＷ４４０の単離 ハシルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔ
ｉｌｉｓ）Ｍ１１１２／ｐＯＷ４４０細胞（実施例１で
増殖）約１０２（湿潤型ｆｆ１）を、遠心分離（１０分
間、４°Ｃ１１０，００Ｏｒｐｍ）によって収穫し、Ｔ
ＢＳ（１０ｍＭトリス（ｐＨ８）、ＩＱｍＭＮａＣ／、
１ｍＭＥＤＴＡ）約５０．／で洗浄し、最後に再度遠心
分離することにより集める。ＴＥ緩衝欣（２５％シュク
ロース含有）約２０−１引き続き水２５０μｌ中のりゾ
チーム１０岬を加える。この混合物を３７℃で約３０分
間インキュベートした後、ＲＮａｓｅ約１００単位を添
加する。得られた混合物を再び３７℃で３０分間インキ
ュベートし、５ＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）および
塩化ナトリウムに関して各々１％およびＩＭとし、この
混合物を水浴で約３時間冷却する。溶解物を遠心分離（
４℃、１９．００Ｏｒｐｍで３０分間）した後、上清を
ＴＥで３１．８ｍに調節し、次いで塩化セシウム２８．
７ｆおよびエチジウムプロミド、４＃ｌ／（ｘｏ＊／ａ
／）を添加する。

ｖＴｉｓｏ回転子（ベックマン・インストルメンツ（Ｂ
ｅｃｋｍａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　）　）にて４
９．５０　Ｏｒｐｍで１６時間遠心分離することにより
、塩化セシウム勾配を創る。プラスミドのバンドを集め
、ＶＴｉｓｏ回転子（ベックマン・インストルメンツ（
Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　）　）にて
ｓ　ｓ、ｏ　ｏ　ｏ　ｒｐｍで１６時間遠心分離し、次
に再び集め、同容量のイソアミルアルコールで色が全て
消失するまで抽出（そしてもう一度抽出する）し、希Ｔ
Ｅで透析し、エタノール沈殿し、ＴＥ４００μｌに再懸
濁する。得られたプラスミドｐＯＷ４４０ＤＮＡは、将
来ノ使用のために４℃で保存した。

２、プラスミドｐＯＷ４４０のＸｈｏｌ消化オヨヒ〜、
５５　ｋｂフグラメントの単離 水に入れたプラスミドｐＯＷ４４０約２ｏμ１（２０μ
ｙ）、ＤＴＴ（１０ｍＭジチオトレイトール）ｌμｔ、
ＢＳＡ（牛血溝７　／Ｌ／ブミ７）（１０μｙ／−７）
１１１１、水２０μ／、Ｘｈｏ［制限酵素４μ！（６単
位）および１０×反応ミックス８５μｌを、３７℃で約
１時間インキュベートする。６５℃で１ｏ分間インキュ
ベーションすることにより反応を終了させ、次いでこの
反応混合物を氷上で冷却し、フェノールオヨヒクロロホ
ルム：イソアミルアルコール（２４：１）のそれぞれで
抽出し、次にエタノール沈殿する。所望の〜、６５ｋｂ
制限フラグメントを常法によって分離し、アガロースゲ
ル電気泳動（マニアナイス（Ｍａｎｉａｔｉｓ　）等、
１９８２．モレキュラー・クローニング（Ｍｏ１ｅｃｕ
ｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）　、　コールド・スプリング
・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　
Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　）　、＝＋−ル
）’　−スプリング・ハーバ−、ニューヨーク）によす
単離する。所望の〜、５５ｋｂフラグメントを約１゜μ
ｌの水に溶解する。

※Ｘｈｏ、［制限酵素のための反応ミックスは、以下の
成分を用いて調製した。

１００ｍＭ　　　　）　　リ　ｘ　−ＨＣｔ　　（ｐＨ
８）１００　ｍＭ　　　ＭｇＣｌ２ ．１％　　　　　　　ト　リ　ト　ンＸ−１００３、プ
ラスミドｐＫＣ７（ＡＴＣＣ３７０８４）のＢａｍＨＩ
　　Ｂｇ’　ＩＩ消化 ＸｈｏｌＩ制限酵素ではな（ＢａｍＨｌおよびＢｇｌ［
制限酵素を使用する以外は実施例２Ａ−２の記載と実質
的に同様にして、所望の消化を行なう。エタノール沈殿
後、消化物を水１０１１１に溶解し、さらに精製するこ
となく使用した。

４、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）Ｋ１２ＪＡ２２１／ｐＯＷ
６５０のライゲーションおよび組み立て プラスミドｐＯＷ４４０の〜、６５　ｋｂ　ＸｈｏＩＩ
フラグメント約４μｚ（３μｐ）、プラスミドｐＫｃ７
のＢａｍＨＩ−Ｂｇｌ　■消化物２ｔｔｔ（１μｙ）、
水１ｏｔｔｔ、ＡＴＰ２μ！（１０ｍＭ）、ＤＴＴ１ｉ
ｌ！、ライゲーションミックス　２μｌおよびＴ４ＤＮ
Ａリガーゼ１μｚ（４１１位）を１６℃で約１６時間イ
ンキュベートする。６５℃で１０分間インキュベーショ
ンすることにより反応を終了させ、次いで氷上で冷却し
た後、得られた結紮混合物を、レーダーバーブ（Ｌｅｄ
ｅｒｂｕｒｇ　）およびコーエン（Ｃｏｈｅｎ　）　、
　１９７４Ｊ、ハクテリオロジ−（Ｊ　、　Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌｏｇｙ　）　１１９　：１０７２　の形質転換
方法に実質的に従って、抗生物質アンピシリン８０μｙ
／ｗを含有するＴＹ寒天（トリプト７１０　ｙ／Ｌ、酵
母エキＸ５Ｐ／Ｌ、ＮａＣｔ　５９／Ｌ、　ｐＨ７，２
、寒天１５　ｙ／Ｌ　）上で大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）Ｋ
１２ＪＡ２２１を形質転換するのに使用する。得られた
形質転換体を常法により培養し、同定し、所望の形質転
換体を、引き続きプラスミドｐＯＷ６５０の生産および
分離に用いる。

χライゲーションミックスは以下の組成で調製した。

５００ｍＭ　　　ト　リ　ｘ−ＨＣＩ　　、　　ＰＨ７
，８１００ｍＭ　ＭｇＣｒ２ Ｂ、プラスミドｐＯＷ３４０および大腸菌（Ｅ。

Ｃ０１ｉ）Ｋ１２ＪＡ２２１／ｐＯＷ３４０の組み立て
１、ＤＮＡ配列の組み立て 〔式中、Ａはデオキシアデニルであり、Ｇはデオキシグ
アニルであり、Ｃはデオキシシトシルであり、■はチミ
ジルである〕 自動化した亜リン酸トリエステル法を用いて所望のフラ
グメントを組み立てる。いかなるＤＮＡ合成機も使用で
きるか、アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌ　ｉ
ｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　）　（７オスター・シテ
ィ、カルフォルニア）のＤＮＡ合成ｆｉ３８０Ａが好ま
しい。当業者には、上の配列は、常法により、イタクラ
（Ｉｔａｋｕｒａ　）等、１９７７、＋イーｍシス（５
ｃｉｅｎｃｅ　）　１９８　：　１０５６およびフレア
（Ｃｒｅａ　）等、１９７８．ブロク・ナト・アシド・
サイ（Ｐｒｏｃ　。

Ｎａｐ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）ＵＳＡ　７５　：　５
７６５の方法に従っても合成できることか理解できるで
あろう。

さらに、特に好ましい合成方法が、シュング（Ｈｓｉｕ
ｎｇ）等、１９８３．ヌクレイツク・アシド・リサーチ
（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　）　
１１　：　３２２７およびナラング（Ｎａｒａｎｇ　）
等、１９８０．メ７ツズ・イン・エンザイモロジ−（Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏ−１ｏｇγ）６８：
９０に開示されている。所望のフラグメントを１０ｍＭ
のトリス（ｐＨ７，８）に溶解し、将来の使用のために
一２０℃で貯蔵した。

２、プラスミドＰＮＭ５８７．４−４のＨｐｈ　ｒ　−
Ｘｈ。

■消化および〜、　２７　ｋｂフグラメントの単離ａ、
プラスミドｐＮＭ５８７．４−４の単離大腸菌（Ｅ、ｃ
ｏｌｉ　）　Ｋ　１２　ＪＡ２２１／ＰＮＭ５８７．４
４（ＮＲＲＬ　Ｂ−１５８１２）を、常套の微生物学的
方法に従って、抗生物質アンピシリン１００μｆ／−を
伴うＴＹブロス（寒天を含まない外はＴＹ寒天と同一）
で培養する。１８時間インキュベーションした後、培養
物約、５ｄを１．５ｓ／のエッペンドルフ管に移し、約
１５秒間遠心分離する。他に指示がない限り、操作は全
て周囲温度で行なう。

得られた上清を、微細な先端のアスピレータ−で注意深
く除き、細胞ペレットを、リゾチーム２■／−、グルコ
ース５ＱｍＭ、ＥＤＴＡ（エチＬ／７ジアミン四酢酸）
ＩＯｍＭおよびトリＸ　−１−Ｉｃｅ　（ｐｌ−１８）
２５ｍＭを含有する、新たに調製したりゾチーム溶液約
１００μｌに）断層する。０°Ｃで３０分間インキュベ
ーションした後、アルカリ性５ＤＳ（ドデシル硫酸ナト
リウム）溶液（，２ＮＮａＯＨ１１％５ＤＳ）約２００
μｌを添加し、次いで管を穏やかに振り混ぜ、５分間０
℃に保持する。次に、３Ｍ酢酸ナトリウム（最少量の水
に酢酸ナトリウム３モルを溶解し、氷酢酸でｐＨを４．
８に調節した後、容量をＩＬとすることにより、調製す
る）約１５０μｌを加える。数秒間倒置することにより
管の内容物を穏やかに混合すると、ＤＮＡ凝塊が形成す
る。

管を６０分間Ｏ℃に保ち、次いで５分間遠心分離して殆
んど澄明な上清を得る。この上清の約、４−を第２の遠
沈管に移し、ここに冷エタノール１ｌｌＩｌを加える。

管を３０分間−２０℃に保った後、得られた沈殿を遠心
分離して集め、吸引によって上滑を除く。このＤＮＡペ
レットを１．ＩＳｆ酢酸すトリウム／　、０５　Ｍ　）
リス−ｔ−ｉＣ４（ｐＨ８）２００μｌに溶解し、２容
蚤の冷エタノールの添加により再沈殿させる。−２０℃
で１０分の後、沈殿を遠心分離によって集め、所望のプ
ラスミドｐＮＭ５８７．４−４ＤＮＡを組み立てた。

ｂ、プラスミドＰＮＭ５８７．４−４の１−１ｐｈ　１
−Ｘｈｏ　■消化および〜、２７　ｋｂフグラメントの
単離水に入れたプラスミドｐＮＭ５８７．４−４約２０
μ１（２０μ９）、ＤＴＴ２μ、、Ｂ５Ａｌμｔ　（１
０００ｔｔｙ／ｗｔｔ　）、水２０　μｚ　、　Ｈｐｈ
　Ｉ　ｂ　ヨヒＸｈｏＩＩ制限酵素各々４μ／（８単位
）ずつ、および１０×反応ミックス８５００μｌを、３
７℃で約１時間インキユヘー　トする。６５℃で１０分
間インキュベーションすることにより反応を終了させ、
次いて得られた混合物を氷上で冷却し、フェノールおよ
びクロロホルム：インアミルアルコール（２４：１）（
７）各々で抽出し、エタノール沈殿する。所望の〜、２
７　ｋｂ　Ｈｐｈ　■−Ｘｈｏ　■制限フラグメントを
常法により分離し、アクリルアミドゲル電気泳動（マニ
アテイス（Ｍａｎｉａｔｉｓ　）等、１９８２）によっ
て単離し、次いて約３０μｌの水に溶解する。

ＸＨｐｈ　■−Ｘｈｏ　’ｆｌ制限酵素用の反応ミック
スは、以下の組成で調製した： １００ｍＭ　ＫＣ／ １００ｍＭ　　）リス−ＨＣ／（ＰＨ７，５）ＩＱ　Ｑ
　ｍＭ　ＭｇＣ１２ Ｃ，プラスミドｐＵＣ８のＢａｍＨ１消化ベセスダ・リ
サーチ・ラボラトリ−（ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒ
ｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　）　（ガイサーズバーグ
、メリーランド）から市販品が入手可能なプラスミドｐ
ＵＣ３の所望の消化は、ＸｈｏｌＩ制限酵素および反応
ミックスの代わりにＢａｍＨ工制限酵素および反応ミッ
クスゞを用い、エタノール沈殿後、消化物を水１０μｌ
に溶解して、これ以上精製せずに使用すること以外は、
実施例２Ａ−２の記載と実質的に同様にして、行なった
。

×ＢａｍＨＩ制限酵素用反応ミックスは以下の組成で調
製した： ５００ｍＭ　ＮａＣｌ ３００ｍＭ　　ｌ−リス−Ｈｃｔ　（ｐＨｓ　）１００
　ｍＭ　ＭｇＣ１２ ｄ、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）Ｋ１２ＪＡ２２１／ｐＯＷ
３４０のライゲーションおよび組み立て実施例２Ｂ−１
のＤＮＡ配列約２μ！（，５μｙ）、プラスミドＰＮＭ
５８７．４−４の〜、　２７　ｋｂ　Ｈｐｈ　ニーＸｈ
ｏｌ（フラグメント３μｌ（，８μｆ）、およびｐＵＣ
１３（７）ＢａｍＨＩ消化物２μ！（１μ２）をライゲ
ーションし、実施例２人−４の記載と実質的に同様にし
て大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ　）Ｋ１２　ＪＡ２２１　　を
形質転換する。得られた形質転換体を常法により培養し
、同定し、所望の形質転換体を、引き続きプラスミドｐ
ＯＷ３４０の生成および単離に使用した。

し、プラスミドｐＯＷ３４１および大腸菌（Ｅ。

ｃｏｌｉ）Ｋ１２ＪＡ２２１／ｐＯＷ３４１の組み立て
１、プラスミドｐＯＷ６５０のＢｇｌ　■消化Ｘｈｏｌ
制限酵素および反応ミックスの代わりにＢｇｌ　ｌ［制
限酵素および反応ミックス　を使用し、かつエタノール
沈殿後、消化物を水１０μｌに溶解し、これ以上の精製
をせずに使用すること以外は実施例２Ａ−２の記載と実
質的に同様にして、所望のプラスミドｐＯＷ６５０の消
化を行なう。

＊　Ｂｇｌ　ＩＩ制限酵素用反応ミックスは以下の組成
で調製した： ５００ｍＭ　ＮａＣｚ ６０ｍＭ　トリス−ＨＣ／　（ＰＨ７，５）５　Ｑ　ｍ
Ｍ　ＭｇＣｊ２ ２、プラスミドｐＯＷ３４０の１３ａｍＨ工消化Ｘｈｏ
［制限酵素および反応ミックスではなく１３ａｍＨＩ制
限酵素および反応ミックスを使用し、エタノール沈殿後
、消化物を水１０μｌに溶解し、これ以上の精製をせず
に使用する以外は実施例２Ａ−２の記載と実質的に同様
にして、所望の消化を行なう。

３、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）Ｋ１２ＪＡ２２１／ｐＯＷ
３４１のライゲーションおよび組み立て 実施例２Ａ−４の記載と実質的に同様にして、プラスミ
ドｐ　ＯＷ６５０のＢｇｌ　ｆｌ消化物約２μ！（，８
μｙ）およびプラスミドｐＯＷ３４０のＢａｍＨＩ消化
物２μｌ（１μグ）をライゲーションし、大腸菌（Ｅ、
Ｃ０１ｉ）Ｋ１２ＪＡ！２１を形質転換する。得られた
形質転換体を常法により培養し、所望のプラスミドｐＯ
Ｗ３４１についてスクリーニングする。

ＨｐａＩ消化、引き続き８％アクリルアミドゲル中での
電気泳動、そしてフラグメントの分析により、フラグメ
ントの方向が正しいプラスミドを同定する。プラスミド
ｐＯＷ３４１の制限サイト地図を、添付の第３図に示す
。所望の大腸菌（Ｅ、（ｏｌｉ）Ｋ１２ＪＡ２２１／ｐ
ＯＷ３４１形質転換体を常法によって培養し、引き続き
プラスミドｐＯＷ３４１の生成および単離に使用した。

Ｄ、プラスミドｐＯＷ４４８および大腸菌（Ｅ。

ｃｏｌｉ）Ｋ１２ＪＡ２２１／ｐＯＷ４４８の組み立て
１、プラスミドｐＯＷ３４１のＥｃｏＲＩ消化Ｘｈｏｌ
Ｉ制限酵素および反応ミックスの代わりにＥｃｏＲ工制
限酵索および反応ミックス８を使用し、エタノール沈殿
後、消化物を水１０μｌに溶解し、これ以上精製するこ
となく使用する外は実施例２Ａ−２の記載と実質的に同
様にして、所望の組み立てを行なう。

×ＥｃｏＲＩ制限酵素用の反応ミックスは以下の組成で
調製した。

５００ｍＭ　ＮａＣｔ ５００ｍＭ　　　）　　リ　ｙ、　−ＨＣｔ　（ｐＨ８
）６０　ｍＭ　Ｍｇ　Ｃｌ２ ２、プラスミドｐＯＷ４３０のＥｃｏＲＩ消化実施例１
の記載と実質的に同様にして、バシルス・サブティリス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌ　ｉｓ　）ＭＩ　１
１２／ｐＯＷ４３０（ＮＲＲＬ　Ｂ−１５８３３）の生
長培養物からプラスミドｐＯＷ４３０を単離する。次い
で、Ｘｈｏ［制限酵素および反応ミックスの代わりにＥ
ｃｏＲＩ制限酵素および反応ミックスを使用し、エタノ
ール沈殿後、消化物を水１０μｌに溶解し、これ以上の
精製をせずに使用する以外は実施例２Ａ−２の記載と実
質的に同様にして、プラスミドｐＯＷ４３０を消化する
。

３、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）Ｋ１２ＪＡ２２１／ｐＯＷ
４４８のライゲーションおよび組み立て 実施例２Ａ−４の記載と実質的に同様にして、プラスミ
ドｐＯＷ３４１およびｐＯＷ４３０のそれぞれのＥｃｏ
ＲＩ消化物約２μｚ（１μ７）をライゲーションし、大
腸菌に１２ＪＡ２２１　　を形質転換する。

得られた形質転換体を常法により培養し、所望のプラス
ミドｐＯＷ４４８についてスクリーニングする。両フラ
グメントを持ったプラスミドを含んでいる形質転換体を
、アンピシリンおよびクロラムフェニコール耐性につい
て選択することにヨリ、同定する。所望の大腸菌（Ｅ、
　ｃｏｌｉ　）Ｋ１２ＪＡ２２１／ｐＯＷ４４８形質転
換体を常法により培養し、引き続きプラスミドｐＯＷ４
４８の生産および単離に使用する。プラスミドｐＯＷ４
４８の制限サイト地図を、添付の第２図に示す。

Ｅ、ハシルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕ
ｂｔｉｌｉｓ）Ｍｌ１１２／ｐＯＷ４４８　の組み立て
バシルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔ
ｉｌｉｓ）Ｍ１１１２は、Ｂ、サブティリス（Ｂ、　５
ｕｂＬｉｌ　ｉｓ　）Ｍ１１１２／ｐＯＷ４３０　（Ｎ
ＲＲＬ　Ｂ−１５８３３）をクロラムフェニコールの不
在下に常法で培養することにより得ることができる。Ｂ
、サブティリス（Ｂ。

ｓｕｂｔｉｌｉｓ）Ｍ１１１２／ｐＯＷ４３０細胞は；
上記の培養条件下で、自然にｐＯＷ４３０プラスミドを
失い、その結果、所望のクロラムフェニコール感受性Ｂ
、サブティリス（Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ　）ＭＩ　１
１２菌株が得られる。このプラスミドを欠（Ｂ、サブテ
ィリス（Ｂ、　５ｕｂｔｉｌ　ｉｓ　）Ｍ　１１１２細
胞のみが選択され、記載したバシルス（Ｂａｃｉｌ　Ｉ
ｕｓ　）形質転換方法に使用される。このことを試験し
、確認するために、クロラムフェニコールに対する感受
性を利用できることは、当業者には認識および理解でき
るであろう。

滅菌ＰＡＢ（ペナッセイ（Ｐｅｎａｓｓａｙ　）ブロス
）約５０−にバシルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓｓｕｂｔ山ｓ）ＭＩ１１２を接種し、細胞密度が２×
１０８細胞／−に達するまで３７℃でインキユベートス
る。次いで、この細胞を、無菌操作を用いてペレット化
し、約５ｄのＳＭＭＰ（同容量の４ｘＰＡＢ並びに１Ｍ
シュクロース１．０４Ｍマレイン酸および、０４　Ｍ　
ＭｇＣｒ２からなる溶液。ＮａＯＨでｐＨ５，５に調節
する。）に再懸濁することによって、プロトプラスト化
する。次に、リゾチーム（Ｓ？ｔｆＭ（０，５Ｍシュク
ロース１．０２Ｍマレイン酸、および、　０２　Ｍ　Ｍ
ｇ　Ｃｔ　２゜ＮａＯＨでｐＨ６，５，に調節する。）
中２０〜／ｄ）約２５０μｌを、無菌沖過を用いて加え
る。この細胞を穏やかに振とうしながら３７℃で約２時
間インキュベートする。得られたプロトプラストをペレ
ット化し、ＳＭＭＰ５−で洗浄し、次いでＳＭＭＰ５．
ｔに再ｖ！、１ｆｉ６する。遠心分離（２５℃、１２分
間、２．６０　Ｏｒｐｍ　）後、プロトプラスト約、１
ｍ＋／を、プラスミドｐＯＷ４４８　ＤＮＡおよび２Ｘ
ＳＭＭからなる１：１の混合物約２０μｌの添加により
、形質転換する。次に、ＰＥＧ溶Ｍ（ＰＥＧ６０００（
ポリエチレングリコール）４０２．２ｘＳＭＭ５０ｓｚ
、水でｌｏ〇−とする）約１．５ｄを加え、約２分後に
ＳＭＭＰ約５ｄを加える。次に、このプロトプラストを
ペレット化シ、ＳＭＭＰｌ−に懸濁し、穏やかに振とう
しつツ３０℃で約２時間インキュベートする。得られた
懸濁液の一部を、クロラムフェニコールを含有する０Ｍ
３再生培地に蒔く（１１当り以下の組成を有する： ９１９　寒天１２ｙを含有する脱イオン水５５５ｄ中の
Ｄ−マンニトール １０％　カザミノ酸５〇− １０％　酵母エキス５０．／ ２０％　グルコース２５１Ｉｅ ５％　リン酸二カリウム１０〇− １Ｍ　　ＭｇＣｔ２２０−１ １０％　ゼラチン）。

Ｄ−マンニトール、カザミノ酸および酵母エキスを、−
緒にオートクレーブにかける。ゼラチンをオートクレー
ブにかけた後、直ちに添加し、混合物の冷後に残りの成
分を加える。この培地は、最終的抗生物質クロラムフェ
ニコール濃度を１０μｙ／ｄとした。

所望のバシルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕ
ｂＬｉｌｉｓ）Ｍ１１１２／ｐＯＷ４４８菌株として、
クロラムフェニコール耐性コロニーを選択する。この菌
株を培養し、さらに、構成プラスミドとの同一性を、常
套の制限酵素およびアガロースゲル電気泳動分析（７二
７テイ７、　（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等、　１９８２）に
よって確認する。所望のバシルス・サブティリス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ　）　Ｍｌ　１１２／
ｐＯＷ４４８形質転換体は、ヒトのプロインシュリンを
発現し、かつこのプロインシュリン産物を培養基中に分
泌することか示された。細胞内および培地中の両方にヒ
トプロインシュリンが存在することを、常套のラジオイ
ムノアッセイによって確定した。

実施例３　バシルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｂｔｉｌ　ｉｓ　）　Ｓ　Ｒ２２およびＢ、サブテ
ィリｘ　（Ｂ。

５ｕｂｔｉｌｉｓ）ＳＲ２２／ｐＯＷ４４８の誘導ハシ
リス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌ
ｉｓ）ＳＲ２２は、受理番号ＮＲＲＬ　Ｂ−１５８９３
の下にノーザン・ジージョナル・リサーチ・ラボラトリ
−（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｒｅｇｉｏｎａｌ　Ｒｅ５ｅａ
ｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（ペオリア、イリノイ
ズ）に寄託され、永久ストックカルチャーコレクション
の一部となっている菌株、Ｂ、サブティリス（Ｂ、５ｕ
ｂｔｉｌｉｓ）ＳＲ２２／ｐＯＷ４４０を、クロラムフ
ェニコールの不在下で常法通り培養することによって誘
導できる。Ｂ、サブティリス（Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ
　）　５Ｒ２２／ｐＯＷ４４０細胞は、上記の培養条件
下で自然にｐＯＷ４４０プラスミドを失い、その結果、
所望のクロラムフェニコール感受性Ｂ、サブティリス（
Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ　）ＳＲ２２菌株が生成する。

クロラムフェニコールに対する感受性を使用することに
より、このプラスミドを欠（Ｂ、サブティリス（Ｂ、　
ｓｕＭｉｌ　ｉｓ　）　Ｓ　Ｒ２２細胞のみを前の記載
に従って選択し、プラスミドｐＯＷ４４８形質転換体の
産生に使用し得ることを試験し、確認することかできる
ことを当業者は認識および理解できるであろう。

【図面の簡単な説明】

第１図はプラスミドｐＯＷ４４０の制限サイト地図、第
２図はプラスミドｐＯＷ４４８の制限サイト地図、第３
図はプラスミドｐＯＷ３４１の制限サイト地図のそれぞ
れ模式図である。 特許出願人　　イーライ・リジー・アンド・カンノぐニ
ー 代　理　人　弁理士青白　葆（外１名）ＦＩＧ、Ｉ ＥｃｏＲＩ ＦＩＧ、２

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、バシルスにおいて機能的ポリペプチドを発現する方
   法であって、 ａ）バシルス宿主細胞中で選択でき、かつ複製可能であ
   る組換えＤＮＡ発現ベクター（ここで該ベクターは、 １）スタフィロコッカス・アウレウスのヌクレアーゼ遺
   伝子の転写および翻訳活性化配列、および、 ２）機能的ポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列、 を含んでいる）によって該宿主細胞を形質転換し、そし
   て、 ｂ）該ポリペプチドの発現に適切な条件下で、この形質
   転換された細胞を培養することからなる方法 （ただし、１）機能的ポリペプチド配列と転写および翻
   訳活性化配列は、直接隣接し、翻訳読み取り枠内にあっ
   て該機能的ポリペプチドを発現する様に配置されており
   、そして、２）機能的ポリペプチドのＮ−末端アミノ酸
   がメチオニンである時、この機能的ポリペプチド配列は
   、該末端アミノ酸をコードしているヌクレオチドトリプ
   レットを欠く）。 ２、ａ）組換えＤＮＡ発現ベクターが、さらに信号ペプ
   チド暗号化配列を含んでおり、かつ、ｂ）形質転換され
   た細胞を、該機能的ポリペプチドの発現および分泌に好
   適な条件下で培養することからなる第１項に記載の方法 （ただし、１）コードされている信号ペプチドのＮ−末
   端アミノ酸がメチオニンである時、この信号ペプチド暗
   号化配列は、該アミノ酸をコードしているヌクレオチド
   トリプレットを欠き、かつ、信号ペプチド暗号化配列は
   、発現のために、該転写および翻訳活性化配列の下流に
   、これと直接隣接して翻訳読み取り枠内に位置しており
   、２）該信号ペプチド暗号化配列によりコードされてい
   る信号ペプチドのＣ−末端をコードしているヌクレオチ
   ドトリプレットは、機能的ポリペプチド配列の上流にこ
   れと直接隣接して翻訳読み取り枠内に位置しており、そ
   して３）機能的ポリペプチド配列は、該機能的ポリペプ
   チドのＮ−末端アミノ酸をコードしているヌクレオチド
   トリプレットを含む）。 ３、機能的ポリペプチド配列が、ヒトのプロインシュリ
   ン、ヒトのインシュリンＡ鎖、ヒトのインシュリンＢ鎖
   、ヒトのプレープロインシュリン、ヒトの成長ホルモン
   、牛成長ホルモン、豚成長ホルモン、成長ホルモン放出
   因子、インターフェロン、インターロイキンII、酵素、
   またはホルモンをコードしている、第１項または第２項
   のいずれかに記載の方法。 ４、機能的ポリペプチド配列がヒトのプロインシュリン
   のものである第３項記載の方法。 ５、第１項または第２項記載の方法に使用する組換えＤ
   ＮＡ発現ベクター。 ６、プラスミドである、第５項記載の組換えＤＮＡ発現
   ベクター。 ７、機能的ポリペプチド配列が、ヒトの成長ホルモン、
   ヒトのインシュリン、ヒトのインシュリンＡ鎖、ヒトの
   インシュリンＢ鎖、ヒトのプレープロインシュリン、ヒ
   トのプロインシュリン、牛成長ホルモン、豚成長ホルモ
   ン、インターフェロン、成長ホルモン放出因子、インタ
   ーロイキンII、酵素またはホルモンをコードしている、
   第１項または第２項記載の方法に使用するための組換え
   ＤＮＡ発現ベクター。 ８、機能的ポリペプチド配列がヒトのプロインシュリン
   をコードしている、第７項記載の組換えＤＮＡ発現ベク
   ター。 ９、プラスミドｐＯＷ４４０またはプラスミドｐＯＷ４
   ４８。 １０、プラスミドｐＯＷ４３０、プラスミドｐＯＷ６５
   ０、プラスミドｐＯＷ５０、プラスミドｐＯＷ３４０、
   プラスミドｐＯＷ３４１、またはプラスミドｐＯＷ６５
   ０。 １１、第５項〜第１０項のいずれか１項に記載のＤＮＡ
   発現ベクターを含む、第１項または第２項記載の方法に
   使用するための形質転換された宿主細胞。 １２、第５項〜第１０項のいずれか１項に記載のＤＮＡ
   発現ベクターにより形質転換された宿主細胞。 １３、バシルスまたは大腸菌である、第１２項記載の宿
   主細胞。 １４、バシルス・サブテイリスである、第１３項記載の
   宿主細胞。 １５、第１０項記載のプラスミドにより形質転換された
   大腸菌宿主細胞。 １６、バシルス・サブテイリスＭＩ１１２／ｐＯＷ４４
   ０、バシルス・サブテイリス・バシルス・サブテイリス
   ＳＲ２２／ｐＯＷ４４８、バシルス・サブテイリスＭＩ
   １１２／ｐＯＷ４４８、バシルス・サブテイリスＳＲ２
   ２／ｐＯＷ４４０、大腸菌Ｋ１２ＪＡ２２１／ｐＯＷ４
   ４８、大腸菌Ｋ１２ＪＡ２２１／ｐＯＷ３４１、大腸菌
   Ｋ１２ＪＡ２２１／ｐＯＷ３４０、大腸菌Ｋ１２ＪＡ２
   ２１／ｐＯＷ６５０、またはバシルス・サブテイリスＭ
   Ｉ１１２／ｐＯＷ４３０。