JPS59203497A - 組換えｄｎａ発現ベクタ− - Google Patents
組換えｄｎａ発現ベクタ−Info
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- JPS59203497A JPS59203497A JP59005510A JP551084A JPS59203497A JP S59203497 A JPS59203497 A JP S59203497A JP 59005510 A JP59005510 A JP 59005510A JP 551084 A JP551084 A JP 551084A JP S59203497 A JPS59203497 A JP S59203497A
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- JP
- Japan
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- vector
- bacillus
- paragraph
- plasmids
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/76—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Actinomyces; for Streptomyces
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ
（枯草菌）のｖｅｇプロモーターおよび機能的ポリペプ
チドを暗号化している遺伝子の両者に結合しているＢａ
ｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓリポソ一ム結合サイト
暗号化ＤＮＡフラグメントを含有している組換え１）Ｎ
Ａ発現ベクターに関する。本発明はまた、上記ベクター
の形質転換体、およびＢａｃｉｌｌｕｓ中で生産され増
殖培地中に分泌される機能的ポリペプチドの製造法に関
するものである。
（枯草菌）のｖｅｇプロモーターおよび機能的ポリペプ
チドを暗号化している遺伝子の両者に結合しているＢａ
ｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓリポソ一ム結合サイト
暗号化ＤＮＡフラグメントを含有している組換え１）Ｎ
Ａ発現ベクターに関する。本発明はまた、上記ベクター
の形質転換体、およびＢａｃｉｌｌｕｓ中で生産され増
殖培地中に分泌される機能的ポリペプチドの製造法に関
するものである。
本発明により提供される発現ベクターはＢａｃｉｌ Ｉ
ｕｓおよびその他の宿主細胞に使用されるものである。
ｕｓおよびその他の宿主細胞に使用されるものである。
これまでＢａｃｉｌｌｕｓにおける組換えＤＮＡ技術の
開発と発展は遅れており、それは、一般に好適なりロー
ニングベクターおよび発現ベクターが欠乏していること
から特に困難であった。この発現ベクターの不足は、Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ における外来性の転写および翻訳開始
信号に対する認識の欠乏がその理由の１つであるとされ
ている。従って、よく知られているｔｒｐ （Ｈａｌｌ
ｅｗｅｌｌ 、 Ｒ，Ａ、およびＳ、 Ｉｉｍｔａｇｅ
、 ｌ ９８０ 、 Ｇｅｎｅ ９： ２７ ）、Ｉａ
ｃ （Ｇｕａｒａｎ（ｅ 、 Ｌ、ら、１９８０ 、
Ｃｅ１ｌ ２０ ： ５４３およびＲｏｂｅｒｔｓ
、 Ｔ、 Ｍ、ら、１９７９ 、 Ｐｒｏｃ。
開発と発展は遅れており、それは、一般に好適なりロー
ニングベクターおよび発現ベクターが欠乏していること
から特に困難であった。この発現ベクターの不足は、Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ における外来性の転写および翻訳開始
信号に対する認識の欠乏がその理由の１つであるとされ
ている。従って、よく知られているｔｒｐ （Ｈａｌｌ
ｅｗｅｌｌ 、 Ｒ，Ａ、およびＳ、 Ｉｉｍｔａｇｅ
、 ｌ ９８０ 、 Ｇｅｎｅ ９： ２７ ）、Ｉａ
ｃ （Ｇｕａｒａｎ（ｅ 、 Ｌ、ら、１９８０ 、
Ｃｅ１ｌ ２０ ： ５４３およびＲｏｂｅｒｔｓ
、 Ｔ、 Ｍ、ら、１９７９ 、 Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＩＪＳＡ ７６ ：
５５９６ ）、Ｉｐｐ （Ｌｅｅ、Ｎ、ら、１ ｇ
Ｂ １ 、 ） 、 ｏｆ １３ａｃｔｅｒｉ
ｏｌ。
５５９６ ）、Ｉｐｐ （Ｌｅｅ、Ｎ、ら、１ ｇ
Ｂ １ 、 ） 、 ｏｆ １３ａｃｔｅｒｉ
ｏｌ。
１４６： ８６１ ： Ｚｗｉｅｂｃｌ、Ｌ、Ｊ、ら
、 １９８１ 。
、 １９８１ 。
Ｊ、ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 １４５ ： ６５４
およびＮａｔａｍｕｒａ 、 Ｋ、およびＭ、 Ｉ
ｎｏｕｙｃ、 １９７９ 。
およびＮａｔａｍｕｒａ 、 Ｋ、およびＭ、 Ｉ
ｎｏｕｙｃ、 １９７９ 。
ＣｃＱｌ１３°１１０９ ） およびバタテリオファ
ージλＰ Ｌ （１）ｅｒｏｍ、 Ｃ，ら、１９８２
、 Ｇｅｎｅ １７：４５：Ｒｅｍａｕｔ 、Ｅ、ら、
１９８１ 、Ｇｅｎｅ １５（１）：８１ お
よびＢｅｒｎａ ｒｄ 、 Ｉ−１，ら、 １９７９
、 Ｇｅｎｅ ５ ： ５９ ）転写および翻訳−指
令プロモーター系はＢａｃｉｌｌｕｓでは機能しない。
ージλＰ Ｌ （１）ｅｒｏｍ、 Ｃ，ら、１９８２
、 Ｇｅｎｅ １７：４５：Ｒｅｍａｕｔ 、Ｅ、ら、
１９８１ 、Ｇｅｎｅ １５（１）：８１ お
よびＢｅｒｎａ ｒｄ 、 Ｉ−１，ら、 １９７９
、 Ｇｅｎｅ ５ ： ５９ ）転写および翻訳−指
令プロモーター系はＢａｃｉｌｌｕｓでは機能しない。
従って、５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ （ブドウ球
菌）および５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ （連鎖状球菌
）の様なダラム陽性菌からの少数の薬剤耐性遺伝子の例
外を除いて、Ｂａｃｉｌｌｕｓ で発現された外来性
遺伝子はほとんどなく、真核性遺伝子は実際上客に等し
い。
菌）および５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ （連鎖状球菌
）の様なダラム陽性菌からの少数の薬剤耐性遺伝子の例
外を除いて、Ｂａｃｉｌｌｕｓ で発現された外来性
遺伝子はほとんどなく、真核性遺伝子は実際上客に等し
い。
Ｂａｃｉｌｌｕｓは外来性の転写信号および翻訳信号を
認識する能力が極めて低いため、遺伝子発現を指令する
内性信号の開発が必要とされている。初期になされた幾
つかのクローニングの試みとしては、Ｂ、５ｕｂｉｌｉ
ｓ中へのＢ 、 Ｉ １ｃｌｌｅｎ ｉ ［ｏｒｍｉ
ｓのβ−ラクタマーゼ遺伝子のクローニングおよび発現
〔欧州特許公開第００３６２５９号（出願番号第８１３
００８５８．８号）明細書に開示〕並ひにＢ、ｓｔｅａ
ｒｏｔｂｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓおよびＢ。
認識する能力が極めて低いため、遺伝子発現を指令する
内性信号の開発が必要とされている。初期になされた幾
つかのクローニングの試みとしては、Ｂ、５ｕｂｉｌｉ
ｓ中へのＢ 、 Ｉ １ｃｌｌｅｎ ｉ ［ｏｒｍｉ
ｓのβ−ラクタマーゼ遺伝子のクローニングおよび発現
〔欧州特許公開第００３６２５９号（出願番号第８１３
００８５８．８号）明細書に開示〕並ひにＢ、ｓｔｅａ
ｒｏｔｂｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓおよびＢ。
ａｍｙｉθ１ｉｑｕｅＥａｃｉｅｎｓの １−アミラー
ゼ遺伝子のクローニングおよび発現〔それぞれ欧州特許
公開第００５７９７６号（出願番号第８２３００１５８
１号）明細書、およびＤｅｒｗｅｎｔ Ａｂｓｔｒａｃ
ｔ 第３７３２３１ζ／１９号（ヘルギー国特許出願
第Ｂ１“：８９１−６５９号）に開示〕が挙けられる。
ゼ遺伝子のクローニングおよび発現〔それぞれ欧州特許
公開第００５７９７６号（出願番号第８２３００１５８
１号）明細書、およびＤｅｒｗｅｎｔ Ａｂｓｔｒａｃ
ｔ 第３７３２３１ζ／１９号（ヘルギー国特許出願
第Ｂ１“：８９１−６５９号）に開示〕が挙けられる。
さらに、Ｖｅｇプロモーターおよび翻訳信号（Ｂ。
５ｕｌ）ｔｉｌｉｓにとって内性のもの。Ｍｏｒａｎ
Ｊｒ、。
Ｊｒ、。
Ｃ，Ｉ）、等、 １ ｇ ８２ 、Ｍｏｌ、Ｇｅｎ、
Ｇｃｎｅｔ、 １８６：３３９）もまた分離されており
、これらは本発明の目的のために有用な出発物質である
。従って、事実」二あらゆるポリペプチドのＢａｃｉｌ
ｌｕｓ中での発現を指令するのに使用し得る様に、前述
のｖｃｇプロモーターおよび翻訳信号を含む配列を修飾
し、遺伝子手術を行なった。これは、当技術分野におけ
る著しい進歩を示すものであり、かつダラム陽性菌に使
用できる発現ベクターの必要性を満たす助けとなるもの
である。
Ｇｃｎｅｔ、 １８６：３３９）もまた分離されており
、これらは本発明の目的のために有用な出発物質である
。従って、事実」二あらゆるポリペプチドのＢａｃｉｌ
ｌｕｓ中での発現を指令するのに使用し得る様に、前述
のｖｃｇプロモーターおよび翻訳信号を含む配列を修飾
し、遺伝子手術を行なった。これは、当技術分野におけ
る著しい進歩を示すものであり、かつダラム陽性菌に使
用できる発現ベクターの必要性を満たす助けとなるもの
である。
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ は非病原性で
あり、細胞内毒素を生産せず、また遺伝子生産物を増殖
培地中・＼分泌し得ることから、この微生物における遺
伝子クローニングおよび生産物の発現は、非常に有利で
ある。加えて、Ｂ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ は広範囲に
研究されており、ダラム陽性閑の遺伝的研究の原型をな
すものである。本発明に係る小さく多方面に渡り利用可
能な発現ベクターは、上記の有利性を商業的方面に発展
させられるため、特に重要となる。
あり、細胞内毒素を生産せず、また遺伝子生産物を増殖
培地中・＼分泌し得ることから、この微生物における遺
伝子クローニングおよび生産物の発現は、非常に有利で
ある。加えて、Ｂ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ は広範囲に
研究されており、ダラム陽性閑の遺伝的研究の原型をな
すものである。本発明に係る小さく多方面に渡り利用可
能な発現ベクターは、上記の有利性を商業的方面に発展
させられるため、特に重要となる。
ここに開示する本発明の１］的に沿って、以ｌに用語を
定義する。
定義する。
組換えＤＮＡ発現ベクター：１またはそれ以」−のＩ）
Ｎ Ａセグメントを加えることか可能な、または加え
た、ＤＮＡ分子からなる自律的複製媒体のすべてをさし
、プラスミドを含むが、これに駆足される訳ではない。
Ｎ Ａセグメントを加えることか可能な、または加え
た、ＤＮＡ分子からなる自律的複製媒体のすべてをさし
、プラスミドを含むが、これに駆足される訳ではない。
形質転換：、Ｄ 、Ｎ Ａを宿主受容細胞中に導入して
遺伝型を変、化させその結果該受容細胞を変化させるこ
と。
遺伝型を変、化させその結果該受容細胞を変化させるこ
と。
形質転操体：形質転換を受けた宿主受容細胞。
制限フラグメント：１またはそれ以−Ｌの制限酵素の作
用により生成したプラスミドまたは染色体ＤＮＡの線状
の一部分またはその全体。
用により生成したプラスミドまたは染色体ＤＮＡの線状
の一部分またはその全体。
機能的ポリペプチド：全体がへテロローガス（異質）な
、回収可能なかつ生物学的に活性なポリペプチドまたは
前駆体、ヘテロローガスなポリペプチド計た七−４Ｇ−
一−−Ｍ −ツユゎ≠井およびホモローカス（同質
）なポリペプチドの一部または全体からなる回収可能な
かつ生物学的に活性なポリペプチド、もしくはヘテロロ
ーガスなポリペプチドと生物学的に不活性なホモローガ
スなポリペプチドとからなる回収可能ながっ生物学的に
不活性な融合ポリペプチドであって、特異的に開裂可能
なもの。
、回収可能なかつ生物学的に活性なポリペプチドまたは
前駆体、ヘテロローガスなポリペプチド計た七−４Ｇ−
一−−Ｍ −ツユゎ≠井およびホモローカス（同質
）なポリペプチドの一部または全体からなる回収可能な
かつ生物学的に活性なポリペプチド、もしくはヘテロロ
ーガスなポリペプチドと生物学的に不活性なホモローガ
スなポリペプチドとからなる回収可能ながっ生物学的に
不活性な融合ポリペプチドであって、特異的に開裂可能
なもの。
融合遺伝子生産物・ホモローガスなポリペプチドの一部
または全体と融合した回収可能なヘテロローカスなポリ
ペプチド。
または全体と融合した回収可能なヘテロローカスなポリ
ペプチド。
挿入異性体＝Ｉ）ＮＡフラグメントが受容ＤＮＡの２ま
たはそれ以上の適合サイトのうちの１が所に挿入された
際に形成される可能性のある２またはそれ以」−の組換
えＩ） Ｎ Ａのうちの１個。
たはそれ以上の適合サイトのうちの１が所に挿入された
際に形成される可能性のある２またはそれ以」−の組換
えＩ） Ｎ Ａのうちの１個。
本発明は組換えＤＮＡ発現ベクターを調製する方法を提
供するものであり、その方法は、■）式： 〔式中、Ａはデオキシアデニル、Ｇはデオキシグアニル
、Ｃはデオキシシトシノペ］゛はチミジル、ｋはＧまた
はＣ，Ｒ１はＧまたはＣを表わす〕で示されるリポソー
ム結合サイト含有ＤＮＡ配列、２） Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓのＶｅｇプロモーター、および ３）機能的ポリペプチドを暗号化している遺伝子、をラ
イゲーションすることからなる（ただし艮およびＲ１は
同時に同じデオキシリボヌクレオチドであることはなく
、該ベクターは選択可能であり、該プロモーターおよび
該ＤＮＡ配列は該ベクターにより形質転換された宿主細
胞中で該遺伝子の転写および発現を指令することを条件
とする）。
供するものであり、その方法は、■）式： 〔式中、Ａはデオキシアデニル、Ｇはデオキシグアニル
、Ｃはデオキシシトシノペ］゛はチミジル、ｋはＧまた
はＣ，Ｒ１はＧまたはＣを表わす〕で示されるリポソー
ム結合サイト含有ＤＮＡ配列、２） Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓのＶｅｇプロモーター、および ３）機能的ポリペプチドを暗号化している遺伝子、をラ
イゲーションすることからなる（ただし艮およびＲ１は
同時に同じデオキシリボヌクレオチドであることはなく
、該ベクターは選択可能であり、該プロモーターおよび
該ＤＮＡ配列は該ベクターにより形質転換された宿主細
胞中で該遺伝子の転写および発現を指令することを条件
とする）。
さらに本発明は、上記ベクターの形質転換体、およびＢ
ａｃＩ１１ｕｓ中で生産−され培養培地中へ分泌される
機能的ポリペプチドを生産する方法を提供するものであ
る。
ａｃＩ１１ｕｓ中で生産−され培養培地中へ分泌される
機能的ポリペプチドを生産する方法を提供するものであ
る。
ｖｅｇプロモーターおよび遺伝子をライゲーションする
リポソーム結合サイト含有１） Ｎ Ａ配列は、ＩＬａ
ｋｕｒａ等、１９７７．５ｃｉｅｎｃｅ １．９８ ：
１０５６およびＣｒｅａ等、１９７８、Ｉ）ｒｏｃ
、 Ｎａｔ。
リポソーム結合サイト含有１） Ｎ Ａ配列は、ＩＬａ
ｋｕｒａ等、１９７７．５ｃｉｅｎｃｅ １．９８ ：
１０５６およびＣｒｅａ等、１９７８、Ｉ）ｒｏｃ
、 Ｎａｔ。
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ ７５ ： ５７６５に
記載の方法と実質的に同様にして、完全に保護したトリ
チオ片シリポヌクレオチド構築ブロックを用いて、改良
ホスホトリエステル法（こより、常法通り合成できる。
記載の方法と実質的に同様にして、完全に保護したトリ
チオ片シリポヌクレオチド構築ブロックを用いて、改良
ホスホトリエステル法（こより、常法通り合成できる。
ｖｅｇプロモーターは、直接合成によっても、才だプラ
スミドｐＭｓ４８０のＩミＣ０ＲＩ −５ｆａＮＩ消化
によっても得られる。得られた〜、３３ ｋｂＥｃｏＲ
ｌ −５ｆａＮＩ ７ラグメントは、ｖｃｇプロモータ
ーと共に、暗号鎖の５′末端に伺加的なデオキシリボヌ
クレオチドを含んでいる（ｌｉｃｏＲｌの粘ｚ１゛末端
に隣接している）。プラスミドｐＭｓ４８０は〜４，８
ｋｂてあり、ＮｏｒｔｈｅｒｎＲｃｇｉｏｎａｌ
Ｒｃｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （Ｐ
ｅｏｒｉａ。
スミドｐＭｓ４８０のＩミＣ０ＲＩ −５ｆａＮＩ消化
によっても得られる。得られた〜、３３ ｋｂＥｃｏＲ
ｌ −５ｆａＮＩ ７ラグメントは、ｖｃｇプロモータ
ーと共に、暗号鎖の５′末端に伺加的なデオキシリボヌ
クレオチドを含んでいる（ｌｉｃｏＲｌの粘ｚ１゛末端
に隣接している）。プラスミドｐＭｓ４８０は〜４，８
ｋｂてあり、ＮｏｒｔｈｅｒｎＲｃｇｉｏｎａｌ
Ｒｃｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （Ｐ
ｅｏｒｉａ。
１１１ｉｎｏｉｓ在）に寄託され、永久ストックカルチ
ート−コレクションの一部となっている菌株であるＩ・
７． Ｃ（＋１ ｉ Ｋ１２ ＪＡ２２１ ／ ｐＭ
Ｓ ４８０から常法により分離できる。この菌株は、プ
ラスミドｐｌＶ１ｓ４８０の好ましい供給源および保管
源として、受理番号ＮＲＲＬ Ｂ−１５２５８の下に誰
でも利用可能である。
ート−コレクションの一部となっている菌株であるＩ・
７． Ｃ（＋１ ｉ Ｋ１２ ＪＡ２２１ ／ ｐＭ
Ｓ ４８０から常法により分離できる。この菌株は、プ
ラスミドｐｌＶ１ｓ４８０の好ましい供給源および保管
源として、受理番号ＮＲＲＬ Ｂ−１５２５８の下に誰
でも利用可能である。
組み立ての簡便および便宜のためｖｅｇ プロモーター
はプラスミドＰＭ５４．８０の１″：ｃｏＲＩ −８［
ａＮＩ 消化により得た。次いで得られたフラグメン
トを、５ｆａＮ１およびＮｃｏ Ｉ 粘着末端を有す
るよう設計された配列を持った前述のリポソーム結合サ
イト含有１） Ｎ Ａ配列にライゲーションした。この
配列は、Ｎｃｏ Ｉ 制限化遺伝子およびＭ述の〜、
３３ｋｂ Ｅ ｃｏ Ｒ１−３ｆａＮＩ ｖｃｇ７’。
はプラスミドＰＭ５４．８０の１″：ｃｏＲＩ −８［
ａＮＩ 消化により得た。次いで得られたフラグメン
トを、５ｆａＮ１およびＮｃｏ Ｉ 粘着末端を有す
るよう設計された配列を持った前述のリポソーム結合サ
イト含有１） Ｎ Ａ配列にライゲーションした。この
配列は、Ｎｃｏ Ｉ 制限化遺伝子およびＭ述の〜、
３３ｋｂ Ｅ ｃｏ Ｒ１−３ｆａＮＩ ｖｃｇ７’。
モーター含有フラグメントの両者と同時にライゲーショ
ンすることにより、ポリペプチドを直接発現するように
なる。Ｎｃｏｌ 粘着末端のライゲーションによりＮ
ｃｏ ｌ 制限化遺伝子のΔ′Ｉ″Ｇ翻訳開始トリプレ
ットが回復されるので、直接発現か可能となる。従って
、上詰合成配列は、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓ−ｕｂｔｉｌｉ
ｓのｖｅｇ プロモーターの支配下において、機能的
ポリペプチドを暗号化している遺伝子を不遍的に直接発
現せしめるのに有用である。
ンすることにより、ポリペプチドを直接発現するように
なる。Ｎｃｏｌ 粘着末端のライゲーションによりＮ
ｃｏ ｌ 制限化遺伝子のΔ′Ｉ″Ｇ翻訳開始トリプレ
ットが回復されるので、直接発現か可能となる。従って
、上詰合成配列は、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓ−ｕｂｔｉｌｉ
ｓのｖｅｇ プロモーターの支配下において、機能的
ポリペプチドを暗号化している遺伝子を不遍的に直接発
現せしめるのに有用である。
好ましいのは、翻訳開始点にＮｃｏ ｌ サイトを几
来有している遺伝子であるか、このようなサイトを欠く
遺伝子も使用することかできる。後者の場合、その遺伝
子を制限酵素で開裂させ、次いで所望のＮｃｏ Ｉ粘着
末端を含むよう人工的に再組み立てずれはよイ（Ｉｔａ
ｋｕｒａ等、１９７７ およ０：Ｃｒｅａ等、１．９７
８）。別法として、組み立ての簡便さおよび容易さによ
っては修飾遺伝子を全合成してもよい。どちらの場合に
おいても、修飾された遺伝子は前述のリポソーム結合サ
イト含有配列のＮ（：ＯＩ 粘６末端にライゲーション
することかできるため、Ａ Ｔ Ｇメチオニン−暗号化
開始トリプレット 物か直接発現＝Ｔ能となる。本発明に係る１３ａｃｉｌ
ｌｕｓのプロモーター含有発現ベクターは、顕著な技術
的進歩を示すものである。該ベクターはＢａｃｉｌｌｕ
ｓに不遍的に採用でき、ホモローガスなりａｃｉｌｌｕ
ｓプロモーターの支配下において、いかなるポリペプチ
ド暗号化遺伝子の発現にも使用できる。
来有している遺伝子であるか、このようなサイトを欠く
遺伝子も使用することかできる。後者の場合、その遺伝
子を制限酵素で開裂させ、次いで所望のＮｃｏ Ｉ粘着
末端を含むよう人工的に再組み立てずれはよイ（Ｉｔａ
ｋｕｒａ等、１９７７ およ０：Ｃｒｅａ等、１．９７
８）。別法として、組み立ての簡便さおよび容易さによ
っては修飾遺伝子を全合成してもよい。どちらの場合に
おいても、修飾された遺伝子は前述のリポソーム結合サ
イト含有配列のＮ（：ＯＩ 粘６末端にライゲーション
することかできるため、Ａ Ｔ Ｇメチオニン−暗号化
開始トリプレット 物か直接発現＝Ｔ能となる。本発明に係る１３ａｃｉｌ
ｌｕｓのプロモーター含有発現ベクターは、顕著な技術
的進歩を示すものである。該ベクターはＢａｃｉｌｌｕ
ｓに不遍的に採用でき、ホモローガスなりａｃｉｌｌｕ
ｓプロモーターの支配下において、いかなるポリペプチ
ド暗号化遺伝子の発現にも使用できる。
本発明を例示する発現ベクターは、プラスミドｐＭ．ｓ
４８０ （７） 〜，３３ ｋｂ ＥｃｏＲＩ −
ＳｆａＮＩフラグメント、プレプロインンユリンプラス
ミドＰｏｗ６０１の〜４ ｋｂ Ｉｉｃｏ Ｒ１ −Ｎ
ＣＯ Ｉ フラグメント、および前述のリポソーム結
合サイト含有ＤＮＡ配列をライゲーションすることによ
り組み立てられた。得られたプラスミド（ ｐＯＷｌｏ
と命名）はＩ’：、ｃｏｌｉ中で機能的であり、Ｖｅ
ｇプロモーターを持った、翻訳読み取り相に機能的ポリ
ペプチド暗号化遺伝子を含んでいる。プラスミド１）
Ｏ Ｗ １ ０は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ中で機１能的な例
示発現ベクターを組み立てるのに特に有用である。プラ
スミドＰＯＷ１ｏを組み立てるのに出発物質として使用
するプラスミド１）Ｏ Ｗ ６ ０ １は〜４，４ｋｔ
〕であり、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｃｇｉｏｎａｌ Ｒ
ｃｓｃａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｙ （ Ｐｅｏｒｉ
ａ 、 Ｉ Ｉ Ｉ ｉｎｏｉ ｓ在）に寄託され、永
久ストックカルチャーコレクションの一部となっている
菌株Ｅ 、 ｃｏｌ ｉ Ｋ １ ２ ＪＡ ２２ １
／Ｉ）ＯＷ６０１から、常法により分離できる。この
菌株は、」−記プラスミドの好ましい供給源および保管
源として、受理番号ＮＲＲＬ Ｂ−１５２５９ の
下にｉｆｆ−ても利用可能である。
４８０ （７） 〜，３３ ｋｂ ＥｃｏＲＩ −
ＳｆａＮＩフラグメント、プレプロインンユリンプラス
ミドＰｏｗ６０１の〜４ ｋｂ Ｉｉｃｏ Ｒ１ −Ｎ
ＣＯ Ｉ フラグメント、および前述のリポソーム結
合サイト含有ＤＮＡ配列をライゲーションすることによ
り組み立てられた。得られたプラスミド（ ｐＯＷｌｏ
と命名）はＩ’：、ｃｏｌｉ中で機能的であり、Ｖｅ
ｇプロモーターを持った、翻訳読み取り相に機能的ポリ
ペプチド暗号化遺伝子を含んでいる。プラスミド１）
Ｏ Ｗ １ ０は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ中で機１能的な例
示発現ベクターを組み立てるのに特に有用である。プラ
スミドＰＯＷ１ｏを組み立てるのに出発物質として使用
するプラスミド１）Ｏ Ｗ ６ ０ １は〜４，４ｋｔ
〕であり、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｃｇｉｏｎａｌ Ｒ
ｃｓｃａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｙ （ Ｐｅｏｒｉ
ａ 、 Ｉ Ｉ Ｉ ｉｎｏｉ ｓ在）に寄託され、永
久ストックカルチャーコレクションの一部となっている
菌株Ｅ 、 ｃｏｌ ｉ Ｋ １ ２ ＪＡ ２２ １
／Ｉ）ＯＷ６０１から、常法により分離できる。この
菌株は、」−記プラスミドの好ましい供給源および保管
源として、受理番号ＮＲＲＬ Ｂ−１５２５９ の
下にｉｆｆ−ても利用可能である。
ＩＳａｃｉｌｌｕｓ中で機能的な例示ベクターは、Ｐｌ
ｃ。
ｃ。
１（１消化プラスミドｌ）ＯＷｌｏ をＥｃｏＲＩ
消化プラスミドＰ１１１−１８またはｐ Ｂ ５ １
にライゲーションすることにより組み立てられる。プラ
スミドｌ）Ｉｌｌ−１３は〜３， ９ ｋ ｌ）であり
、１３ａｃｉｌｌｕｓ中で機能的な複製起源と共にクロ
ラムフ１ニコール］１ｉ１性遺伝子を含んでいる。プラ
スミドｌ）ＩＩ ］−１８はプラスミドｐＨ Ｉ −
１ ６の〜． ７ ｋ ｂ ｔｌｐａ ’ＩＩ欠失によ
って組み立てられる。後者のプラスミドは、既知のキメ
ラプラスミドｌ） Ｂｌ） １ ２からのインヒポ欠失
（Ｇｒｙｃｌａｎ等、１９８０、Ｊ。
消化プラスミドＰ１１１−１８またはｐ Ｂ ５ １
にライゲーションすることにより組み立てられる。プラ
スミドｌ）Ｉｌｌ−１３は〜３， ９ ｋ ｌ）であり
、１３ａｃｉｌｌｕｓ中で機能的な複製起源と共にクロ
ラムフ１ニコール］１ｉ１性遺伝子を含んでいる。プラ
スミドｌ）ＩＩ ］−１８はプラスミドｐＨ Ｉ −
１ ６の〜． ７ ｋ ｂ ｔｌｐａ ’ＩＩ欠失によ
って組み立てられる。後者のプラスミドは、既知のキメ
ラプラスミドｌ） Ｂｌ） １ ２からのインヒポ欠失
（Ｇｒｙｃｌａｎ等、１９８０、Ｊ。
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １４ １ （１） ： ２
４６に開示）によるものであり、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｒ
ｃｇｉｏｎａｌ Ｒｃｓｃａｒｃｈｌ、、ａｌｔｏｒａ
ｔｏｒｙ （ Ｐｃｏｒｉａ 、 ｌｌｌ ｉｎｏｉｓ
在）に寄託され、永久ス暑・ツタカルチャーコレクショ
ンの一部となっている組み立てられた菌株、ＢａＣｉｌ
ｌｕｓ５１曲ｃｉｌｉｓ Ｍｌ ］ １ ２／ＰＩ（
Ｉ −１ ５から常法により分間［てきる。この菌株は
該プラスミドの好ましい供給源および保管源として受理
番号Ｎ Ｒ Ｒ Ｉ・Ｂ−１２５９７の下で１１，でも
利用可能である。前述の、プラスミドｐ■Ｉ − １
８へのライゲーションの結果、例示の〜８，４ｋｌ〕
プラスミド１）ＯＷ５２５およびｌ） ＯＷ ５ ２
６か得られる。各々のプラスミドＩ） ０ ’Ａ’ ５
２ ５ およびｌ） Ｏ Ｗ ５ ２ ６ の制［；
艮すイト地図を添付の第１図に示す。
４６に開示）によるものであり、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｒ
ｃｇｉｏｎａｌ Ｒｃｓｃａｒｃｈｌ、、ａｌｔｏｒａ
ｔｏｒｙ （ Ｐｃｏｒｉａ 、 ｌｌｌ ｉｎｏｉｓ
在）に寄託され、永久ス暑・ツタカルチャーコレクショ
ンの一部となっている組み立てられた菌株、ＢａＣｉｌ
ｌｕｓ５１曲ｃｉｌｉｓ Ｍｌ ］ １ ２／ＰＩ（
Ｉ −１ ５から常法により分間［てきる。この菌株は
該プラスミドの好ましい供給源および保管源として受理
番号Ｎ Ｒ Ｒ Ｉ・Ｂ−１２５９７の下で１１，でも
利用可能である。前述の、プラスミドｐ■Ｉ − １
８へのライゲーションの結果、例示の〜８，４ｋｌ〕
プラスミド１）ＯＷ５２５およびｌ） ＯＷ ５ ２
６か得られる。各々のプラスミドＩ） ０ ’Ａ’ ５
２ ５ およびｌ） Ｏ Ｗ ５ ２ ６ の制［；
艮すイト地図を添付の第１図に示す。
１ｉｃｏＲ１ 消化プラスミドＩ）ＯＷＩＯ のＥ
ｃ ｏ旧消化プラスミＩ’ｐｌＳＳ１ ′＼のライゲー
ションの結果、例示の〜１２．８ｋｂプラスミドｐＯＷ
５ ２ ７およびｌ） Ｏ’Ａ’ ５ ２ ８か生１
戊する。プラスＥｌ−ｐＢＳ ｌ は、プラスミドｐ
ｉ−ＩＩ − Ｌ８（７）〜４．，５ ｋ ｌ）＋３ａ
ｍｌ−１１ ７ラクメントをプラスミドｐＥＬ］Ｑ５
の〜４，４ ｋｂ １３ａｍ Ｉ］Ｉフ７クメ：／ ｌ
・ニライケ’ーンヨンすること番こより組み立てられる
。グラスミドｐＥＬ１０５ は、ブラスミｌ’ｐｆ、Ｒ
２ 〔１−ｆｉｎｄ ＩＩＩ ／白化プラスミドりＪ
Ｊ ５ （ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ等、１９８０、Ｎａｃ
ｕｒｃ ２８６ ： ５２５ に開示）をｌｌｉｎｄ
Ｊｌｌ消化プラスミドｐＢＲ３２２ にライゲーシ
ョンすることにより組み立てる〕の〜１． ６ ｋ ｂ
ＢａｍＨ ＩフラグメントをプラスミドｐＥＬｘｏ３
の〜２．８ｋｂ ＢａｍＨＩ フラグメントにラ
イゲーションするこきにより組み立てられる。このプラ
スミドＰＥＬＩＱ３は、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏ
ｎａｌ Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｙ （
Ｐｅｏｒｉａ 、 Ｉ ＩＪｉｎｏｉｓ在）に寄託され
、永久スｊ・ツクカルチャーコレクションの一部トナッ
’ＴニイルｒｍａＳｔｒｅｐｔｏｒｎｙｃｅｓ ｇｒ
ａｎｕｌｏｒｕｂｅｒＮｏ、Ａ ３９９１２．１３／Ｐ
ＥＬ１０３がら常法により分離できる。この菌株は、該
プラスミドの望ましい供給源および保管源として受理番
号ＮＲＲＬ１２５４９ （７）下で一般に入手可能であ
る。プラスミ）’ ｐＯＷ ５２７ ｔｉＪＪ：ヒｐ
ＯＷ ５２８（７）各々ノ制限サイト地図を添付の第１
図に示した。
ｃ ｏ旧消化プラスミＩ’ｐｌＳＳ１ ′＼のライゲー
ションの結果、例示の〜１２．８ｋｂプラスミドｐＯＷ
５ ２ ７およびｌ） Ｏ’Ａ’ ５ ２ ８か生１
戊する。プラスＥｌ−ｐＢＳ ｌ は、プラスミドｐ
ｉ−ＩＩ − Ｌ８（７）〜４．，５ ｋ ｌ）＋３ａ
ｍｌ−１１ ７ラクメントをプラスミドｐＥＬ］Ｑ５
の〜４，４ ｋｂ １３ａｍ Ｉ］Ｉフ７クメ：／ ｌ
・ニライケ’ーンヨンすること番こより組み立てられる
。グラスミドｐＥＬ１０５ は、ブラスミｌ’ｐｆ、Ｒ
２ 〔１−ｆｉｎｄ ＩＩＩ ／白化プラスミドりＪ
Ｊ ５ （ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ等、１９８０、Ｎａｃ
ｕｒｃ ２８６ ： ５２５ に開示）をｌｌｉｎｄ
Ｊｌｌ消化プラスミドｐＢＲ３２２ にライゲーシ
ョンすることにより組み立てる〕の〜１． ６ ｋ ｂ
ＢａｍＨ ＩフラグメントをプラスミドｐＥＬｘｏ３
の〜２．８ｋｂ ＢａｍＨＩ フラグメントにラ
イゲーションするこきにより組み立てられる。このプラ
スミドＰＥＬＩＱ３は、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏ
ｎａｌ Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｙ （
Ｐｅｏｒｉａ 、 Ｉ ＩＪｉｎｏｉｓ在）に寄託され
、永久スｊ・ツクカルチャーコレクションの一部トナッ
’ＴニイルｒｍａＳｔｒｅｐｔｏｒｎｙｃｅｓ ｇｒ
ａｎｕｌｏｒｕｂｅｒＮｏ、Ａ ３９９１２．１３／Ｐ
ＥＬ１０３がら常法により分離できる。この菌株は、該
プラスミドの望ましい供給源および保管源として受理番
号ＮＲＲＬ１２５４９ （７）下で一般に入手可能であ
る。プラスミ）’ ｐＯＷ ５２７ ｔｉＪＪ：ヒｐ
ＯＷ ５２８（７）各々ノ制限サイト地図を添付の第１
図に示した。
プラスミｌ’ｐＯＷ５２５、Ｐｏｗ５２６ 、ｐＯＷ５
２７およびｐＯＷ５２８はＢａｃｉｌｌｕｓ中で機能的
であり、ｖｃｇ プロモーターを持った翻訳読み取り相
に機能的プレプロインシュリン暗号化遺伝子を有り共に
リポソーム結合サイト含有合成りＮＡ配列を含んでおり
、このため本発明を例示するものである。その他の例示
ベクターは、１）プラスミドｐＯＷ１０をＮｃｏｌ
によって、またプラスミドＰＭＣ１４０３をＢａｍＨＩ
制限酵素によって消化し、 ２）得られた粘着末端をＤＮＡポリメラーゼのフレナラ
（Ｋｌ ｅｎｏｗ ）フラグメントで満たし、３）上記
で得られたフラグメントをＥｃｏＲＩ制限酵素で消化し
、そして ４）これら２個の７ラグメントを各々のＥｃｏＲＩおよ
び鈍感末端においてライゲーションする、ことにより組
み立てられる。
２７およびｐＯＷ５２８はＢａｃｉｌｌｕｓ中で機能的
であり、ｖｃｇ プロモーターを持った翻訳読み取り相
に機能的プレプロインシュリン暗号化遺伝子を有り共に
リポソーム結合サイト含有合成りＮＡ配列を含んでおり
、このため本発明を例示するものである。その他の例示
ベクターは、１）プラスミドｐＯＷ１０をＮｃｏｌ
によって、またプラスミドＰＭＣ１４０３をＢａｍＨＩ
制限酵素によって消化し、 ２）得られた粘着末端をＤＮＡポリメラーゼのフレナラ
（Ｋｌ ｅｎｏｗ ）フラグメントで満たし、３）上記
で得られたフラグメントをＥｃｏＲＩ制限酵素で消化し
、そして ４）これら２個の７ラグメントを各々のＥｃｏＲＩおよ
び鈍感末端においてライゲーションする、ことにより組
み立てられる。
これらの組み立てに出発物質として使用するプラスミド
ｐＭＣ１４０３は〜９，９ｋｂであり、ｌａｃ Ｚ遺伝
子の一部を含んでいる。このプラスミドはＮｏｒｔｈｅ
ｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｐｅｏｒｉａ 、 ｌ１ｌｉｎｏｉ
ｓ在）に寄託され、永久ストックカルチャーコレクショ
ンの一部となっている菌株Ｅ、ｃｏｌｉ Ｋ １２ Ｂ
Ｅ９０４／ＰＭＣ１４０３から常法により分離できる。
ｐＭＣ１４０３は〜９，９ｋｂであり、ｌａｃ Ｚ遺伝
子の一部を含んでいる。このプラスミドはＮｏｒｔｈｅ
ｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｐｅｏｒｉａ 、 ｌ１ｌｉｎｏｉ
ｓ在）に寄託され、永久ストックカルチャーコレクショ
ンの一部となっている菌株Ｅ、ｃｏｌｉ Ｋ １２ Ｂ
Ｅ９０４／ＰＭＣ１４０３から常法により分離できる。
この菌株は該プラスミドの好ましい供給源および保管源
として受理番号ＮＲＲＬ Ｂ−１５２１３の下で誰で
も人手可能である。上記のライゲーションにおいてはＮ
ｃｏｌおよびＢａ＋ｎ Ｉ−１１制限サイトの両者が回
復されるので、ＶＱｇ プロモーターを持った翻訳読
み取り相と にＩａｃ Ｚ 遺伝子の一部を有する泗にリポソ−ム
結合サイト含有合成 （プラスミドｐＯＷ３０．３と命名）が生成する。
として受理番号ＮＲＲＬ Ｂ−１５２１３の下で誰で
も人手可能である。上記のライゲーションにおいてはＮ
ｃｏｌおよびＢａ＋ｎ Ｉ−１１制限サイトの両者が回
復されるので、ＶＱｇ プロモーターを持った翻訳読
み取り相と にＩａｃ Ｚ 遺伝子の一部を有する泗にリポソ−ム
結合サイト含有合成 （プラスミドｐＯＷ３０．３と命名）が生成する。
プラスミドＰＯＷ３０３をＥｃｏＲＩ制御’ｍ ｉｌ
素て消化し、ｆζｃｏＲ１消化プラスミドｐｉ−（１−
１８ニライケーシヨンすると、例示プラスミドｐＯＷ５
２３およびＰＯＷ５２４が生成する。ＥｃｏＲＩ消化プ
ラスミドｐＨ１−１８をＥｃｏ ＲＩ 消化プラスミド
ｐＢＳ ｌ に置き換えて同様の組み立てを行なうと
、例示プラスミドＰＯＷ５２９ およびＰＯＷ５３０が
得られる。プラスミドｐＯＷ５２３、Ｐ ＯＷ ５２４
、ＰＯＷ５２９およびＰＯＷ５３（１はｌ５ａｃｉｌｌ
ｕｓ中で機能的であり、ｖｅｇ プロモーターを持った
翻訳読み取り相に機能的ポリペプチド暗号化遺伝子を有
すると共に、前記のＤＮＡ配列を含み、このためやはり
本発明を例示するものである。前記ベクターにより宿主
細胞に付与されるβ−ガラクトシダーゼ活性は、選択的
マーカーとして使用でき、従って該ベクターは分子クロ
ーニングに一般的に有用となる。プラスミドｐＯＷ５２
３、ｐ ＯＷ ５２４．００ｗ５２９およびＰｏｗ５３
０の各々の制限サイト地図を添付の第２図に示す。
素て消化し、ｆζｃｏＲ１消化プラスミドｐｉ−（１−
１８ニライケーシヨンすると、例示プラスミドｐＯＷ５
２３およびＰＯＷ５２４が生成する。ＥｃｏＲＩ消化プ
ラスミドｐＨ１−１８をＥｃｏ ＲＩ 消化プラスミド
ｐＢＳ ｌ に置き換えて同様の組み立てを行なうと
、例示プラスミドＰＯＷ５２９ およびＰＯＷ５３０が
得られる。プラスミドｐＯＷ５２３、Ｐ ＯＷ ５２４
、ＰＯＷ５２９およびＰＯＷ５３（１はｌ５ａｃｉｌｌ
ｕｓ中で機能的であり、ｖｅｇ プロモーターを持った
翻訳読み取り相に機能的ポリペプチド暗号化遺伝子を有
すると共に、前記のＤＮＡ配列を含み、このためやはり
本発明を例示するものである。前記ベクターにより宿主
細胞に付与されるβ−ガラクトシダーゼ活性は、選択的
マーカーとして使用でき、従って該ベクターは分子クロ
ーニングに一般的に有用となる。プラスミドｐＯＷ５２
３、ｐ ＯＷ ５２４．００ｗ５２９およびＰｏｗ５３
０の各々の制限サイト地図を添付の第２図に示す。
さらに不発ヴＪは、培養培地中へ分泌される機能的ポリ
ペプチドをＢａｃｉｌｌｕｓにおいて生産する方法を提
供するものである。分泌は、本発明に係るポリペプチド
暗号化遺伝子が信号ペプチドをも暗号化している場合に
起こる。信号ペプチドは、しばしば新しく合成されたポ
リペプチドを含む、アミノ酸の短いリーダー領域であり
、ポリペプチドを細胞膜を超えて輸送する際に機能する
と考えられている。信号ペプチドは、一般に、新しく合
成されたポリペプチドから輸送の際に切断される。
ペプチドをＢａｃｉｌｌｕｓにおいて生産する方法を提
供するものである。分泌は、本発明に係るポリペプチド
暗号化遺伝子が信号ペプチドをも暗号化している場合に
起こる。信号ペプチドは、しばしば新しく合成されたポ
リペプチドを含む、アミノ酸の短いリーダー領域であり
、ポリペプチドを細胞膜を超えて輸送する際に機能する
と考えられている。信号ペプチドは、一般に、新しく合
成されたポリペプチドから輸送の際に切断される。
上記の分泌方法は、その基礎をなす輸送機構により何ら
限定されるものではなく、 １）式： ５’ ＡＧＴＧＡＧＧＴＧＧＡＴＲＣ３’１１１１１
１１１１ １ ３’ ＴＣＣＡＣＣＴＡＲＩＧＧＴＡＣ５’
〔式中、Ａはデオキシアデニル、Ｇはデオキシグアニル
、Ｃはデオキシシトシル、■はチミジル、ｋはＧまたは
Ｃ，Ｒ１はＧまたはＣを表わす〕で示されるリポソーム
結合サイト含有ＤＮＡ配列、２） Ｂａｃｉｌｌｕｓ
５ｕｂｔｉｌｉｓの ｖｅｇ プロモーター、お
よび ３）信号ペプチドを含有する機能的ポリペプチドを暗号
化している遺伝子、 を含有する組み換えＤＮＡ発現ベクターによりＢａｃｉ
ｌｌｕｓ宿主細胞を形質転換し、該形質転換Ｂλｃｉ目
ｕｓ宿主細胞を増殖条件下に培養することからなるもの
である（ただし■（およびに１は同時に同じデオキシリ
ボヌクレオチドであることはなく、該ベクターは選択可
能であり、該プロモーターおよび該ＤＮＡ配列は、形質
転換された該Ｂａｃｉｌｌｕｓ細胞において転写と発現
を指令することを条件とする）。
限定されるものではなく、 １）式： ５’ ＡＧＴＧＡＧＧＴＧＧＡＴＲＣ３’１１１１１
１１１１ １ ３’ ＴＣＣＡＣＣＴＡＲＩＧＧＴＡＣ５’
〔式中、Ａはデオキシアデニル、Ｇはデオキシグアニル
、Ｃはデオキシシトシル、■はチミジル、ｋはＧまたは
Ｃ，Ｒ１はＧまたはＣを表わす〕で示されるリポソーム
結合サイト含有ＤＮＡ配列、２） Ｂａｃｉｌｌｕｓ
５ｕｂｔｉｌｉｓの ｖｅｇ プロモーター、お
よび ３）信号ペプチドを含有する機能的ポリペプチドを暗号
化している遺伝子、 を含有する組み換えＤＮＡ発現ベクターによりＢａｃｉ
ｌｌｕｓ宿主細胞を形質転換し、該形質転換Ｂλｃｉ目
ｕｓ宿主細胞を増殖条件下に培養することからなるもの
である（ただし■（およびに１は同時に同じデオキシリ
ボヌクレオチドであることはなく、該ベクターは選択可
能であり、該プロモーターおよび該ＤＮＡ配列は、形質
転換された該Ｂａｃｉｌｌｕｓ細胞において転写と発現
を指令することを条件とする）。
プラスミドｐｏｗ ５２５、ｐＯＷ５２６、ｐＯＷ５２
７およびｐＯＷ５２８、並びにこれらのＢａｃｉｌｌｕ
ｓ ５ｕｂｃｉｌｉｓ ＭＩ ｌ ｌ ２ 形質転
換体Ｃよ、本発明に係る分泌方法を例示するものである
。これら各プラスミドは、前述のｖｃｇ プロモ−ター
、リボリーム結合サイト含有ＤＮＡ配列、およびプロイ
ンシュリンの信号ペプチド含有形態であるプレプロイン
シュリンを暗号化している遺伝子を含有している。Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ 宿主細胞かこれ
らベクターにより形質転換されると、プレプロインシュ
リンが細胞内で生産され、プロインシュリンが培養培地
中・＼分泌される。
７およびｐＯＷ５２８、並びにこれらのＢａｃｉｌｌｕ
ｓ ５ｕｂｃｉｌｉｓ ＭＩ ｌ ｌ ２ 形質転
換体Ｃよ、本発明に係る分泌方法を例示するものである
。これら各プラスミドは、前述のｖｃｇ プロモ−ター
、リボリーム結合サイト含有ＤＮＡ配列、およびプロイ
ンシュリンの信号ペプチド含有形態であるプレプロイン
シュリンを暗号化している遺伝子を含有している。Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ 宿主細胞かこれ
らベクターにより形質転換されると、プレプロインシュ
リンが細胞内で生産され、プロインシュリンが培養培地
中・＼分泌される。
上記の分泌方法はプレプロインシュリンを暗号化してい
る遺伝子の使用に限定されるものではない。信号ペプチ
ド含有機能的ポリペプチドを暗号化している任意の遺伝
子、例えば免疫調節物質、プレ成長ホルモン、プレーヒ
ト成長ホルモン、プレー豚成長ホルモン、蛋白分解変性
酵素およびセルロース分解変性酵素を暗号化している遺
伝子などを使用することかで−きる。また、所望の信号
ペプチドを暗号化しているＤＮＡは、直接合成すること
もできるし、また、既に存在している遺伝子から開裂さ
せ、次いて通常はこのような信号ペプチド暗号化配列を
欠いている遺伝子にライゲーションする。このようにし
て、機能的ポリペプチドを暗号化している遺伝子は、全
て、本発明に係る分泌方法に適用できるように修飾する
ことができる。従って、本発明方法は本来、信号ペプチ
ド暗号化領域を含んでいる遺伝子の使用に限定されるも
のではない。
る遺伝子の使用に限定されるものではない。信号ペプチ
ド含有機能的ポリペプチドを暗号化している任意の遺伝
子、例えば免疫調節物質、プレ成長ホルモン、プレーヒ
ト成長ホルモン、プレー豚成長ホルモン、蛋白分解変性
酵素およびセルロース分解変性酵素を暗号化している遺
伝子などを使用することかで−きる。また、所望の信号
ペプチドを暗号化しているＤＮＡは、直接合成すること
もできるし、また、既に存在している遺伝子から開裂さ
せ、次いて通常はこのような信号ペプチド暗号化配列を
欠いている遺伝子にライゲーションする。このようにし
て、機能的ポリペプチドを暗号化している遺伝子は、全
て、本発明に係る分泌方法に適用できるように修飾する
ことができる。従って、本発明方法は本来、信号ペプチ
ド暗号化領域を含んでいる遺伝子の使用に限定されるも
のではない。
本発明は極めて多様な利用性があり、組換えＤＮＡクロ
ーニングベクター中の遺伝子によって暗号化され得るあ
らゆるポリペプチドの生産に対して通用することができ
る。好ましい組換えＤＮＡクローニングベクターはプラ
スミドであるが、バタテリオファージおよびその他のベ
クターもまた使うことかでき、これらは当業者には周知
のものである。代表的なプし・プロインシュリンおヨヒ
Ｉａｃ Ｚ遺伝子に加えて、使用可能な遺伝子としては
、天然に存在する遺伝子、非天然の遺伝子、および一部
は天然で一部は合成または非天然である遺伝子が含まれ
る。さらに詳細には、該遺伝子には、ヒトプロインシュ
リン、ヒトインシュリンＡ鎖、ヒトインシュリンＢ鎖、
非ヒトインシュリン、ヒト成長ホルモン、非ヒト成長ホ
ルモン、中成長ホルモン、豚成長ホルモン、ヒトインタ
ーフェロン、非ヒトインターフェロン、ウィルス抗原、
ウロキナーゼ、あらゆるペプチドホルモン、あらゆる酵
素、あるいは研究または商業的価値を有する実質上全て
の他のポリペプチドを暗号化することが可能である。
ーニングベクター中の遺伝子によって暗号化され得るあ
らゆるポリペプチドの生産に対して通用することができ
る。好ましい組換えＤＮＡクローニングベクターはプラ
スミドであるが、バタテリオファージおよびその他のベ
クターもまた使うことかでき、これらは当業者には周知
のものである。代表的なプし・プロインシュリンおヨヒ
Ｉａｃ Ｚ遺伝子に加えて、使用可能な遺伝子としては
、天然に存在する遺伝子、非天然の遺伝子、および一部
は天然で一部は合成または非天然である遺伝子が含まれ
る。さらに詳細には、該遺伝子には、ヒトプロインシュ
リン、ヒトインシュリンＡ鎖、ヒトインシュリンＢ鎖、
非ヒトインシュリン、ヒト成長ホルモン、非ヒト成長ホ
ルモン、中成長ホルモン、豚成長ホルモン、ヒトインタ
ーフェロン、非ヒトインターフェロン、ウィルス抗原、
ウロキナーゼ、あらゆるペプチドホルモン、あらゆる酵
素、あるいは研究または商業的価値を有する実質上全て
の他のポリペプチドを暗号化することが可能である。
本発明の組換えＤＮＡ発現ベクターは、その使用を単一
の種または菌株に限定する訳ではない。
の種または菌株に限定する訳ではない。
逆に該ベクターは広範囲に適用でき、多くの菌類、特に
Ｂａｃｉｌｌｕｓ、 Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ お
よび４凰ｃｏｌｉの非制限菌株の宿主細胞に形質転換す
ることができる。非制限菌株は、常法により、および当
業者に周知の原理（Ｌｏｍ６ｖｓｋａｙａ等、１９８０
、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ
４４ ： ２０６ ）を応用することによりＢａｃｉｌ
ｌｕｓおよびＳ ｔｒｅｐＬｏｍｙｃｅｓ類より簡単に
選択、分離できる。非制限菌株の宿主細胞は制限酵素を
欠くため、形質転換の際プラスミドＩ） Ｎ Ａを切断
才たは劣化させることがない。
Ｂａｃｉｌｌｕｓ、 Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ お
よび４凰ｃｏｌｉの非制限菌株の宿主細胞に形質転換す
ることができる。非制限菌株は、常法により、および当
業者に周知の原理（Ｌｏｍ６ｖｓｋａｙａ等、１９８０
、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ
４４ ： ２０６ ）を応用することによりＢａｃｉｌ
ｌｕｓおよびＳ ｔｒｅｐＬｏｍｙｃｅｓ類より簡単に
選択、分離できる。非制限菌株の宿主細胞は制限酵素を
欠くため、形質転換の際プラスミドＩ） Ｎ Ａを切断
才たは劣化させることがない。
本発明においては、本発明に係るベクターのいかなる制
限サイ１−も切断しない制限酵素を含有する宿主細胞も
また非制限性とみなすこととする。
限サイ１−も切断しない制限酵素を含有する宿主細胞も
また非制限性とみなすこととする。
本発明に係るベクターを特に有用に使用でき、かつ形質
転換できる好ましいＢａｃｉｌｌｕｓ類の非制限菌株の
宿主細胞には、例えば以下のような微生物の非制限細胞
か含まれる： Ｂ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ 、 Ｂ、 ５ｕｂｔｉｌｉ
ｓ Ｍｌ ｌ １２．１３゜ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉ
ｓ、 Ｂ、ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｖａｒ。
転換できる好ましいＢａｃｉｌｌｕｓ類の非制限菌株の
宿主細胞には、例えば以下のような微生物の非制限細胞
か含まれる： Ｂ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ 、 Ｂ、 ５ｕｂｔｉｌｉ
ｓ Ｍｌ ｌ １２．１３゜ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉ
ｓ、 Ｂ、ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｖａｒ。
１ｓｒａｅｌｉｅｎｓｉｓ 、 １３．ｃｅｒｅｕｓ
、 １３＋ａｎｔｈｒａｃｉｓ。
、 １３＋ａｎｔｈｒａｃｉｓ。
Ｂ、 ｐｉｌｉｆｏｒｍｉｓ 、 Ｂ、 ｔｒｏｐｉｃ
ｕｓｌＢ、 ａｌｖｅｉ。
ｕｓｌＢ、 ａｌｖｅｉ。
Ｂ 、 ｍｅｇａ ｔｅｒ ｉｕｍｌＢ 、 ｐｕｍｉ
ｌ ｕｓ 、 １３．１１ｃｌｌｅｎｉ［ｏｒｍｉｓ
。
ｌ ｕｓ 、 １３．１１ｃｌｌｅｎｉ［ｏｒｍｉｓ
。
Ｂ、 ｐｏｌ ｙｍｙｘａ １１３．ｍａｃｅｒａｎｓ
ｌｌＢ、ｃｉｒｃｕｌａｎｓ 。
ｌｌＢ、ｃｉｒｃｕｌａｎｓ 。
Ｂ、 ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、 Ｂ、
ｃｏａｇｕｌａｎｓ 。
ｃｏａｇｕｌａｎｓ 。
Ｂ、ｆｉｒｍｕｓ 、 Ｂ、ｂｒｅｖｉｓｌＢ、 ５ｐ
ｈａｃｒｉｃｕｓ。
ｈａｃｒｉｃｕｓ。
１１Ｓ、 ｐａｓｔｅｕｒｉｉ 、 Ｂ、
ｆａｓｔｉｄｉｏｓｕｓ 、 Ｂ、１ａｒｖａｃ
。
ｆａｓｔｉｄｉｏｓｕｓ 、 Ｂ、１ａｒｖａｃ
。
＋３．ｌｅｎＬｉｍｏｒｂｕｓ、 Ｂ、ａｐｉａｒｕｓ
、 Ｂ、ａｍｙｌｏｌｉｑｕｉ［ａｃｉｃｎｓ。
、 Ｂ、ａｍｙｌｏｌｉｑｕｉ［ａｃｉｃｎｓ。
１３、１ａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ および１３．ｐｏｐ
ｉｌｌａｅ ０アミノグリコシド抗生物質を産生じ、本
発明に係るベクターを特に有用に使用でき、形質転換で
きる好ましいＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ 属の非制限
菌株の宿主細胞には、例えば以下のような微生物の非Ｉ
ＩＩ限細胞か含まれる： Ｓ、ｋａｎａ−ｍｙｃｃｔｉｃｕｓ （カナマイシン
類）、Ｓ、ｃｈｒｅｓｔｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ （アミ
フシジン）、Ｓ。
ｉｌｌａｅ ０アミノグリコシド抗生物質を産生じ、本
発明に係るベクターを特に有用に使用でき、形質転換で
きる好ましいＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ 属の非制限
菌株の宿主細胞には、例えば以下のような微生物の非Ｉ
ＩＩ限細胞か含まれる： Ｓ、ｋａｎａ−ｍｙｃｃｔｉｃｕｓ （カナマイシン
類）、Ｓ、ｃｈｒｅｓｔｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ （アミ
フシジン）、Ｓ。
ｇｒｉｓｅｏ ｆｌａｖｕｓ （抗生物質Ｍ、Ａ１２
６７）、Ｓ、ｍ１ｃｒｏｓ’ｐｏｒｃｕｓ （抗生物
質５Ｆ−７６７）、Ｓ 、 ｒｉｂｏｓｉｄｉｆ １ｃ
ｕｓ （抗生物質Ｓ Ｌ’ ７３３ ）、Ｓ、Ｈａｖｏ
ｐｅｒｓｉｃｕｓ （スベクチノマイシン）、Ｓ、 ５
ｐｅｃｔａｂｉｊｉｓ （アクチノスペククシン）、・
Ｓ、ｒｉｍｏｓｕｓ ｆｏｒｍａ ｐａｒｏｍｏｍ
ｙｃｉｎｕｓ （）（ＣＩモモマイシン類カテヌリン
）、Ｓ、 Ｉ’ｒａｄｉａｃ ｖａｒ。
６７）、Ｓ、ｍ１ｃｒｏｓ’ｐｏｒｃｕｓ （抗生物
質５Ｆ−７６７）、Ｓ 、 ｒｉｂｏｓｉｄｉｆ １ｃ
ｕｓ （抗生物質Ｓ Ｌ’ ７３３ ）、Ｓ、Ｈａｖｏ
ｐｅｒｓｉｃｕｓ （スベクチノマイシン）、Ｓ、 ５
ｐｅｃｔａｂｉｊｉｓ （アクチノスペククシン）、・
Ｓ、ｒｉｍｏｓｕｓ ｆｏｒｍａ ｐａｒｏｍｏｍ
ｙｃｉｎｕｓ （）（ＣＩモモマイシン類カテヌリン
）、Ｓ、 Ｉ’ｒａｄｉａｃ ｖａｒ。
１Ｌａｌｉｃｕｓ （７ミノシジン）、Ｓ、 ｂｌｕｅ
ｎｓｉｓＶａｒ、 ｂｌｕｅｎｓｉｓ （プルエンソマ
イシン）、Ｓ。
ｎｓｉｓＶａｒ、 ｂｌｕｅｎｓｉｓ （プルエンソマ
イシン）、Ｓ。
ｃａｔｅｎｕｌａｅ （カテヌリン）、Ｓ、 ｏｌｉｖ
ｏｒｅｔｉｃｕｌｉＨｒ、ｃｅｌｌｕｌｏｐｂｉｌｕｓ
（デス１−マイシンＡ）、５、 ｔｅｎｅｂｒａｒ
ｉｕｓ （トブラマイシン、アプラマイシン）、Ｓ、Ｉ
ａｖｅｎｄｕｌａｅ （ネオマイシン）、Ｓ。
ｏｒｅｔｉｃｕｌｉＨｒ、ｃｅｌｌｕｌｏｐｂｉｌｕｓ
（デス１−マイシンＡ）、５、 ｔｅｎｅｂｒａｒ
ｉｕｓ （トブラマイシン、アプラマイシン）、Ｓ、Ｉ
ａｖｅｎｄｕｌａｅ （ネオマイシン）、Ｓ。
ａｌｂｏｇｒｉｓｃｏｌｕｓ （ネオマイシン類）、Ｓ
、ａｌｌ）ｕｓｖａ ｒ 、 ｍｅ ｔ ａｍｙｃ ｉ
ｎｕ ｓ （メタマイシン）、Ｓ。
、ａｌｌ）ｕｓｖａ ｒ 、 ｍｅ ｔ ａｍｙｃ ｉ
ｎｕ ｓ （メタマイシン）、Ｓ。
ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ ｖａｒ、 ｓａｇａｍ
ｉｃｎｓｉｓ （スベクチノマイシン）、Ｓ、 ｂｉ
ｋｉｎｉｃｎｓｉｓ （ストレプトマイシン）、 ｓ、
ｇｒｉｓｅｕｓ （ストレプトマイシン）、Ｓ、ｃｒ
ｙｔｈｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ ｖａｒ、 ｎａ
ｒｕｔｏｃｎｓｉｓ（スＩ−レプ）フィシン）、Ｓ、
ｐｏｏｌｅｎｓｉｓ （ストレプトマイシン）、Ｓ、ｇ
ａｌｂｕｓ （ストレプトマイシン）、Ｓ、ｒａｍｅ
ｕ５ （ストレプトマイシン）、Ｓ、ｏｌｉｖａｃｅ
ｕｓ （ストレプトマイシン）、Ｓ。
ｉｃｎｓｉｓ （スベクチノマイシン）、Ｓ、 ｂｉ
ｋｉｎｉｃｎｓｉｓ （ストレプトマイシン）、 ｓ、
ｇｒｉｓｅｕｓ （ストレプトマイシン）、Ｓ、ｃｒ
ｙｔｈｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ ｖａｒ、 ｎａ
ｒｕｔｏｃｎｓｉｓ（スＩ−レプ）フィシン）、Ｓ、
ｐｏｏｌｅｎｓｉｓ （ストレプトマイシン）、Ｓ、ｇ
ａｌｂｕｓ （ストレプトマイシン）、Ｓ、ｒａｍｅ
ｕ５ （ストレプトマイシン）、Ｓ、ｏｌｉｖａｃｅ
ｕｓ （ストレプトマイシン）、Ｓ。
ｒｎａｓｈｕｃｎｓ ｉ ｓ （ストレプトマイシン）
、Ｓ。
、Ｓ。
１１ｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ ｖａｒ 、 Ｉ ｉ
ｍｏｎｅｕｓ （バリタフィシン類）、Ｓ、ｒｉｍｏ
［ａｃｉｅｎｓ （デストマイシン）、Ｓ、ｈｙｇｒ
ｏｓｃｏｐｉｃｕｓ ｆｏｒｍａ ｇｌｅｂｏｓｕｓ
（ダレホマイシン）、Ｓ、ｆｒａｄｉａｃ （ハ
イプリマイシン類、ネオマイシン類）、Ｓ、ｅｕｒｏｃ
ｉｄｉｃｕｓ （抗生物質Ａ１６３１６−Ｃ）、Ｓ、
ａｑｕａｃａｎｕｓ （Ｎ−メチルハイグ０フィシンＢ
）、Ｓ 、ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｕｓ（ハイグロマイシ
ンＡ）、Ｓ、 ｎｏｂｏｒｉｔｏｅｎｓｉｓ（ハイグロ
マイシン）、Ｓ、ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ （ハ
イグロマイシン類）、Ｓ、、ａｔｒｏｆａｃｉｅｎｓ
（）１イグ０フイシン）、Ｓ、ｋａｓｕｇａｓｐｉｎｕ
ｓ （カナマイシン）、Ｓ、ｋａｓｕｇａｃｎｓｉｓ
（カナマイシン類）、Ｓ、ｎｅｔｒｏｐｓｉｓ （抗
生物１ｉ、、ｒ−−ＡＭ３１）、Ｓ、１ｉｖｉｄｕｓ
（リビドマイシン類）、Ｓ 、ｈｏ（ｕｃｎｓｉｓ（
セルドマイシン複合体）、およびＳ、ｃンｔｎｕｓ
（リボシルパロマミン）。
ｍｏｎｅｕｓ （バリタフィシン類）、Ｓ、ｒｉｍｏ
［ａｃｉｅｎｓ （デストマイシン）、Ｓ、ｈｙｇｒ
ｏｓｃｏｐｉｃｕｓ ｆｏｒｍａ ｇｌｅｂｏｓｕｓ
（ダレホマイシン）、Ｓ、ｆｒａｄｉａｃ （ハ
イプリマイシン類、ネオマイシン類）、Ｓ、ｅｕｒｏｃ
ｉｄｉｃｕｓ （抗生物質Ａ１６３１６−Ｃ）、Ｓ、
ａｑｕａｃａｎｕｓ （Ｎ−メチルハイグ０フィシンＢ
）、Ｓ 、ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｕｓ（ハイグロマイシ
ンＡ）、Ｓ、 ｎｏｂｏｒｉｔｏｅｎｓｉｓ（ハイグロ
マイシン）、Ｓ、ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ （ハ
イグロマイシン類）、Ｓ、、ａｔｒｏｆａｃｉｅｎｓ
（）１イグ０フイシン）、Ｓ、ｋａｓｕｇａｓｐｉｎｕ
ｓ （カナマイシン）、Ｓ、ｋａｓｕｇａｃｎｓｉｓ
（カナマイシン類）、Ｓ、ｎｅｔｒｏｐｓｉｓ （抗
生物１ｉ、、ｒ−−ＡＭ３１）、Ｓ、１ｉｖｉｄｕｓ
（リビドマイシン類）、Ｓ 、ｈｏ（ｕｃｎｓｉｓ（
セルドマイシン複合体）、およびＳ、ｃンｔｎｕｓ
（リボシルパロマミン）。
マクロライド抗生物質を陀生じ、本発明に係るベクター
を特に有用に使用でき、形質転換できる好ましいＳｔｒ
ｅｐｔｏｍｙｃｅｓ 類の非制限菌株宿主細胞には、例
えば以下のような微生物の非制限細胞が含まれる： Ｓ
、 ｃａｅｌｃｓｃｉｓ （抗生物質Ｍ１８８）、Ｓ
、 ｐｌａｔｅｎ’ｓ ｉｓ’ （プラナ／フィシン）
、Ｓ 、ｒｏｃｈｅｉｖａｒ、ｖｏｌｕ））ｉｌｉｓ（
抗生物質Ｔ２６３６）、Ｓ。
を特に有用に使用でき、形質転換できる好ましいＳｔｒ
ｅｐｔｏｍｙｃｅｓ 類の非制限菌株宿主細胞には、例
えば以下のような微生物の非制限細胞が含まれる： Ｓ
、 ｃａｅｌｃｓｃｉｓ （抗生物質Ｍ１８８）、Ｓ
、 ｐｌａｔｅｎ’ｓ ｉｓ’ （プラナ／フィシン）
、Ｓ 、ｒｏｃｈｅｉｖａｒ、ｖｏｌｕ））ｉｌｉｓ（
抗生物質Ｔ２６３６）、Ｓ。
ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ （メチマイシン類） 、Ｓ、ｇ
ｒｉｓｅｏ［ｕｓｃｕｓ（プントリン）、Ｓ、ｎａｒｂ
ｏｎｃｎｓｉｓ （’； ヨサーｙイシン、ナルポマ
イシン）、’Ｓ、［ｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ （抗生
物質ＮＡ−１８１）、Ｓ 、 ｇｒｉｓｅｏｆａｃｉｅ
ｎｓ （抗生物質ＰＡ１３３Ａ、Ｂ）、Ｓ、ｒｏｓｅｏ
ｃｉＬｒｅｕｓ（アルボ→ノーイクリン）、Ｓ、ｌ）ｒ
ｕｎｅｏｇｒｉｓｅｕｓ （フルポザイクリン）、Ｓ、
ｒｏｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｃｓ （フルホザイクリ
ン）、Ｓ、 ｃｉｎｅｒｏｃｈｒｏ＋ｎｏｇｅｎｅｓ（
シラマイシン１３）、５．ａｌｂｕｓ （アルトマイ
シン）、Ｓ、ｆｅｌｌｅｕｓ （アルボマイシン、ビグ
０フイシン）、Ｓ 、ｒｏｃ、ｈｅ ｉ （ランカシジ
ン、ポレリジン）、Ｓ、ｖｉｏｌａｃｅｏｎｉｇｅｒ
（ランカシジン）、Ｓ、ｇｒｉｓｃｕｓ （ボレリジ
ン）、Ｓ、ｍａｉｚｃｕｓ （インクラマイシン）、Ｓ
、 ａｌｂｕｓ Ｖａｒ、 ｃｏｉｌ＋ｎｙｃｃｔｉ
ｃｕｓ（コレイマイシン）、Ｓ、ｍｙｃａｒｏｆａｃｉ
ｅｎｓ （アセチルロイコマイシン、ニスピノマイシン
）、Ｓ。
ｒｉｓｅｏ［ｕｓｃｕｓ（プントリン）、Ｓ、ｎａｒｂ
ｏｎｃｎｓｉｓ （’； ヨサーｙイシン、ナルポマ
イシン）、’Ｓ、［ｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ （抗生
物質ＮＡ−１８１）、Ｓ 、 ｇｒｉｓｅｏｆａｃｉｅ
ｎｓ （抗生物質ＰＡ１３３Ａ、Ｂ）、Ｓ、ｒｏｓｅｏ
ｃｉＬｒｅｕｓ（アルボ→ノーイクリン）、Ｓ、ｌ）ｒ
ｕｎｅｏｇｒｉｓｅｕｓ （フルポザイクリン）、Ｓ、
ｒｏｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｃｓ （フルホザイクリ
ン）、Ｓ、 ｃｉｎｅｒｏｃｈｒｏ＋ｎｏｇｅｎｅｓ（
シラマイシン１３）、５．ａｌｂｕｓ （アルトマイ
シン）、Ｓ、ｆｅｌｌｅｕｓ （アルボマイシン、ビグ
０フイシン）、Ｓ 、ｒｏｃ、ｈｅ ｉ （ランカシジ
ン、ポレリジン）、Ｓ、ｖｉｏｌａｃｅｏｎｉｇｅｒ
（ランカシジン）、Ｓ、ｇｒｉｓｃｕｓ （ボレリジ
ン）、Ｓ、ｍａｉｚｃｕｓ （インクラマイシン）、Ｓ
、 ａｌｂｕｓ Ｖａｒ、 ｃｏｉｌ＋ｎｙｃｃｔｉ
ｃｕｓ（コレイマイシン）、Ｓ、ｍｙｃａｒｏｆａｃｉ
ｅｎｓ （アセチルロイコマイシン、ニスピノマイシン
）、Ｓ。
ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ （ツリマイシン、レロ
マイシン、マリドマイシン、タイロシン、カルボマイシ
ン）、Ｓ、ｇｒｉｓｅｏｓｐｉｒａｌｉｓ （レロフイ
シン）、Ｓ。
マイシン、マリドマイシン、タイロシン、カルボマイシ
ン）、Ｓ、ｇｒｉｓｅｏｓｐｉｒａｌｉｓ （レロフイ
シン）、Ｓ。
ＩａｖｃｎｃＪｕｌａｅ （アルトガマイシン）、Ｓ、
ｒｉｍｏｓｕｓにュートラマイシン）、Ｓ 、 ｄｅｌ
ｔａｅ （７’ ／ｌ／タマインン）、Ｓ 、 ｆｕ
ｎｇｉｃ ｉｄｉ ｃｕｓ ｖａｒ、ｃｓｐｉｎｏｎ〕
ｙｃｅｔｉｃｕｓ（ニスピノマイシン類）、Ｓ、 ｆｕ
ｒｄｉｃｉｄｉｃｕｓ （ミデカマイシン）、Ｓ、
ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ （フオロマシジン１））、
Ｓ、ｅｕｒｏｃｉｄｉｃｕｓ （メチマイシン）、Ｓ
、ｇｒｉＳｅｏｌｕｓ （グリセオマイシン）、Ｓ、ｆ
ｌａｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ （ア７ ロフイシン
、シラマイシン類）、Ｓ、ｆｉｍｂｒｉａｔｕｓ （
アマロマイシン）、Ｓ、 ｆａｓｃｉｃｕｌｕｓ （ア
マロマイシン）、Ｓ、ｅｒｙｔｈｒｃｕｓ （、ｒ−リ
ス０ フィシン類）、Ｓ。
ｒｉｍｏｓｕｓにュートラマイシン）、Ｓ 、 ｄｅｌ
ｔａｅ （７’ ／ｌ／タマインン）、Ｓ 、 ｆｕ
ｎｇｉｃ ｉｄｉ ｃｕｓ ｖａｒ、ｃｓｐｉｎｏｎ〕
ｙｃｅｔｉｃｕｓ（ニスピノマイシン類）、Ｓ、 ｆｕ
ｒｄｉｃｉｄｉｃｕｓ （ミデカマイシン）、Ｓ、
ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ （フオロマシジン１））、
Ｓ、ｅｕｒｏｃｉｄｉｃｕｓ （メチマイシン）、Ｓ
、ｇｒｉＳｅｏｌｕｓ （グリセオマイシン）、Ｓ、ｆ
ｌａｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ （ア７ ロフイシン
、シラマイシン類）、Ｓ、ｆｉｍｂｒｉａｔｕｓ （
アマロマイシン）、Ｓ、 ｆａｓｃｉｃｕｌｕｓ （ア
マロマイシン）、Ｓ、ｅｒｙｔｈｒｃｕｓ （、ｒ−リ
ス０ フィシン類）、Ｓ。
ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ （オレアンドマイシン）、
Ｓ。
Ｓ。
ｏｌｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ （オレアンドマ
イシン）、Ｓ、 ｓｐｉｎｉｃｈｒｏｍｏｇｃｎｃｓ
ｖａｒ、 ｓｕｒａｇａｏｅｎｓｉｓ （クジマイシ
ン類）、Ｓ、ｋｉｃａｓａｃｏｃｎｓｉｓ （ロイコ
マイシン）、Ｓ、 ｎａｒｂｏｎｃｎｓｉｓ ｖａｒ
。
イシン）、Ｓ、 ｓｐｉｎｉｃｈｒｏｍｏｇｃｎｃｓ
ｖａｒ、 ｓｕｒａｇａｏｅｎｓｉｓ （クジマイシ
ン類）、Ｓ、ｋｉｃａｓａｃｏｃｎｓｉｓ （ロイコ
マイシン）、Ｓ、 ｎａｒｂｏｎｃｎｓｉｓ ｖａｒ
。
ｊｏｓａｍｙｃｅｔｉｃｕｓ （ｏイオマイシンＡ３、
ジョサマイシン）、Ｓ、 ａｌｂｏｇｒｉｓｅｏｌｕｓ
（ミコノマイシン）、Ｓ、ｂｉｋｉｎｉｃｎｓｉｓ
（チェナマイシン）、Ｓ＋ｃｉｒｒａｔｕｓ （
シラマイシン）、Ｓ。
ジョサマイシン）、Ｓ、 ａｌｂｏｇｒｉｓｅｏｌｕｓ
（ミコノマイシン）、Ｓ、ｂｉｋｉｎｉｃｎｓｉｓ
（チェナマイシン）、Ｓ＋ｃｉｒｒａｔｕｓ （
シラマイシン）、Ｓ。
ｃｊｉａｋａｒｔｅｎｓｉｓ （ニタマイシン）、Ｓ
、 ｃｕｒｙｔｈｃｒ＋ｎｕｓ（アンゴラマイシン）、
Ｓ、ｆｒａｄｉ；ｉｃ （タイロシン、ラクテノシン
、マクロジン）、Ｓ 、 ｇｏｓｈｉｋｉ ｅｎｓ ｉ
ｓ（バンクマイシン）、Ｓ、ｇｒｉｓｅｏｆｌａｖｕｓ
（アキュマイシン）、Ｓ、Ｉ】ａｌｓｔｅｄｉｉ （
カルボマイシン）、Ｓ 、ｔｅｎｄａｅ （カルボマイ
シン） 、Ｓ９ｍａｃｒｏｓｐｏｒｅｕｓ（カルボマイ
シン）、Ｓ、 ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ （カル
ボマイシン）、およびＳ、ａｌｌ）ｉｒｅｔｉｃｕｌｉ
（カルボマイシン）。
、 ｃｕｒｙｔｈｃｒ＋ｎｕｓ（アンゴラマイシン）、
Ｓ、ｆｒａｄｉ；ｉｃ （タイロシン、ラクテノシン
、マクロジン）、Ｓ 、 ｇｏｓｈｉｋｉ ｅｎｓ ｉ
ｓ（バンクマイシン）、Ｓ、ｇｒｉｓｅｏｆｌａｖｕｓ
（アキュマイシン）、Ｓ、Ｉ】ａｌｓｔｅｄｉｉ （
カルボマイシン）、Ｓ 、ｔｅｎｄａｅ （カルボマイ
シン） 、Ｓ９ｍａｃｒｏｓｐｏｒｅｕｓ（カルボマイ
シン）、Ｓ、 ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ （カル
ボマイシン）、およびＳ、ａｌｌ）ｉｒｅｔｉｃｕｌｉ
（カルボマイシン）。
β−ラクタム抗生物質を産生じ、本発明に係るベクター
を特に有用に使用でき、形質転換できる好ましいＳＬｒ
ｃｐｔｏｍｙｃｅｓ類の非制限菌株宿主細胞には、例え
は以下のような微生物の非制限細胞か含才れる： Ｓ、
Ｉｉｐｍａｎｉｉ （Ａ ｌ ５８８４、ＭＭ４５５
０、ＭＭ１３９０２）、Ｓ、 ｃｌａｖｕｌ ｉｇｅｒ
ｕｓ（Ａ１６８８６Ｂ、クラプラン酸）、 Ｓ。
を特に有用に使用でき、形質転換できる好ましいＳＬｒ
ｃｐｔｏｍｙｃｅｓ類の非制限菌株宿主細胞には、例え
は以下のような微生物の非制限細胞か含才れる： Ｓ、
Ｉｉｐｍａｎｉｉ （Ａ ｌ ５８８４、ＭＭ４５５
０、ＭＭ１３９０２）、Ｓ、 ｃｌａｖｕｌ ｉｇｅｒ
ｕｓ（Ａ１６８８６Ｂ、クラプラン酸）、 Ｓ。
Ｉａｃｌａｍｃｌｕｒａｎｓ （セファマイシンＣ）、
Ｓ 、 ｇｒ ｉ ５ｃｕｓ（セファマイシンΔ、Ｂ）
、Ｓ 、ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ（デアセトキシセ
ファロスポリンＣ）、Ｓ。
Ｓ 、 ｇｒ ｉ ５ｃｕｓ（セファマイシンΔ、Ｂ）
、Ｓ 、ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ（デアセトキシセ
ファロスポリンＣ）、Ｓ。
ｗａｄａｙａｍｃｎｓｉｓ （ＷＳ −３４４２−１）
）、Ｓ。
）、Ｓ。
ｃｈ；目ｔｒｃｕｓｉｓ （Ｓ １’ ｌ ５２３
）、 Ｓ 、 ｈｃｔｃｒｏｍｏｒｐｈｕｓおよび
Ｓ、ｐａｎａｙｅｎｓｉｓ （Ｃ２０！３１Ｘ） ：
Ｓ。
）、 Ｓ 、 ｈｃｔｃｒｏｍｏｒｐｈｕｓおよび
Ｓ、ｐａｎａｙｅｎｓｉｓ （Ｃ２０！３１Ｘ） ：
Ｓ。
ｃｉｎｎａｍｏｎｃｎｓｉｓ 、Ｓ、ｆｉｍｂｒｉａｔ
ｕｓｌＳ、１１ａｌｓｔｃｄｉｉ、Ｓ、 ｒｏｃｈｃ
ｉおよＱ： Ｓ 、ｖ ｉ ｒ ｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇ
ｃｎｃ ｓ （セファマイシンＡＳＢ ） ： Ｓ、
ｃａｃｔｌｅｙａ （チェナマイシン）；およびＳ、
ｏｌ ｉ ｖａｃｅｕｓ、 Ｓ 、ｆｌａｖｏｖｉｒｃ
ｎｓ 。
ｕｓｌＳ、１１ａｌｓｔｃｄｉｉ、Ｓ、 ｒｏｃｈｃ
ｉおよＱ： Ｓ 、ｖ ｉ ｒ ｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇ
ｃｎｃ ｓ （セファマイシンＡＳＢ ） ： Ｓ、
ｃａｃｔｌｅｙａ （チェナマイシン）；およびＳ、
ｏｌ ｉ ｖａｃｅｕｓ、 Ｓ 、ｆｌａｖｏｖｉｒｃ
ｎｓ 。
Ｓ、 ｆｌａｖｕｓ、 Ｓ、ｆｕｌｖｏｖｉｒｉｄｉ
ｓｊ、ａｒｇｃｎｔｃｏｌｕｓおよびＳ、 ５ｉｏｙａ
ｅｎｓｉｓ （ＭＭ ４５５０およびＭＭ １３９０２
）。
ｓｊ、ａｒｇｃｎｔｃｏｌｕｓおよびＳ、 ５ｉｏｙａ
ｅｎｓｉｓ （ＭＭ ４５５０およびＭＭ １３９０２
）。
ポリエーテル抗生物質を産生じ、本発明に係るベクター
を特に有用に使用でき、形質転換できる好ましいＳｉｒ
ｃｐｔｏｍｙＣｅＳ 類の非制限菌株宿主細胞には、例
えば以下のような微生物の非制限細胞が含まれる°Ｓ、
ａｌｌ）ｕｓ （Ａ ２０’４、Ａ２８６９５Ａおよび
Ｂ１ザリノマイシン）、Ｓ 、ｂｙｇ ｒｏ ５ｃｏｐ
１ｃｕｓ（Ａ２１８、エメリシト、Ｉ−） Ｅ ：３
ｇ ３６、Ａ１２ＯＡ、、Ａ２８６９５ＡおよびＩ瓢
エテロマイシン、ジョサマイシン）、Ｓｏｇｒｈｃｕｓ
（クリツリキシン）、Ｓ 、 ｃｏｎｇｌｏｂａｔｕ
ｓ （イオノマイシン）、Ｓ、ｅｕｒｏｃｉｄｉｃｕｓ
ｖａｒ、 ａｓｉｃｒｏｃｉｄｉｃｕｓ （ライ
ドロマイシン）、Ｓ、Ｉａｓａｌ １ｃｎｓｉｓ （う
→）−ロシド）、Ｓ、ｒｉｂｏｓｉｄｉｆｉｃｕｓ （
Ｄノマイシン）、Ｓ、 ｃａｃａｏｉ ｖａｒ、 ａ
ｓｏｃｎｓｉｓ （ライソセリン）、Ｓ 、 ｃｉｎｎ
ａｍｏｎｅｎｓｉｓ （そネンンン）、Ｓ。
を特に有用に使用でき、形質転換できる好ましいＳｉｒ
ｃｐｔｏｍｙＣｅＳ 類の非制限菌株宿主細胞には、例
えば以下のような微生物の非制限細胞が含まれる°Ｓ、
ａｌｌ）ｕｓ （Ａ ２０’４、Ａ２８６９５Ａおよび
Ｂ１ザリノマイシン）、Ｓ 、ｂｙｇ ｒｏ ５ｃｏｐ
１ｃｕｓ（Ａ２１８、エメリシト、Ｉ−） Ｅ ：３
ｇ ３６、Ａ１２ＯＡ、、Ａ２８６９５ＡおよびＩ瓢
エテロマイシン、ジョサマイシン）、Ｓｏｇｒｈｃｕｓ
（クリツリキシン）、Ｓ 、 ｃｏｎｇｌｏｂａｔｕ
ｓ （イオノマイシン）、Ｓ、ｅｕｒｏｃｉｄｉｃｕｓ
ｖａｒ、 ａｓｉｃｒｏｃｉｄｉｃｕｓ （ライ
ドロマイシン）、Ｓ、Ｉａｓａｌ １ｃｎｓｉｓ （う
→）−ロシド）、Ｓ、ｒｉｂｏｓｉｄｉｆｉｃｕｓ （
Ｄノマイシン）、Ｓ、 ｃａｃａｏｉ ｖａｒ、 ａ
ｓｏｃｎｓｉｓ （ライソセリン）、Ｓ 、 ｃｉｎｎ
ａｍｏｎｅｎｓｉｓ （そネンンン）、Ｓ。
ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ （ナラジン）、Ｓ、ｇａｌ
ｌｉｎａｒｉｕｓ（ＲＰ ３０５０４ ）、Ｓ、Ｉｏｎ
ｇｗｏｏｃｌｃｎｓｉｓ （ライソセリン）、Ｓ、ｆｌ
ａｖｅｏｌｕｓ （ＣＰ ３８９３６）、Ｓｏｍｕｔａ
ｂｉｌｌｉｓ （Ｓ −１１７４３ａ ）、およびＳ、
ｖｉｏｌａｃｅｏｎｉｇｅｒ （＝ゲリシン）。
ｌｉｎａｒｉｕｓ（ＲＰ ３０５０４ ）、Ｓ、Ｉｏｎ
ｇｗｏｏｃｌｃｎｓｉｓ （ライソセリン）、Ｓ、ｆｌ
ａｖｅｏｌｕｓ （ＣＰ ３８９３６）、Ｓｏｍｕｔａ
ｂｉｌｌｉｓ （Ｓ −１１７４３ａ ）、およびＳ、
ｖｉｏｌａｃｅｏｎｉｇｅｒ （＝ゲリシン）。
グリコペプチド抗生物質を産生じ、本発明に係るベクタ
ーを特に有用に使用でき、形質転換できる好ましいＳｔ
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ類の非制限菌株宿主細胞には、例
えは以下のような微生物の非制限細胞が含才れる： Ｓ
、 ｏｒｉｅｎｔａ目ＳおよびＳ、＋１ａｒａ−ｎｏｍ
ａｃｈｉｅｎｓｉｓ （バンコマイシン） 、Ｓ 、ｃ
ａｎｄｉｄｕｓ（Ａ−３５５１２、アボパルシン）、お
よびＳ。
ーを特に有用に使用でき、形質転換できる好ましいＳｔ
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ類の非制限菌株宿主細胞には、例
えは以下のような微生物の非制限細胞が含才れる： Ｓ
、 ｏｒｉｅｎｔａ目ＳおよびＳ、＋１ａｒａ−ｎｏｍ
ａｃｈｉｅｎｓｉｓ （バンコマイシン） 、Ｓ 、ｃ
ａｎｄｉｄｕｓ（Ａ−３５５１２、アボパルシン）、お
よびＳ。
ｃｂｕｒｏｓｐｏｒｅｕｓ （Ｌ Ｌ −Ａ Ｍ ３７
４ ）。
４ ）。
本発明に係るベクターを特に有用に使用でき、形質転換
できる、その他の好ましいＳ ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
の非制限菌株宿主細胞には、例えば以下のような微生物
の非制限細胞が含まれる・Ｓ 、ｃｏｅｌ １ｃｏｌｏ
ｒ、Ｓ＋ｇｒａｎｕｌｏｒｕｂｃｒ１Ｓ、ｒｏｓｅｏｓ
ｐｏｒｕｓ 、 Ｓ。
できる、その他の好ましいＳ ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
の非制限菌株宿主細胞には、例えば以下のような微生物
の非制限細胞が含まれる・Ｓ 、ｃｏｅｌ １ｃｏｌｏ
ｒ、Ｓ＋ｇｒａｎｕｌｏｒｕｂｃｒ１Ｓ、ｒｏｓｅｏｓ
ｐｏｒｕｓ 、 Ｓ。
１ｉｖｉｄａｎｓ、 Ｓ、ｅｓｐｉｎｏｓｕｓ お、
よびＳ 、ａｚｕｒｅｕｓ 。
よびＳ 、ａｚｕｒｅｕｓ 。
本発明はＢａｃｉｌｌｕｓおよびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓにその使用が限定される訳ではなく、種々のＥ、ｃ
ｏｌｉ宿主細胞に使用することができる。好ましいＥ。
ｅｓにその使用が限定される訳ではなく、種々のＥ、ｃ
ｏｌｉ宿主細胞に使用することができる。好ましいＥ。
ｃｏｌ ｉ宿主細胞には、Ｅ、ｃｏｌ ｉ Ｋ １２、
Ｅ、ｃｏｌｉＫ１２Ｊ、Ａ２２１、Ｅ、ｃｏｌｉ Ｋｌ
２ ＨＢＩＱｌ 、Ｅ、ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｃ６０
０、Ｅ、ｃｏｌｉＫ１２ｃ６００Ｍｋ−Ｒｋ、 Ｅ、ｃ
ｏｌｉ Ｋ１２ Ｃ６００Ｍｋ” ｉｔ、−およびＥ、
ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＲＶ ３０８か含まれる。
Ｅ、ｃｏｌｉＫ１２Ｊ、Ａ２２１、Ｅ、ｃｏｌｉ Ｋｌ
２ ＨＢＩＱｌ 、Ｅ、ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｃ６０
０、Ｅ、ｃｏｌｉＫ１２ｃ６００Ｍｋ−Ｒｋ、 Ｅ、ｃ
ｏｌｉ Ｋ１２ Ｃ６００Ｍｋ” ｉｔ、−およびＥ、
ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＲＶ ３０８か含まれる。
本発明の態様は全て有用であるか、本発明の発現ベクタ
ーのうち畿つかのものが特に好ましい。
ーのうち畿つかのものが特に好ましい。
即ち好ましいベクターは、プラスミドｐＯＷ５２３、ｐ
ＯＷ５２４、ＰＯＷ５２６、ｐＯＷ５２７、ｐＯＷ５２
８、ＰＯＷ５２９およびｐ ＯＷ ５３０であり、好ま
しい形質転換体はＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ
Ｍｌ １１２／ ｐｏｗ ５２３、Ｂ 、 ｓｕｂｔｉ
ｌｉｓＭＩ １１２／ｐＯＷ５２４、Ｂ、 ５ｕｂＬｉ
ｌｉｓ Ｍ１１１２／ＰＯＷ５２５、）３．５ｕｂＬ
ｉｌ ｉｓ Ｍ Ｉ ｌ １２／ｐＯＷ５２６、Ｂ、
５ｕｂｔｉｌｉｓ〜１１１１２／ｐＯＷ５２７、Ｂ、５
ｕｂｔｉｌｉｓ Ｍｌ １１２ ／ ｐＯＷ ５２８、
Ｂ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｍｌ １１２ ／ ｐＯＷ
５２９およびＢ、５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｍｌ ｌ １２
／ ＰＯＷ ５３ Ｑである。
ＯＷ５２４、ＰＯＷ５２６、ｐＯＷ５２７、ｐＯＷ５２
８、ＰＯＷ５２９およびｐ ＯＷ ５３０であり、好ま
しい形質転換体はＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ
Ｍｌ １１２／ ｐｏｗ ５２３、Ｂ 、 ｓｕｂｔｉ
ｌｉｓＭＩ １１２／ｐＯＷ５２４、Ｂ、 ５ｕｂＬｉ
ｌｉｓ Ｍ１１１２／ＰＯＷ５２５、）３．５ｕｂＬ
ｉｌ ｉｓ Ｍ Ｉ ｌ １２／ｐＯＷ５２６、Ｂ、
５ｕｂｔｉｌｉｓ〜１１１１２／ｐＯＷ５２７、Ｂ、５
ｕｂｔｉｌｉｓ Ｍｌ １１２ ／ ｐＯＷ ５２８、
Ｂ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｍｌ １１２ ／ ｐＯＷ
５２９およびＢ、５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｍｌ ｌ １２
／ ＰＯＷ ５３ Ｑである。
これら奸才しい群の中でも、プラスミドｐＯＷ５２３、
ｐＯＷ５２５、ｐＯＷ５２７、およびＰＯＷ５２９、ま
た形質転換体Ｂ、ｓｕｂｔｉｌｉｓＭｌ １１２／Ｐ
ＯＷ５２３ 、 夏３． ５ｕｂｔｉｌ ｉｓ
Ｍ’ｌ、。
ｐＯＷ５２５、ｐＯＷ５２７、およびＰＯＷ５２９、ま
た形質転換体Ｂ、ｓｕｂｔｉｌｉｓＭｌ １１２／Ｐ
ＯＷ５２３ 、 夏３． ５ｕｂｔｉｌ ｉｓ
Ｍ’ｌ、。
１１２／ｐＯＷ５２５．１３．５ｕｂｔ １１１５Ｍ
Ｉ ］、 １２／ＰＯＷ５２７ およびＢ、 ５ｕｂｔ
ｉｌｉｓ Ｍｌ １１２ ／ｐＯＷ５２９が最も好まし
い。
Ｉ ］、 １２／ＰＯＷ５２７ およびＢ、 ５ｕｂｔ
ｉｌｉｓ Ｍｌ １１２ ／ｐＯＷ５２９が最も好まし
い。
本発明に係る組換えＤＮＡ発現ベクターおよび形質転換
体は広範な利用性を有し、特にＢａｃｉｌｌｕｓ内で使
用し得る発現ビヒクル（媒体）の必要性を満たすもので
ある。即ち本発明のベクターは、現在１“〕、 ｃｏｌ
ｉにおいて生合成されている物質のＢａｃｉｌｌｕｓ
における遺伝的発現および分泌を可能にするものである
。Ｂａｃｉｌｌｕｓの大規模発酵は、Ｅ、ｃｏｌｉの発
酵よりよく知られ、理解されているため、上記のことは
特に有利である。事実Ｅ、ｃｏｌ ｉの商業的発酵は、
今なお実験的であり困難を伴う。
体は広範な利用性を有し、特にＢａｃｉｌｌｕｓ内で使
用し得る発現ビヒクル（媒体）の必要性を満たすもので
ある。即ち本発明のベクターは、現在１“〕、 ｃｏｌ
ｉにおいて生合成されている物質のＢａｃｉｌｌｕｓ
における遺伝的発現および分泌を可能にするものである
。Ｂａｃｉｌｌｕｓの大規模発酵は、Ｅ、ｃｏｌｉの発
酵よりよく知られ、理解されているため、上記のことは
特に有利である。事実Ｅ、ｃｏｌ ｉの商業的発酵は、
今なお実験的であり困難を伴う。
本発明は、現在Ｅ、ｃｏｌｉにおいて生合成されている
物質、例えばヒトインシュリン、ヒトプロインシュリン
、グルカゴン、インターフェロン、ヒト成長ホルモン、
中成長ホルモン等をＢａｃｉｌｌｕｓにおいて産生させ
る別法を提供することにより、Ｌ記の問題を解決に導く
ものである。これは本発明のベクターが高度の利用性を
有し、上記生産物を暗号化するＤＮＡ配列を取り込むこ
とカタてき・ることから可能となる。このように、本発
明は宿主の選択における融通性があり、Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓをポリペプチドおよびその他の遺伝子産物の生合成に
使用する手段を提供するものである。
物質、例えばヒトインシュリン、ヒトプロインシュリン
、グルカゴン、インターフェロン、ヒト成長ホルモン、
中成長ホルモン等をＢａｃｉｌｌｕｓにおいて産生させ
る別法を提供することにより、Ｌ記の問題を解決に導く
ものである。これは本発明のベクターが高度の利用性を
有し、上記生産物を暗号化するＤＮＡ配列を取り込むこ
とカタてき・ることから可能となる。このように、本発
明は宿主の選択における融通性があり、Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓをポリペプチドおよびその他の遺伝子産物の生合成に
使用する手段を提供するものである。
本発明に係る形質転換体かポリペプチド産物を分泌する
能力は、商業的に有利である。例えは、ポリペプチドの
分離および精製は、宿主細胞を溶菌、破壊することなく
、発酵の間に連続的に行なうことができる。さらにこの
分子必によって、元来存在するプロテアーゼによる遺伝
子産物の蛋白分解的劣化が防御できる。非保護状態の外
来性ポリペプチドを速やかに消化するこのような酵素を
微生物が生産することは周知の事実である。本発明に係
る分泌方法は、蛋白分解的劣化を受ＴＪ易いポリペプチ
ドを、かかる劣イヒが起こる前に宿主細胞から融離させ
る手段を提供することによって、この問題を解決に導く
。これに加えて、細胞外分泌は細胞内蓄積に伴う細胞の
死滅および有害な影響を防ぐため、該宿主細胞は、その
遺伝子産物の毒性作用からも守られることになる。
能力は、商業的に有利である。例えは、ポリペプチドの
分離および精製は、宿主細胞を溶菌、破壊することなく
、発酵の間に連続的に行なうことができる。さらにこの
分子必によって、元来存在するプロテアーゼによる遺伝
子産物の蛋白分解的劣化が防御できる。非保護状態の外
来性ポリペプチドを速やかに消化するこのような酵素を
微生物が生産することは周知の事実である。本発明に係
る分泌方法は、蛋白分解的劣化を受ＴＪ易いポリペプチ
ドを、かかる劣イヒが起こる前に宿主細胞から融離させ
る手段を提供することによって、この問題を解決に導く
。これに加えて、細胞外分泌は細胞内蓄積に伴う細胞の
死滅および有害な影響を防ぐため、該宿主細胞は、その
遺伝子産物の毒性作用からも守られることになる。
プラスミドＰＥＬ １０３ 、ｐｉ−１１−１６、ｐＭ
８４８０、ｌ）ＭＣ１４０３およびｐＯＷ６０１ の
各供給源であるＳＬｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒａｎｕ
ｌｏｒｕｂｃｒＮｏ、 Ａ３９９１２ 、１３／ｐＥＬ
１０３ 、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｍｌ
ｌ １２／ ｐＦＩｌ −１６、Ｅ、ｃｏｌｉＫ １
２ ＪＡ２２１／ｐＭＳ ４８０、Ｅ、ｃｏｌｉ Ｋ
１２１λＥ９０４／ｐＭｃ１４０３およびＥ、ｃｏｌｉ
Ｋ１２ＪＡ２２１／ＰＯＷ６０１ならひにＳｔｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓは、幾つかの異な
る培地のいずれかを使用して多（の方法で培養できる。
８４８０、ｌ）ＭＣ１４０３およびｐＯＷ６０１ の
各供給源であるＳＬｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒａｎｕ
ｌｏｒｕｂｃｒＮｏ、 Ａ３９９１２ 、１３／ｐＥＬ
１０３ 、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｍｌ
ｌ １２／ ｐＦＩｌ −１６、Ｅ、ｃｏｌｉＫ １
２ ＪＡ２２１／ｐＭＳ ４８０、Ｅ、ｃｏｌｉ Ｋ
１２１λＥ９０４／ｐＭｃ１４０３およびＥ、ｃｏｌｉ
Ｋ１２ＪＡ２２１／ＰＯＷ６０１ならひにＳｔｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓは、幾つかの異な
る培地のいずれかを使用して多（の方法で培養できる。
培地の炭水化物涙として好適なものには、例えば糖蜜、
グルコース、デキストリン、およびグリセロールがあり
、窒素源には大豆粉、アミノ酸混合物およびペプトンが
ある。栄養無機塩類もまた添加され、これにはナトリφ
ム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、リン酸、塩
化物、硫酸塩等のイオンを生成する通常の塩類が含まれ
る。他の微生物の発育と増殖に必要であるように、必須
微量元素もまた添加される。こうした微量元素は、通常
、他の培地成分の添加に付随する不純物の形で供給され
る。
グルコース、デキストリン、およびグリセロールがあり
、窒素源には大豆粉、アミノ酸混合物およびペプトンが
ある。栄養無機塩類もまた添加され、これにはナトリφ
ム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、リン酸、塩
化物、硫酸塩等のイオンを生成する通常の塩類が含まれ
る。他の微生物の発育と増殖に必要であるように、必須
微量元素もまた添加される。こうした微量元素は、通常
、他の培地成分の添加に付随する不純物の形で供給され
る。
Ｓｉｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒａｎｕｌｏｒｕｂｅ
ｒ Ｎｏ、Ａ３９９１２゜１３／ｐＥＬ１０３は約ｐ
Ｈ５〜９という比較的広いｐＨ領域の下で、約１５〜４
０℃の温度範囲において、好気的培養条件下に成育する
。しかしながらプラスミドＰＥＬ１０３を最大収量で生
産するためには、培地のｐＨを約７．２で培養を開始し
、培地の温度を約３０℃に保つことが望ましい。上記の
条件でＳｔｒｅｐｉｏｍｙｃｅｓ ’ｇｒａｎｕｒｏｌ
ｕｂｅｒ Ｎｏ。
ｒ Ｎｏ、Ａ３９９１２゜１３／ｐＥＬ１０３は約ｐ
Ｈ５〜９という比較的広いｐＨ領域の下で、約１５〜４
０℃の温度範囲において、好気的培養条件下に成育する
。しかしながらプラスミドＰＥＬ１０３を最大収量で生
産するためには、培地のｐＨを約７．２で培養を開始し
、培地の温度を約３０℃に保つことが望ましい。上記の
条件でＳｔｒｅｐｉｏｍｙｃｅｓ ’ｇｒａｎｕｒｏｌ
ｕｂｅｒ Ｎｏ。
Ａ３９９１２．１３／ｐＥＬ１０３を培養すれば、プラ
スミドｐＥＬ １０３を当業者周知の技術で常法通り分
離し得る細胞の保有体が得られる。
スミドｐＥＬ １０３を当業者周知の技術で常法通り分
離し得る細胞の保有体が得られる。
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｍｌ ｌ
ｌ ２／ｐＩ■−１６は約ｐＨ５〜８．５ という比較
的広いｐＨ領域の下で、約２５〜４５℃の温度範囲にお
いて、好気的培養条件下に成育する。しかしながらプラ
スミドｐＨｌ−１５を最大収量で生産するためには、培
地のｐＨを約７で培養を開始し、培地の温度を約３７′
Ｃに保つことか望ましい。上記の条件でＩ％ａｃｉｌｌ
ｕｓ ５ｕｂＬｉｌｉｓ Ｍｌ １１２／ｐＨ１−１
６を培養ずれは、プラスミドｐＨｌ−１６を当業者周知
の技術で常法通り分離し得る細胞の保有体が得られる。
ｌ ２／ｐＩ■−１６は約ｐＨ５〜８．５ という比較
的広いｐＨ領域の下で、約２５〜４５℃の温度範囲にお
いて、好気的培養条件下に成育する。しかしながらプラ
スミドｐＨｌ−１５を最大収量で生産するためには、培
地のｐＨを約７で培養を開始し、培地の温度を約３７′
Ｃに保つことか望ましい。上記の条件でＩ％ａｃｉｌｌ
ｕｓ ５ｕｂＬｉｌｉｓ Ｍｌ １１２／ｐＨ１−１
６を培養ずれは、プラスミドｐＨｌ−１６を当業者周知
の技術で常法通り分離し得る細胞の保有体が得られる。
１’：、 ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＪＡ２２１／ＰＭ
Ｓ ４８０．Ｅ。
Ｓ ４８０．Ｅ。
ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＢＥ９０４／ｐＭｃ１４０３およ
びｉｇ。
びｉｇ。
ｃｏｌｉ Ｋ １２ ＪＡ２２１ ／ｐＯＷ６０１のそ
れぞれは、約ｐｉ−１５，５〜８という比較的広いｐＨ
領域のドで、約２５〜４０℃の温度範囲において、好気
下 的培養条件に成育する。しかしながらプラスミド△ ＰＭＳ ４８０、ｐＭｃ１４０３およびＰＯＷ５Ｑｌの
それぞれを最大収量で生産するためには、培地のｐＩ■
を約７．２で培養を開始し、培地の温度を約３７℃に保
つことか望ましい。上記の条件てＥ。
れぞれは、約ｐｉ−１５，５〜８という比較的広いｐＨ
領域のドで、約２５〜４０℃の温度範囲において、好気
下 的培養条件に成育する。しかしながらプラスミド△ ＰＭＳ ４８０、ｐＭｃ１４０３およびＰＯＷ５Ｑｌの
それぞれを最大収量で生産するためには、培地のｐＩ■
を約７．２で培養を開始し、培地の温度を約３７℃に保
つことか望ましい。上記の条件てＥ。
ｃｏｌ ｉ細胞を培養すれば、各々のプラスミドを当業
者周知の技術で常法通り分離し得る細胞の保有体が得ら
れる。
者周知の技術で常法通り分離し得る細胞の保有体が得ら
れる。
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。
本発明の説明および本発明を構成する実際の手法を適宜
述べた。
述べた。
実施例１ プラスミドｐＯＷＩＱの組み立てＡ、プラス
ミドｐＭｓ４８０の〜、３８ｋｂＥｃｏＲＩ−８ｆａＮ
ｌフラグメントの組み立て１、プラスミドｐＭ５４８０
の単離 細菌Ｅ、ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＪＡ２２１／ＰＭＳ４８０
（ＮＲＲＬ Ｂ−１５２５８）を、１００ ｔｔ ｇ
ｌ ｍｌの抗生物質アンピシリンを含んだ゛ｒＹグロ
ス（１％トリプトン１．５％酵母エキス１．５係塩化ナ
トリウム、ｐｉ（７）中、通常の微生物学的手法に従っ
て培養した。１８時間インキュベートした後、培養物、
５ｍｌを１．５ｍ１．のエツペンドルフチューブに移し
１５秒間遠心した。特に明記しない限り、全ての操作は
周囲温度で行なった。生成した」二澄液を先端の細いア
スペレーターを用いて注意深く除き、細胞ペレットを、
２”／／ｄのりゾチーム、５０ｍＭのグルコース、ｌ
Ｑ ｍＭ’（１） ＥＤＴＡ （エチＬｚンジアミン
テトラアセテート）および２５ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ
８）を含有する調製したはかりのリゾチーム溶液約１０
０μＩに懸濁した。０℃で３０分間インキュベートした
後、アルカリ性・Ｓ Ｌ） Ｓ （ドデシル硫酸ナトリ
ウム）溶液（，２ＮＮａＯ〔［、ｘ％５Ｉ）Ｓ）約２０
０ ｔｔｌを加え、デユープをゆっくり回転させ、５分
間ｏ℃に保った。
ミドｐＭｓ４８０の〜、３８ｋｂＥｃｏＲＩ−８ｆａＮ
ｌフラグメントの組み立て１、プラスミドｐＭ５４８０
の単離 細菌Ｅ、ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＪＡ２２１／ＰＭＳ４８０
（ＮＲＲＬ Ｂ−１５２５８）を、１００ ｔｔ ｇ
ｌ ｍｌの抗生物質アンピシリンを含んだ゛ｒＹグロ
ス（１％トリプトン１．５％酵母エキス１．５係塩化ナ
トリウム、ｐｉ（７）中、通常の微生物学的手法に従っ
て培養した。１８時間インキュベートした後、培養物、
５ｍｌを１．５ｍ１．のエツペンドルフチューブに移し
１５秒間遠心した。特に明記しない限り、全ての操作は
周囲温度で行なった。生成した」二澄液を先端の細いア
スペレーターを用いて注意深く除き、細胞ペレットを、
２”／／ｄのりゾチーム、５０ｍＭのグルコース、ｌ
Ｑ ｍＭ’（１） ＥＤＴＡ （エチＬｚンジアミン
テトラアセテート）および２５ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ
８）を含有する調製したはかりのリゾチーム溶液約１０
０μＩに懸濁した。０℃で３０分間インキュベートした
後、アルカリ性・Ｓ Ｌ） Ｓ （ドデシル硫酸ナトリ
ウム）溶液（，２ＮＮａＯ〔［、ｘ％５Ｉ）Ｓ）約２０
０ ｔｔｌを加え、デユープをゆっくり回転させ、５分
間ｏ℃に保った。
次いで、酢酸ナトリウム３モルを最少量の水に溶かし、
氷酢酸でｐｉ−１４，８に調節し、容量を１１に調節す
ることにより調製した３Ｍ酢酸ナトリウム約１５０ｚｉ
を、チューブの内容物を２．３秒間静か（こ転倒させて
混合することにより形成した１）ＮＡのかたまりに加え
た。
氷酢酸でｐｉ−１４，８に調節し、容量を１１に調節す
ることにより調製した３Ｍ酢酸ナトリウム約１５０ｚｉ
を、チューブの内容物を２．３秒間静か（こ転倒させて
混合することにより形成した１）ＮＡのかたまりに加え
た。
チューブを６０分間０℃に保ち、５分間遠心するとほと
んど澄明な上澄液が得られた。この上澄液約、４ ｍｌ
を第２の遠心管に移し、それに冷エタノール１ ｒｎｌ
、を加えた。遠心管を３０分間−２０℃に保った後、得
られた沈殿を遠心分離して（２分間）集め、上澄液をア
スピレータ−で除去した。
んど澄明な上澄液が得られた。この上澄液約、４ ｍｌ
を第２の遠心管に移し、それに冷エタノール１ ｒｎｌ
、を加えた。遠心管を３０分間−２０℃に保った後、得
られた沈殿を遠心分離して（２分間）集め、上澄液をア
スピレータ−で除去した。
この様にして巣めたペレットを、ＩＭ酢酸ナトリ’）ム
／ 、０５Ｍ ト’Ｊ ス塩酸（ｐＩ（ｓ ） ２０
（Ｊｔｔｌに溶解し、２倍量の冷エタノールを加えて再
沈殿させた。１゛０分間−２０℃に放置した後、沈殿を
遠心して集めたところ、これは所望のプラスミドｐＭＳ
４８０ ＤＮＡで構成されていた。
／ 、０５Ｍ ト’Ｊ ス塩酸（ｐＩ（ｓ ） ２０
（Ｊｔｔｌに溶解し、２倍量の冷エタノールを加えて再
沈殿させた。１゛０分間−２０℃に放置した後、沈殿を
遠心して集めたところ、これは所望のプラスミドｐＭＳ
４８０ ＤＮＡで構成されていた。
２、 プラスミドｐＭＳ ４８Ｑ のＥｃｏＲＩ−３ｆ
ａＮｌ消化 ＴＥ緩衝液（ｌＱｍＭ トリス塩酸、ｐｌ−１８，１ｍ
ＭＥＤＴＡ）中のプラスミドｐＭＳ４８０（実施例Ａ−
１で単離したもの）約５μ／？（５μｇ）、ＤＴＴ（１
００ｍＭジチオトレイット）５μＪ１ＢＳＡ（牛血清７
／ｌ／フミン） ５ μｚ （１０００ｘ１ｇ／ｄ）、
水２５ Ｉｌｌ、Ｅ ｃｏＲＩ 制限酵素＜５μｌ（
５Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ単位）およ
び１０ｘ反応ミックス′＜ｊ３５μｌ を３７℃で約１
時間インキュベートした。次いで６５℃で１ｏ分間イン
キュベートして反応を停止させた。反応混合物を氷Ｊ−
，で冷却し、５ＭＮａＣＪ １．１ ｌｉｅ、水４ｔｔ
ｌおよびＳ ｆ ａ Ｎ Ｉ 制限酵素５ ｔｌｌ
（５ＮｅｗＥｎｇｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ単位）を
加えた後３７℃で１時間インキュベートした。６５℃で
１時間インキュベートして反応を停止させ、反応混合物
を氷」ニで冷却り、フェノールおよびクロロホルム：イ
ソアミルアルコール（２４： １ ）の混液で抽出し、
エク／−ル沈殿に付した。所望の〜、３Ｂ ｋｂ Ｉζ
ｃ。
ａＮｌ消化 ＴＥ緩衝液（ｌＱｍＭ トリス塩酸、ｐｌ−１８，１ｍ
ＭＥＤＴＡ）中のプラスミドｐＭＳ４８０（実施例Ａ−
１で単離したもの）約５μ／？（５μｇ）、ＤＴＴ（１
００ｍＭジチオトレイット）５μＪ１ＢＳＡ（牛血清７
／ｌ／フミン） ５ μｚ （１０００ｘ１ｇ／ｄ）、
水２５ Ｉｌｌ、Ｅ ｃｏＲＩ 制限酵素＜５μｌ（
５Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ単位）およ
び１０ｘ反応ミックス′＜ｊ３５μｌ を３７℃で約１
時間インキュベートした。次いで６５℃で１ｏ分間イン
キュベートして反応を停止させた。反応混合物を氷Ｊ−
，で冷却し、５ＭＮａＣＪ １．１ ｌｉｅ、水４ｔｔ
ｌおよびＳ ｆ ａ Ｎ Ｉ 制限酵素５ ｔｌｌ
（５ＮｅｗＥｎｇｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ単位）を
加えた後３７℃で１時間インキュベートした。６５℃で
１時間インキュベートして反応を停止させ、反応混合物
を氷」ニで冷却り、フェノールおよびクロロホルム：イ
ソアミルアルコール（２４： １ ）の混液で抽出し、
エク／−ル沈殿に付した。所望の〜、３Ｂ ｋｂ Ｉζ
ｃ。
Ｒ１−５ｆａＮｌ 制限フラグメントを常法に従って
分離し、アガロースゲル電気泳動て単離した（ｔＶＩａ
ｎ ｌ ａ Ｌ Ｉ Ｓら、１９８２、Ｍｏ１ｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ。
分離し、アガロースゲル電気泳動て単離した（ｔＶＩａ
ｎ ｌ ａ Ｌ Ｉ Ｓら、１９８２、Ｍｏ１ｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ。
Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ １ｌａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ） 。所望の〜、３８ｋｌ〕フ
ラグメントは水約３０μｌに溶解した。
ｏｒａｔｏｒｙ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ） 。所望の〜、３８ｋｌ〕フ
ラグメントは水約３０μｌに溶解した。
※制限酵素およびその他の酵素は下記の供給源から入手
できる： Ｎｅｗ Ｉｉｎｇｌａｎｄ １３ｉｏ Ｊａｂｓ、Ｉ
ｎｃ、、 ３２ Ｔｏｙ、ｅｒＲｏａｄ ｌ５ｅｖｅ
ｒｌｙ、 Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｏ１９１５お
よび１３ｏｃｈｒｉｎｇｅｒ −Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂ
ｉｏｃｈｃｍｉｃａｌｓ 。
できる： Ｎｅｗ Ｉｉｎｇｌａｎｄ １３ｉｏ Ｊａｂｓ、Ｉ
ｎｃ、、 ３２ Ｔｏｙ、ｅｒＲｏａｄ ｌ５ｅｖｅ
ｒｌｙ、 Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｏ１９１５お
よび１３ｏｃｈｒｉｎｇｅｒ −Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂ
ｉｏｃｈｃｍｉｃａｌｓ 。
７ ｇ ４１ Ｃａｓｔｌｃｗａｙ Ｉ）ｒｉｖｅ
Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ。
Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ。
Ｉｎｄｉａｎａ ４６２５０
ミ＜；Ｋ Ｉ’、 ｃｏ ＲＩ制限酵素用の反応ミック
ス（１０ｘ）は以下の成分で調製した：５００ｍＭ
ＮａＣｌ！、１０００ｍＭトリス塩酸（ＰＨ７，２）
および５０ＩＴＩＭ ＭｇＣＪ２ Ｂ、プラスミドｐＯＷ６０１ の〜４． ｋ ｌ）
Ｅｃｏ Ｒ１−Ｎｃｏｌフラグメントの組み立て ■、プラスミドｐｏｗ ６０１ の分離プラスミドＩ）
ＯＷ６０１はＥ、ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＪＡ２２１／ｐ
ＯＷ６０ｉ （ＮＲＲＩ−Ｂ−１−５２５９） から分
離する。実施例ＩＡ−１と同様にしてこの菌株を培養し
、プラスミドを分離した。
ス（１０ｘ）は以下の成分で調製した：５００ｍＭ
ＮａＣｌ！、１０００ｍＭトリス塩酸（ＰＨ７，２）
および５０ＩＴＩＭ ＭｇＣＪ２ Ｂ、プラスミドｐＯＷ６０１ の〜４． ｋ ｌ）
Ｅｃｏ Ｒ１−Ｎｃｏｌフラグメントの組み立て ■、プラスミドｐｏｗ ６０１ の分離プラスミドＩ）
ＯＷ６０１はＥ、ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＪＡ２２１／ｐ
ＯＷ６０ｉ （ＮＲＲＩ−Ｂ−１−５２５９） から分
離する。実施例ＩＡ−１と同様にしてこの菌株を培養し
、プラスミドを分離した。
２、 プラスミド１）ＯＷ６０１のＥｃｏＲＩ −Ｎｃ
ｏ １〆肖化 プラスミドＰＭＳ４８０ の代りにプラスミドＰＯＷ
６０１ を使用するほがは実施例ＩＡ−２と実質的に
同様にして消化を行なう。
ｏ １〆肖化 プラスミドＰＭＳ４８０ の代りにプラスミドＰＯＷ
６０１ を使用するほがは実施例ＩＡ−２と実質的に
同様にして消化を行なう。
Ｃ，Ｉ）ＮＡフラグメントの組み立て
〔丑記式中、ＲはＧでありＲ１はＣである〕この組み立
ては、以下Ｃ２示すオリゴヌクレオチドＴ１およびＴ
２の合成と５′燐酸化によって行なう。
ては、以下Ｃ２示すオリゴヌクレオチドＴ１およびＴ
２の合成と５′燐酸化によって行なう。
−ｒｌ ： ５’ ＡＧＴＧＡＧＧ’ｒＧＧＡ’１
−ＧＣ３’１′２ ５′ ＣＡＴＧＧＣＡＴＣＣＡＣＣ
Ｔ ３′オリコヌクレオチド′Ｉ゛１および１゛２を、
Ｎｃｏｌ粘着末端を持った所望のＩ） Ｎ Ａフラグメ
ントを組み立てる為に使用した。このオリゴヌクレオチ
ド合成は、完全に保護されたデオキシリボヌクレオチド
組み立てブロックを使用し、改良ホスホトリエステル法
により常法通りに行なった。
−ＧＣ３’１′２ ５′ ＣＡＴＧＧＣＡＴＣＣＡＣＣ
Ｔ ３′オリコヌクレオチド′Ｉ゛１および１゛２を、
Ｎｃｏｌ粘着末端を持った所望のＩ） Ｎ Ａフラグメ
ントを組み立てる為に使用した。このオリゴヌクレオチ
ド合成は、完全に保護されたデオキシリボヌクレオチド
組み立てブロックを使用し、改良ホスホトリエステル法
により常法通りに行なった。
」二の合成は、添付の図面の第３図に要約したフラグメ
ントＴ１について以下に述べる方法で代表される。図中
、Ｔ□の合成に使用される各種のヌクレオチドフラグメ
ントに番号を伺した。使用した略号（コリ、下の通りで
ある二ＭＳ−Ｉ’ｅ−メシチレンスルホニルテトラゾー
ル Ｂ Ｓ Ａ−ベンゼンスルホン酸、ｌ” Ｌ Ｃｗ
薄層クロマトグラフィー、ｌＩＰ Ｌ Ｃ−高速液体ク
ロマトクラフィー、Ｉ） Ｍ Ｔ＝４．４’−ジメトキ
シトリチル、ＣＥ＝２−シアノエチル、Ｒ＝ｐ−クロロ
フェニル、Ｂｌ−ベンゾイル （Ｙ）２ＮＨ＝ ジイ
ソプロピルアミン、１１３ｕ−イソブチリル、Ｐγ：ピ
リジン、Ａｃ０Ｈ−酢酸。
ントＴ１について以下に述べる方法で代表される。図中
、Ｔ□の合成に使用される各種のヌクレオチドフラグメ
ントに番号を伺した。使用した略号（コリ、下の通りで
ある二ＭＳ−Ｉ’ｅ−メシチレンスルホニルテトラゾー
ル Ｂ Ｓ Ａ−ベンゼンスルホン酸、ｌ” Ｌ Ｃｗ
薄層クロマトグラフィー、ｌＩＰ Ｌ Ｃ−高速液体ク
ロマトクラフィー、Ｉ） Ｍ Ｔ＝４．４’−ジメトキ
シトリチル、ＣＥ＝２−シアノエチル、Ｒ＝ｐ−クロロ
フェニル、Ｂｌ−ベンゾイル （Ｙ）２ＮＨ＝ ジイ
ソプロピルアミン、１１３ｕ−イソブチリル、Ｐγ：ピ
リジン、Ａｃ０Ｈ−酢酸。
完全に保護されたデオキシリボテトラヌクレオチド２（
３１２ｍＰ１，１５ｒｆｕｎｏＪ） およびデオキシ
リボヌクレオチド４ （５０〃％’１，０１７ｍｒｎｏ
ｌ）をクロロホルム／メタノール（７： ３ （Ｖ／Ｖ
）、それぞれ２ｒｎｌと１．Ｊ）の混液中、２ ％ Ｂ
Ｓ Ａを用いて０℃で１０分間処理して５′水酸基を
脱保護する。飽和重炭酸アンモニウム水（２ｍＩＶ）を
加えて反応を停止し、クロロホルム（２５Ｊ ）で抽出
し、水洗する（２ｘｌＯ−）。有機層を乾燥しく硫酸マ
グネシウム）、少量（約５−）になるまで濃縮し、石油
エーテル（３５〜６０℃の留分）を加えて沈殿させる。
３１２ｍＰ１，１５ｒｆｕｎｏＪ） およびデオキシ
リボヌクレオチド４ （５０〃％’１，０１７ｍｒｎｏ
ｌ）をクロロホルム／メタノール（７： ３ （Ｖ／Ｖ
）、それぞれ２ｒｎｌと１．Ｊ）の混液中、２ ％ Ｂ
Ｓ Ａを用いて０℃で１０分間処理して５′水酸基を
脱保護する。飽和重炭酸アンモニウム水（２ｍＩＶ）を
加えて反応を停止し、クロロホルム（２５Ｊ ）で抽出
し、水洗する（２ｘｌＯ−）。有機層を乾燥しく硫酸マ
グネシウム）、少量（約５−）になるまで濃縮し、石油
エーテル（３５〜６０℃の留分）を加えて沈殿させる。
無色の沈殿を遠心して集め、減圧下デシケータに入れて
乾燥してそれぞれ６および８を得る。これらは共にシリ
カゲルｌ’Ｌｃ（Ｍｅｒｃｋ ６０１’ ２５４ 、ク
ロロホルム／メタノール＝９／１ ）ζこおいて均一で
ある。
乾燥してそれぞれ６および８を得る。これらは共にシリ
カゲルｌ’Ｌｃ（Ｍｅｒｃｋ ６０１’ ２５４ 、ク
ロロホルム／メタノール＝９／１ ）ζこおいて均一で
ある。
テトラマー１および３ （４００）ｔｒｙｌ、］ ７ｍ
ｍｏ ｌ ；１００■１．０４３ｍｍ０／ｌ’）を周囲
温度でジイソプロピルアミン／ピリジン（１： ５ Ｃ
Ｖ／Ｖ）、２−）で３０分間処理してホスホジエステル
（５おヨヒ６）に変換する。反応混合物に無水エーテル
（２０ｍｂ ）を加えて沈殿を生じさせる。遠心して試
薬を除き、」二澄液をデカントする。残渣を、これに無
水ピリジンを加えて蒸発させることにより乾燥する。ダ
イマーＢ （，０４ｍｍｏｌ） とテトラマー７を、
無水ピリジン（１ｍ／、 ）中、ＭＳ−Ｉ−ｃ （６５
＋１ｉｙ１．２５ｍｍｏＪ ） を用いて結合させ、
反応混合物を周囲温度で２時間放置する。ＴＬＣ分析の
結果、９５％のタイマー８がヘキサマー生成物に変換し
たことかわかった（１０％硫酸水を噴霧し、１００′Ｃ
で加熱することによりＤＭ丁基を肉眼で検出する）。反
応混合物にエーテルを加えて沈殿させ、上澄液をデカン
トする。ダイマー４およびテトラマー２について」−で
説明した如く、このヘキサマーの５′位を２％Ｂ Ｓ
Ａ （８ｍｌ）で脱保護する。シリカゲルカラム（Ｍｅ
ｒｃｋ ６０Ｉ−１，３，５Ｘ５（Ｊｌ＋）を用い、ク
ロロホルム／メタノール（９８：２〜９５゛５、（Ｖ／
Ｖ））による段階的グラジェント溶！１３ ｉこより生
成物１０を精製する。生成物１０を含んでいるフラクシ
ョンを蒸発乾固する。
ｍｏ ｌ ；１００■１．０４３ｍｍ０／ｌ’）を周囲
温度でジイソプロピルアミン／ピリジン（１： ５ Ｃ
Ｖ／Ｖ）、２−）で３０分間処理してホスホジエステル
（５おヨヒ６）に変換する。反応混合物に無水エーテル
（２０ｍｂ ）を加えて沈殿を生じさせる。遠心して試
薬を除き、」二澄液をデカントする。残渣を、これに無
水ピリジンを加えて蒸発させることにより乾燥する。ダ
イマーＢ （，０４ｍｍｏｌ） とテトラマー７を、
無水ピリジン（１ｍ／、 ）中、ＭＳ−Ｉ−ｃ （６５
＋１ｉｙ１．２５ｍｍｏＪ ） を用いて結合させ、
反応混合物を周囲温度で２時間放置する。ＴＬＣ分析の
結果、９５％のタイマー８がヘキサマー生成物に変換し
たことかわかった（１０％硫酸水を噴霧し、１００′Ｃ
で加熱することによりＤＭ丁基を肉眼で検出する）。反
応混合物にエーテルを加えて沈殿させ、上澄液をデカン
トする。ダイマー４およびテトラマー２について」−で
説明した如く、このヘキサマーの５′位を２％Ｂ Ｓ
Ａ （８ｍｌ）で脱保護する。シリカゲルカラム（Ｍｅ
ｒｃｋ ６０Ｉ−１，３，５Ｘ５（Ｊｌ＋）を用い、ク
ロロホルム／メタノール（９８：２〜９５゛５、（Ｖ／
Ｖ））による段階的グラジェント溶！１３ ｉこより生
成物１０を精製する。生成物１０を含んでいるフラクシ
ョンを蒸発乾固する。
同様にして、テトラマー５をテトラマー６と結合させ、
完全に保護された生成物をシリカゲルで直接精製する。
完全に保護された生成物をシリカゲルで直接精製する。
この化合物の３′末端を、既述した如くジイソプロピル
アミン／ピリジンで脱保護してフラグメント９を得る。
アミン／ピリジンで脱保護してフラグメント９を得る。
最後にオクトマー９とヘキサマー１０を無水ピリジン（
，５ｄ）中、縮合剤としテＭＳＴｃ （１００ｍ１ｉＩ
１．３９ｍｍｏ７ ） を用イテ結合すセル。反応Ｆ
。
，５ｄ）中、縮合剤としテＭＳＴｃ （１００ｍ１ｉＩ
１．３９ｍｍｏ７ ） を用イテ結合すセル。反応Ｆ
。
了後（４５分、周囲温度）、混合物をロータＩＪ−エバ
ポレーターで濃縮し、残留物をシリカゲルクロマトグラ
フィーに付す。ピリジン（，５ｎ＋７）中の化合物１．
１ （２０７”ｎを濃水酸化アンモニウムで処理し７（
７−１８時間、６０ ’Ｃ）、次いて８０係酢酸で処理
して（１５分、周囲温度）完全に脱保護する。酢酸を蒸
発させた後、固形残留物を蒸留水（２−）に溶解し、エ
チルエーテルで抽出する（３×２ｒｎｌ）。水層を濃縮
乾固し、５０％ピリジン／水に溶解する一生成物をポリ
エチレンイミン−セルロース（ＰＥＩ／Ｕｖ２５４）の
プレパラテイブ薄層クロマトグラフィー用プレート（Ｎ
ａｒａｎｇＳ、Ａ、ら、１９８０、Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｙ、ｙｍｏｌｏｇｙ６５ ： ６１０ ）次
いで逆相Ｃ−１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ）を使ったＨＰ
ＬＣにより精製する。化合物１２の配列は２次元配列分
析により確認する。
ポレーターで濃縮し、残留物をシリカゲルクロマトグラ
フィーに付す。ピリジン（，５ｎ＋７）中の化合物１．
１ （２０７”ｎを濃水酸化アンモニウムで処理し７（
７−１８時間、６０ ’Ｃ）、次いて８０係酢酸で処理
して（１５分、周囲温度）完全に脱保護する。酢酸を蒸
発させた後、固形残留物を蒸留水（２−）に溶解し、エ
チルエーテルで抽出する（３×２ｒｎｌ）。水層を濃縮
乾固し、５０％ピリジン／水に溶解する一生成物をポリ
エチレンイミン−セルロース（ＰＥＩ／Ｕｖ２５４）の
プレパラテイブ薄層クロマトグラフィー用プレート（Ｎ
ａｒａｎｇＳ、Ａ、ら、１９８０、Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｙ、ｙｍｏｌｏｇｙ６５ ： ６１０ ）次
いで逆相Ｃ−１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ）を使ったＨＰ
ＬＣにより精製する。化合物１２の配列は２次元配列分
析により確認する。
次いでオリゴヌクレオチドＴ２を組み立てた。
これは、上記オリゴヌクレオチドＴ□の合成法と実質的
に同様にして行なった。
に同様にして行なった。
得られたオリゴヌクレオチドＴ□および］”２１０μに
づつを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼの存在下、（ｒ
−３２ｐ ）−ＡＴＰ （Ｎｅｗ ＥｎｇｌａｎｄＮ
ｕｃｌｅａｒ ） を用いて定量的に燐酸化すると比
活性が約Ｉ Ｃｉ ／ｍｍｏ ｌのものが得られる。放
射線標識フラグメントを２０％ポリアクリルアミド／７
Ｍ尿素ゲル電気泳動法によって精製し、溶出したフラグ
メントの配列を部分的蛇毒消化物の２次元電気泳動／ホ
モクロマトグラフィー（Ｊａｙう、１９７４、Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ ａｃｉｄｓ、Ｒｅｓ、ｌ ：３３１）番こよ
り確認した。次いでフラグメントＴ１およびＴ２を常法
によりアニーリングし、所望のＤＮＡフラグメントを得
た。
づつを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼの存在下、（ｒ
−３２ｐ ）−ＡＴＰ （Ｎｅｗ ＥｎｇｌａｎｄＮ
ｕｃｌｅａｒ ） を用いて定量的に燐酸化すると比
活性が約Ｉ Ｃｉ ／ｍｍｏ ｌのものが得られる。放
射線標識フラグメントを２０％ポリアクリルアミド／７
Ｍ尿素ゲル電気泳動法によって精製し、溶出したフラグ
メントの配列を部分的蛇毒消化物の２次元電気泳動／ホ
モクロマトグラフィー（Ｊａｙう、１９７４、Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ ａｃｉｄｓ、Ｒｅｓ、ｌ ：３３１）番こよ
り確認した。次いでフラグメントＴ１およびＴ２を常法
によりアニーリングし、所望のＤＮＡフラグメントを得
た。
Ｄ、１）プラスミドｐＭｓ４８０の〜、３ＢｋｂＥｃｏ
ＲＩ−５ｆａＮＩ フラグメント、２）プラスミドｐ
ＯＷ ６０１ の〜４ｋｂＥｃｏＲＩ−Ｎｃｏｌフラグ
メントおよび３）実施例ＩＣの合成りＮＡフラグメント
のライゲーション（結紮、結合）によるプラスミドｐＯ
Ｗ１０の組み立ておよびＥ 、 ｃｏｌ １Ｋ１２
ＪＡ２２１／ＰＯＷ １０ の組み立てプラスミドｐＭ
ｓ ４８０の〜、３８ ｋｂ ＥｃＯＲｌ−３ｆａＮＩ
フラグメント約８ｔｔｌ （，０１μｇ）、プラスミド
ｐＯＷ６０１ の〜４ｋｂ’ ＥｃｏＲＩ −ＮＣＯＩ
フラグメント８μｌ （，１０μｇ）、実施例ＩＣのＤ
ＮＡフラグメント１０μｌ （，７μｇ）、水１０ｐ１
．（１０ｍＭ）ＡＴｉ’４ｔｔｌ、（１００ｍＭ）
ジＱｔ ） レイット（ＤＴＴ）２．５μ１１ ライゲ
ーションミックス５μｌおよびＴ４ＤＮΔリガーゼ※２
．５ ｆｉ ｌ （〜２ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂ
ｉｏ ｊａｂ単位）を１６°Ｃで約１６時間インキュベ
ートする。
ＲＩ−５ｆａＮＩ フラグメント、２）プラスミドｐ
ＯＷ ６０１ の〜４ｋｂＥｃｏＲＩ−Ｎｃｏｌフラグ
メントおよび３）実施例ＩＣの合成りＮＡフラグメント
のライゲーション（結紮、結合）によるプラスミドｐＯ
Ｗ１０の組み立ておよびＥ 、 ｃｏｌ １Ｋ１２
ＪＡ２２１／ＰＯＷ １０ の組み立てプラスミドｐＭ
ｓ ４８０の〜、３８ ｋｂ ＥｃＯＲｌ−３ｆａＮＩ
フラグメント約８ｔｔｌ （，０１μｇ）、プラスミド
ｐＯＷ６０１ の〜４ｋｂ’ ＥｃｏＲＩ −ＮＣＯＩ
フラグメント８μｌ （，１０μｇ）、実施例ＩＣのＤ
ＮＡフラグメント１０μｌ （，７μｇ）、水１０ｐ１
．（１０ｍＭ）ＡＴｉ’４ｔｔｌ、（１００ｍＭ）
ジＱｔ ） レイット（ＤＴＴ）２．５μ１１ ライゲ
ーションミックス５μｌおよびＴ４ＤＮΔリガーゼ※２
．５ ｆｉ ｌ （〜２ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂ
ｉｏ ｊａｂ単位）を１６°Ｃで約１６時間インキュベ
ートする。
６５℃で１０分間インキュベートして反応を停止させ、
氷上で冷却した後、ＬｅｄｅｒｂｅｒｇおよびＣｏｈｅ
ｎ （１ｇ７４、Ｊ 、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ 、
１ ］、 ９ ：１０７２ ）の形質転換法と実質
的に同様にして、１０μｇ／−の抗生物質テトラサイク
リンを含有しているＴＹプレート上、得られた結合混合
物を使ってＥ、ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＪＡ２２１ （／
ＮＲＩｔｔ、 １３−１５２１１）を形質転換した。
氷上で冷却した後、ＬｅｄｅｒｂｅｒｇおよびＣｏｈｅ
ｎ （１ｇ７４、Ｊ 、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ 、
１ ］、 ９ ：１０７２ ）の形質転換法と実質
的に同様にして、１０μｇ／−の抗生物質テトラサイク
リンを含有しているＴＹプレート上、得られた結合混合
物を使ってＥ、ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＪＡ２２１ （／
ＮＲＩｔｔ、 １３−１５２１１）を形質転換した。
得られた形質転換体を常法により培養し、実施例ＩＡと
実質的に同様にして、プラスミドｐＯＷＩＱの製造およ
び単離用として使用した。プラスミドｐＯＷ１ｕの制限
サイト地図を第１図に示す。
実質的に同様にして、プラスミドｐＯＷＩＱの製造およ
び単離用として使用した。プラスミドｐＯＷ１ｕの制限
サイト地図を第１図に示す。
９〈Ｔ４ＤＮＡ ＩＪガーゼは以下の供給源から入手で
きる： Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ Ｌａｂｓ、
、 Ｉｎｃ１３２ ’Ｉ’ｏｚｅｒ Ｒｄ、 Ｂｃ
ｖｅｒｌｙ 、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ１９１５ ※※ ライゲーションミックスは以下の成分から調製し
た：５θ（７ｍＭトリス塩酸（ｐｌ−１７，６）、Ｉ
Ｕ （Ｊ ｒｎ Ｍ Ｍ ｇ Ｃｌ ２ 。
きる： Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ Ｌａｂｓ、
、 Ｉｎｃ１３２ ’Ｉ’ｏｚｅｒ Ｒｄ、 Ｂｃ
ｖｅｒｌｙ 、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ１９１５ ※※ ライゲーションミックスは以下の成分から調製し
た：５θ（７ｍＭトリス塩酸（ｐｌ−１７，６）、Ｉ
Ｕ （Ｊ ｒｎ Ｍ Ｍ ｇ Ｃｌ ２ 。
実施例２ プラスミドｐＯＷ５２５およびｐＯＷ５２６
．並びにＥ、ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＪＡ２２１／ＰＯＷ５
２５およびＥ、ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＪＡ２２１／ｐＯＷ
５２６の組み立て Ａ、プラスミドｐｔ１１＝ １６の分離１、 Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｍｌ ｌ １２ ／
ｐＨＩ＝１６の培養 １３ａｃｉ目ｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｍｌ ｌ
１２ ／ ＰＩ日−１６（ＮＲＲＬＢ−１２５９７）
をＰ Ａ Ｂ寒天（１５ｇ／ｌの寒天および１０μｇ／
、−のクロラムフェニコールを含有しているＩ） Ａ
Ｂ※（Ｐｃｎａｓｓ武ｙブロス））に植えつけて常法通
りに増殖培養物を調製した。接種したプレーＩ・を３７
℃で約１８時間インキュベートし、１個のコロニーを選
択し、ＩＵμｇ／ｍＩＶのクロラムフェニコールを含む
滅菌Ｐ Ａ １３培地５ｕｕｍｌに接種した。接種した
ブロスを３７℃で約１８時間インキュベートすると、１
ｓａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｍｌ ｌ １２
／ＰＨＩ −１５細胞を収穫し、プラスミドＩ） Ｎ
Ａを分離することかできる。
．並びにＥ、ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＪＡ２２１／ＰＯＷ５
２５およびＥ、ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＪＡ２２１／ｐＯＷ
５２６の組み立て Ａ、プラスミドｐｔ１１＝ １６の分離１、 Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｍｌ ｌ １２ ／
ｐＨＩ＝１６の培養 １３ａｃｉ目ｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｍｌ ｌ
１２ ／ ＰＩ日−１６（ＮＲＲＬＢ−１２５９７）
をＰ Ａ Ｂ寒天（１５ｇ／ｌの寒天および１０μｇ／
、−のクロラムフェニコールを含有しているＩ） Ａ
Ｂ※（Ｐｃｎａｓｓ武ｙブロス））に植えつけて常法通
りに増殖培養物を調製した。接種したプレーＩ・を３７
℃で約１８時間インキュベートし、１個のコロニーを選
択し、ＩＵμｇ／ｍＩＶのクロラムフェニコールを含む
滅菌Ｐ Ａ １３培地５ｕｕｍｌに接種した。接種した
ブロスを３７℃で約１８時間インキュベートすると、１
ｓａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｍｌ ｌ １２
／ＰＨＩ −１５細胞を収穫し、プラスミドＩ） Ｎ
Ａを分離することかできる。
ｉ＜Ｉ’ＡＢはＤｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
Ｉ）ｅｔｒｏｉｔＭｉｃｈｉｇａｎから人手できる
。
Ｉ）ｅｔｒｏｉｔＭｉｃｈｉｇａｎから人手できる
。
２、プラスミドの分離
まず遠心分ｘｉ （１（７分、４℃、１ｕ、ｏｏＯｒｐ
ｍ）してＢａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｍ
１１１２／ｐＨｌ−１６細胞約１０ｇ（湿めった重量）
を集め、約５０ｍｌの−１”Ｅ Ｓ （ｌ Ｑ
ｍＭ ト リ ス Ｉ（１）ｌ−Ｉ８ ） 、 １０
＋ｎ＃ｔＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ ）中で洗い、再
び遠心して集める。２５％のシュクロースを含む゛ｒＥ
緩衝液をこのペレットに加え、水２５０μｌ中のりゾチ
ーム約１０ｍ９を加える。この混合物を３７℃で約３０
分間インキュベートし、ＲＮａｓｅ １００単位を加え
る。得られた混合物を再び３７℃で３０分間インキュベ
ートし、５ＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）および塩化
ナトリウムについてそれぞれ１％およびＩＭにした後、
混合物を水浴で約３０分間冷却する。溶解質を遠心分離
しく３０分、４℃、１９．０００ ｒｐｍ） 、上澄液
をＴＥで３１．８ｒＪに調節し、塩化セシウム２８．７
ｇとエチジウムプロミド、４ ｍｌ（１６ｍｆｌ／ｍｚ
）を加えた。４９．５０Ｏｒｐｍ で１６時間遠心分
離することにより、塩化セシウムグラジェント（勾配）
を形成させた。プラスミドの帯を集め、５５．００Ｏｒ
ｐｍで１６時間遠心分離して再び集め、同容量のインア
ミルアルコールで３回抽出し、希ＴＥで透析し、エタノ
ール沈殿させ、ＴＥ４００ｔｌｌに再懸濁した。得られ
たプラスミドｐＨ１−１５ＤＮＡ は、使用するまで４
℃で保存した。
ｍ）してＢａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｍ
１１１２／ｐＨｌ−１６細胞約１０ｇ（湿めった重量）
を集め、約５０ｍｌの−１”Ｅ Ｓ （ｌ Ｑ
ｍＭ ト リ ス Ｉ（１）ｌ−Ｉ８ ） 、 １０
＋ｎ＃ｔＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ ）中で洗い、再
び遠心して集める。２５％のシュクロースを含む゛ｒＥ
緩衝液をこのペレットに加え、水２５０μｌ中のりゾチ
ーム約１０ｍ９を加える。この混合物を３７℃で約３０
分間インキュベートし、ＲＮａｓｅ １００単位を加え
る。得られた混合物を再び３７℃で３０分間インキュベ
ートし、５ＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）および塩化
ナトリウムについてそれぞれ１％およびＩＭにした後、
混合物を水浴で約３０分間冷却する。溶解質を遠心分離
しく３０分、４℃、１９．０００ ｒｐｍ） 、上澄液
をＴＥで３１．８ｒＪに調節し、塩化セシウム２８．７
ｇとエチジウムプロミド、４ ｍｌ（１６ｍｆｌ／ｍｚ
）を加えた。４９．５０Ｏｒｐｍ で１６時間遠心分
離することにより、塩化セシウムグラジェント（勾配）
を形成させた。プラスミドの帯を集め、５５．００Ｏｒ
ｐｍで１６時間遠心分離して再び集め、同容量のインア
ミルアルコールで３回抽出し、希ＴＥで透析し、エタノ
ール沈殿させ、ＴＥ４００ｔｌｌに再懸濁した。得られ
たプラスミドｐＨ１−１５ＤＮＡ は、使用するまで４
℃で保存した。
カナマイシン耐性遺伝子はプラスミドｐｌ−１１−１６
の〜、７４ ｋｂ Ｈｐａ ■フラグメント内に含佳れ
ている。従って、ＨＰａ’ｌＩ 制限酵素で処理して
ライゲーションすると〜３，９ｋｂプラスミドか得られ
た。カナマイシン耐性遺伝子のないこのプラスミドはｐ
Ｈｌ−１８と命名した。プラスミドｐＨｌ−１８組み立
ての方法を以下に詳述する。
の〜、７４ ｋｂ Ｈｐａ ■フラグメント内に含佳れ
ている。従って、ＨＰａ’ｌＩ 制限酵素で処理して
ライゲーションすると〜３，９ｋｂプラスミドか得られ
た。カナマイシン耐性遺伝子のないこのプラスミドはｐ
Ｈｌ−１８と命名した。プラスミドｐＨｌ−１８組み立
ての方法を以下に詳述する。
Ｂ、プラスミドｐＨ１−１８の組み立て１、プラスミド
ｐＨ１，−１６の部分的ＨｐａＩＩ消化プラスミドｐＨ
１−１５ＤＮＡ約５μｌ（２，５μｇ）、ＢＳＡ １
μｌ （２”Ｗ／ｍｌ ）、水３７１１１ 、１ｌｐａ
■制限酵素２１ｔ７？（２Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ １
３ｉｏ Ｌａｂｓ単位含有）、および反応ミックス ５
μｌを３７℃で１時間インキュベートシた。６５℃で１
０分間加熱して反応を終結させた後、２倍容量の９５係
エタノールを加えてＤＮＡを沈殿させた。得られたＩ）
Ｎ Ａの沈殿を７０％エタノールで洗浄し、るまてズ
呆存した。
ｐＨ１，−１６の部分的ＨｐａＩＩ消化プラスミドｐＨ
１−１５ＤＮＡ約５μｌ（２，５μｇ）、ＢＳＡ １
μｌ （２”Ｗ／ｍｌ ）、水３７１１１ 、１ｌｐａ
■制限酵素２１ｔ７？（２Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ １
３ｉｏ Ｌａｂｓ単位含有）、および反応ミックス ５
μｌを３７℃で１時間インキュベートシた。６５℃で１
０分間加熱して反応を終結させた後、２倍容量の９５係
エタノールを加えてＤＮＡを沈殿させた。得られたＩ）
Ｎ Ａの沈殿を７０％エタノールで洗浄し、るまてズ
呆存した。
×Ｈｐａｌｌ制限酵素用反応ミックスは以下の成分で：
ＪＭ製した： ６ ＱｍＭ ＫＣＪ、１００ｍＭトリス
塩酸（ｐｉ−１７，４）、１０ Ｑ ｍＭ ＭｇＣｌ２
．１０ｍＭジチオトレイット。
ＪＭ製した： ６ ＱｍＭ ＫＣＪ、１００ｍＭトリス
塩酸（ｐｉ−１７，４）、１０ Ｑ ｍＭ ＭｇＣｌ２
．１０ｍＭジチオトレイット。
２、 プラスミドＰＨＩ −１５Ｈｐａｌｌ 消化物
ｏ） ライゲ−ション プラスミドｐＨＩ −１６１−Ｉｐａ ＩＩ消化物（実
施例３ Ｂ −１で調製）約５μｊ、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼ２μｌおよびライゲーションミックスう〈４３μｌを
約１６℃で約１８時間インキュベートした。３Ｍ酢酸ナ
トリウム約５μｌと９５％エタノール５０μｌを加えて
反応を停止させた。得られたＤＮＡの沈殿を７０係エタ
ノールに入れて洗浄し、減圧乾燥し、′Ｉ゛１ζ緩衝液
１０μｇに懸濁し、使用するまで４ ’Ｃで保存した。
ｏ） ライゲ−ション プラスミドｐＨＩ −１６１−Ｉｐａ ＩＩ消化物（実
施例３ Ｂ −１で調製）約５μｊ、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼ２μｌおよびライゲーションミックスう〈４３μｌを
約１６℃で約１８時間インキュベートした。３Ｍ酢酸ナ
トリウム約５μｌと９５％エタノール５０μｌを加えて
反応を停止させた。得られたＤＮＡの沈殿を７０係エタ
ノールに入れて洗浄し、減圧乾燥し、′Ｉ゛１ζ緩衝液
１０μｇに懸濁し、使用するまで４ ’Ｃで保存した。
ｊ＜ライゲーションミックスは以下の成分で調製した：
６６ｍＮＩトリス塩酸（ＰＨ７，８）、ｌＱｍＭジチオ
トレイット、６．６ ｍ Ｍ Ｍ ｇ Ｃｌ ２．４ｍ
ＭＡＴＰＣ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ
Ｍｌ ｌ １２／ＰＩ（Ｉ −１８の組み立て Ｂ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｍ１１１２／Ｉ）ＩＩ Ｉ
−１６（ＮＲＲＩ−Ｂ−１２５９７）をクロラムフェ
ニコールの非存在下で常法通り培養するとＢａｃｉｌｌ
ｕｓ ｓｕｂＥｉｌｉｓＭ■１１２ を得ることがで
きる。Ｂ、 ｓｕｂｔｉｌｉｓＭｌ ｌ ｌ ２ ／ｐ
Ｈ１−１５細胞は、」−記の培養条件下で自然にｐＰＩ
Ｉ−１６プラスミドを失ない、かくして所望のクロラム
フェニコール感受性の１匁。
６６ｍＮＩトリス塩酸（ＰＨ７，８）、ｌＱｍＭジチオ
トレイット、６．６ ｍ Ｍ Ｍ ｇ Ｃｌ ２．４ｍ
ＭＡＴＰＣ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ
Ｍｌ ｌ １２／ＰＩ（Ｉ −１８の組み立て Ｂ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｍ１１１２／Ｉ）ＩＩ Ｉ
−１６（ＮＲＲＩ−Ｂ−１２５９７）をクロラムフェ
ニコールの非存在下で常法通り培養するとＢａｃｉｌｌ
ｕｓ ｓｕｂＥｉｌｉｓＭ■１１２ を得ることがで
きる。Ｂ、 ｓｕｂｔｉｌｉｓＭｌ ｌ ｌ ２ ／ｐ
Ｈ１−１５細胞は、」−記の培養条件下で自然にｐＰＩ
Ｉ−１６プラスミドを失ない、かくして所望のクロラム
フェニコール感受性の１匁。
５ｕｂｔｉｌｉｓ〜ＩＩ １１２ 株か得られるので
ある。当業者には明らかな様にクロラムフェニコールに
対する感受性を利用して、このプラスミドを持たないＢ
、５ｕｂＬｉｌｉｓ Ｍｌ ｌ １２ たけを選択
し、それをここに述べるＢａｃｉｌｌｕｓ の形質転換
に使用することをテストし、確かなものにすることがで
きる。
ある。当業者には明らかな様にクロラムフェニコールに
対する感受性を利用して、このプラスミドを持たないＢ
、５ｕｂＬｉｌｉｓ Ｍｌ ｌ １２ たけを選択
し、それをここに述べるＢａｃｉｌｌｕｓ の形質転換
に使用することをテストし、確かなものにすることがで
きる。
滅菌ＰＡＢ約５０−にＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｒｉｌ
ｉｓＭ１１１２を接種し、３７℃で細胞密度が２×１０
８細胞／ｒｎ１になるまでインキュベートした。
ｉｓＭ１１１２を接種し、３７℃で細胞密度が２×１０
８細胞／ｒｎ１になるまでインキュベートした。
次いで滅菌技術を用い、細胞をペレット化し、それを約
５Ｔｎｌの５ＭＭＩ’ （同容滑の４ ｘ Ｐ Ａ
１３およびツユクロース１．ＯＭ、マレイン酸、０４Ｍ
１よひＭｇ ｃ １２． Ｑ ４Ｍを含む溶液、ＮａＯ
［１てｐｌｔ６５に調節）に再懸瀾することによってプ
ロトプラスト ＾４シユクロース、、０２Ｍ マレイン酸、、０２ＭＮ
＋ ｇ Ｃ ｌ ２、ＮａＯＨ でｐＬｌ ６．５に
調節）中、２０〃ｔｙ ／ ｍｌ ）約２５０μｌを濾
過滅菌して加えた。細胞をお／ζやかに振帰しながら３
７℃で約２時間インキュベートした。得られたプロトプ
ラストをペレット化し、Ｓへ４ＭＰ５ｍＩＶで洗浄し、
ＳＭＭＰ５，、１６に再懸濁した。遠心分離（２５℃、
１２分、２、６００ｒＰｍ）した後、プロトプラスト約
．１ηｆにプラスミドｐｉ−１ １ − １８ＤＮＡと
２ＸＳＭＭからなる混合物（１：１）約２０μｌを加え
てこれを形質転換した。直ちに１） ＥＣ溶液（ ４．
０ ｇ Ｏ）１）１０６０００（ポリエチレンクリコ
ール）、５０ｍｌＯ） ２ ｘ Ｓ ＭＭ，水を加えて
１００Ｊ）約１． ５ Ｊ。
５Ｔｎｌの５ＭＭＩ’ （同容滑の４ ｘ Ｐ Ａ
１３およびツユクロース１．ＯＭ、マレイン酸、０４Ｍ
１よひＭｇ ｃ １２． Ｑ ４Ｍを含む溶液、ＮａＯ
［１てｐｌｔ６５に調節）に再懸瀾することによってプ
ロトプラスト ＾４シユクロース、、０２Ｍ マレイン酸、、０２ＭＮ
＋ ｇ Ｃ ｌ ２、ＮａＯＨ でｐＬｌ ６．５に
調節）中、２０〃ｔｙ ／ ｍｌ ）約２５０μｌを濾
過滅菌して加えた。細胞をお／ζやかに振帰しながら３
７℃で約２時間インキュベートした。得られたプロトプ
ラストをペレット化し、Ｓへ４ＭＰ５ｍＩＶで洗浄し、
ＳＭＭＰ５，、１６に再懸濁した。遠心分離（２５℃、
１２分、２、６００ｒＰｍ）した後、プロトプラスト約
．１ηｆにプラスミドｐｉ−１ １ − １８ＤＮＡと
２ＸＳＭＭからなる混合物（１：１）約２０μｌを加え
てこれを形質転換した。直ちに１） ＥＣ溶液（ ４．
０ ｇ Ｏ）１）１０６０００（ポリエチレンクリコ
ール）、５０ｍｌＯ） ２ ｘ Ｓ ＭＭ，水を加えて
１００Ｊ）約１． ５ Ｊ。
を添加し、約２分後にＳＭＭＰ５，ｚを加えた。次いで
プロトプラストをペレット化し、ＳＭＭＰ １Ｈに懸
濁し、おだやかに振帰しながら３０℃で約２時間インキ
ュベートした。この様にして調製した懸濁液を、１１当
たりり、下の成分を含有しているクロラムフェニコール
含有Ｄ Ｍ ３ ｐｊ生培地に植えた： ９１ｇ：寒天１２１’を含有している脱イオン水５５５
ｍｌ中の１）−マンニット １０％：カザミノ酸５ ０ ｍ１ １０％゛酵母エキス５０．Ｊ ２０％ニゲルコース２５，、４ ５％：燐酸二カリウム１ ０ ０ ｒｎｌｌ Ｍ ：
Ｍｇ Ｃｌ ２ ２ ０ ｒｎｌｌ０飴：ゼラチン ｉ ｏ 〃＋ｙ ：クロラムフエニコールＤーマンニッ
ト、カザミノ酸および酵母エキスは一緒にオートクレー
ブｌこかけた。オートクレーブ処理の後、直ちにゼラ≠
ンを加え、その混合物を冷却した後、残りの成分を加え
た。この培地の最終的なりロラムフエニコール濃度は１
０μｇ／−であった。
プロトプラストをペレット化し、ＳＭＭＰ １Ｈに懸
濁し、おだやかに振帰しながら３０℃で約２時間インキ
ュベートした。この様にして調製した懸濁液を、１１当
たりり、下の成分を含有しているクロラムフェニコール
含有Ｄ Ｍ ３ ｐｊ生培地に植えた： ９１ｇ：寒天１２１’を含有している脱イオン水５５５
ｍｌ中の１）−マンニット １０％：カザミノ酸５ ０ ｍ１ １０％゛酵母エキス５０．Ｊ ２０％ニゲルコース２５，、４ ５％：燐酸二カリウム１ ０ ０ ｒｎｌｌ Ｍ ：
Ｍｇ Ｃｌ ２ ２ ０ ｒｎｌｌ０飴：ゼラチン ｉ ｏ 〃＋ｙ ：クロラムフエニコールＤーマンニッ
ト、カザミノ酸および酵母エキスは一緒にオートクレー
ブｌこかけた。オートクレーブ処理の後、直ちにゼラ≠
ンを加え、その混合物を冷却した後、残りの成分を加え
た。この培地の最終的なりロラムフエニコール濃度は１
０μｇ／−であった。
得うレタクロラムフエニコール耐性コロニーを、カナマ
イシン感受性について試験した。クロラムフェニコール
に耐性でカナマイシンに感受性のあるコロニーを、所望
のＢａｃ目１ｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｍｌｌ、１２
／ｐＨ１７１Ｂ株として選択した。この菌株を培養し、
常套の制限酵素分析およびアガロースゲル電気泳動分析
（ Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８２ ） により構成プ
ラスミドであることを確認した。
イシン感受性について試験した。クロラムフェニコール
に耐性でカナマイシンに感受性のあるコロニーを、所望
のＢａｃ目１ｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｍｌｌ、１２
／ｐＨ１７１Ｂ株として選択した。この菌株を培養し、
常套の制限酵素分析およびアガロースゲル電気泳動分析
（ Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８２ ） により構成プ
ラスミドであることを確認した。
■）、プラスミドｐｔｌＩ−１３およびｐＯＷＩＱの１
ｃＣＱ尺１消化 を １）１目−１８約４μＪ（３μｇ）、ｐＯＷ１０１△ １１ ｌ （ １”Ｗ’） 、水５ １１ ｌ 、
１ ０ Ｘ ＥｃｏＲＩ 緩衝液１μｌおよびＥｃｏＲ
１制限酵素１，５μＪ（５Ｎｅｗ− Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏ Ｌａｂ単位含有）を３７℃で１．５時間イン
キュベートシた。６５℃で］０分間インキュベートして
反応を停止さぜた後、ＥＣＯＲＩ消化したＤＮＡを水で
冷却し、エタノール沈殿さぜ、水３０μｌに溶解した。
ｃＣＱ尺１消化 を １）１目−１８約４μＪ（３μｇ）、ｐＯＷ１０１△ １１ ｌ （ １”Ｗ’） 、水５ １１ ｌ 、
１ ０ Ｘ ＥｃｏＲＩ 緩衝液１μｌおよびＥｃｏＲ
１制限酵素１，５μＪ（５Ｎｅｗ− Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏ Ｌａｂ単位含有）を３７℃で１．５時間イン
キュベートシた。６５℃で］０分間インキュベートして
反応を停止さぜた後、ＥＣＯＲＩ消化したＤＮＡを水で
冷却し、エタノール沈殿さぜ、水３０μｌに溶解した。
Ｅ プラスミドｐＨ １ − １８ および’ｐＯ
Ｗ １０ＥｃｏＲＩ 消化物のライゲーションおよＯ
−１で〕、ｃｏｌｉＫ１２ ＪＡ２２１／ｐＯＷ５２
５およびＥ，ｃｏｌｉＫ１２ ＪＡ２２１／ｌ）ＯＷ
５２６の組み立てｐＨ１−１８およびｌ） Ｏ Ｗ Ｉ
Ｑの１らｃｏＲＩ ／Ｉ！ｉ化物約３０μＪ，ＩＯ
Ｘジチオトレイット４μｌ（１ ０ＱｍＭ）、Ａ１．−
１）４ ｌＪ （ ｌ Ｑ ｍＭ ）、１０×リガーゼ
緩衝液４μｌおよびＴ４１）ＮＡ ＩＪガーゼ１ ｔｔ
ｌ！ （ ３ Ｎｅｗ Ｉ尤ｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ
ＬａＩ）単位含有）を１６℃で約４時間インキュベ
ートした。６５℃で１０分間インキュベートシて反応を
停止させ、次いで氷で冷却した後、寄られた結合ＤＮＡ
を使って、ＬｅｄｃｒｂｃｒｇおよびＣｏｈｅｎ （１
９７４）の形質転換法に従って、テトラザイクリン１０
μｇ／−を含有しているＴ Ｙプレー１・上、１・：、
ｃｏｌｉＫ１２ ＪＡ２２１ （ ＮＲ艮Ｌ Ｂ −
：Ｉ，５２１１ ）を形質転換した。得られた形質転換
体を常法により培養し、実施例ＩＡと実質的に同様にし
て、プラスミドｐＯＷ５２５ およびｐ ＯＷ ５ ２
６の製造および単離に使用した。プラスミドｐＯＷ５
２５ とＰＯＷ５２６ は、常法に従い、制限酵素
およびアガロ−スケルミ熱泳動分析（ＭａｎｉａＬｉｓ
ら、１９８２）により同定し、区別することができる。
Ｗ １０ＥｃｏＲＩ 消化物のライゲーションおよＯ
−１で〕、ｃｏｌｉＫ１２ ＪＡ２２１／ｐＯＷ５２
５およびＥ，ｃｏｌｉＫ１２ ＪＡ２２１／ｌ）ＯＷ
５２６の組み立てｐＨ１−１８およびｌ） Ｏ Ｗ Ｉ
Ｑの１らｃｏＲＩ ／Ｉ！ｉ化物約３０μＪ，ＩＯ
Ｘジチオトレイット４μｌ（１ ０ＱｍＭ）、Ａ１．−
１）４ ｌＪ （ ｌ Ｑ ｍＭ ）、１０×リガーゼ
緩衝液４μｌおよびＴ４１）ＮＡ ＩＪガーゼ１ ｔｔ
ｌ！ （ ３ Ｎｅｗ Ｉ尤ｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ
ＬａＩ）単位含有）を１６℃で約４時間インキュベ
ートした。６５℃で１０分間インキュベートシて反応を
停止させ、次いで氷で冷却した後、寄られた結合ＤＮＡ
を使って、ＬｅｄｃｒｂｃｒｇおよびＣｏｈｅｎ （１
９７４）の形質転換法に従って、テトラザイクリン１０
μｇ／−を含有しているＴ Ｙプレー１・上、１・：、
ｃｏｌｉＫ１２ ＪＡ２２１ （ ＮＲ艮Ｌ Ｂ −
：Ｉ，５２１１ ）を形質転換した。得られた形質転換
体を常法により培養し、実施例ＩＡと実質的に同様にし
て、プラスミドｐＯＷ５２５ およびｐ ＯＷ ５ ２
６の製造および単離に使用した。プラスミドｐＯＷ５
２５ とＰＯＷ５２６ は、常法に従い、制限酵素
およびアガロ−スケルミ熱泳動分析（ＭａｎｉａＬｉｓ
ら、１９８２）により同定し、区別することができる。
プラスミドｐＯＷ５２５およびｐＯＷ５２６の制限サイ
ト地図を添付の第１図に示す。
ト地図を添付の第１図に示す。
実施例３ １３ａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂＬｉｌｉｓ Ｍ
ｌ１１２／））ＯＷ ５２５および１３．５ｕｂｔｉｌ
ｉｓ Ｍｌ ｌ ］ ２ ／ＰＯＷ５２６の組み立て プラスミドｐｉ−Ｉｆ−１８の代りにプラスミドｐＯＷ
５２５およびＰＯＷ５２６を使用するほかは実施例２Ｃ
と実質的に同様にして表記の組み立てを行なった。得ら
れたＢａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｃｉｌｉｓ Ｍ１１１
２／／Ｉ）ＯＷ５２５およびＢ、５ｕｂｔｉｌｉｓ
Ｍ１１１２／ＰＯＷ５２６ クロラムフェニコール−
耐性、カナマイシン−感受性形質転換体コロニーを常法
により分離し、構成プラスミドの制限酵素およびアガロ
ースゲル電気泳動分析により確認した。
ｌ１１２／））ＯＷ ５２５および１３．５ｕｂｔｉｌ
ｉｓ Ｍｌ ｌ ］ ２ ／ＰＯＷ５２６の組み立て プラスミドｐｉ−Ｉｆ−１８の代りにプラスミドｐＯＷ
５２５およびＰＯＷ５２６を使用するほかは実施例２Ｃ
と実質的に同様にして表記の組み立てを行なった。得ら
れたＢａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｃｉｌｉｓ Ｍ１１１
２／／Ｉ）ＯＷ５２５およびＢ、５ｕｂｔｉｌｉｓ
Ｍ１１１２／ＰＯＷ５２６ クロラムフェニコール−
耐性、カナマイシン−感受性形質転換体コロニーを常法
により分離し、構成プラスミドの制限酵素およびアガロ
ースゲル電気泳動分析により確認した。
この様にして組み立てられた形質転換体はプラスミドｐ
ＯＷ５２５ およびｐＯＷ５２６の製造と単離に有用で
あり、細胞内にプレープロインシュリンを生産し、培養
培地にプロインシュリンを***する。このことは、細胞
溶解質および培養培地のインビトロアッセイにより確認
された。
ＯＷ５２５ およびｐＯＷ５２６の製造と単離に有用で
あり、細胞内にプレープロインシュリンを生産し、培養
培地にプロインシュリンを***する。このことは、細胞
溶解質および培養培地のインビトロアッセイにより確認
された。
実施例４ プラスミドｐＯＷ５２７およびｐＯＷ５２８
、並びにＥ、ｃｏｌｉ Ｋｌ ２ＪＡ２２１／ ｐｕＸ
〜５２７およびＦ、、ｃｏｌｉ Ｋ １２ ＪＡ ２２
１ ／１）ＯＷ５２８の組み立て プラスミドｐＨ１−１８の代りにプラスミドｐＢＳ ｌ
を使用するほかは実施例２と実質的に同様にして表記の
組み立てを行なった。プラスミド１）ＢＳＩは以下の方
法で組み立てた。
、並びにＥ、ｃｏｌｉ Ｋｌ ２ＪＡ２２１／ ｐｕＸ
〜５２７およびＦ、、ｃｏｌｉ Ｋ １２ ＪＡ ２２
１ ／１）ＯＷ５２８の組み立て プラスミドｐＨ１−１８の代りにプラスミドｐＢＳ ｌ
を使用するほかは実施例２と実質的に同様にして表記の
組み立てを行なった。プラスミド１）ＢＳＩは以下の方
法で組み立てた。
Ａ、プラスミドＰＥＬ１０３の分離
１、 ストレプトマイセス・グラニュ１コルーバ盃Ａ３
９９１２１３／Ｐ１巴Ｌ１０３の培養ストレプトマイセ
ス・グラニュロルーバ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ｇｒａｎｕｌｏｒｕｂｃｒ ）Ａ Ａ３９９１２１３／
ｐＥＬＩＱ３（ＮＲＲＬｌ、２５４９）の栄養接種物を
、常法により、その株を滅菌トリブチカーゼ大豆ブロス
” １）（３５ｇ／ｌ脱イオン水）５０ｍｌ中、液中好
気条件下で増殖させることにより調製した。
９９１２１３／Ｐ１巴Ｌ１０３の培養ストレプトマイセ
ス・グラニュロルーバ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ｇｒａｎｕｌｏｒｕｂｃｒ ）Ａ Ａ３９９１２１３／
ｐＥＬＩＱ３（ＮＲＲＬｌ、２５４９）の栄養接種物を
、常法により、その株を滅菌トリブチカーゼ大豆ブロス
” １）（３５ｇ／ｌ脱イオン水）５０ｍｌ中、液中好
気条件下で増殖させることにより調製した。
このトリブチカーゼ大豆ブロス接種物を３０℃テ４８時
間インキュベートした。インキュベートした後、この接
種物約１０ｍＺを滅菌ブロス５００ｄに移し、３０℃で
約２０時間インキュベートした。ｐＨの調節は行わなか
った。インキュベートしたものから、ストレプトマイセ
ス・グラニュロルーバ盃Ａ３９９１２．］ ３／ｐＥＬ
１０３細胞を収穫し、次いでプラスミドＤＮＡを単離す
ることができる。
間インキュベートした。インキュベートした後、この接
種物約１０ｍＺを滅菌ブロス５００ｄに移し、３０℃で
約２０時間インキュベートした。ｐＨの調節は行わなか
った。インキュベートしたものから、ストレプトマイセ
ス・グラニュロルーバ盃Ａ３９９１２．］ ３／ｐＥＬ
１０３細胞を収穫し、次いでプラスミドＤＮＡを単離す
ることができる。
Ｘｌ）トリブチカーゼ大豆ブロスはＢ Ｂ Ｌｌ）ｉｖ
ｉｓｉｏｎ、 ＋３ｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ
＆Ｃｏ＋ｎｐａｎｙ。
ｉｓｉｏｎ、 ＋３ｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ
＆Ｃｏ＋ｎｐａｎｙ。
Ｃｏｃｋｅｙｓｖｉｌｌｅ、 Ｍａｒｙｌａｎｄ ２
Ｉ Ｑ ３ Ｑから入手できる。
Ｉ Ｑ ３ Ｑから入手できる。
２、プラスミドの単離
ストレプトマイセス・グラニュロルーバｍＡ３９９１２
．１３／１）ＥＬ１０３ 細胞約１２ｇ（湿めった重
量）を遠心分離しく１０分、４℃、１０．０００ｒＰｍ
）、１０％グリセリンで洗い、上の条件下で遠心分離し
て回収した。この細胞に’ｒ Ｅ Ｓ緩衝液（０，０１
Ｍトリス（ヒドロキンメチル）アミノエタン〔トリス〕
、Ｑ、 Ｑ Ｑ Ｉ ＭＥＤ’ｌ”Ａ、３４％シュクロ
ース、ｐＨ８） 約５０．Ｉｌを添加し、次いで０．
２５ Ｍ ＥＤＴＡ Ｉ Ｑｄ中のりゾヂーム約０．２
５ｇを加えた。この混合物を３７℃で約１５分間インキ
ュベートした後、］゛Ｅ緩衝液（０，０１Ｍトリス、Ｑ
、Ｑ Ｑ Ｉ Ｍ Ｅｌ）ＴＡ 、 １）１１８ ）
中の１０％トリトンＸ−］ ００を約０．５ Ｊ加えた
。
．１３／１）ＥＬ１０３ 細胞約１２ｇ（湿めった重
量）を遠心分離しく１０分、４℃、１０．０００ｒＰｍ
）、１０％グリセリンで洗い、上の条件下で遠心分離し
て回収した。この細胞に’ｒ Ｅ Ｓ緩衝液（０，０１
Ｍトリス（ヒドロキンメチル）アミノエタン〔トリス〕
、Ｑ、 Ｑ Ｑ Ｉ ＭＥＤ’ｌ”Ａ、３４％シュクロ
ース、ｐＨ８） 約５０．Ｉｌを添加し、次いで０．
２５ Ｍ ＥＤＴＡ Ｉ Ｑｄ中のりゾヂーム約０．２
５ｇを加えた。この混合物を３７℃で約１５分間インキ
ュベートした後、］゛Ｅ緩衝液（０，０１Ｍトリス、Ｑ
、Ｑ Ｑ Ｉ Ｍ Ｅｌ）ＴＡ 、 １）１１８ ）
中の１０％トリトンＸ−］ ００を約０．５ Ｊ加えた
。
得られた混合物を約１５分間６５℃でインキュベートシ
た。溶解質を遠心分離（４５分間、４℃、１ｓ 、ｏ
００ ｒｐｍ ）した後、」−澄液をイソアミルアルコ
ールで４回、クロロホルム−イソアミルアルコール溶液
（２４・１）で１回抽出した。次いて水相に３Ｍ酢酸す
ｌ−ＩＪウム０．１容吊を加えた後、冷（−２０℃）９
５％エタノール３容丹を添加した。ドライアイス−エタ
ノール浴中てエタノール沈殿を素早く行ない、Ｉ） Ｎ
Ａ沈殿を遠心分離（１５分、４℃、１０，０００ｒＰ
ｍ）で集めた。この沈殿を減圧乾燥し、ｓ −ｒ ｒＬ
緩衝液（０，ＯＩＭｌ−リス、０．００１ＭＥＤＴＡ、
ｏ、ｏｘＭ 塩化ブ叫・リウム）１．１．ｄに再懸濁し
た。エチジウムブロミドヲ用い、セシウムクロライド勾
配遠心分離法（４０時間、１５℃、３５，０００ｒＰｍ
） によってプラスミドＩ） Ｎ Ａを精製した。遠
心分離した後所望のプラスミドＰＥＬ １０３ ＤＮＡ
帯を除き、常法によりエチジウムプロミドを抽出した
。３容量のエタノール中でＤＮＡを沈殿させ、この様に
して分離したプラスミドｐＥＬ １０３ ＤＮＡを１０
倍に希釈したＴ Ｅ緩衝液１艷に溶解し、−２０℃で貯
蔵した。
た。溶解質を遠心分離（４５分間、４℃、１ｓ 、ｏ
００ ｒｐｍ ）した後、」−澄液をイソアミルアルコ
ールで４回、クロロホルム−イソアミルアルコール溶液
（２４・１）で１回抽出した。次いて水相に３Ｍ酢酸す
ｌ−ＩＪウム０．１容吊を加えた後、冷（−２０℃）９
５％エタノール３容丹を添加した。ドライアイス−エタ
ノール浴中てエタノール沈殿を素早く行ない、Ｉ） Ｎ
Ａ沈殿を遠心分離（１５分、４℃、１０，０００ｒＰ
ｍ）で集めた。この沈殿を減圧乾燥し、ｓ −ｒ ｒＬ
緩衝液（０，ＯＩＭｌ−リス、０．００１ＭＥＤＴＡ、
ｏ、ｏｘＭ 塩化ブ叫・リウム）１．１．ｄに再懸濁し
た。エチジウムブロミドヲ用い、セシウムクロライド勾
配遠心分離法（４０時間、１５℃、３５，０００ｒＰｍ
） によってプラスミドＩ） Ｎ Ａを精製した。遠
心分離した後所望のプラスミドＰＥＬ １０３ ＤＮＡ
帯を除き、常法によりエチジウムプロミドを抽出した
。３容量のエタノール中でＤＮＡを沈殿させ、この様に
して分離したプラスミドｐＥＬ １０３ ＤＮＡを１０
倍に希釈したＴ Ｅ緩衝液１艷に溶解し、−２０℃で貯
蔵した。
ＩＳ、プラスミドｌ） Ｌ Ｒ２の組み立て１、プラス
ミドｐＨ６のｌ４ｉｎｄｌｌｌ消化プラスミドｐ ｌ
Ｊ５ ＤＮＡ （Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ２
８６ ： ５２５．１９８０ 年参照）約２０１ｚｌ
（２０μｇ ） 、 ｌ！ｌ５Ａ−（牛血清アルブミ、
ン、１１１＋７７ｍ１）５μｌ、水１９ Ｉｌｌ、 ｌ
−１ｉｎｄ Ｉｆｆ （３Ｎｅｗｆｉｎｇｌａｎｄ １
３ｉｏ Ｌａｂｓ単位含有）制限酵素１μｌ、および反
応ミックス″５μｌを３７℃で２時間イ７キュヘ−トｌ
、た。４Ｍ酢酸アンモニウム約５０μｌおよび９５％エ
タノール２００μｌを加えて反応を停止させた。得られ
たＤＮＡ沈殿物を７０係エタノールで２回洗浄し、減圧
乾燥し、１”Ｅｉ衝液液２０μｌ懸濁して一２０℃で貯
蔵した。
ミドｐＨ６のｌ４ｉｎｄｌｌｌ消化プラスミドｐ ｌ
Ｊ５ ＤＮＡ （Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ２
８６ ： ５２５．１９８０ 年参照）約２０１ｚｌ
（２０μｇ ） 、 ｌ！ｌ５Ａ−（牛血清アルブミ、
ン、１１１＋７７ｍ１）５μｌ、水１９ Ｉｌｌ、 ｌ
−１ｉｎｄ Ｉｆｆ （３Ｎｅｗｆｉｎｇｌａｎｄ １
３ｉｏ Ｌａｂｓ単位含有）制限酵素１μｌ、および反
応ミックス″５μｌを３７℃で２時間イ７キュヘ−トｌ
、た。４Ｍ酢酸アンモニウム約５０μｌおよび９５％エ
タノール２００μｌを加えて反応を停止させた。得られ
たＤＮＡ沈殿物を７０係エタノールで２回洗浄し、減圧
乾燥し、１”Ｅｉ衝液液２０μｌ懸濁して一２０℃で貯
蔵した。
矢） ｆ（ｉｎｄＩｆ［制限酵素のための反応ミック
スは、以下の成分で軸装した： ６００１ＴＩＭ Ｎａ
Ｃｌ 、 １００ｍＭ ト リ ス −［−１ｃＪ
（ｐＨ７，９） 、 ７０ ｍ Ｍ Ｍ ｇ Ｃ
ｌ ２ 、ｌＱｍＭジチオトレイット。
スは、以下の成分で軸装した： ６００１ＴＩＭ Ｎａ
Ｃｌ 、 １００ｍＭ ト リ ス −［−１ｃＪ
（ｐＨ７，９） 、 ７０ ｍ Ｍ Ｍ ｇ Ｃ
ｌ ２ 、ｌＱｍＭジチオトレイット。
２、プラスミドｐＢＲ３２２の１４ｉｎｄＩＩＩ消化プ
ラスミドｐＢＲ３２２ＤＮ八へ１）約８μｆ（４μｇ）
、反応ミックス５μｌ 、 Ｂ Ｓ Ａ （ｉ ｙｔｔ
ｑ ／ｍＩ！ ）５ｔｔｌ、水３１μｌおよびＨｉｎｄ
［制限酵素ｌμｌを３７℃で２時間インキュベートシた
。６０℃で１０分インキュベートして反応を終結した後
、４Ｍ酢酸アンモニウム約５０μｊと９５％エタノール
２００μｌを添加した。得られたＩ） Ｎ Ａ沈殿を７
０％エタノールで２回洗浄し、減圧乾燥し、水４５μｌ
に懸濁した。
ラスミドｐＢＲ３２２ＤＮ八へ１）約８μｆ（４μｇ）
、反応ミックス５μｌ 、 Ｂ Ｓ Ａ （ｉ ｙｔｔ
ｑ ／ｍＩ！ ）５ｔｔｌ、水３１μｌおよびＨｉｎｄ
［制限酵素ｌμｌを３７℃で２時間インキュベートシた
。６０℃で１０分インキュベートして反応を終結した後
、４Ｍ酢酸アンモニウム約５０μｊと９５％エタノール
２００μｌを添加した。得られたＩ） Ｎ Ａ沈殿を７
０％エタノールで２回洗浄し、減圧乾燥し、水４５μｌ
に懸濁した。
’ｘ１） プラスミドｐＢＲ３２２は実施例ＩＡ−２
に記載した住所のＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｌｌ
ｃｉｍＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｓ から入手できる
。
に記載した住所のＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｌｌ
ｃｉｍＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｓ から入手できる
。
３、ＢｉｎｄＮ 消化プラスミドｐｌＪ６とｐＢＲ３２
２の結合（ライゲーション） 山ｎｄ７ＩＦ処理プラスミドｐｌＪ６約２０μｌ。
２の結合（ライゲーション） 山ｎｄ７ＩＦ処理プラスミドｐｌＪ６約２０μｌ。
１１ｉｎｄｌｌＩ処理プラスミドＰＢＲ３２２２０Ａｌ
。
。
Ｂ Ｓ Ａ （１ｍｙ ／、ｚ ） ５μｌ 、 Ｔ４
ＤＮＡリガーゼ１μｌ、およびライゲーションミック
ス８５μｌを１６℃で４時間インキュベートした。４Ｍ
酢酸アンモニウム約５０１１１および９５％エタノール
２００μｌを加えて反応−を終了させた。得られた１）
Ｎ Ａ沈殿物を７０条エタノールで２回洗浄し、減／
）乾燥し、−ｒＥ緩衝液ζこ懸濁した。乙のｊ凹濁ＤＮ
Ａは所望のプラスミドｐ Ｌ Ｒ２を構成していた。
ＤＮＡリガーゼ１μｌ、およびライゲーションミック
ス８５μｌを１６℃で４時間インキュベートした。４Ｍ
酢酸アンモニウム約５０１１１および９５％エタノール
２００μｌを加えて反応−を終了させた。得られた１）
Ｎ Ａ沈殿物を７０条エタノールで２回洗浄し、減／
）乾燥し、−ｒＥ緩衝液ζこ懸濁した。乙のｊ凹濁ＤＮ
Ａは所望のプラスミドｐ Ｌ Ｒ２を構成していた。
Ｘ）ライゲーションミックスは以下の成分で調製した：
５００ｍＭトリスーＨＣｌ （ｐＨ７，８）、２００
ｍＭ ジチオトレイット、ｌ ＯＱｍＭＭｇＣ１２、
ｌ Ｑ ｍＭ ＡＴＰ Ｃ，１′、、ｃｏＪｉ Ｋ １２ ＨＢ １０１／ ｐ
ＬＲ２ＣＤ調製Ｅ、ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＨＢ １０１細
胞（Ｂｏｌｉｖａｒら、Ｇｃｎｅ ２ ： ７５−９３
゜１９７７年１Ｍ）約１０−を遠心分離によってペレッ
ト化し、０．０１Ｍ塩化ナトリウム約１０−に懸濁した
。次いで細胞を再ひペレット化し、０．０３Ｍ塩化カル
シウム約１０−に再懸濁し、氷上で約２０分インキュベ
ートし、３回目のペレット化を行ない、最後に０．０．
３Ｍ塩化カルシウム１．２５ｉに再懸濁した。得られた
細胞懸濁液は以降の形質転換を行ない得るもの（コンピ
テント）であった。
５００ｍＭトリスーＨＣｌ （ｐＨ７，８）、２００
ｍＭ ジチオトレイット、ｌ ＯＱｍＭＭｇＣ１２、
ｌ Ｑ ｍＭ ＡＴＰ Ｃ，１′、、ｃｏＪｉ Ｋ １２ ＨＢ １０１／ ｐ
ＬＲ２ＣＤ調製Ｅ、ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＨＢ １０１細
胞（Ｂｏｌｉｖａｒら、Ｇｃｎｅ ２ ： ７５−９３
゜１９７７年１Ｍ）約１０−を遠心分離によってペレッ
ト化し、０．０１Ｍ塩化ナトリウム約１０−に懸濁した
。次いで細胞を再ひペレット化し、０．０３Ｍ塩化カル
シウム約１０−に再懸濁し、氷上で約２０分インキュベ
ートし、３回目のペレット化を行ない、最後に０．０．
３Ｍ塩化カルシウム１．２５ｉに再懸濁した。得られた
細胞懸濁液は以降の形質転換を行ない得るもの（コンピ
テント）であった。
ＴＥ緩衝液中のプラスミドＩ） Ｉ−Ｒ２をエタノール
沈殿させ、３ＱｍＭ塩化カルシウム溶液１５０μｌに懸
濁し、試験管中でコンピテントＥ、ｃｏＪｉＫ１２
Ｉ−ＩＢＩＯＩ細胞約２００／Ｉｌとゆっくり混合した
。得られた混合物を氷上で約４５分、次いで４２℃で約
１分インキユヘートした。次いて、アンピシリンを５０
μｇ／ｉ含有するＬ−ブロス（１３ｅｒＬａｎｉ１．Ｉ
、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ６２ ： ’２９３．
１９５１年参照）約３−を添加した。この混合物を撮檄
しながら３７℃で１時間インキュベートし、アンピシリ
ンを含有しているＬ−寒天（Ｍｉｌｌｅｒ： １９７２
、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏ１ｅｃｕｌ
ａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ 、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｉ（ａｒｂｏｒ Ｌａｂｓ。
沈殿させ、３ＱｍＭ塩化カルシウム溶液１５０μｌに懸
濁し、試験管中でコンピテントＥ、ｃｏＪｉＫ１２
Ｉ−ＩＢＩＯＩ細胞約２００／Ｉｌとゆっくり混合した
。得られた混合物を氷上で約４５分、次いで４２℃で約
１分インキユヘートした。次いて、アンピシリンを５０
μｇ／ｉ含有するＬ−ブロス（１３ｅｒＬａｎｉ１．Ｉ
、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ６２ ： ’２９３．
１９５１年参照）約３−を添加した。この混合物を撮檄
しながら３７℃で１時間インキュベートし、アンピシリ
ンを含有しているＬ−寒天（Ｍｉｌｌｅｒ： １９７２
、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏ１ｅｃｕｌ
ａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ 、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｉ（ａｒｂｏｒ Ｌａｂｓ。
Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、 Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ 参照）上にのばした。生存コロニーを選択し
、期待した表現型（Ａｍｐ 、−Ｌ−ｅｔ” ）を試
験した結果、これはに 所望の１４．ｃｏｌ ｉ Ｋ １２ ｆ（Ｂ １０１
／ ｐＬＲ２形質転換体を構成していた。
Ｙｏｒｋ 参照）上にのばした。生存コロニーを選択し
、期待した表現型（Ａｍｐ 、−Ｌ−ｅｔ” ）を試
験した結果、これはに 所望の１４．ｃｏｌ ｉ Ｋ １２ ｆ（Ｂ １０１
／ ｐＬＲ２形質転換体を構成していた。
１〕、プラスミドｐＥＬ１０７ およびｐＥＬ１０５の
組み立て １プラスミドＰＩ−Ｒ２のＢａｍＨ１消化および〜１．
６ｋｂチオストレプトン耐性付与フラグメントの単離 プラスミドＰＬＲ２ＤＮＡ約５０μｇ、反応ミックス８
１０μｌ、ＢＳｋ（１ｙｎグ／艷）１０μｌ、水２９μ
ｌ、およびＢａｍ１−１１制限酵素１μｌ！（４単位／
μｌ）を３７℃で２時間インキュベートした。
組み立て １プラスミドＰＩ−Ｒ２のＢａｍＨ１消化および〜１．
６ｋｂチオストレプトン耐性付与フラグメントの単離 プラスミドＰＬＲ２ＤＮＡ約５０μｇ、反応ミックス８
１０μｌ、ＢＳｋ（１ｙｎグ／艷）１０μｌ、水２９μ
ｌ、およびＢａｍ１−１１制限酵素１μｌ！（４単位／
μｌ）を３７℃で２時間インキュベートした。
同容量の４Ｍ酢酸アンモニウムおよび２．５容量の９５
係エタノールを加え、その混合物を一２０℃で約１８時
間冷却してＤＮＡを沈殿させた。この１） ＮΔ沈殿物
を遠心分離して集め、ＴＥ緩衝液約５０μｌに！ＩＷ、
Ｈした。このＤＮＡ懸濁液から、常法により、アガロ
ースゲル電気泳動（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８２ ）
によって所望の〜ｌ、５ ｋｂ ＢａｍＨＩ制限フラ
グメントを単離した。単離後、このフラグメントを、次
の工程の結合のために、ＴＥ２・プラスミドｐＥＬ１０
３の部″）的１パ１１１Ａ彬プラ；ｌ ｉ ドｐＥＬ
１０３ ＤＮＡ約２０μｇ。
係エタノールを加え、その混合物を一２０℃で約１８時
間冷却してＤＮＡを沈殿させた。この１） ＮΔ沈殿物
を遠心分離して集め、ＴＥ緩衝液約５０μｌに！ＩＷ、
Ｈした。このＤＮＡ懸濁液から、常法により、アガロ
ースゲル電気泳動（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８２ ）
によって所望の〜ｌ、５ ｋｂ ＢａｍＨＩ制限フラ
グメントを単離した。単離後、このフラグメントを、次
の工程の結合のために、ＴＥ２・プラスミドｐＥＬ１０
３の部″）的１パ１１１Ａ彬プラ；ｌ ｉ ドｐＥＬ
１０３ ＤＮＡ約２０μｇ。
反応ミックス１０ｔｔｌ、ＢＳＡ（１”Ｐ／ｄ）１０μ
ｌ、水３９μ１１およびＢａ＋ｎ１−Ｉ Ｉ制限酵素（
酵素２μｌを水８μｌに希釈して調製する）１μｊを周
囲温度で約１５分間インキュベートした。同容量の４Ｍ
酢酸アンモニウムおよび２容量の９５係エタノールを加
え、この混合物を約１８時間−２０℃に冷却してＤＮＡ
を沈殿させた。Ｉ） Ｎ Ａ沈殿物を遠心分離して集め
、７０係エタノールで洗い、減圧乾燥した後ＴＥ緩衝液
約５０μｌに懸濁した。
ｌ、水３９μ１１およびＢａ＋ｎ１−Ｉ Ｉ制限酵素（
酵素２μｌを水８μｌに希釈して調製する）１μｊを周
囲温度で約１５分間インキュベートした。同容量の４Ｍ
酢酸アンモニウムおよび２容量の９５係エタノールを加
え、この混合物を約１８時間−２０℃に冷却してＤＮＡ
を沈殿させた。Ｉ） Ｎ Ａ沈殿物を遠心分離して集め
、７０係エタノールで洗い、減圧乾燥した後ＴＥ緩衝液
約５０μｌに懸濁した。
３、結合（ライゲーション）
部分的に消化したプラスミドＰＥＬ１０３ ＤＮＡ約
２０ 、ｃｘｇ、プラスミドＰＬＲ２の〜１．６ ｋ
ｂ１３ａｍＨｉ制限フラグメント１０μｇ、ライゲーシ
ョンミックス５μｌ 、ＢＳＡ（１／”ｉＶ／ｍ１）５
ｔｔｌ 。
２０ 、ｃｘｇ、プラスミドＰＬＲ２の〜１．６ ｋ
ｂ１３ａｍＨｉ制限フラグメント１０μｇ、ライゲーシ
ョンミックス５μｌ 、ＢＳＡ（１／”ｉＶ／ｍ１）５
ｔｔｌ 。
水１０ｔｔｌおよび−１−４１）ＮＡ リガ７ゼ１μｊ
の混合物を約１６℃で約４時間インキュベートした。
の混合物を約１６℃で約４時間インキュベートした。
４Ｍ酢酸アンモニウム４０μｌおよび冷エタノール２０
０ｔｉｌを添加した後、この混合物を約１８時間−２０
℃に冷却してＩ） Ｎ Ａを沈殿させた。このＩ） Ｎ
Ａ沈殿物を遠心分離して集め、７０係エタノール中で
洗浄し、再び集め、次の形質転換工程のために培地Ｐ
（ＨｏｐｗｏｏｄおよびＷｒｉｇｈｔ、Ｊ 、Ｍｏ１ｃ
ｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔ
ｉｃｓ １６２に 、３０７．１９７８年該照）５０μ似懸濁した。
０ｔｉｌを添加した後、この混合物を約１８時間−２０
℃に冷却してＩ） Ｎ Ａを沈殿させた。このＩ） Ｎ
Ａ沈殿物を遠心分離して集め、７０係エタノール中で
洗浄し、再び集め、次の形質転換工程のために培地Ｐ
（ＨｏｐｗｏｏｄおよびＷｒｉｇｈｔ、Ｊ 、Ｍｏ１ｃ
ｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔ
ｉｃｓ １６２に 、３０７．１９７８年該照）５０μ似懸濁した。
可能性のあるｐＥＬ１０３制限フラグメントのビ」、ど
のフラグメントが〜１．５ ｋ ｂ Ｂａｍ１（Ｉチオ
ストレプトン耐性付与フラグメントと結合するかによっ
て、種々のタイプの組替えプラスミドが生成する。プラ
スミドｐＥＬ１０３の〜２，８ｋｂＩｓ ａ ｍ Ｈ１
制限フラグメントに結合すると所望の〜４，４ｋｂプラ
スミドｐＥＬ１０７およびｐＥＬ１０５が得られる。〜
ｌ、 ５ ｋｂ ＢａｍＨＩ耐性付与フラグメントはど
ちらの方向にも向くことができるので、２方向の組替え
プラスミドが生成する。
のフラグメントが〜１．５ ｋ ｂ Ｂａｍ１（Ｉチオ
ストレプトン耐性付与フラグメントと結合するかによっ
て、種々のタイプの組替えプラスミドが生成する。プラ
スミドｐＥＬ１０３の〜２，８ｋｂＩｓ ａ ｍ Ｈ１
制限フラグメントに結合すると所望の〜４，４ｋｂプラ
スミドｐＥＬ１０７およびｐＥＬ１０５が得られる。〜
ｌ、 ５ ｋｂ ＢａｍＨＩ耐性付与フラグメントはど
ちらの方向にも向くことができるので、２方向の組替え
プラスミドが生成する。
プラスミドｐｉミＬ１０７およびｐＥＬ１０５の各々の
制限サイトおよび機能地図を第４図に示す。
制限サイトおよび機能地図を第４図に示す。
Ｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｍｂｏｆａｃｉｅ
ｎｓ ／ ｐＥＬ１０７およびＳ 、 ａｍｂｏｆａｃ
ｉｅｎｓ ／ ｐ Ｅ Ｌ Ｉ Ｑ ５の調製 実施例４Ｄ−３からのＤＮＡ約２０μにおよびストレプ
トマイセス・アンボファシエンス′）（Ｓ 、 ａｍｂ
ｏｆａｃｉｅｎｓ ） （７）プロトプラスト（Ｂａ
ｌｔｚ。
ｎｓ ／ ｐＥＬ１０７およびＳ 、 ａｍｂｏｆａｃ
ｉｅｎｓ ／ ｐ Ｅ Ｌ Ｉ Ｑ ５の調製 実施例４Ｄ−３からのＤＮＡ約２０μにおよびストレプ
トマイセス・アンボファシエンス′）（Ｓ 、 ａｍｂ
ｏｆａｃｉｅｎｓ ） （７）プロトプラスト（Ｂａ
ｌｔｚ。
Ｊ、ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ
ｇｙ １０７：９３．１９７８年診照）ＩＸ１０８
を使って、国際特許出願塵ＰＣＴ／ＧＢ７９１０００９
５（国際公１プＩＪ盃Ｗ０７９１０１１６９ ）の実施
例２の方法に従って表記の調製を行なった。
ｇｙ １０７：９３．１９７８年診照）ＩＸ１０８
を使って、国際特許出願塵ＰＣＴ／ＧＢ７９１０００９
５（国際公１プＩＪ盃Ｗ０７９１０１１６９ ）の実施
例２の方法に従って表記の調製を行なった。
Ｘ）この株はＮｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ
Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬ：ａｂｏｒａｔｏｒｙ、 Ｐｅｏ
ｒｉａ、 ｌ１ｌｉｎｏｉｓ、 のパーマネント・スト
ック・カルチャーコレクション（ＮＲＲＬ）に寄託され
ており、ＮＲＲＬ ２’４２０ の番号で誰でも利用可
能である。再生プロトプラストに改良に２培地（Ｂａ１
ｔｚ、 Ｊ、ｏＥ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉ
−”Ｏｇ）’ １０７ ： ９３．１９７８年蓄照）
トップ寒天（最終的なプレート濃度を５０μｇ／−にす
るに十分なチオストレプトンを含有している）を積層す
ることにより、所望の形質転換体をチオストレプトン耐
性によって選択する。得られたＳ ｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓ ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ ／ ｐ Ｅ Ｌ Ｉ
Ｏ７およびＳ 、ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ ／ ｐ
Ｅ Ｌ Ｉ Ｑ ５チオストレプトン耐性コロニーを既
知の方法で単離し、培養し、構成プラスミドの制限酵素
およびゲル電気泳動分析（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８
２）により同定した。
Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬ：ａｂｏｒａｔｏｒｙ、 Ｐｅｏ
ｒｉａ、 ｌ１ｌｉｎｏｉｓ、 のパーマネント・スト
ック・カルチャーコレクション（ＮＲＲＬ）に寄託され
ており、ＮＲＲＬ ２’４２０ の番号で誰でも利用可
能である。再生プロトプラストに改良に２培地（Ｂａ１
ｔｚ、 Ｊ、ｏＥ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉ
−”Ｏｇ）’ １０７ ： ９３．１９７８年蓄照）
トップ寒天（最終的なプレート濃度を５０μｇ／−にす
るに十分なチオストレプトンを含有している）を積層す
ることにより、所望の形質転換体をチオストレプトン耐
性によって選択する。得られたＳ ｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓ ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ ／ ｐ Ｅ Ｌ Ｉ
Ｏ７およびＳ 、ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ ／ ｐ
Ｅ Ｌ Ｉ Ｑ ５チオストレプトン耐性コロニーを既
知の方法で単離し、培養し、構成プラスミドの制限酵素
およびゲル電気泳動分析（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８
２）により同定した。
従って、最終濃度を５０μｇ ／ ｍＡにするに十分な
チオストレプトンを含有しているトリブチカーゼ大豆ブ
ロスに接種することにより、異なった単離されたコロニ
ーの栄養接種物（１０ｍｌ）を常法により調製する。接
種物をいくつか調製し、全ての所望の形質転換体タイプ
のものおよび構成プラスミドが単離されるまで以下の操
作を行なう。即ち、細胞が十分増殖するまで３０℃でイ
ンキュベートシた後、細胞含有ブロス６ｍｌを遠心分離
する。
チオストレプトンを含有しているトリブチカーゼ大豆ブ
ロスに接種することにより、異なった単離されたコロニ
ーの栄養接種物（１０ｍｌ）を常法により調製する。接
種物をいくつか調製し、全ての所望の形質転換体タイプ
のものおよび構成プラスミドが単離されるまで以下の操
作を行なう。即ち、細胞が十分増殖するまで３０℃でイ
ンキュベートシた後、細胞含有ブロス６ｍｌを遠心分離
する。
得られたペレットをＴ、Ｅ緩衝液で洗浄し、再ひペレッ
ト化し、５０ｍＭ）リス（ｐＩ４８．０）４００ｔｔｌ
ニ懸濁する。次イテ０．２５ Ｍ Ｅ Ｄ ＴＡ約８０
μｚ、 ＲＮａｓｅ ２０ Ｉｌｌ およびリゾチー
ム１００μＪ （１０ｍ？／ｍ１ＴＥ’）を加える。
ト化し、５０ｍＭ）リス（ｐＩ４８．０）４００ｔｔｌ
ニ懸濁する。次イテ０．２５ Ｍ Ｅ Ｄ ＴＡ約８０
μｚ、 ＲＮａｓｅ ２０ Ｉｌｌ およびリゾチー
ム１００μＪ （１０ｍ？／ｍ１ＴＥ’）を加える。
この混合物を３７℃で約１５分間インキュベートした後
、１０係トリトンＸ−１００約１０μｌおよび５ＭＮａ
Ｃ１１５０Ｉｉを加え、最後に６０℃で１５分インキュ
ベートする。得られた溶解質を遠心分離しく１５分、４
℃、１５．０００ ｒＰｍ）、Ｊ：澄液を常法によりフ
ェノールで２回、クロロホルム−イソアミルアルコール
溶液（２４： １ ）で１回抽出した後エタノール沈殿
させる。構成プラスミド、従ってその形質転換体の同定
は、常法により、制限酵素およびアガロースゲル電気泳
動分析（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１．９８２ ）により行
なう。プラスミドＰＥＬ］０５を常法により分離し、次
のプラスミドｐＢＳ １の組み立てに使用する。
、１０係トリトンＸ−１００約１０μｌおよび５ＭＮａ
Ｃ１１５０Ｉｉを加え、最後に６０℃で１５分インキュ
ベートする。得られた溶解質を遠心分離しく１５分、４
℃、１５．０００ ｒＰｍ）、Ｊ：澄液を常法によりフ
ェノールで２回、クロロホルム−イソアミルアルコール
溶液（２４： １ ）で１回抽出した後エタノール沈殿
させる。構成プラスミド、従ってその形質転換体の同定
は、常法により、制限酵素およびアガロースゲル電気泳
動分析（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１．９８２ ）により行
なう。プラスミドＰＥＬ］０５を常法により分離し、次
のプラスミドｐＢＳ １の組み立てに使用する。
１・゛、プラスミドｐ１３ｓｌおよびｐＢＳ ３の組み
立て １プラスミドｐＥＬ１０５の部分的ＢａｍＨ：［消プラ
スミドｐｌ礼Ｌｉ０５（実施例４Ａ−１と同様にして、
Ｓ【ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ
／ｐＥＬ１０５ （実施例４ Ｅで調製）から常法に
より単離）約１０μｇ（５μｇ）、Ｂ Ｓ Ａ （１ｍ
ｙ ／ 、ｎｌ ） ２μ１１水２ ｇ μｚ 、
ＩＳａｍｌｌ Ｉ （水で１゛４に希釈）制限酵素１μ
１１およＯ・反応ミックス５μｌを２５℃で１５分間イ
ンキュベートした。４Ｍ酢酢酸アンユニ１クム約５０μ
ｌ９５％エタノール３００μｌを加えて反応を停止させ
た。−２０°Ｃに約２時間冷却した後、得られたＤＮＡ
沈殿物を遠心分離によって集め、７０係エタノール中で
２回洗浄し、減圧乾燥し、ｒ １；−緩衝液約１０μｌ
に懸濁した。
立て １プラスミドｐＥＬ１０５の部分的ＢａｍＨ：［消プラ
スミドｐｌ礼Ｌｉ０５（実施例４Ａ−１と同様にして、
Ｓ【ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ
／ｐＥＬ１０５ （実施例４ Ｅで調製）から常法に
より単離）約１０μｇ（５μｇ）、Ｂ Ｓ Ａ （１ｍ
ｙ ／ 、ｎｌ ） ２μ１１水２ ｇ μｚ 、
ＩＳａｍｌｌ Ｉ （水で１゛４に希釈）制限酵素１μ
１１およＯ・反応ミックス５μｌを２５℃で１５分間イ
ンキュベートした。４Ｍ酢酢酸アンユニ１クム約５０μ
ｌ９５％エタノール３００μｌを加えて反応を停止させ
た。−２０°Ｃに約２時間冷却した後、得られたＤＮＡ
沈殿物を遠心分離によって集め、７０係エタノール中で
２回洗浄し、減圧乾燥し、ｒ １；−緩衝液約１０μｌ
に懸濁した。
プラスミドｐＥＬ１０５ は２つの１３ａｎ］ＨＩ制
限サイトを持っているので、種々のフラグメントの混合
物が生成する。
限サイトを持っているので、種々のフラグメントの混合
物が生成する。
２プラスミドｐＨ１−１８のＢａｍＨＩ消化プラスミド
ｐｔ（１−１８約５μｌ（５１℃ｇ）、ＢＳＡ （１１
１１／ｍＶ） ２ μＪ、水９ Ａｌｌ 、 ＢａｍＨ
Ｉ（４単位／μＪ）制限酵素１μｌおよび反応ミックス
１．５μｌを３７°Ｃで約２時間インキュベートした。
ｐｔ（１−１８約５μｌ（５１℃ｇ）、ＢＳＡ （１１
１１／ｍＶ） ２ μＪ、水９ Ａｌｌ 、 ＢａｍＨ
Ｉ（４単位／μＪ）制限酵素１μｌおよび反応ミックス
１．５μｌを３７°Ｃで約２時間インキュベートした。
同容量の４Ｍ酢酸アンモニウムおよび２゜５容量の９５
係エタノールを添加した後、この混合物を一２０°Ｃに
約１８時間冷却してＩ） Ｎ Ａを沈殿させた。遠心分
割、によってＩ） Ｎ Ａ沈殿物を集め、７０％エタノ
ールで洗い、１′Ｆ−緩衝液約１０μｌに懸副した。
係エタノールを添加した後、この混合物を一２０°Ｃに
約１８時間冷却してＩ） Ｎ Ａを沈殿させた。遠心分
割、によってＩ） Ｎ Ａ沈殿物を集め、７０％エタノ
ールで洗い、１′Ｆ−緩衝液約１０μｌに懸副した。
３、結合（ライゲーション）
Ｂａｍｌ−１１消化プラスミドｐｒ−１１−１８約５１
１１、プラスミドｌ） Ｉｉ Ｌ Ｉ Ｑ ５ Ｂａｍ
０１部分的消化物８μ１１水２７μＪ、ＡＴＰ５μｌ
（４ｍＭ ）、 ライゲーションミックス５μｌおよ
びＩ’４１）ＮＡリガーゼ２μｌを１６゛ｃで約１８時
間インキュへ一トシた。４Ｍ酢酸アンモニウム５０μｌ
および９５係エタノール２００μｊを加えて反応をイ孕
止させた。
１１、プラスミドｌ） Ｉｉ Ｌ Ｉ Ｑ ５ Ｂａｍ
０１部分的消化物８μ１１水２７μＪ、ＡＴＰ５μｌ
（４ｍＭ ）、 ライゲーションミックス５μｌおよ
びＩ’４１）ＮＡリガーゼ２μｌを１６゛ｃで約１８時
間インキュへ一トシた。４Ｍ酢酸アンモニウム５０μｌ
および９５係エタノール２００μｊを加えて反応をイ孕
止させた。
−２０℃で約２時間インキュベートした後、所望のプラ
スミドｐ Ｂ Ｓ １ およびｐＢｓ３＋）ＮＡ沈殿物
を遠心分離して集め、７ｏ俸エタノールで洗い、減圧乾
燥し、ＴＥ緩衝２１０μｌに懸濁し、使用するまで４℃
で貯蔵した。
スミドｐ Ｂ Ｓ １ およびｐＢｓ３＋）ＮＡ沈殿物
を遠心分離して集め、７ｏ俸エタノールで洗い、減圧乾
燥し、ＴＥ緩衝２１０μｌに懸濁し、使用するまで４℃
で貯蔵した。
プラスミドＰ１″：Ｌ１０５ には２つのＢ ａ ｍＨ
ｉ制限→ノーイトかあるので、部分的１３ ａ ｍ ｉ
（Ｉ消化により２個の〜４，４ ｋｂ ＢａｍＩ旧フラ
クメントが生成する。従って、上記の操作によってプラ
スミドｐ １３ ＳｌおよびｐＢＳ３ の挿入アイソマ
ーが生成する。
ｉ制限→ノーイトかあるので、部分的１３ ａ ｍ ｉ
（Ｉ消化により２個の〜４，４ ｋｂ ＢａｍＩ旧フラ
クメントが生成する。従って、上記の操作によってプラ
スミドｐ １３ ＳｌおよびｐＢＳ３ の挿入アイソマ
ーが生成する。
ＢａｍＨＩ制限１） Ｎ Ａはいづれの方向にも結合す
ることができるので、２方向の組替えプラスミドが生成
する。プラスミドｐＢＳ１およびｐＢＳ３のそれぞれの
制限サイトおよび機能地図を第５図に示した。
ることができるので、２方向の組替えプラスミドが生成
する。プラスミドｐＢＳ１およびｐＢＳ３のそれぞれの
制限サイトおよび機能地図を第５図に示した。
Ｇ、 １３ａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌ ｉｓ
Ｍｌ １１２ ／ ｐＢＳ １およびＢ、５ｕｂＬｉ
ｌｉｓ Ｍｌｌ １２／ｐＢＳ３の調製プラスミドｐＩ
（Ｉ −１８の代りに、プラスミドｐＢ８１ およびｐ
ＢＳ３を用いるほかは、実施例２Ｃと実質的に同じ方法
で、所望の調製を行なう。
Ｍｌ １１２ ／ ｐＢＳ １およびＢ、５ｕｂＬｉ
ｌｉｓ Ｍｌｌ １２／ｐＢＳ３の調製プラスミドｐＩ
（Ｉ −１８の代りに、プラスミドｐＢ８１ およびｐ
ＢＳ３を用いるほかは、実施例２Ｃと実質的に同じ方法
で、所望の調製を行なう。
得られたＢａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｍｌ
１１２／ｐＢＳ１およびＢａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂ
ｔｉｌｉｓ Ｍｌ ｌ１２／ｐＢＳ３クロラムフエニコ
ール耐性並びにカナマイシン感受性形質転換体コロニー
を既知の方法で分離し、培養し、常法に従い、構成プラ
スミドの制限酵素およびアガロースゲル電気泳動分析（
ＭａｎｉａＬｉｓら、１９８２）によって同定する。Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｍｌ １１２／ ｐ
ＢＳ １を選択、培養してプラスミドｐＢＳ ｌ を
単離する。
１１２／ｐＢＳ１およびＢａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂ
ｔｉｌｉｓ Ｍｌ ｌ１２／ｐＢＳ３クロラムフエニコ
ール耐性並びにカナマイシン感受性形質転換体コロニー
を既知の方法で分離し、培養し、常法に従い、構成プラ
スミドの制限酵素およびアガロースゲル電気泳動分析（
ＭａｎｉａＬｉｓら、１９８２）によって同定する。Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｍｌ １１２／ ｐ
ＢＳ １を選択、培養してプラスミドｐＢＳ ｌ を
単離する。
■−■、プラスミドｐＯＷ５２７ およびｐＯＷ５２８
、並ひにＥ、ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＪＡ ２２１／１）
ＯＷ５２７およびＥ、ｃｏｌｉＫ１２ ＪＡ ２２１／
１）ＯＷ５２８の組み立て プラスミドｐｔｌ ｌ −１８の代りにプラスミドｐＢ
Ｓｌ を使用するほかは実施例２と実質的に同様にして
、所望のプラスミドｐＯＷ５２７およびｐＯＷ５２８、
並ひに形質転換体Ｅ、ｃｏｌｉＫ１２ＪＡ ２２１／ｐ
ＯＷ５２７および１礼、ｃｏｌｉＫ１２ＪＡ ２２１／
ＰＯＷ５２８を調製した。ＥｃｏＲＩ制限化ＤＮＡはい
づれの方向にも結合することかできるので、２方向の組
換えプラスミドか生成する。
、並ひにＥ、ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＪＡ ２２１／１）
ＯＷ５２７およびＥ、ｃｏｌｉＫ１２ ＪＡ ２２１／
１）ＯＷ５２８の組み立て プラスミドｐｔｌ ｌ −１８の代りにプラスミドｐＢ
Ｓｌ を使用するほかは実施例２と実質的に同様にして
、所望のプラスミドｐＯＷ５２７およびｐＯＷ５２８、
並ひに形質転換体Ｅ、ｃｏｌｉＫ１２ＪＡ ２２１／ｐ
ＯＷ５２７および１礼、ｃｏｌｉＫ１２ＪＡ ２２１／
ＰＯＷ５２８を調製した。ＥｃｏＲＩ制限化ＤＮＡはい
づれの方向にも結合することかできるので、２方向の組
換えプラスミドか生成する。
プラスミドＰＯＷ５２７およびｐＯＷ５２８のそれぞれ
の制限サイト地図蚕第１図に示した。
の制限サイト地図蚕第１図に示した。
実施例５ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ
Ｍｌ ｌ １２／ＰＯＷ５２７および１３，５ｕｂＬ
ｉｌｉｓ Ｍｌ ｌ １２／ＰＯＷ５２８の組み立て プラスミドｐｉ（Ｉ−１８の代りにプラスミド１） Ｏ
Ｗ ５２７およびｐ ＯＷ ５２８を用いるほかは実施
例２Ｃと実質的に同楳にして表記の組み立てを行なう。
Ｍｌ ｌ １２／ＰＯＷ５２７および１３，５ｕｂＬ
ｉｌｉｓ Ｍｌ ｌ １２／ＰＯＷ５２８の組み立て プラスミドｐｉ（Ｉ−１８の代りにプラスミド１） Ｏ
Ｗ ５２７およびｐ ＯＷ ５２８を用いるほかは実施
例２Ｃと実質的に同楳にして表記の組み立てを行なう。
得られたＢａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｍ
ｌｌ、１２／ＰＯＷ５２７およびＢ、 ５ｕｂｔｉｌ
ｉｓ Ｍｌ ｌ ｌ ２／ ｌ） ＯＷ ５２８ ク
ロラムフェニコール面１性およびカナマイシン感受性形
質転換体コロニーを常法に従って分離し、構成プラスミ
ドの制限酵素およびアガロニスゲル電気泳動分析（Ｍａ
ｎｉａｔｉｓら、１９８２ ）により、常法通り同定し
た。プラスミドｌ） ＯＷ ５２７ およびｐＯＷ５２
８ の製造及び単離に有用な、この様にして組み立てた
形質転換体は細胞内でプレープロインシュリンを生産し
、培養培地にプロインシュリンを分泌する。これは細胞
溶解質および培養培地の両者をインビトロでアッセイす
ることにより確認した。
ｌｌ、１２／ＰＯＷ５２７およびＢ、 ５ｕｂｔｉｌ
ｉｓ Ｍｌ ｌ ｌ ２／ ｌ） ＯＷ ５２８ ク
ロラムフェニコール面１性およびカナマイシン感受性形
質転換体コロニーを常法に従って分離し、構成プラスミ
ドの制限酵素およびアガロニスゲル電気泳動分析（Ｍａ
ｎｉａｔｉｓら、１９８２ ）により、常法通り同定し
た。プラスミドｌ） ＯＷ ５２７ およびｐＯＷ５２
８ の製造及び単離に有用な、この様にして組み立てた
形質転換体は細胞内でプレープロインシュリンを生産し
、培養培地にプロインシュリンを分泌する。これは細胞
溶解質および培養培地の両者をインビトロでアッセイす
ることにより確認した。
実施例６ プラスミドＰＯＷ３０３ およびＥ。
ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＢＥ９０４／ＰＯＷ３０３の組み
立てＡ、プラスミドｐＯＷＩＱのＮｃｏｌ消化ＴＥ緩衝
液中のプラスミドｐＯＷ１０（実施例ＩＤで調製）約２
μＪ（２μｇ）、ＤＴＴ２．５μｌ（１００ｍＭ）、Ｂ
ＳＡ 、５１１１ （１，０００μｇ／ｍｌ）、水１７
１１１．Ｎｃｏｌ制限酵素１ μｉ （４ＮｅｗＦ、ｎ
ｇｌａｎｄ Ｂｉｏ Ｌａｂ単位含有）、ＩＯＸ反応
ミックス２．５μｌを３７′Ｇで１．５時間インキュベ
ートした。６５’Ｃで１ｏ分間インキュへ一トシて反応
を停止させた後、消化したＩ）ＮΔをエタノール沈殿さ
せ、水３４，５μｌに溶解した。
立てＡ、プラスミドｐＯＷＩＱのＮｃｏｌ消化ＴＥ緩衝
液中のプラスミドｐＯＷ１０（実施例ＩＤで調製）約２
μＪ（２μｇ）、ＤＴＴ２．５μｌ（１００ｍＭ）、Ｂ
ＳＡ 、５１１１ （１，０００μｇ／ｍｌ）、水１７
１１１．Ｎｃｏｌ制限酵素１ μｉ （４ＮｅｗＦ、ｎ
ｇｌａｎｄ Ｂｉｏ Ｌａｂ単位含有）、ＩＯＸ反応
ミックス２．５μｌを３７′Ｇで１．５時間インキュベ
ートした。６５’Ｃで１ｏ分間インキュへ一トシて反応
を停止させた後、消化したＩ）ＮΔをエタノール沈殿さ
せ、水３４，５μｌに溶解した。
ＨＮｃｏｌ制限酵素用反応ミックスは以下の成分で調製
した：ＮａＣ１’１５００ｍＭ、トリス塩酸（Ｐ Ｉ−
Ｉ ７’） ６０ ｍＭ、 ＭｇＣＪ２
６０ ｍＭ。
した：ＮａＣ１’１５００ｍＭ、トリス塩酸（Ｐ Ｉ−
Ｉ ７’） ６０ ｍＭ、 ＭｇＣＪ２
６０ ｍＭ。
Ｂ、プラスミドＰＭＣ１４０３のＢ ａ＋ｎ ｔｌ ｌ
消化プラスミドｐＯＷ１０およびＮｃｏｌ 制限
酵素と反応ミックスの代りにプラスミドｐＭｃ１４０３
および１３ ａ ＋ｎ Ｉ］Ｉ制限酵素と反応ミックス
を使用するほかは実施例６Ａと実質的に同様にして、表
記の消化を行なった。実施例１Ａ−１と実質的に同様に
して、Ｅ、ｃｏｌｉＫ１２ ＢＥ９０４／ＰＭｃ１４０
３（ＮＲＲＬ Ｂ−１５２１３，） からプラスミド
ｐＭｃ１４０３ を分離した。消化したＩ） Ｎ Ａ
をエタノール沈殿させ、水３４，５μｌに溶解した。
消化プラスミドｐＯＷ１０およびＮｃｏｌ 制限
酵素と反応ミックスの代りにプラスミドｐＭｃ１４０３
および１３ ａ ＋ｎ Ｉ］Ｉ制限酵素と反応ミックス
を使用するほかは実施例６Ａと実質的に同様にして、表
記の消化を行なった。実施例１Ａ−１と実質的に同様に
して、Ｅ、ｃｏｌｉＫ１２ ＢＥ９０４／ＰＭｃ１４０
３（ＮＲＲＬ Ｂ−１５２１３，） からプラスミド
ｐＭｃ１４０３ を分離した。消化したＩ） Ｎ Ａ
をエタノール沈殿させ、水３４，５μｌに溶解した。
Ｃ，Ｎｃｏｌ消化プラスミドｐ Ｏ’Ａ’ ｌ Ｑおよ
びＢ ａ ｍ Ｉ−１１消化プラスミドルＭｃ１４０３
のフレナラ補充（Ｋｌｃｎｏｗ Ｆ’ｉｌｌ −ｉ
ｎ ）実施例６Ａおよび６ＢのＮｃｏＩおよびＢ ａ
ｍｔｌ Ｉ消化物を混合しく６９μｌ）、ｄＡＴＰ、ｄ
ＧＴＰ、ｄ Ｃ１Ｎ’ オヨヒ’ ＴＴ Ｐ 各４ ｔ
ｔｚ、 Ｄ Ｎ Ａ ；Ｐ！ ’Ｊ ｌ ラーゼＩ
ラージ（Ｋｌｅｎｏｗ ）フラグメント ５μ１（１０
単位含有）および１０×クレナウ緩衝液（，５Ｍトリス
塩酸（ｐＬＩ ７．２ ）１，１ＭＭｇＳ０４、ｌ ｍ
Ｍ ＤＴＴ ） １０ ｆｉ ｌを１６℃で３０分間
インキュベートした。６５℃で１０分間インキュベート
して反応を停止させた後、ＤＮＡをエタノール沈殿すせ
、フェノールで１回、クロロホルム、イソアミルアルコ
ール（２４： １ ）で２回抽出し、再びエタノール沈
殿させた。このフレナラ補充１） Ｎ Ａを水２０μｌ
に溶解し、次のＦ、ｃｏＲ１消化に供した。
びＢ ａ ｍ Ｉ−１１消化プラスミドルＭｃ１４０３
のフレナラ補充（Ｋｌｃｎｏｗ Ｆ’ｉｌｌ −ｉ
ｎ ）実施例６Ａおよび６ＢのＮｃｏＩおよびＢ ａ
ｍｔｌ Ｉ消化物を混合しく６９μｌ）、ｄＡＴＰ、ｄ
ＧＴＰ、ｄ Ｃ１Ｎ’ オヨヒ’ ＴＴ Ｐ 各４ ｔ
ｔｚ、 Ｄ Ｎ Ａ ；Ｐ！ ’Ｊ ｌ ラーゼＩ
ラージ（Ｋｌｅｎｏｗ ）フラグメント ５μ１（１０
単位含有）および１０×クレナウ緩衝液（，５Ｍトリス
塩酸（ｐＬＩ ７．２ ）１，１ＭＭｇＳ０４、ｌ ｍ
Ｍ ＤＴＴ ） １０ ｆｉ ｌを１６℃で３０分間
インキュベートした。６５℃で１０分間インキュベート
して反応を停止させた後、ＤＮＡをエタノール沈殿すせ
、フェノールで１回、クロロホルム、イソアミルアルコ
ール（２４： １ ）で２回抽出し、再びエタノール沈
殿させた。このフレナラ補充１） Ｎ Ａを水２０μｌ
に溶解し、次のＦ、ｃｏＲ１消化に供した。
” ＤＮＡポリメラーゼエのＫｌ ｅｎｏｗ （フレ
ナラ）フラグメントは以下の供給源から入手できる：Ｂ
ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｃａｌｓ。
ナラ）フラグメントは以下の供給源から入手できる：Ｂ
ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｃａｌｓ。
７９４１ Ｃａｓｔｌｅｗａｙ Ｉ）ｒｉｖｅ Ｉ
ｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ。
ｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ。
Ｉｎｄｉａｎａ ４６２５０
Ｄ、フレナラ補充ＮｃｏＩおよびＢａｍ ［１１７ラグ
メントのＥｃｏＲＩ消化 フレナラ補充ＤＮＡ約２０μ／（４μｇ）、ＤＴＴ ｓ
μｌ！ （１００ｍＭ）、Ｂ５Ａ３μ／（１０００”
！／／ｒｎ１）、ＥｃｏＲＩ制限酵素２μＩ！（ＩＯＮ
ｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ １３ｉｏ Ｌａｄ単位含有
）および（１０Ｘ）反応ミックス５μｌを３７℃で１時
間インキュベートし、次いで６５℃で１０分間インキュ
ベートした。得られたＥｃｏＲＩ 消化ＤＮＡをエタ
ノール沈殿させ、水３０μｌに浴解した。
メントのＥｃｏＲＩ消化 フレナラ補充ＤＮＡ約２０μ／（４μｇ）、ＤＴＴ ｓ
μｌ！ （１００ｍＭ）、Ｂ５Ａ３μ／（１０００”
！／／ｒｎ１）、ＥｃｏＲＩ制限酵素２μＩ！（ＩＯＮ
ｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ １３ｉｏ Ｌａｄ単位含有
）および（１０Ｘ）反応ミックス５μｌを３７℃で１時
間インキュベートし、次いで６５℃で１０分間インキュ
ベートした。得られたＥｃｏＲＩ 消化ＤＮＡをエタ
ノール沈殿させ、水３０μｌに浴解した。
Ｅ、ＥｃｏＲＩ 消化したフレナラ補充Ｎｃｏｌおよび
ＢａｍＨＩ フラグメントのライゲーションおよびＥ
、ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｂｌ！、９０４／ＰＯＷ３０３
の組み立て ＥｃｏＲＩ 消化したフレナラ補充フラグメント約３
０ｐｉ、ＤＴ”Ｔ４μ／（１００ｍＭ）、ＡＴＰ４ｐｌ
（１００ｍＭ）、１０×リガ一ゼ緩衝液４μｍおよび
ゴ、ＤＮＡ リガーゼ１ ｔｔｌ （］、 Ｑ Ｎｅ
ｗＥｎｇｌａｎｄ ＋３ｉｏ Ｌａｂ 単位含有）を
１６℃で約１６時間、次いで６５゛Ｃで１０分間インキ
ュベートした。得られた結合ＤＮＡ （ｐＯＷ３０３
と命名した）約１５μｌを氷上で冷却した後、Ｅ、ｃｏ
ｌｉＫ１２ ＋３１９０４ （ＮＲＲＬ Ｂ−１５
２１２）の形質転換に使用した。これは、プラスミドＰ
ＯＷＩＯの代りにプラスミドｐＯＷ３０３を、テトラサ
イクリンの代りにアンピシリン８０μｇ／ｍｌを使用す
るほかは実施例ＩＤの方法と実質的に同様にして行なっ
た。さらに、β−ガラクトシダーゼ活性の簡単なアッセ
イに色を使用できる様に、Ｔ Ｙプレートに５−プロそ
−４−クロロ−３−インドリル−β−■）−ガラクトシ
ド（Ｘ−ｇａｌり４０μｇ／ｒｔ１を含ませた。得られ
た青色のアンピシリン剛性形質転換体は所望の１ら、ｃ
ｏｌｉ Ｋ１２ ＢＥ ９０４／Ｐ ＯＷ ３０．
３を構成していた。この形質転換体を通常の微生物学的
手法で培養し、実施例ＩＡ−１と実質的に同様にしてｐ
ＯＷ３０３の製造および単離用に使用した。プラスミド
ｐＯＷ３０３ の制限サイト地図を添付の第２図に示
した。
ＢａｍＨＩ フラグメントのライゲーションおよびＥ
、ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｂｌ！、９０４／ＰＯＷ３０３
の組み立て ＥｃｏＲＩ 消化したフレナラ補充フラグメント約３
０ｐｉ、ＤＴ”Ｔ４μ／（１００ｍＭ）、ＡＴＰ４ｐｌ
（１００ｍＭ）、１０×リガ一ゼ緩衝液４μｍおよび
ゴ、ＤＮＡ リガーゼ１ ｔｔｌ （］、 Ｑ Ｎｅ
ｗＥｎｇｌａｎｄ ＋３ｉｏ Ｌａｂ 単位含有）を
１６℃で約１６時間、次いで６５゛Ｃで１０分間インキ
ュベートした。得られた結合ＤＮＡ （ｐＯＷ３０３
と命名した）約１５μｌを氷上で冷却した後、Ｅ、ｃｏ
ｌｉＫ１２ ＋３１９０４ （ＮＲＲＬ Ｂ−１５
２１２）の形質転換に使用した。これは、プラスミドＰ
ＯＷＩＯの代りにプラスミドｐＯＷ３０３を、テトラサ
イクリンの代りにアンピシリン８０μｇ／ｍｌを使用す
るほかは実施例ＩＤの方法と実質的に同様にして行なっ
た。さらに、β−ガラクトシダーゼ活性の簡単なアッセ
イに色を使用できる様に、Ｔ Ｙプレートに５−プロそ
−４−クロロ−３−インドリル−β−■）−ガラクトシ
ド（Ｘ−ｇａｌり４０μｇ／ｒｔ１を含ませた。得られ
た青色のアンピシリン剛性形質転換体は所望の１ら、ｃ
ｏｌｉ Ｋ１２ ＢＥ ９０４／Ｐ ＯＷ ３０．
３を構成していた。この形質転換体を通常の微生物学的
手法で培養し、実施例ＩＡ−１と実質的に同様にしてｐ
ＯＷ３０３の製造および単離用に使用した。プラスミド
ｐＯＷ３０３ の制限サイト地図を添付の第２図に示
した。
実施例７ プラスミドｐＯＷ５２３およびｐＯＷ５２４
並びにＥ、ｃｏｌ ｉ Ｋ １２ Ｉ３ Ｅ ９０４／
ＰＯＷ５２３および１ｉ、ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＢＥ
９０４／ＰＯＷ５２４の組み立て プラスミドｐｏｗ１０の代りにプラスミドＰＯＷ３０３
． テトラサイクリンの代りにアンピシリン８０μｇ
／ ｍｔ：を使用するほかは実施例２ ＋）および２Ｅ
と実質的に同様にして表記の組み立てを行なった。更に
、β−ガラクトシダーゼ活性の簡単なアッセイに色を使
用し得る様に１゛ＹプレートにＸ−ｇａ１４Ｑμｇ／Ｔ
ｎｌを含有せしめた。Ｅｃ。
並びにＥ、ｃｏｌ ｉ Ｋ １２ Ｉ３ Ｅ ９０４／
ＰＯＷ５２３および１ｉ、ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＢＥ
９０４／ＰＯＷ５２４の組み立て プラスミドｐｏｗ１０の代りにプラスミドＰＯＷ３０３
． テトラサイクリンの代りにアンピシリン８０μｇ
／ ｍｔ：を使用するほかは実施例２ ＋）および２Ｅ
と実質的に同様にして表記の組み立てを行なった。更に
、β−ガラクトシダーゼ活性の簡単なアッセイに色を使
用し得る様に１゛ＹプレートにＸ−ｇａ１４Ｑμｇ／Ｔ
ｎｌを含有せしめた。Ｅｃ。
ＲＩ制限ＤＮＡはいづれの方向にも結合し得るので、２
方向の組換えプラスミドか生成する。プラスミドｐＯＷ
５２３ とＰＯＷ５２４の制限サイト地図を添付の第２
図に示す。
方向の組換えプラスミドか生成する。プラスミドｐＯＷ
５２３ とＰＯＷ５２４の制限サイト地図を添付の第２
図に示す。
実施例Ｂ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ
Ｍｌ １１２／ＰＯＷ５２３およびＢ、５ｕｂｔｉ
ｌｉｓ Ｍｌ ｌ １２／ｐＯＷ５２４の組み立て プラスミドｐＨ１１８の代りにプラスミドｐＯＷ５２３
およびｐＯＷ５２４を使用するほかは実施例２Ｃと実
質的に同様にして表記の組み立てを行なった。更に、β
−ガラクトシダーゼ活性の簡便なアッセイとして色を使
用し得る様に、再生培地がＸ−ｇａ／４０μｇ／ｒｎｌ
を含む様に改良した。
Ｍｌ １１２／ＰＯＷ５２３およびＢ、５ｕｂｔｉ
ｌｉｓ Ｍｌ ｌ １２／ｐＯＷ５２４の組み立て プラスミドｐＨ１１８の代りにプラスミドｐＯＷ５２３
およびｐＯＷ５２４を使用するほかは実施例２Ｃと実
質的に同様にして表記の組み立てを行なった。更に、β
−ガラクトシダーゼ活性の簡便なアッセイとして色を使
用し得る様に、再生培地がＸ−ｇａ／４０μｇ／ｒｎｌ
を含む様に改良した。
得られたＢａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ ＭＩ
ｌ １２ ／ ＰＯＷ５２３および１３．５ｕｂｔｉ
ｌｉｓ ＭＩ １１２／ＰＯＷ５２４クロラムフエニコ
ール耐性、カナマイシン感受性形質転換体コロニーを既
知の方法で分離した。この形質転換体はＸ−ｇａｌ含有
プレート上に暗青色のコロニーを生成した。これはβ−
ガラクトシダーゼ活性を暗号化している遺伝子が、直接
発現のための正しい翻訳解読相同に存在することを示し
ている。このことは更に、形質転換体にβ−ガラクトシ
ダーゼ活性が存在することを示したインビトロアッセイ
により、そしてまたプラスミドの構造分析により確認さ
れた。所望のＢ、ｓｕｂｔｉｌｉｓＭｌ １１２／ＰＯ
Ｗ５２３およびＢ、５ｕｂｔｉｌ ｉｓ ＭＴ１１２／
ＰＯＷ５２４形質転換体を培養し、次いで構成プラスミ
ドの制限酵素およびアガロース−ゲル電気泳動分析（Ｍ
ａｎｉａｔｉｓ ら、１９８２）により常法通り同定し
た。
ｌ １２ ／ ＰＯＷ５２３および１３．５ｕｂｔｉ
ｌｉｓ ＭＩ １１２／ＰＯＷ５２４クロラムフエニコ
ール耐性、カナマイシン感受性形質転換体コロニーを既
知の方法で分離した。この形質転換体はＸ−ｇａｌ含有
プレート上に暗青色のコロニーを生成した。これはβ−
ガラクトシダーゼ活性を暗号化している遺伝子が、直接
発現のための正しい翻訳解読相同に存在することを示し
ている。このことは更に、形質転換体にβ−ガラクトシ
ダーゼ活性が存在することを示したインビトロアッセイ
により、そしてまたプラスミドの構造分析により確認さ
れた。所望のＢ、ｓｕｂｔｉｌｉｓＭｌ １１２／ＰＯ
Ｗ５２３およびＢ、５ｕｂｔｉｌ ｉｓ ＭＴ１１２／
ＰＯＷ５２４形質転換体を培養し、次いで構成プラスミ
ドの制限酵素およびアガロース−ゲル電気泳動分析（Ｍ
ａｎｉａｔｉｓ ら、１９８２）により常法通り同定し
た。
実施例９ プラスミドＰＯＷ５２９ およびｐＯＷ５３
０並びにＩ気ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＢＥ９０４／ＰＯＷ５
２９およびｆシ、ｃｏｌｉ Ｋｌ ２１ＳＥ ９０４／
１）ＯＷ５３０の組み立て プラスミドｐＯＷＩＱおよびｐｌ−１１−１８の代りに
プラスミドｐＯＷ３０３およびｐ１３ｓｌ を使用し、
テトラサイクリンの代りにアンピシリン８０μｇ／−を
使用するほかは実施例２１）および２■Ｃと実質的に同
様にして表記の組み立てを行なう。
０並びにＩ気ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＢＥ９０４／ＰＯＷ５
２９およびｆシ、ｃｏｌｉ Ｋｌ ２１ＳＥ ９０４／
１）ＯＷ５３０の組み立て プラスミドｐＯＷＩＱおよびｐｌ−１１−１８の代りに
プラスミドｐＯＷ３０３およびｐ１３ｓｌ を使用し、
テトラサイクリンの代りにアンピシリン８０μｇ／−を
使用するほかは実施例２１）および２■Ｃと実質的に同
様にして表記の組み立てを行なう。
更に、β−ガラクトシダーゼ活性の簡便なアッセイとし
て色を使用し得る様に、Ｔ ＹプレートにＸ−ｇａ１４
０μｇ／ｒｎｌを含ませた。ＥｃｏＲＩ 制限化ＤＮ
Ａはいづれの方向にも結合し得るので２つの方向性の異
なる組換えプラスミドが得られる。
て色を使用し得る様に、Ｔ ＹプレートにＸ−ｇａ１４
０μｇ／ｒｎｌを含ませた。ＥｃｏＲＩ 制限化ＤＮ
Ａはいづれの方向にも結合し得るので２つの方向性の異
なる組換えプラスミドが得られる。
プラスミドＰＯＷ５２９ ねよびｐ’ＯＷ ５３０のそ
れぞれの制限サイト地図を第２図に示す。
れぞれの制限サイト地図を第２図に示す。
実施例ＩＱ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ
ＭＩ ｌ １２／ｐＯＷ５２９ およびＢ、５ｕｂ
ｔｉｌｉｓ Ｍ Ｉ ｌ １２ ／ｐ ＯＷ５３０
の組み立て プラスミドｐＯＷ５２３ およびｐ ＯＷ ５２４ の
代りにプラスミドｐＯＷ５２９およびｐ Ｏ’Ｗ５３０
を使用するほかは実施例８と実質的に同様にして表記の
組み立てを行なう。この形質転換体は、Ｘ−ｇａｌ
含有プレート上に暗青色のコロニーを生成した。これは
、β−ガラクトシダーゼ活性を暗号化している遺伝子が
直接発現のための正しい翻訳解読相の中にあることを示
している。このことは、形質転換体にβ−ガラクトシダ
ーゼ活性の存在することを示すインビトロアッセイおよ
びプラスミドの構造分析により確められる。所望のＢ。
ＭＩ ｌ １２／ｐＯＷ５２９ およびＢ、５ｕｂ
ｔｉｌｉｓ Ｍ Ｉ ｌ １２ ／ｐ ＯＷ５３０
の組み立て プラスミドｐＯＷ５２３ およびｐ ＯＷ ５２４ の
代りにプラスミドｐＯＷ５２９およびｐ Ｏ’Ｗ５３０
を使用するほかは実施例８と実質的に同様にして表記の
組み立てを行なう。この形質転換体は、Ｘ−ｇａｌ
含有プレート上に暗青色のコロニーを生成した。これは
、β−ガラクトシダーゼ活性を暗号化している遺伝子が
直接発現のための正しい翻訳解読相の中にあることを示
している。このことは、形質転換体にβ−ガラクトシダ
ーゼ活性の存在することを示すインビトロアッセイおよ
びプラスミドの構造分析により確められる。所望のＢ。
５ｕｂｔ １ｌｉｓ Ｍｌ １１２ ／ ｐＯＷ ５２
９および１フ。
９および１フ。
５ｕｌ）いＩｉｓ Ｍ ｌ １１２ ／１）ＯＷ ５
３０形質転換体を培養し、次いで構成プラスミドの制限
酵素およびアガロースゲル電気泳動分析（Ｍａｎｉａｔ
ｉｓら、１９８２ ）により同定する。
３０形質転換体を培養し、次いで構成プラスミドの制限
酵素およびアガロースゲル電気泳動分析（Ｍａｎｉａｔ
ｉｓら、１９８２ ）により同定する。
実施例１１ ＤＮＡフラグメントの組み立て〔式中、
ｋはＣ，Ｒ１はＧを表わす〕 以下に示すオリゴヌクレオチドＴ３およびＴ４の合成お
よび５′燐酸化により表記の組み立てを行なう。
ｋはＣ，Ｒ１はＧを表わす〕 以下に示すオリゴヌクレオチドＴ３およびＴ４の合成お
よび５′燐酸化により表記の組み立てを行なう。
Ｔ３ 二 ５’ ＡＧＴＧＡＧＧＴＧＧ／ＭＪ７
ＣＣ３’Ｔ４ ： ５’ ＣＡＴＣＧＧＡＴＣＣＡ
ＣＣＴ ；３’１３ａｍＨ１制限サイトに隣接する
Ｎｃｏ Ｉ粘着末端を持った所望のＤＮＡフラグメント
を組み立てる為にオリゴヌクレオチドＴ３および−，［
”４を使用した。このオリゴヌクレオチドの合成は、完
全に保護されたデオキシリボヌクレオチド組み立てブロ
ックを使用し、改良ホスホトリエステル法によって常法
通りに行なった。実施例ＩＣと実質的に同様にして所望
の組み立てを行なった。
ＣＣ３’Ｔ４ ： ５’ ＣＡＴＣＧＧＡＴＣＣＡ
ＣＣＴ ；３’１３ａｍＨ１制限サイトに隣接する
Ｎｃｏ Ｉ粘着末端を持った所望のＤＮＡフラグメント
を組み立てる為にオリゴヌクレオチドＴ３および−，［
”４を使用した。このオリゴヌクレオチドの合成は、完
全に保護されたデオキシリボヌクレオチド組み立てブロ
ックを使用し、改良ホスホトリエステル法によって常法
通りに行なった。実施例ＩＣと実質的に同様にして所望
の組み立てを行なった。
実施例１２ プラスミドｐｏｗ１１およびＥ。
ｃｏｌｉＫ １２ ＪＡ２２１／ＰＯＷｌｌの組み立
て実施例ＩＣのＤＮＡフラグメントの代りに実施例１１
のＤＮＡフラグメントを使用するほかは実雄側１と実質
的に同様にして表記の組み立てを行なう。プラスミドＩ
）ＯＷｌｌの制限サイト地図は、既述したＢａ ｍ Ｈ
Ｉ サイトを除き、第１図のプラスミド１）ＯＷ １
０のものと同じである。
て実施例ＩＣのＤＮＡフラグメントの代りに実施例１１
のＤＮＡフラグメントを使用するほかは実雄側１と実質
的に同様にして表記の組み立てを行なう。プラスミドＩ
）ＯＷｌｌの制限サイト地図は、既述したＢａ ｍ Ｈ
Ｉ サイトを除き、第１図のプラスミド１）ＯＷ １
０のものと同じである。
実施例１３ プラスミドｐＯＷ５３１およびｐ ＯＷ
５３２ 、並びにＥ、ｃｏｌｉＫ１２ ＪＡ２２１／
ｌ） ＯＷ ５３１およびＥ、ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｊ
Ａ２２１／ｐＯＷ５３２の組み立て プラスミドｐＯＷＩＱの代りにプラスミド（ｙ ＯＷ
ｌ ｌを使用するほかは実施例２と実質的に同様にして
表記の組み立てを行なう。プラスミドｐ ＯＷ 、５３
１ およびｐＯＷ５３２のそれぞれの制限サイト地図は
、既述したｐＯＷｌｌフラグメントからのもう１つの１
３ａ＋ｎＨＩサイトを除き、第１図のプラスミドｐＯＷ
５２５ およびｐ ＯＷ ５２６のものと同じである。
５３２ 、並びにＥ、ｃｏｌｉＫ１２ ＪＡ２２１／
ｌ） ＯＷ ５３１およびＥ、ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｊ
Ａ２２１／ｐＯＷ５３２の組み立て プラスミドｐＯＷＩＱの代りにプラスミド（ｙ ＯＷ
ｌ ｌを使用するほかは実施例２と実質的に同様にして
表記の組み立てを行なう。プラスミドｐ ＯＷ 、５３
１ およびｐＯＷ５３２のそれぞれの制限サイト地図は
、既述したｐＯＷｌｌフラグメントからのもう１つの１
３ａ＋ｎＨＩサイトを除き、第１図のプラスミドｐＯＷ
５２５ およびｐ ＯＷ ５２６のものと同じである。
実施例１４ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ
Ｍｌ １１２／ ｐ ＯＷ ５３１およびＢａｃｉ
ｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｍ１１１２／ｐＯＷ５
３２の組み立て プラスミドＰＯＷ５２５ およびｐＯＷ５２６の代りに
プラスミドｐＯＷ５３１およびｐ ＯＷ ５３２を使用
するほかは実施例３と実質的に同様にして表記の組み立
てを行なう。
Ｍｌ １１２／ ｐ ＯＷ ５３１およびＢａｃｉ
ｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｍ１１１２／ｐＯＷ５
３２の組み立て プラスミドＰＯＷ５２５ およびｐＯＷ５２６の代りに
プラスミドｐＯＷ５３１およびｐ ＯＷ ５３２を使用
するほかは実施例３と実質的に同様にして表記の組み立
てを行なう。
実施例１５ プラスミドｐ ＯＷ ５３３ およびｐ
ＯＷ５３４、並びにＥ、 ｃｏｔ ｉ ＪＡ ２２１／
ＰＯＷ５３３およびＥ、ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＪＡ２２］
、／ＰＯＷ５３４、の組み立て プラスミドｐＯＷＩＱの代りにプラスミドｐＯＷ１１を
使用するほかは実施例４と実質的に同様にして表記の組
み立てを行なう。プラスミドｐＯＷ５３３およびｐＯＷ
５３４のそれぞれの制限サイト地図は、既述した１）Ｏ
Ｗｌｌ フラグメントからのもう１つのＢａｍＨＩサイ
トを除けば、第１図のプラスミドＰＯＷ５２７およびｐ
ＯＷ５２８のものと同じである。
ＯＷ５３４、並びにＥ、 ｃｏｔ ｉ ＪＡ ２２１／
ＰＯＷ５３３およびＥ、ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＪＡ２２］
、／ＰＯＷ５３４、の組み立て プラスミドｐＯＷＩＱの代りにプラスミドｐＯＷ１１を
使用するほかは実施例４と実質的に同様にして表記の組
み立てを行なう。プラスミドｐＯＷ５３３およびｐＯＷ
５３４のそれぞれの制限サイト地図は、既述した１）Ｏ
Ｗｌｌ フラグメントからのもう１つのＢａｍＨＩサイ
トを除けば、第１図のプラスミドＰＯＷ５２７およびｐ
ＯＷ５２８のものと同じである。
実施例１６ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ
Ｍｌ ｉ１２／ｐＯＷ５３３およびＢａｃｉｌｌｕ
ｓ ５ｕｂｔｉｓ Ｍ１１１２／ＰＯＷ５３４の組み
立て プラスミドｐ、ＯＷ ５２７およびＰＯＷ５２８の代り
にプラスミドｐＯＷ５３３およびｐｏｗ５３４を使用す
るほかは実施例５と実質的に同様にして表記の組み立て
を行なう。
Ｍｌ ｉ１２／ｐＯＷ５３３およびＢａｃｉｌｌｕ
ｓ ５ｕｂｔｉｓ Ｍ１１１２／ＰＯＷ５３４の組み
立て プラスミドｐ、ＯＷ ５２７およびＰＯＷ５２８の代り
にプラスミドｐＯＷ５３３およびｐｏｗ５３４を使用す
るほかは実施例５と実質的に同様にして表記の組み立て
を行なう。
実施例１７ プラスミドｐＯＷ３１０およびＥ。
ｃｏｌ ｉ Ｋ １２ ＢＥ ９０４／ＰＯＷ ３１０
の組み立てプラスミドｐｏＷｉｏの代りにプラスミドｐ
ＯＷ１１を使用するほかは実施例６と実質的に同様にし
て表記の組み立てを行なう。プラスミドｐＯＷ３１０の
制限→ノーイト地図は、既述したｐ ＯＷ ｌ ｌフラ
グメントからのもう１つのＢ ａ ｍ Ｉ−Ｉ Ｉサイ
トを除けば、第２図のプラスミドＰＯＷ３０３ のもの
と同じである。
の組み立てプラスミドｐｏＷｉｏの代りにプラスミドｐ
ＯＷ１１を使用するほかは実施例６と実質的に同様にし
て表記の組み立てを行なう。プラスミドｐＯＷ３１０の
制限→ノーイト地図は、既述したｐ ＯＷ ｌ ｌフラ
グメントからのもう１つのＢ ａ ｍ Ｉ−Ｉ Ｉサイ
トを除けば、第２図のプラスミドＰＯＷ３０３ のもの
と同じである。
実施例１８ プラスミドｐ ＯＷ ５３５ および１）
ＯＷ ５３６およびＥ、ｃｏｌｉＫ１２ ＢＥ９０！
１／ Ｐ ＯＷ ５３５ およびＩ執ｃｏｌｉ Ｋ１２
Ｂｌ’、 ９０４／ｐＯＷ５３６ の組み立て プラスミドｐＯＷ３０３の代りにプラスミド１） ＯＷ
３１０を使用するほかは実施例７と実質的に同様にし
て表記の組み立てを行なう。プラスミドｌ） ＯＷ ５
３５およびｐＯＷ５３６のそれぞれの制限サイト地図は
、既述したｐＯＷ３１０フラグメントからのもう１つの
ＢａｍＨＩサイトを除いて第２図のプラスミドＰＯＷ５
２３およびｐＯＷ５２４のものと同じである。
ＯＷ ５３６およびＥ、ｃｏｌｉＫ１２ ＢＥ９０！
１／ Ｐ ＯＷ ５３５ およびＩ執ｃｏｌｉ Ｋ１２
Ｂｌ’、 ９０４／ｐＯＷ５３６ の組み立て プラスミドｐＯＷ３０３の代りにプラスミド１） ＯＷ
３１０を使用するほかは実施例７と実質的に同様にし
て表記の組み立てを行なう。プラスミドｌ） ＯＷ ５
３５およびｐＯＷ５３６のそれぞれの制限サイト地図は
、既述したｐＯＷ３１０フラグメントからのもう１つの
ＢａｍＨＩサイトを除いて第２図のプラスミドＰＯＷ５
２３およびｐＯＷ５２４のものと同じである。
実施例１ ｇ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉ
ｓ Ｍｌ １１２／ ｐ ＯＷ ５３５ およびＢａｃ
ｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓＭＩ ’１１２／ｐＯ
Ｗ５３６の組み立てプラスミドＰＯＷ５２３ およびｐ
ＯＷ５２４の代りにプラスミドＰＯＷ５３５およびｐＯ
Ｗ５３６を使用するほかは実施例８と実質的に同様にし
て表記の組み立てを行なう。
ｓ Ｍｌ １１２／ ｐ ＯＷ ５３５ およびＢａｃ
ｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓＭＩ ’１１２／ｐＯ
Ｗ５３６の組み立てプラスミドＰＯＷ５２３ およびｐ
ＯＷ５２４の代りにプラスミドＰＯＷ５３５およびｐＯ
Ｗ５３６を使用するほかは実施例８と実質的に同様にし
て表記の組み立てを行なう。
実施例２０ プラスミドｐＯＷ５３７およびｌ）Ｏ’Ａ
’５３８並びにＥ、ｃｏｌｉ Ｋ１２１３＋！： ９０
４／ Ｉ）０〜へ′５３７およびＥ、ｃｏｌｉ Ｋ １
２ ＢＥ ｇ０４／ｌ）ｏｗ５３８の組み立て プラスミドＰＯＷ、３．ｏ３の代りにプラスミドｐＯＷ
３１０を使用するほかは実施例９と実質的に同様にして
表記の組み立てを行なう。プラスミドＰＯＷ５３７ お
よびＰＯＷ５３８ のそれぞれの制限サイト地図は、既
述した。ＯＷ ３１０ フラグメントからのもう１つの
Ｂａｍ１−１１サイトを除けば、第２図に示したｐＯＷ
５２９ およびｐＯＷ５３０のものと同じである。
’５３８並びにＥ、ｃｏｌｉ Ｋ１２１３＋！： ９０
４／ Ｉ）０〜へ′５３７およびＥ、ｃｏｌｉ Ｋ １
２ ＢＥ ｇ０４／ｌ）ｏｗ５３８の組み立て プラスミドＰＯＷ、３．ｏ３の代りにプラスミドｐＯＷ
３１０を使用するほかは実施例９と実質的に同様にして
表記の組み立てを行なう。プラスミドＰＯＷ５３７ お
よびＰＯＷ５３８ のそれぞれの制限サイト地図は、既
述した。ＯＷ ３１０ フラグメントからのもう１つの
Ｂａｍ１−１１サイトを除けば、第２図に示したｐＯＷ
５２９ およびｐＯＷ５３０のものと同じである。
実施例２１ １３ａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ
Ｍｌ １１２／１）ＯＷ５３７ およびＢａｃｉｌｌ
ｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓＭｌ １１２／ｐＯＷ５３８
の組み立てプラスミドＰＯＷ５２９およびｐＯＷ５３０
の代り番こｐＯＷ５３７ およびｐＯＷ５３Ｂ
を使用するほかは実施例１０と実質的に同様にして表記
の組み立てを行なう。
Ｍｌ １１２／１）ＯＷ５３７ およびＢａｃｉｌｌ
ｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓＭｌ １１２／ｐＯＷ５３８
の組み立てプラスミドＰＯＷ５２９およびｐＯＷ５３０
の代り番こｐＯＷ５３７ およびｐＯＷ５３Ｂ
を使用するほかは実施例１０と実質的に同様にして表記
の組み立てを行なう。
第１図はプラスミドｐＯＷ５２５、ｐＯＷ５２６、））
ＯＷ５２７ およびｐＯＷ５２８の制限サイト地図、′
Ｓ２図はプラスミドｐＯＷ５２３、ｐＯＷ５２４、ＰＯ
Ｗ５２９ およびＰ ＯＷ ５３０の制限サイト地図、
第３図はフラグメントＴ１の合成方法を示す工程図、第
４図はプラスミドｐ Ｅ Ｌ ｌ ０７およびｌ） Ｅ
Ｌ Ｉ Ｑ ５ の制限サイト地図、第５図はプラスミ
ドｐＨ５］およびｐＢＳ ３の制限サイト地図である。 特許出願人 イーライ・リリー・アンド・カンパニー−
−赫 二 −一一瓜、し 二二 １肛 層、１
久図面の浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、 １ ４、ｐＯＷ ５２８ （〜１２．８ ｋｂ）ＦＩＧ、
２ ４、 ｐＯＷ ５３０〜１８．６ ｋｂｐＥＬ１０７ ｐＥＬ１０５ Ｂ８１ Ｂｓ３ 第１０の続き ＣＩ２ Ｒ１／１９ ） ■発 明 者 ジエームズ・ロバート・ミラーアメリカ
合衆国インディアナ４６ ２５０インデイアナポリス・スラ ング アメリカ合衆国インディアナ４６ ２６０インデイアナポリス・ウニ スト・エイティーエイトウス・ ストリート１０８番 手続補正書（、ッ） 昭和５那 ５月１６日 憤 特許片長 官 殿 １、事件の表示 昭和５９年特許願第 ５５１０ 万２発明の名
称 組換えＤＮＡ発現ベクター ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 ４代理人 住所 大阪府大阪市東区本町２−１０ 本町ビル内従出
致します。
ＯＷ５２７ およびｐＯＷ５２８の制限サイト地図、′
Ｓ２図はプラスミドｐＯＷ５２３、ｐＯＷ５２４、ＰＯ
Ｗ５２９ およびＰ ＯＷ ５３０の制限サイト地図、
第３図はフラグメントＴ１の合成方法を示す工程図、第
４図はプラスミドｐ Ｅ Ｌ ｌ ０７およびｌ） Ｅ
Ｌ Ｉ Ｑ ５ の制限サイト地図、第５図はプラスミ
ドｐＨ５］およびｐＢＳ ３の制限サイト地図である。 特許出願人 イーライ・リリー・アンド・カンパニー−
−赫 二 −一一瓜、し 二二 １肛 層、１
久図面の浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、 １ ４、ｐＯＷ ５２８ （〜１２．８ ｋｂ）ＦＩＧ、
２ ４、 ｐＯＷ ５３０〜１８．６ ｋｂｐＥＬ１０７ ｐＥＬ１０５ Ｂ８１ Ｂｓ３ 第１０の続き ＣＩ２ Ｒ１／１９ ） ■発 明 者 ジエームズ・ロバート・ミラーアメリカ
合衆国インディアナ４６ ２５０インデイアナポリス・スラ ング アメリカ合衆国インディアナ４６ ２６０インデイアナポリス・ウニ スト・エイティーエイトウス・ ストリート１０８番 手続補正書（、ッ） 昭和５那 ５月１６日 憤 特許片長 官 殿 １、事件の表示 昭和５９年特許願第 ５５１０ 万２発明の名
称 組換えＤＮＡ発現ベクター ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 ４代理人 住所 大阪府大阪市東区本町２−１０ 本町ビル内従出
致します。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 ■１式： （式中、ＡはデオキシアデニルベＧはデオキシグアニル
、Ｃはデオキシシトシル、］゛はチミジル、Ｉ（はＧま
たはＣ１’Ｒ１はＧまたはＣを表わす。たたし、ｋとに
１が同時に同一のデオキシリボヌクレオチドを表わすこ
とはない。） で示されるリポソーム結合サイト含有１） Ｎ Ａ配列
。 ２、ａ）式： （式中、Ａはデオキシアデニル、Ｇはデオキシグアニル
、Ｃはデオキシシトシル、■はチミジル、ｋはＧまたは
Ｃ，Ｒ１はＧまたはＣを表わす。ただし、ｋとＲ１が同
時に同一のデオキシリボヌクレオチドを表わすことはな
い。） で示されるリポソーム結合サイト含有ＤＮＡ配列、１）
） Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓのｖｅｇ
プロモーター、および Ｃ）機能的ポリペプチドを暗号化している遺伝子を含有
している組換えＤＮＡ発現ベクター（たたし、該ベクタ
ーは選択可能であり、該プロモーターおよび該１） Ｎ
Ａ配列は、該ベクターによって形質転換された宿主細
胞中で該遺伝子の転写および発現を指令することを条件
とする）。 ３、プラスミドである第２項に記載のベクター。 ４、該遺伝子によって暗号化されている機能的ポリペプ
チドがヒトプレプロインシュリン、ヒトプロインシュリ
ン、ヒトインシュリンＡ鎖、ヒトインシュリンＢ鎖、非
ヒトインシュリン、ヒト成長ホルモン、非ヒト成長ホル
モン、ウシ成長ホルモン、ブタ成長ホルモン、ヒトイン
ターフェロン、非ヒトインターフェロン、ウィルス抗原
、ウロキナーゼ、ペプチドホルモン類または酵素類であ
る第２項または第３項に記載のベクター。 ５、ＲがＧであり、Ｒ１がＣである第２項〜第４項のい
ずれかに記載のベクター。 ６、プラスミドｐＯＷＩＱ、ｐＯＷ３０３、ｐＯＷ５２
３、ｐＯＷ５２４、ｐＯＷ５２５、ＰＯＷ５２６、ｐＯ
Ｗ５２７、ｐＯＷ５２８．ｐＯＷ５２９またはＰＯＷ５
３ｏ である第５項に記載のベクター。 ７、フ５ スミＦ ｐＯＷ５２３、ｐＯＷ５２４、ＰＯ
Ｗ５２５、ｐＯＷ５２６、ＰＯＷ５２７、ｐＯＷ５２８
、ＰＯＷ５２ｇまたはｐＯＷ５３０である第６項に記載
のベクター。 ８、プラスミドｐＯＷ５２７、ｐＯＷ５２８、ｐＯＷ５
２９ またはｐＯＷ５３０である第７項に記載のベクタ
ー。 ９、 ＲがＣであり、ＲがＧである第２項〜第４項のい
ずれかに記載のベクター。 １０、プラスミドｐＯＷｌｌ、ｐＯＷ５３１、ｐＯＷ５
３２、ｐＯＷ５３３、ｐＯＷ５３４、ＰＯＷ３１０、ｐ
ＯＷ５３５、ＰＯＷ５３６、ｐＯＷ５３７またはｐＯＷ
５３８ である第９項に記載のベクター。 １１、プラスミドｐＯＷ５３１、ｐＯＷ５３２、ｐ （
）Ｗ ５３３、ｐＯＷ５３４、ｐ ＯＷ ５３５、ｐＯ
Ｗ５３６、ｐＯＷ５３７またはｐＯＷ５３８である第１
０項記載のベクター。 １２、プラスミドｐＯＷ５３３、ｐＯＷ５３４、ｐＯＷ
５３７またはｐＯＷ５３８である第１１項記載のベクタ
ー。 １３、第２項〜第１２項のいずれかに記載のベクターを
含有している形質転換宿主細胞。 １４、第７項または第１１項のベクターを含有している
Ｂａｃｉｌｌｕｓ、好ましくは５ｕｂｔｉｌｉｓ 種で
ある第１３項に記載の宿主細胞。 １５、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｍｌ
ｌ１２ である第１４項に記載の宿主細胞。 １６、第８項または第１２項に記載のベクターを含有し
ているＳｃｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ である第１３項に記
載の宿主細胞。 １７、 Ｅ、ｃｏｌｉである第１３項に記載の宿主細胞
。 １８、第６項に記載のベクターを含有しているＥ。 ｃｏｌｉ Ｋ１２ＪＡ２２１である第１７項に記載の宿
主細胞。 １９、第１０項に記載のベクターを含有している１乙、
ｃｏｌｉ Ｋ １２ ＢＥ ９０４である第１７項に記
載の宿主細胞。 ２０、２）式： （式中、Ａはデオキシアデニル、Ｇはデオキシグアニル
、Ｃはデオキシシトシル、■はチミジル、ｋはＧまたは
Ｃ，Ｒ１はＧまたはＣを表わす。ただし、ｋとに１が同
時に同一のデオキシリボヌクレオチドを表わすことはな
い。） で示されるリポソーム結合サイト含有ＤＮＡ配列、ｂ）
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓのｖｅｇプロ
モーター、および Ｃ）機能的ポリペプチドを暗号化している遺伝子を結合
させることからなる組換えＤＮＡ発現ベクターの調製法
（ただし、該ベクターは選択可能であり、該プロモータ
ーおよび該ＤＮＡ配列は、該ベクターによって形質転換
された宿主細胞中で該遺伝子の転写および発現を指令す
ることを条件とする）。 ２１、第７項または第１１項に記載の組換え発現ベクタ
ーでＢａｃｉｌｌｕｓ宿主細胞を形質転換し、その形質
転換されたＢａｃｉｌｌｕｓ宿主細胞を増殖条件下に培
養することからなる、機能的ポリペプチドを培地中に分
泌するＢａｃｉｌｌｕｓ中で該ポリペプチドを生産する
方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US45879283A | 1983-01-18 | 1983-01-18 | |
| US458792 | 1983-01-18 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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