JPS6174594A - イネ萎縮ウイルスに対するモノクロ−ナル抗体の製造方法 - Google Patents
イネ萎縮ウイルスに対するモノクロ−ナル抗体の製造方法Info
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- JPS6174594A JPS6174594A JP19885284A JP19885284A JPS6174594A JP S6174594 A JPS6174594 A JP S6174594A JP 19885284 A JP19885284 A JP 19885284A JP 19885284 A JP19885284 A JP 19885284A JP S6174594 A JPS6174594 A JP S6174594A
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明はイネ萎縮ウィルスに対して特異性を示すモノク
ローナル抗体の製造方法に関し、詳しくはイネ萎縮ウィ
ルスで免疫した動物からの抗体産生細胞と骨髄腫細胞と
の間に形成された融合細胞ハイブリッドのクローンを培
養することによるイネ、5Mウィルスに対するモノクロ
ーナル抗体の製遣方法に関する。
ローナル抗体の製造方法に関し、詳しくはイネ萎縮ウィ
ルスで免疫した動物からの抗体産生細胞と骨髄腫細胞と
の間に形成された融合細胞ハイブリッドのクローンを培
養することによるイネ、5Mウィルスに対するモノクロ
ーナル抗体の製遣方法に関する。
本発明の方法により製造されるモノクローナル抗体は、
イネの植物体にイネ萎縮ウィルスが存在しているかどう
かを診断するためにイネの体液をスクリーニングする際
に用いる診断補助物として有用であり、またイネ萎縮ウ
ィルス又はウィルスを構成する蛋白質の捕捉剤としてウ
ィルス分析上重要である。
イネの植物体にイネ萎縮ウィルスが存在しているかどう
かを診断するためにイネの体液をスクリーニングする際
に用いる診断補助物として有用であり、またイネ萎縮ウ
ィルス又はウィルスを構成する蛋白質の捕捉剤としてウ
ィルス分析上重要である。
し従来の技術〕
従来、タバコモザイクウィルスに対するモノクローナル
抗体及びキュウリ緑斑モザイクウィルスに対するモノク
ローナル抗体が各々の該ウィルスで免疫したマウスから
の抗体産生細胞と骨髄腫細胞との間に形成された融合細
胞ハイブリッドのクローンを培養することにより得られ
たと報告されている( pietzgan et aL
Achives of Virology74゜19
7(1982ン ; Br1and et a
l+ J、VirologicalMethods
5+ 295 (1982) 妄Moadallal
et al。
抗体及びキュウリ緑斑モザイクウィルスに対するモノク
ローナル抗体が各々の該ウィルスで免疫したマウスから
の抗体産生細胞と骨髄腫細胞との間に形成された融合細
胞ハイブリッドのクローンを培養することにより得られ
たと報告されている( pietzgan et aL
Achives of Virology74゜19
7(1982ン ; Br1and et a
l+ J、VirologicalMethods
5+ 295 (1982) 妄Moadallal
et al。
EMBOJournal L 1005 (1982)
i 及び井上正保ら、昭和58年度日本植物病理学会
大会講演要旨予稿集、1−55参照〕。
i 及び井上正保ら、昭和58年度日本植物病理学会
大会講演要旨予稿集、1−55参照〕。
植物ウィルスに対するモノクローナル抗体としては上述
のとおりタバコモザイクウィルスに対するモノクローナ
ル抗体及びキュウリ緑斑モザイクウィルスに対するモノ
クローナル抗体が知られているにすぎない。この反面、
植物に害を及ぼす植物ウィルスは種々知られており、こ
れら植物ウィルスによって植物が甚大な被害を受けてい
るのが実情である。植物ウィルスに感−染していないイ
ネ、野菜などの幼苗を選んで育成栽培することは、その
作物の生産性を上げかつ良品質の作物を得るうえで必要
である。従って、植物のウィルス感染の有無を早期に知
るためにその診断補助物として種々の植物ウィルスに対
するモノクローナル抗体があることは望ましいことであ
る。
のとおりタバコモザイクウィルスに対するモノクローナ
ル抗体及びキュウリ緑斑モザイクウィルスに対するモノ
クローナル抗体が知られているにすぎない。この反面、
植物に害を及ぼす植物ウィルスは種々知られており、こ
れら植物ウィルスによって植物が甚大な被害を受けてい
るのが実情である。植物ウィルスに感−染していないイ
ネ、野菜などの幼苗を選んで育成栽培することは、その
作物の生産性を上げかつ良品質の作物を得るうえで必要
である。従って、植物のウィルス感染の有無を早期に知
るためにその診断補助物として種々の植物ウィルスに対
するモノクローナル抗体があることは望ましいことであ
る。
しかして、本発明の目的は、植物ウィルスに対するモノ
クローナル抗体の種類を広げることにあシ、従来報告さ
れていない該モノクローナル抗体の製造方法を提供する
ことにある。
クローナル抗体の種類を広げることにあシ、従来報告さ
れていない該モノクローナル抗体の製造方法を提供する
ことにある。
本発明によれば、上記の目的は、動物をイネ萎縮ウィル
スで免疫し、該動物からの抗体産生細胞と骨髄腫細胞と
の間に融合細胞ハイブリッドを形成させ、該ハイブリッ
ドをクローン化し、ついでイネ萎縮ウィルスに対し特異
性を示す抗体を産生ずるクローンを選択し、培養するこ
とを特徴とするイネ萎縮ウィルスに対するモノクローナ
ル抗体の製造方法を提供することによって達成される。
スで免疫し、該動物からの抗体産生細胞と骨髄腫細胞と
の間に融合細胞ハイブリッドを形成させ、該ハイブリッ
ドをクローン化し、ついでイネ萎縮ウィルスに対し特異
性を示す抗体を産生ずるクローンを選択し、培養するこ
とを特徴とするイネ萎縮ウィルスに対するモノクローナ
ル抗体の製造方法を提供することによって達成される。
本発明において融合細胞ハイブリッドは、イネ萎縮ウィ
ルスで免疫された動物から得られた該イネ萎縮ウィルス
に対する抗体を産生ずる細胞(以下、これを抗体産生細
胞と称することがある)と骨髄腫細胞とを融合させるこ
とによって形成される。使用される抗体産生細胞として
はイネ萎縮ウィルスで免疫された動物からの膵臓細胞又
はリンパ節細胞が好ましい。抗体産生細胞及び骨髄腫細
胞はこれらが融合可能な限りにおいて供給源である動物
の8属は限定されない。例えばマウス対ラット、ラット
対人間、マウス対人間などの組合わせにおいて抗体産生
細胞と骨髄腫細胞とが融合可能であるが、両者の供給源
として同じ種属の動物を使用するのが好ましい。本発明
の実施のだめの1つの好ましい融合細胞ハイブリッドは
、イネ萎縮ウィルスで免疫したマウスの膵臓細胞とマウ
スの骨髄腫細胞とを融合させて得られるものであり、例
えば予めイネ萎縮ウィルスで免疫したBALB/cマウ
スの゛抗イネ萎縮つィルス抗体産生脾臓細胞とBALB
/cマウスの骨髄腫細胞との融合細胞ハイブリッドであ
る。骨髄腫細胞としてはケーラー(K6hler )ら
によりネイチャー(Nature ) 、 256巻、
495−497頁(1975)に報告されているMOP
C−21系列のものが好ましく、そのなかでも特にP3
−X6!+Ag8 u−1が好ましい。
ルスで免疫された動物から得られた該イネ萎縮ウィルス
に対する抗体を産生ずる細胞(以下、これを抗体産生細
胞と称することがある)と骨髄腫細胞とを融合させるこ
とによって形成される。使用される抗体産生細胞として
はイネ萎縮ウィルスで免疫された動物からの膵臓細胞又
はリンパ節細胞が好ましい。抗体産生細胞及び骨髄腫細
胞はこれらが融合可能な限りにおいて供給源である動物
の8属は限定されない。例えばマウス対ラット、ラット
対人間、マウス対人間などの組合わせにおいて抗体産生
細胞と骨髄腫細胞とが融合可能であるが、両者の供給源
として同じ種属の動物を使用するのが好ましい。本発明
の実施のだめの1つの好ましい融合細胞ハイブリッドは
、イネ萎縮ウィルスで免疫したマウスの膵臓細胞とマウ
スの骨髄腫細胞とを融合させて得られるものであり、例
えば予めイネ萎縮ウィルスで免疫したBALB/cマウ
スの゛抗イネ萎縮つィルス抗体産生脾臓細胞とBALB
/cマウスの骨髄腫細胞との融合細胞ハイブリッドであ
る。骨髄腫細胞としてはケーラー(K6hler )ら
によりネイチャー(Nature ) 、 256巻、
495−497頁(1975)に報告されているMOP
C−21系列のものが好ましく、そのなかでも特にP3
−X6!+Ag8 u−1が好ましい。
細胞融合後、融合細胞ハイブリッドをクローン化し、個
々のクローンを培養し、そのクローン群からイネ萎縮ウ
ィルスに対し特異性を示す抗体を産生ずるクローンを選
別する。生育する全てのクローンがイネ萎縮ウィルスに
対する抗体を産生ずるのではない。例えば、後述の実施
例では生育するクローンのうちその10%よりも少ない
クローンがイネ萎縮ウィルスに対し特異性を示す抗体を
産生じた。また、イネ萎縮ウィルスに対する抗体を産生
ずるクローンは必ずしも同一の抗原決定基を認識する抗
体を産生ずるとは限らない。ある1つのクローンはイネ
萎縮ウィルスを構成する複数の蛋白質のうちの特定の1
つの蛋白質と反応する抗体を産生ずるが、他の1つのク
ローンはその数鍾の蛋白質と反応する抗体を産生じ、さ
らに他の1つのクローンはそれらの蛋白質とは別の蛋白
質と反応する抗体を産生ずる。同様にして抗体産生クロ
ーンを選別し、培養することによりイネ萎縮ウィルスに
対し程度の異なる選択性を有する抗体を種々産生ずるこ
とができる。かかるクローンによって産生される抗体は
一般にモノクローナル抗体と称される。
々のクローンを培養し、そのクローン群からイネ萎縮ウ
ィルスに対し特異性を示す抗体を産生ずるクローンを選
別する。生育する全てのクローンがイネ萎縮ウィルスに
対する抗体を産生ずるのではない。例えば、後述の実施
例では生育するクローンのうちその10%よりも少ない
クローンがイネ萎縮ウィルスに対し特異性を示す抗体を
産生じた。また、イネ萎縮ウィルスに対する抗体を産生
ずるクローンは必ずしも同一の抗原決定基を認識する抗
体を産生ずるとは限らない。ある1つのクローンはイネ
萎縮ウィルスを構成する複数の蛋白質のうちの特定の1
つの蛋白質と反応する抗体を産生ずるが、他の1つのク
ローンはその数鍾の蛋白質と反応する抗体を産生じ、さ
らに他の1つのクローンはそれらの蛋白質とは別の蛋白
質と反応する抗体を産生ずる。同様にして抗体産生クロ
ーンを選別し、培養することによりイネ萎縮ウィルスに
対し程度の異なる選択性を有する抗体を種々産生ずるこ
とができる。かかるクローンによって産生される抗体は
一般にモノクローナル抗体と称される。
イネ萎縮ウィルスに対するモノクローナル抗体の製造は
、上記の抗体産生クローンをインビトロ(in vit
ro )で培地中において、又はインビボ(in vi
vo )で組織適合性動物若しくは胸腺摘出ヌードマウ
スの体内において維持、生育させる(とにより行なわれ
る。産生されたモノクローナル抗体は培地から又は動物
の血清若しくは腹水から、この技術分野において知られ
た手段により回収される〔例えば、プロシーデイングズ
・オブ・ザ・す7ヨナル・アカデミ−・オブ・サイエン
ス・ニーニスエイ(Proc、 Natl、 Acad
、 Sci、USA ) 、 75巻、1510−1
540頁(197B)参照〕。
、上記の抗体産生クローンをインビトロ(in vit
ro )で培地中において、又はインビボ(in vi
vo )で組織適合性動物若しくは胸腺摘出ヌードマウ
スの体内において維持、生育させる(とにより行なわれ
る。産生されたモノクローナル抗体は培地から又は動物
の血清若しくは腹水から、この技術分野において知られ
た手段により回収される〔例えば、プロシーデイングズ
・オブ・ザ・す7ヨナル・アカデミ−・オブ・サイエン
ス・ニーニスエイ(Proc、 Natl、 Acad
、 Sci、USA ) 、 75巻、1510−1
540頁(197B)参照〕。
以下に、細胞融合ハイブリッドを形成させるための1つ
の典型的な方法を示す。各々の工程に示される操作は公
知方法に従って行なわれる。この方法はBALB/eマ
ウスの骨髄腫細胞とイネ萎縮ウィルスで免疫されたBA
LB/cマウスの膵臓細胞とを融合することを示してい
るが、他の動物由来の骨髄腫細胞及び抗体産生細胞を用
いて行なうこともできる。
の典型的な方法を示す。各々の工程に示される操作は公
知方法に従って行なわれる。この方法はBALB/eマ
ウスの骨髄腫細胞とイネ萎縮ウィルスで免疫されたBA
LB/cマウスの膵臓細胞とを融合することを示してい
るが、他の動物由来の骨髄腫細胞及び抗体産生細胞を用
いて行なうこともできる。
(リ 融合のための膵臓細胞の調製
イネ萎縮ウィルス液をフロイント(Freund )の
完全アジユバノドで乳化し、この乳化液をBALB/C
マウスの腹腔内に注射し、その1週間後にさらに該マウ
スの尾静脈に追加注射する。追加注射後4日目にマウス
を殺し、膵臓を摘出する。膵臓細胞懸濁液をゲルノ・ル
ト(Gerhard )らによりユアラビアン・ジャー
ナル・オプ・イムノロシイ(Eur、 J、 Immu
n、 ) 、 5巻、720−725頁(1975)に
報告されている方法で調製する。混在する赤血球細胞を
塩化アンモニウムの0.82%水溶液中で4゛°Cで1
5分間処理することにより融解する。上記の膵臓細胞懸
濁液を牛脂児血清を含む培地、例えばダルベコ−変法イ
ーグル培地中での遠心分離(800Xq)及び/又は無
血清培地中での遠心分離(800xy)によシ洗滌し、
最終的に無血清培地中に懸濁させる。
完全アジユバノドで乳化し、この乳化液をBALB/C
マウスの腹腔内に注射し、その1週間後にさらに該マウ
スの尾静脈に追加注射する。追加注射後4日目にマウス
を殺し、膵臓を摘出する。膵臓細胞懸濁液をゲルノ・ル
ト(Gerhard )らによりユアラビアン・ジャー
ナル・オプ・イムノロシイ(Eur、 J、 Immu
n、 ) 、 5巻、720−725頁(1975)に
報告されている方法で調製する。混在する赤血球細胞を
塩化アンモニウムの0.82%水溶液中で4゛°Cで1
5分間処理することにより融解する。上記の膵臓細胞懸
濁液を牛脂児血清を含む培地、例えばダルベコ−変法イ
ーグル培地中での遠心分離(800Xq)及び/又は無
血清培地中での遠心分離(800xy)によシ洗滌し、
最終的に無血清培地中に懸濁させる。
(2)融合のだめの骨髄腫細胞の調製
ケーラーらによシネイチャー、256巻、495−49
7頁(1975)に報告されているMOPC−21系列
に由来しそしてヒボキサンチンホスホリボシルトランス
フェラーゼ(HGPRT E、C,2,4,2,8)が
欠損したBALB/cマウスの骨髄腫細胞p3−X65
Ag8u−1を、8−アザグアニノを0.01%及び牛
脂児血清を10%含むダルベコ−変法イーグル培地中に
維持する。P3−X63Ay8 u−1のギ育は選択培
地、例えばヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン
(HAT)培地によシ阻害される。
7頁(1975)に報告されているMOPC−21系列
に由来しそしてヒボキサンチンホスホリボシルトランス
フェラーゼ(HGPRT E、C,2,4,2,8)が
欠損したBALB/cマウスの骨髄腫細胞p3−X65
Ag8u−1を、8−アザグアニノを0.01%及び牛
脂児血清を10%含むダルベコ−変法イーグル培地中に
維持する。P3−X63Ay8 u−1のギ育は選択培
地、例えばヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン
(HAT)培地によシ阻害される。
(3)融合細胞ハイブリッドの作製
膵臓細胞及び骨髄腫細胞を、コブロフスキ−(Kopr
owski )らがグロシーデイング・オプ・ザ・ナシ
ョナル・アカデミ−・オプ・サイエンス・ニーニスエイ
、74巻、2985−2988頁(1977)に報告し
ているように、ポリエチレングリコール(PEG)10
00の存在において融合させる。融合後、細胞をリトル
フィールド(Littleffeld )がサイエンス
(5cience ) 、 145巻、709−710
頁(1964)に報告しているHAT培地中に懸濁させ
、ついで組織培養プンート例えば96穴マイクロタイタ
ープレートの個々の穴に配分し、培養する。
owski )らがグロシーデイング・オプ・ザ・ナシ
ョナル・アカデミ−・オプ・サイエンス・ニーニスエイ
、74巻、2985−2988頁(1977)に報告し
ているように、ポリエチレングリコール(PEG)10
00の存在において融合させる。融合後、細胞をリトル
フィールド(Littleffeld )がサイエンス
(5cience ) 、 145巻、709−710
頁(1964)に報告しているHAT培地中に懸濁させ
、ついで組織培養プンート例えば96穴マイクロタイタ
ープレートの個々の穴に配分し、培養する。
(4) 抗体の検出
抗体の検出にはグエスドン(Guesdon ) ラが
ジャーナル・オプ・ヒストケミストリイ・アンド・サイ
トケミストリイ(J、 Histochem、 Cyt
ochem、 )−、27巻、1131−1139頁(
1979,)に報告している酵素抗体法が優れており、
この酵素抗体法が本発明におけるイネ萎縮ウィルスに対
するモノクローナル抗体の検出に適用される。組織培養
プレート例えば96穴マイクロタイタープレートの穴壁
に固定化したイネ萎縮ウィルス蛋白質抗原に融合細胞ハ
イブリッド培養液又は融合細胞ハイブリッドを接種した
マウスの腹水を加える。ついで、ビオチン化抗マウスイ
ムノグロブリン抗体を加え、さらに西洋ワサビ起源のペ
ルオキシダーゼと結合したアビジンを加えたのち、その
ペルオキシダーゼ活性を2,2′−アジノージ(5−エ
チルベンゾチアゾリンスルホン酸−6)のアンモニウム
塩(ABTS )の発色で検定する。このABTSの発
色は抗体の存在を指示する。融合細胞ハイブリッド培養
液又は融合細胞ハイブリッドを接種したマウスの腹水の
抗イネ萎縮ウィルス抗体力価はABT Sの50多発色
を与える該培養液又は腹水の最終稀釈倍数で示される。
ジャーナル・オプ・ヒストケミストリイ・アンド・サイ
トケミストリイ(J、 Histochem、 Cyt
ochem、 )−、27巻、1131−1139頁(
1979,)に報告している酵素抗体法が優れており、
この酵素抗体法が本発明におけるイネ萎縮ウィルスに対
するモノクローナル抗体の検出に適用される。組織培養
プレート例えば96穴マイクロタイタープレートの穴壁
に固定化したイネ萎縮ウィルス蛋白質抗原に融合細胞ハ
イブリッド培養液又は融合細胞ハイブリッドを接種した
マウスの腹水を加える。ついで、ビオチン化抗マウスイ
ムノグロブリン抗体を加え、さらに西洋ワサビ起源のペ
ルオキシダーゼと結合したアビジンを加えたのち、その
ペルオキシダーゼ活性を2,2′−アジノージ(5−エ
チルベンゾチアゾリンスルホン酸−6)のアンモニウム
塩(ABTS )の発色で検定する。このABTSの発
色は抗体の存在を指示する。融合細胞ハイブリッド培養
液又は融合細胞ハイブリッドを接種したマウスの腹水の
抗イネ萎縮ウィルス抗体力価はABT Sの50多発色
を与える該培養液又は腹水の最終稀釈倍数で示される。
BALB/C?ウスの骨髄腫細胞p3−X63 Ag
8u−1の培養液は抗イネ萎縮ウィルス抗原活性を全く
有していない。また、P5−X63Ag 8 u −1
を−担うBALB/cマウスの血清及び腹水もまた抗イ
ネ萎縮ウィルス抗原活性を有していない。
8u−1の培養液は抗イネ萎縮ウィルス抗原活性を全く
有していない。また、P5−X63Ag 8 u −1
を−担うBALB/cマウスの血清及び腹水もまた抗イ
ネ萎縮ウィルス抗原活性を有していない。
(実施例〕
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれ
らの実施例により限定されるものではない。
らの実施例により限定されるものではない。
実施例1
融合細胞ハイブリッドの作製及び腹水抗体の製漠エ
イネ萎縮ウィルス1Myを1 mlの0.15M塩化ナ
トリウムを含む10mM ’) 7酸緩衝液(以下、P
BSと略称する)に溶解し、この溶液にフロイントの完
全アジュパン) 1 mlを加えて乳化させたのち、得
られた乳化液をBALB/cマウスの腹腔内に注射した
。1週間後、さらに0.1mlのPBSに溶解した0、
5岬のイネ萎縮ウィルスをマウスの尾静脈に追加注射し
た。追加注射後4日目にマウスを殺し。
トリウムを含む10mM ’) 7酸緩衝液(以下、P
BSと略称する)に溶解し、この溶液にフロイントの完
全アジュパン) 1 mlを加えて乳化させたのち、得
られた乳化液をBALB/cマウスの腹腔内に注射した
。1週間後、さらに0.1mlのPBSに溶解した0、
5岬のイネ萎縮ウィルスをマウスの尾静脈に追加注射し
た。追加注射後4日目にマウスを殺し。
膵臓を摘出し、その膵臓細胞を牛脂児血清を15チ含む
ダルベコ−変法イーグル培地(日本水産株式会社製)に
懸濁させた。膵臓細胞浮遊液を塩化アンモニウムの0.
82%水溶液〔塩化アンモニウム4.129を含む水溶
液400 mtに0.17Mトリス緩衝液(pH7,6
5) 100献を加えて調製)で4°Cで15分間処理
したのち、無血清培地中で遠心分離(800Xg)によ
り2回洗滌し、ついで無血清培地中に懸濁させた。一方
、骨髄腫細胞p3−X63Ag8u−1を、8−アザグ
アニンを0601%及び牛脂児血清を15%含むダルベ
コ−変法イーグル培地中で増殖させたのち、無血清培地
中で遠心分離(800Xg)により2回洗滌し、ついで
無血清培地中に懸濁させた。懸濁状態の膵臓細胞10X
10′個と骨髄腫細胞1xio’個を混合したのち、遠
心分離(800×9)シて沈渣とし、これにポリエチレ
ングリコール1000を44.4%含む無血清培地を0
.5ml加え、1分間細胞を融合させた。得られた細胞
混合物を牛脂児血清を15q6含むダルベコ−変法イー
グル培地中での遠心分離(800XiF)により洗滌し
たのち、同培地中に1×105細胞/ゴとなるように浮
遊させ、その0.1mlを96穴プラスチツクマイクロ
タイタープレートに配り、5チ炭酸ガス雰囲気下のイン
キュベーター中で培養した。培養開始後1日目にHAT
培地を0.1g?加え、以後2日経過毎に培養液の半分
を吸引し、その代りにHAT培地を追加した。96穴プ
ラスチツクマイクロタイタープレートの1穴当り平均5
〜6個の融合細胞ハイブリッドの集塊が生育した。
ダルベコ−変法イーグル培地(日本水産株式会社製)に
懸濁させた。膵臓細胞浮遊液を塩化アンモニウムの0.
82%水溶液〔塩化アンモニウム4.129を含む水溶
液400 mtに0.17Mトリス緩衝液(pH7,6
5) 100献を加えて調製)で4°Cで15分間処理
したのち、無血清培地中で遠心分離(800Xg)によ
り2回洗滌し、ついで無血清培地中に懸濁させた。一方
、骨髄腫細胞p3−X63Ag8u−1を、8−アザグ
アニンを0601%及び牛脂児血清を15%含むダルベ
コ−変法イーグル培地中で増殖させたのち、無血清培地
中で遠心分離(800Xg)により2回洗滌し、ついで
無血清培地中に懸濁させた。懸濁状態の膵臓細胞10X
10′個と骨髄腫細胞1xio’個を混合したのち、遠
心分離(800×9)シて沈渣とし、これにポリエチレ
ングリコール1000を44.4%含む無血清培地を0
.5ml加え、1分間細胞を融合させた。得られた細胞
混合物を牛脂児血清を15q6含むダルベコ−変法イー
グル培地中での遠心分離(800XiF)により洗滌し
たのち、同培地中に1×105細胞/ゴとなるように浮
遊させ、その0.1mlを96穴プラスチツクマイクロ
タイタープレートに配り、5チ炭酸ガス雰囲気下のイン
キュベーター中で培養した。培養開始後1日目にHAT
培地を0.1g?加え、以後2日経過毎に培養液の半分
を吸引し、その代りにHAT培地を追加した。96穴プ
ラスチツクマイクロタイタープレートの1穴当り平均5
〜6個の融合細胞ハイブリッドの集塊が生育した。
融合細胞ハイブリッドが充分増殖した時点(培養開始よ
り約2週間後)で、培養上清のイネ萎縮ウーイルスに対
する抗体力価を酵素抗体法で検定した。
り約2週間後)で、培養上清のイネ萎縮ウーイルスに対
する抗体力価を酵素抗体法で検定した。
総計192穴中18穴の融合細胞ハイブリッド培養上清
にイネ萎縮ウィルスに対する抗体が認められた。抗体を
産生じている各穴の融合細胞ハイブリッドについて限界
稀釈法によるクローニング操作を5回繰返し行なった。
にイネ萎縮ウィルスに対する抗体が認められた。抗体を
産生じている各穴の融合細胞ハイブリッドについて限界
稀釈法によるクローニング操作を5回繰返し行なった。
かくして抗体を安定に産生ずるクローン7株を単離した
。これらのクローンを各々MoAb1 cA4、MoA
b2 cE3、MoAb3c G 7、MoAb4 b
Al 、MoAb5 bEl 、MoAb6 bclo
及びMoAb7 bF9 と命名した。各々のクローン
の培養液を採取した。また、少なくともlX105細胞
を有する各々のクローンを、予めプリスタンを1週間間
隔で2回注射したBALB/cマウスの腹腔内に注射し
、3週間後に抗イネ萎縮ウィルス抗体を含む腹水を採取
した。腹水はマウス1匹当り約10j+l得られた。上
記のクローン7株について得られた培養液及び腹水のイ
ネ萎縮ウィルスに対する抗体力価を酵素抗体法で調べ、
その結果を第1表に示した。
。これらのクローンを各々MoAb1 cA4、MoA
b2 cE3、MoAb3c G 7、MoAb4 b
Al 、MoAb5 bEl 、MoAb6 bclo
及びMoAb7 bF9 と命名した。各々のクローン
の培養液を採取した。また、少なくともlX105細胞
を有する各々のクローンを、予めプリスタンを1週間間
隔で2回注射したBALB/cマウスの腹腔内に注射し
、3週間後に抗イネ萎縮ウィルス抗体を含む腹水を採取
した。腹水はマウス1匹当り約10j+l得られた。上
記のクローン7株について得られた培養液及び腹水のイ
ネ萎縮ウィルスに対する抗体力価を酵素抗体法で調べ、
その結果を第1表に示した。
第 1 表
第1表に示すとおり、腹水の抗体力価は高いもので培養
液の抗体力価の6万倍以上あった。
液の抗体力価の6万倍以上あった。
りO−7MoAbl cA4 をBALB/cマウス
の腹腔内に注射して得られた上記の抗イネ萎縮ウィルス
抗体を含む腹水10gtKPBS (pH7,a)10
肩tを加え、ついで硫酸アンモニウムの飽和水溶液20
m1を加え、得られた溶液を5000回転で20分間遠
心分離した。得られたγ−グロブリンの沈渣をP B
820 mlに容解し、この溶液に硫酸アンモニウムの
飽和水溶液15M1を加えて3000回転で20分間遠
心分離した。その沈渣をP B 35 mlに溶解し、
ついでこの溶液をPBS 21に対して透析し、抗イネ
萎縮ウィルス抗体MoAb1を10 */me含むr−
グロブリン溶液Z wlを得た。
の腹腔内に注射して得られた上記の抗イネ萎縮ウィルス
抗体を含む腹水10gtKPBS (pH7,a)10
肩tを加え、ついで硫酸アンモニウムの飽和水溶液20
m1を加え、得られた溶液を5000回転で20分間遠
心分離した。得られたγ−グロブリンの沈渣をP B
820 mlに容解し、この溶液に硫酸アンモニウムの
飽和水溶液15M1を加えて3000回転で20分間遠
心分離した。その沈渣をP B 35 mlに溶解し、
ついでこの溶液をPBS 21に対して透析し、抗イネ
萎縮ウィルス抗体MoAb1を10 */me含むr−
グロブリン溶液Z wlを得た。
実施例2
抗原分析
ポリアクリルアミドのマイクロビーズ(アフィゲルフロ
19粒径1〜3μ、バイオラド社製)150qとクロー
ンMOAb1 cA4 が産生した抗イネ萎縮ウィル
スモノクローナル抗体MoAb1を10q/me含むr
−グロブリン溶液0.5mlとを0.5譚/のPBS(
pH5,0)中で1−エチル−5−(3−ジメチルアミ
ノプロピル9カルボジイミド(FINDAC,バイオラ
ド社製)2ダの存在下に反応させ、抗イネ萎縮ウィルス
モノクローナル抗体を固定化したマイクロビーズを作製
した。ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を0.05%
及び塩化ナトリウムを0.15M含む10mMトリス緩
衝液(pH8,5)100μlに溶解したイネ萎縮ウィ
ルス120μqを上記のマイクロビーズ280μりに加
工、37°Cで1時間反応させた。反応後、得られたマ
イクロビーズをO,+5M塩化ナトリウムを含む10m
M)リス緩衝液(pH8,5)で洗滌後、このマイクロ
ビーズにSDSを0.2チ及びメルカプトエタノールを
0.2チ含む10mM)!Jス緩衝液10μ4を加えて
上記のマイクロビーズ上に固定化されたモノクローナル
抗体と結合した抗原を溶離させた。溶離した抗原を、ラ
エムリ−(Laemmli )がネイチャー、 227
巻、680−685頁(1970)に報告したゲル電気
泳動の方法に従い、7.5%濃度のポリアクリルアミド
泳動ゲル及び3チ濃度のポリアクリルアミド濃縮ゲルを
用いて15mAで3時間泳動させたのち、ゲル中に分離
された抗原蛋白質をモリセイ(Morrisse>’
)がアナリテイカル・バイオヶミストリイ(Analy
tical Biochemistry ) e 17
巻、307−!110頁(1981)に報告した銀染色
法により検出した。ゲル電気泳動の結果を第1図のレー
ン2に示す。このレーン2が示すように、モノクローナ
ル抗体MoAb1と反応した抗原はイネ萎縮ウィルスを
構成する蛋白質のうち4種類の蛋白質である。第1図の
レーン1は、RNA分解酵素RNaseAで処理し二本
鎖RNAを消化させたの過ネ萎縮ウィルスの蛋白質を上
記の方法でゲル電気泳動させた結果を示す。また、第1
図のレーン3は、抗イネ萎縮ウィルスモノクローナル抗
体MoAb1を固定化したマイクロビーズをSDSを1
チ及びメルカプトエタノールを1%含む10mMトリス
緩衝液で抽出した液を同様にゲル電気泳動させた結果を
示す。このレーン5が示すように、抗イネ萎縮ウィルス
モノクローナル抗体を固定化したマイクロビーズから少
量のモノクローナル抗体の遊離が認められる。
19粒径1〜3μ、バイオラド社製)150qとクロー
ンMOAb1 cA4 が産生した抗イネ萎縮ウィル
スモノクローナル抗体MoAb1を10q/me含むr
−グロブリン溶液0.5mlとを0.5譚/のPBS(
pH5,0)中で1−エチル−5−(3−ジメチルアミ
ノプロピル9カルボジイミド(FINDAC,バイオラ
ド社製)2ダの存在下に反応させ、抗イネ萎縮ウィルス
モノクローナル抗体を固定化したマイクロビーズを作製
した。ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を0.05%
及び塩化ナトリウムを0.15M含む10mMトリス緩
衝液(pH8,5)100μlに溶解したイネ萎縮ウィ
ルス120μqを上記のマイクロビーズ280μりに加
工、37°Cで1時間反応させた。反応後、得られたマ
イクロビーズをO,+5M塩化ナトリウムを含む10m
M)リス緩衝液(pH8,5)で洗滌後、このマイクロ
ビーズにSDSを0.2チ及びメルカプトエタノールを
0.2チ含む10mM)!Jス緩衝液10μ4を加えて
上記のマイクロビーズ上に固定化されたモノクローナル
抗体と結合した抗原を溶離させた。溶離した抗原を、ラ
エムリ−(Laemmli )がネイチャー、 227
巻、680−685頁(1970)に報告したゲル電気
泳動の方法に従い、7.5%濃度のポリアクリルアミド
泳動ゲル及び3チ濃度のポリアクリルアミド濃縮ゲルを
用いて15mAで3時間泳動させたのち、ゲル中に分離
された抗原蛋白質をモリセイ(Morrisse>’
)がアナリテイカル・バイオヶミストリイ(Analy
tical Biochemistry ) e 17
巻、307−!110頁(1981)に報告した銀染色
法により検出した。ゲル電気泳動の結果を第1図のレー
ン2に示す。このレーン2が示すように、モノクローナ
ル抗体MoAb1と反応した抗原はイネ萎縮ウィルスを
構成する蛋白質のうち4種類の蛋白質である。第1図の
レーン1は、RNA分解酵素RNaseAで処理し二本
鎖RNAを消化させたの過ネ萎縮ウィルスの蛋白質を上
記の方法でゲル電気泳動させた結果を示す。また、第1
図のレーン3は、抗イネ萎縮ウィルスモノクローナル抗
体MoAb1を固定化したマイクロビーズをSDSを1
チ及びメルカプトエタノールを1%含む10mMトリス
緩衝液で抽出した液を同様にゲル電気泳動させた結果を
示す。このレーン5が示すように、抗イネ萎縮ウィルス
モノクローナル抗体を固定化したマイクロビーズから少
量のモノクローナル抗体の遊離が認められる。
実施例3
アガロースのマイクロビーズ(セファロース4B、ファ
ルマシア社’JJ’ ) 5 mlを1M炭酸ナトリウ
ム水溶液に懸濁させ、この懸濁液にシアン化ブロマイド
0.5gをアセトニトリル0.5m/に溶解させた溶液
を加えて室温で2分間活性化させたのち、0.1M炭酸
緩衝液(pH10)で洗滌した。抗イネ萎縮ウィルスモ
ノクローナル抗体MoAb1を101ki/d含むr−
グロブリン溶液5賃tを0.1M炭酸緩衝液51/に溶
解し、この溶液を上記の活性化マイクロビーズに加えて
4°Cで3時間反応させた。このようにしてアガロース
のマイクロビーズ111t当す抗イネ萎縮ウィルスモノ
クローナル抗体5qが固定化したアフィニティーカラム
(カラム容積5 ml )を作製した。対照として、正
常BALB/cマウスイムノグロブリンを上記の方法で
アガロースのマイクロビーズに固定化させた。イネ萎縮
ウィルス1ダをSDSを0.1%含む10mMトリス緩
衝液(pH8,5) 100μ4に溶解させ、この溶液
にRNA分解酵素RNaseAの5p9を加えてウィル
ス二本鎖RNAを消化させたのち、塩化ナトリウムを加
えて溶液中の塩化す) IJウムの濃度を0.15Mと
し、この溶液を上記の抗体固定化アフィニティーカラム
に流して付着させた。このカラムにまず0.15M塩化
ナトリウム−10mM)リス緩衝液を流して未結合ウィ
ルス成分を溶出させ、ついで1M塩化ナトリウム水溶液
を流してカラムに非特異的に結合しているウィルス成分
を溶出させ、最後に4Mグアニジン塩酸水溶液(pH8
,0)を流してカラムに特異的に吸着されたウィルス成
分を溶出させた。このカラムクロマトグラフィーの結果
を第2図の(a)に示す。第2図の(′b)は上記の0
.15M塩化ナトリウム−10mM )リス緩衝液によ
る溶出液を用いて行なった再カラムクロマトグラフィー
の結果を示し、第2図の(C)は上記の4Mグアニジン
塩酸水浴液による溶出液を用いて行なった再カラムクロ
マトグラフィーの結果を示し、また第2図の(d)は正
常BALB/cマウスイムノグロブリンを固定化させた
カラムを用いて行なったクロマトグラフィーの結果を示
す。これらの結果によれば、イネ萎縮ウィルスを構成す
る成分の約50%がカラムに特異的に吸着していた。こ
の吸着が特異的反応に基づいていることは第2図の(b
)、(c)及び(d)から証明される。なお第2図の(
a)、(b)、(c)及び(d)において、(りは1M
塩化ナトリウム水溶液による溶出開始時を示し、(2)
は4Mグアニジン塩酸水溶液による溶出開始時を示す。
ルマシア社’JJ’ ) 5 mlを1M炭酸ナトリウ
ム水溶液に懸濁させ、この懸濁液にシアン化ブロマイド
0.5gをアセトニトリル0.5m/に溶解させた溶液
を加えて室温で2分間活性化させたのち、0.1M炭酸
緩衝液(pH10)で洗滌した。抗イネ萎縮ウィルスモ
ノクローナル抗体MoAb1を101ki/d含むr−
グロブリン溶液5賃tを0.1M炭酸緩衝液51/に溶
解し、この溶液を上記の活性化マイクロビーズに加えて
4°Cで3時間反応させた。このようにしてアガロース
のマイクロビーズ111t当す抗イネ萎縮ウィルスモノ
クローナル抗体5qが固定化したアフィニティーカラム
(カラム容積5 ml )を作製した。対照として、正
常BALB/cマウスイムノグロブリンを上記の方法で
アガロースのマイクロビーズに固定化させた。イネ萎縮
ウィルス1ダをSDSを0.1%含む10mMトリス緩
衝液(pH8,5) 100μ4に溶解させ、この溶液
にRNA分解酵素RNaseAの5p9を加えてウィル
ス二本鎖RNAを消化させたのち、塩化ナトリウムを加
えて溶液中の塩化す) IJウムの濃度を0.15Mと
し、この溶液を上記の抗体固定化アフィニティーカラム
に流して付着させた。このカラムにまず0.15M塩化
ナトリウム−10mM)リス緩衝液を流して未結合ウィ
ルス成分を溶出させ、ついで1M塩化ナトリウム水溶液
を流してカラムに非特異的に結合しているウィルス成分
を溶出させ、最後に4Mグアニジン塩酸水溶液(pH8
,0)を流してカラムに特異的に吸着されたウィルス成
分を溶出させた。このカラムクロマトグラフィーの結果
を第2図の(a)に示す。第2図の(′b)は上記の0
.15M塩化ナトリウム−10mM )リス緩衝液によ
る溶出液を用いて行なった再カラムクロマトグラフィー
の結果を示し、第2図の(C)は上記の4Mグアニジン
塩酸水浴液による溶出液を用いて行なった再カラムクロ
マトグラフィーの結果を示し、また第2図の(d)は正
常BALB/cマウスイムノグロブリンを固定化させた
カラムを用いて行なったクロマトグラフィーの結果を示
す。これらの結果によれば、イネ萎縮ウィルスを構成す
る成分の約50%がカラムに特異的に吸着していた。こ
の吸着が特異的反応に基づいていることは第2図の(b
)、(c)及び(d)から証明される。なお第2図の(
a)、(b)、(c)及び(d)において、(りは1M
塩化ナトリウム水溶液による溶出開始時を示し、(2)
は4Mグアニジン塩酸水溶液による溶出開始時を示す。
また、カラムから4Mグアニジン塩酸水溶液により溶出
した両分を、SDSポリアクリルアミド泳動ゲルを用い
て15mAで3時間泳動させた結果を第3図のレーン2
に示す。第3図のレーン1はカラムクロマトグラフィー
に付する前のイネ萎縮ウィルス溶液を同様にゲル電気泳
動させた結果を示す。
した両分を、SDSポリアクリルアミド泳動ゲルを用い
て15mAで3時間泳動させた結果を第3図のレーン2
に示す。第3図のレーン1はカラムクロマトグラフィー
に付する前のイネ萎縮ウィルス溶液を同様にゲル電気泳
動させた結果を示す。
実施例4
ドツトスポットアッセイによる抗原の検出ニトロセルロ
ース膜上に種々の濃度のイネ萎縮ウィルス溶液2μeを
スポットし、これらのドツトスポットを風乾後、実施例
1で得られた抗イネ萎縮ウィルスモノクローナル抗体M
oAb1を含む腹水をPBSで500倍に稀釈した液に
浸し、室温で30分間反応させた。ついで、西洋ワサビ
起源のペルオキシダーゼで標識した山羊抗マウスイムノ
グロブリン抗体(EYフラボ製)をPBSで200倍に
稀釈した液に浸し、室温で50分間反応させたのち、基
質であるジアミノベンジジン溶液に浸した。各々のドツ
トスポットにおいてイネ萎縮ウィルスと上記の抗体を介
して結合したペルオキシダーゼの存在を褐色の発色によ
り確認した。この結果を第4図の(a)に示す。第4図
の(a)において、上段の5個のドツトスポットのイネ
萎縮ウィルス含有量は左から右に各々2000ng、4
00ng、80ng であり、また下段の5個のドツ
トスポットのイネ萎縮ウィルス含有量は左から右に各々
16ng5.2 nq 、 Onqである。第4図の
(a)に示すドツトスポットの発色状態から、イネ萎縮
ウィルスの16ngが効率よくかつ簡便に検出される。
ース膜上に種々の濃度のイネ萎縮ウィルス溶液2μeを
スポットし、これらのドツトスポットを風乾後、実施例
1で得られた抗イネ萎縮ウィルスモノクローナル抗体M
oAb1を含む腹水をPBSで500倍に稀釈した液に
浸し、室温で30分間反応させた。ついで、西洋ワサビ
起源のペルオキシダーゼで標識した山羊抗マウスイムノ
グロブリン抗体(EYフラボ製)をPBSで200倍に
稀釈した液に浸し、室温で50分間反応させたのち、基
質であるジアミノベンジジン溶液に浸した。各々のドツ
トスポットにおいてイネ萎縮ウィルスと上記の抗体を介
して結合したペルオキシダーゼの存在を褐色の発色によ
り確認した。この結果を第4図の(a)に示す。第4図
の(a)において、上段の5個のドツトスポットのイネ
萎縮ウィルス含有量は左から右に各々2000ng、4
00ng、80ng であり、また下段の5個のドツ
トスポットのイネ萎縮ウィルス含有量は左から右に各々
16ng5.2 nq 、 Onqである。第4図の
(a)に示すドツトスポットの発色状態から、イネ萎縮
ウィルスの16ngが効率よくかつ簡便に検出される。
第4図の(b)は抗イネ萎縮ウィルスモノクローナル抗
体の代りに正常BALB/cマウスの腹水を用いて行な
つた対照例におけるドツトスポットの発色状態を示すが
、いずれのドツトスポットも発色しなかった。
体の代りに正常BALB/cマウスの腹水を用いて行な
つた対照例におけるドツトスポットの発色状態を示すが
、いずれのドツトスポットも発色しなかった。
(発明の効果〕
本発明の方法によれば上記の実施例から明らかなとおり
イネ萎縮ウィルスに対し特異性を示すモノクローナル抗
体を製造することができる。
イネ萎縮ウィルスに対し特異性を示すモノクローナル抗
体を製造することができる。
第1図は実施例2で行なったゲル電気泳動の結果を示し
、そのレーン2は固定化抗イネ萎縮ウィルスモノクロー
ナル抗体MoAb1と反応したイネ萎縮ウィルスの蛋白
質についてのゲル電気泳動の結果を、レーン1はRNA
分解酵素RNase Aで処理し二本鎖RNAを消化さ
せたのちのイネ萎縮ウィルスの蛋白質についてのゲル電
気泳動の結果を、またレーン3は固定化抗イネ萎縮ウィ
ルスモノクローナル抗体MoAb1をSDSを1係及び
メルカプトエタノールを1チ含む10 mM トリス緩
衝液で抽出した液についてのゲル電気泳動の結果をそれ
ぞれ示す。第2図は実施例6で行なったアフィニティー
クロマトグラフィーの結果を示し、その(a)はイネ萎
縮ウィルスについて抗イネ萎縮ウィルスモノクローナル
抗体MoAb1を固定化させたアフィニティーカラムを
用いて行なったクロマトグラフィーの結果を、(b)及
び(c)はその溶出液を用いて行なった再カラムクロマ
トグラフィーの結果を、また(d)は正常B A L
B’/cマウスイムノグロブリンを固定化させたカラム
を用いて行なったクロマトグラフィーの結果をそれぞれ
示す。第3図は実施例うで行なったゲル電気泳動の結果
を示し、そのレーン2はアフィニティーカラムから4M
グアニジン塩酸水溶液により溶出した抗イネ萎縮ウィル
スモノクローナル抗体MoAb1と特異的に反応したイ
ネ萎縮ウィルス成分の両分についてのゲル電気泳動の結
果を、またレーン1はアフィニティーカラムクロマトグ
ラフィーに付する前のイネ萎縮ウィルス溶液についての
ゲル電気泳動の結果をそれぞれ示す。第4図は実施例4
で行なったドツトスポットアッセイによるイネ萎縮ウィ
ルスの検出結果を示し、その(a)はイネ萎縮ウィルス
と抗イネ萎縮ウィルスモノクローナル抗体MoAb1及
び山羊抗マウスイムノグロブリン抗体を介して結合した
ベルオギシダーゼが存在するドツトスポットの発色状態
を示し、(b)は抗イネ萎縮ウィルスモノクローナル抗
体MoAb1の代りに正常B A L B /cマウス
の腹水を用いて行なった対照例におけるドツトスポット
の発色状態を示す。
、そのレーン2は固定化抗イネ萎縮ウィルスモノクロー
ナル抗体MoAb1と反応したイネ萎縮ウィルスの蛋白
質についてのゲル電気泳動の結果を、レーン1はRNA
分解酵素RNase Aで処理し二本鎖RNAを消化さ
せたのちのイネ萎縮ウィルスの蛋白質についてのゲル電
気泳動の結果を、またレーン3は固定化抗イネ萎縮ウィ
ルスモノクローナル抗体MoAb1をSDSを1係及び
メルカプトエタノールを1チ含む10 mM トリス緩
衝液で抽出した液についてのゲル電気泳動の結果をそれ
ぞれ示す。第2図は実施例6で行なったアフィニティー
クロマトグラフィーの結果を示し、その(a)はイネ萎
縮ウィルスについて抗イネ萎縮ウィルスモノクローナル
抗体MoAb1を固定化させたアフィニティーカラムを
用いて行なったクロマトグラフィーの結果を、(b)及
び(c)はその溶出液を用いて行なった再カラムクロマ
トグラフィーの結果を、また(d)は正常B A L
B’/cマウスイムノグロブリンを固定化させたカラム
を用いて行なったクロマトグラフィーの結果をそれぞれ
示す。第3図は実施例うで行なったゲル電気泳動の結果
を示し、そのレーン2はアフィニティーカラムから4M
グアニジン塩酸水溶液により溶出した抗イネ萎縮ウィル
スモノクローナル抗体MoAb1と特異的に反応したイ
ネ萎縮ウィルス成分の両分についてのゲル電気泳動の結
果を、またレーン1はアフィニティーカラムクロマトグ
ラフィーに付する前のイネ萎縮ウィルス溶液についての
ゲル電気泳動の結果をそれぞれ示す。第4図は実施例4
で行なったドツトスポットアッセイによるイネ萎縮ウィ
ルスの検出結果を示し、その(a)はイネ萎縮ウィルス
と抗イネ萎縮ウィルスモノクローナル抗体MoAb1及
び山羊抗マウスイムノグロブリン抗体を介して結合した
ベルオギシダーゼが存在するドツトスポットの発色状態
を示し、(b)は抗イネ萎縮ウィルスモノクローナル抗
体MoAb1の代りに正常B A L B /cマウス
の腹水を用いて行なった対照例におけるドツトスポット
の発色状態を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、動物をイネ萎縮ウィルスで免疫し、該動物からの抗
体産生細胞と骨髄腫細胞との間に融合細胞ハイブリッド
を形成させ、該ハイブリッドをクローン化し、ついでイ
ネ萎縮ウィルスに対し特異性を示す抗体を産生するクロ
ーンを選択し、培養することを特徴とするイネ萎縮ウィ
ルスに対するモノクローナル抗体の製造方法。 2、動物がマウスである特許請求の範囲第1項記載の方
法。 3、抗体産生細胞が脾臓細胞である特許請求の範囲第1
項及び第2項記載の方法。 4、抗体産生細胞と骨髄腫細胞とをポリエチレングリコ
ールを用いて融合させる特許請求の範囲第1〜3項記載
の方法。 5、ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジンを含有
する培地中でハイブリッドを培養する特許請求の範囲第
1〜4項記載の方法。 6、マウスをイネ萎縮ウィルスで免疫し、融合細胞ハイ
ブリッドを該マウスの脾臓細胞と骨髄腫細胞との間に形
成させる特許請求の範囲第1〜5項記載の方法。 7、免疫マウスがBALB/cマウスである特許請求の
範囲第6項記載の方法。 8、イネ萎縮ウィルスに対し特異性を示す抗体を産生す
るクローンをマウスに接種し、マウス体内で培養する特
許請求の範囲第1〜7項記載の方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP19885284A JPS6174594A (ja) | 1984-09-21 | 1984-09-21 | イネ萎縮ウイルスに対するモノクロ−ナル抗体の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP19885284A JPS6174594A (ja) | 1984-09-21 | 1984-09-21 | イネ萎縮ウイルスに対するモノクロ−ナル抗体の製造方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6174594A true JPS6174594A (ja) | 1986-04-16 |
Family
ID=16397973
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP19885284A Pending JPS6174594A (ja) | 1984-09-21 | 1984-09-21 | イネ萎縮ウイルスに対するモノクロ−ナル抗体の製造方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS6174594A (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102533664A (zh) * | 2012-01-09 | 2012-07-04 | 浙江大学 | 分泌抗水稻黑条矮缩病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用 |
-
1984
- 1984-09-21 JP JP19885284A patent/JPS6174594A/ja active Pending
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102533664A (zh) * | 2012-01-09 | 2012-07-04 | 浙江大学 | 分泌抗水稻黑条矮缩病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用 |
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