JPS62502095A - リンパ節障害関連ウイルス（ｌａｖ）のゲノムｒｎａによりコ−ドされたタンパク質に対するモノクロ−ナル抗体及び該抗体を分泌するハイブリド−マ - Google Patents
リンパ節障害関連ウイルス（ｌａｖ）のゲノムｒｎａによりコ−ドされたタンパク質に対するモノクロ−ナル抗体及び該抗体を分泌するハイブリド−マInfo
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
１ンパ″″Ｉ宙Ｐ遍ウィルス（ＬＡＶ）のゲノムＲＮ＾によ コードされたタン
パク に・ るモノクローナル枝体 び計 体を 、るハイブリドーマ
本発明は、グリコジル化されているか否かに拘わらずリンパ節障害関連ウィルス
（ＬＡＶ）のゲノムＲＮＡ又はこれに由来するクローン化ＤＮＡによりコードさ
れたポリペプチドを認識するモノクローナル抗体、該抗体を分泌するハイブリド
ーマ、該抗体の作製方法及びその使用法に係る。
このようなりＮＡ配列なりローン化するための方法は、１９８４年９月１９日付
で英国用Ｈ（特許出願第８４２３６５９号）、１９８５年９月１７日付でヨーロ
ッパ出願（特許出願第８５４０１７９９号）及び１９８５年９月１８日付で国際
上Ｂ（特許出願第ｐｃ丁／ＥＰ／８５００４８７号）された特許出願中に開示さ
れている。以下の記載中、本発明の改良と共通する内容についてはこれらの特許
出願を参考にする。
更に本願は、パスツール研究所及びＣＥＮＴＲＥ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥＬＡ
ＲＥＣＨＥＲＣＩＩＥ ５ＣＩＥＮＴＩＦＩＱＵＥ名義の１９８５年１０月１
８日付出願の国際出願ＰＣＴ／ＥＰ ８５００５４８号の内容も参考とする０以
上２件の特許出願の内容は全て参考のために本明細書中に含まれているものと理
解されたい。
より特定的には、ｃ Ｄ Ｎ Ａ及び組み込まれたプロウィルス形態のＬＡＹの
両方について分子クローニングが報告されている０組換体ファージクローンは、
）ｆｉｎｄｌにより部分的に消化されたＬ＾■ｓ染ヒトＴリンパ球ＤＮＡのゲ
ノムライブラリーから単離された０組換体ファージλＪ１９のインサートは、末
端反復配列（ＬＴＲ）のＲ要素内のＦｌｉｎｄｌｌｌ開裂により形成された。従
ってインサートの各末端はＬＴＲの一部を含んでいる。
Ｒ内におけるクラスター構造のＨｉｎｄｌｌ［部位の可能性は、ＬＡＶｃＤＮＡ
クローンであるｐｔ、＾Ｖ７５をこの領域に対応する部分についてＺ配列決定す
ることにより除かれた。従って、ＬＡＶゲノムの完、全な配列情報はλＪ１９ク
ローンから誘導され得る。
Ｈ２Ｓ「ショットガン」クローニング及びジデオキシチェインターミネータ−法
（Ｓａｎｇｅｒ他、１９７７）により、λＪ１９インサートのヌク、レオチド配
列が決定されている。Ｒ配列の２つのコピーを含む再構成されたウィルスのゲノ
ムは、９１９３個のヌクレオチドの長さを有する０番号性はシステムはと明細書
に添付した上記国際出願の第１ａ−１ｅ図に示されてい本発明の目的は、重要な
ＬＡＶタンパク質又は糖タンパク質をより正確に同定する方法を提供すること、
及びＬＡＶウィルスタンパク質又は糖タンパク質の重要な免疫原性部位即ちエピ
トープを有するタンパク質及びポリペプチドに対するモノクローナル抗体を提供
することにある。
本発明はより特定的には、ＬＡＶコアタンパク質又はその断片、特にｐｔ３、ｐ
ｔ８、ｐ２５及びｐ５５タンパク質を認識するモノクローナル抗体に関する。
従って本発明はより特定的には、
−ＬＡＶｃＤＮ＾の約ヌクレオチド３３６から約ヌクレオチド１６５０までの範
囲のＤＮＡ配列によりコードされると見なされ、ＬＡＶウィルスのコアタンパク
質ｐ１８及びｐ２５のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を含有すると見なさ
れるｐ５５タンパク質、ＬＡＶｃＤＮ＾の約ヌクレオチド７３２から約ヌクレオ
チド１３００までの範囲のＤＮＡ配列によりコードされると見なされるｐ２５ダ
ンバク質、
一部ヌクレオチド１３７１から約ヌクレオチド１６５０までの範囲のＤＮＡ配列
によりコードされると見なされるｐ１３タンパク質、−約ヌクレオチド３３６か
ら約ヌクレオチド６１１までの範囲のＤＮＡ配列によりコードされると見なされ
るｐ１８タンパク質、を夫々認識するモノクローナル抗体に関する。
より特定的には本発明は、はぼ次のヌクレオチド位置ニー３３６〜１６５０（ｐ
５５）
−３３６〜６１１（ｐｔ８）
−１３７１〜１６５０（ｐｔ３）
−６５６〜１３００（ｐ２５）
の範囲のＤＮＡ配列によりコードされたペプチド配列と同一−又は同等のペプチ
ド配列を有するポリペプチドを認識するモノクローナル抗体に関する。
特記すべき点として、ｐｔ３、ｐｔｓ及びｐ２５はいずれも同一の前駆体即ちｐ
５５に由来するように思われる。
より特定的には、本発明はＣｏ１１ｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅｓ
Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓ＋内ｅｓ（略称ＣＮＣＭ
）に１９８４年１０月２４日付で寄託された以下の寄託番号：
ＬＡＹ−八１（ｐｔ８）−＝−Ｎｏ、ｌ−３５５ＬＡＹ−Ｂｌ（ｐ２５）−−Ｎ
ｏ、 Ｉ’−３５６ＬＡＶ−ＣＩ（ｐ２５）−・＝Ｎｏ、 ｌ−３５７ＬＡＶ−
Ｄｌ（ｉ）−−Ｎｏ、 ｌ−３５８ＬＡＹ−Ｅｌ（ｐ２５）・−＝Ｎｏ、 Ｉ−
３５９ＬＡＶ−Ｆｌ（ｐ１３）＝−Ｎｏ、ｌ−３６０のハイブリドーマにより産
生されるモノクローナル抗体に係る。
ハイブリドーマを表すために使用した表示は、ＬＡＶウィルスの溶解物から出発
する標準精製手続きにより得られる精製ペプチド、即ち対応するハイブリドーマ
の産生に使用した牌細胞を取出した動物に免疫感作するために当初使用したペプ
チドに対応する。当該モノクローナル抗体の産生に使用される精製ペプチドは、
上記ＰＣＴ出願及びヨーロッパ出願中に開示されているＤＮＡ組換体の対応する
精製発現産物を動物に感作することによっても得られる。前記ハイブリドーマを
作製するための一般的な手順を以下に説明する。
前記モノクローナル抗体の各々の産生に使用した方法の概要を以下に説明する。
マウスの 感
６〜８週齢のＢａ１ｂ／ｃマウス群を使用した。各群に夫々上記の各タンパク質
を感作した。感作のプロトコールは全群に共通しており、Ｉｉ！膜内経路で３回
注射した後、静脈内経路で１回注射するものとし、０日日にフ、ロイントの完全
アジュバントの存在下、１４日目にフロイントの不完全アジュバントの存在下、
２８日及び４２日目にアジュバントの不在下で各回毎に１０■の抗原性製剤を注
射した。
冨■ム びバイブ１ツドの悴
ＭＰＯＣ−２１ｉ胞系に由来するミエローマＰ３ Ｘ ６３＾ｇ８のアザグアニ
ン耐性及び非分泌型変異細胞６．５３を使用した。４５日目にＦＡＳＥＫ八Ｓ
Ｄへ ５Ｔ−ＧＲＯＴＨ及び５ＣＩＩＥＩＤＥＧＣＥＲの技術に従ってポリエチ
レングリコール４０ｏＯの存在下で、感豚したマウスの牌細胞と融合させた。
ＲＰ旧１６−４０″）ＩＡＴ″培地中のハイブリッドの選択は、２４個のウェル
を含むプレート（Ｃｏｓｔａｒ）中で同一の培養技術に従って実施した。
次に、特異抗体を産生したハイブリドーマを、同質遺伝子型の胸腺リンパ球の支
持細胞層の存在下で夫々９６個のウェルを含むプレート中でクローニングした０
次に、選択された分泌性クローンを、同様に胸腺リンパ球の存在下で夫々２４個
のウェルを含むプレート中で増殖した。ウェルの１個にクローンのコンフルエン
Ｉ・な気合が現れたら、８日前にプリスクンを注射したＢ＾１、Ｄ／ｅマウスに
腹膜的経路で注射するか及び／又は培養液中に維持した。
抗１式五」聾ｌ机遇−
５種類の技術により、所望の特異性の抗体を産生ずるクローンの特徴付けが可能
であった。第１段階では、所望の抗体を分泌するハイブリッドをＥＬＩＳＡ法に
より検出し、上滑中にマウスイムノグロブリンを確認した。この第１の選択から
出発し、ウィルス産生ヒト：Ｆ１ａに対するＥＬＩＳＡ法又は免疫蛍光法を使用
して、ウィルス成分に対する抗体を含有している上清をスクリーニングした。最
後に、３％Ｓ−システィンで標識したウィルスの放射性免疫沈降法及びウィルス
試料に対するウェスタンプロット法により上清を分析し、抗し＾■抗体の特異性
を決定した。
１」
異なる融合から出発して得られた細胞を、次に６４８個ののほとんどは”ＨＡＴ
″選択培地中で増殖することの可能な単一ハイブリッドクローンを含んでいた。
５０％を越えるクロした。Ａも代表的な融合をウェスタンプロット法により試験
し、各群の数個のハイブリドーマについては、それらの特異性、抗ウィルスＥＬ
ＩＳＡ法己おける反応性及び培養における発生率（増殖速度）分考慮してサブク
ローニングした。
当初にマウスに感作するのに使用したタンパク質又はポリペプチドをより特異的
に認識する抗体を産生ずるハイブリッドを保持した。得られた全サブクローンは
抗体を分泌することが認められ、この抗体を発現後に同質遺伝子型のマウスに注
射した。得られた各腹水液中の抗体特異性を分析した結果、対応するタンパク質
に関して腹水の各々で形成された抗体に特異性が確認された。
ＣＮＣＭに寄託されている上記ハイブリドーマは、上記タンパク質を使用して得
られるハイブリドーマの代表例である。
これらのハイブリドーマも本発明の一部を構成する。
得られたモノクローナル抗体は、ハイブリドーマを産生するために当初使用した
タンパク質と共通の抗原部位を有するタンパク質又はポリペプチドを精製するた
めに活用され得る。従って、本発明は精製方法自体にも係る。このような方法は
、ＬＡＶの溶解物、８染Ｔリンパ球又はＬＡＶもしくは同様のウィルスを産生ず
ることの可能な任意の他の細胞の処理に使用すると有利である。この方法は、間
遠するエピトープをコードするＤＮＡ配列を有する上記組換体ＤＮ＾で遺伝子工
学的に処理されている細胞により産生されたタンパク質の同定にも適用され得る
。この方法で使用されるモノクローナル抗体は、例えば臭化シアン法により、固
体支持体に固定化されていると有利であり、このような固体支持体の一例として
、例えばスウェーデンのファルマシア社から商標名５ＥＰＨＡＲＯＳＥとして市
販されている三次元架橋アガロース格子のようなアフィニティクロマトグラフィ
処理に好適な固体支持体が挙げられる。
従っ゛て本発明の方法は、上記ポリペプチドを選択的に保持するために、該ポリ
ペプチドを含有している溶液を上記モノクローナル抗体を担持しているアフィニ
ティカラムと接触させる段階と、次に例えばｐＦ１２〜４の適当なイオン強度の
塩溶液のような適当な緩衝液により抗原−抗体複合体を解離させてポリペプチド
を回収する段階とを含んでいる。
このような緩衝液を構成するための適当な塩は酢酸アンモニウムから形成される
。
直ぐに明らかとなるように、前記ポリペプチドを分離してしまうと、同一のモノ
クローナル抗体は該当するエピトープを含んでいると思われる対応するポリペ１
チドから得られる断片の調査のために更に使用できる。尚、該断片は例えばポリ
ペプチド又はタンパク質を断片化することの可能な酵素でより大きなポリペプチ
ドを開裂することにより得られる。このような酵素の例として、慎」且５」立鵠
至！リーａｕｒｅｕｓ Ｖ ８の酵素、α−キモトリプシン、ＢＯＥＩＩＲＩＮ
ＧＥＲ社から市販されているマウス顎下腺プロテアーゼ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ及びＧ
ｌｙ−＾１ａジペプチドを特異的に認識するコラゲナーゼＶｉｂｒｉｏ ａｌ
１ｎｏｌ Ｌｉｅｕｓ ｃｈｅｍｏｖａｒ ％等が挙げられる。
ＣＮＣＭにＮｏ、 ｌ−３５５で寄託されているハイブリドーマにより産生され
るモノクローナル抗体は特に重要である。より特定的には該モノクローナル抗体
はｐｌＢ及びｐ５５の両者を認賞する。従って、ｐ５５（ｐｌＢ及びｐ２５の前
駆体）が各成分に開裂されても、抗体によりより顕著に認識されるエピトープは
変化せずに維持される。
従ってこの抗体はｐｌＢ及びｐ５５の両方を精製するために特に有益である。ｐ
５５に含有される他の成分、特にｐ２５は精製されたｐ５５から出発して精製す
ることができる。該抗体はＬＡＶウィルスを含有する組成中の該ＬＡＶウィルス
を認識することが可能であることも確認された。従ってｐｌＢは、ウィルスエン
ベロープを通して少なくとも特定的に露出され且つ絽胞により更に発現されるト
ランスメンブランタンパク質として機能すると仮定することができる。
従ってこの抗体は、
国際調査報告
国際ｉＩ！審報告
ＡＮＮＥＸτＯＴｉ’、Ｅ ＩｈＪＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ ５ＥＡＲＣＨＲＥ
ＰＯＲＴ ＯＮ
Claims (10)
- １．リンパ節障害関連ウイルス（ＬＡＶ）のコアタンパク質を認識するモノクロ ーナル抗体。
- ２．ＬＡＶのｐ１３タンパク質を認識する請求の範囲第１項に記載のモノクロー ナル抗体。
- ３．ＬＡＶのｐ１８タンパク質を認識する請求の範囲第１項に記載のモノクロー ナル抗体。
- ４．ＬＡＶのｐ２５タンパク質を認識する請求の範囲第１項に記載のモノクロー ナル抗体。
- ５．ＬＡＶのｐ５５タンパク質を認識する請求の範囲第１項に記載のモノクロー ナル抗体。
- ６．ＬＡＶのｐ１３タンパク質及びｐ２５タンパク質の両者を認識する請求の範 囲第１項に記載のモノクローナル抗体。
- ７．ＣＮＣＭに寄託番号Ｉ−３５５、Ｉ−３５６、Ｉ−３５７、Ｉ−３５８、Ｉ −３５９及びＩ−３６０で寄託されているハイブリドーマにより分泌されるモノ クローナル抗体、又は前記ハイブリドーマのいずれかにより産生されるモノクロ ーナル抗体により認識されるエビトープと同一のエピトープを認議する任意のモ ノクローナル抗体から成る群から選択される請求の範囲第１項に記載のモノクロ ーナル抗体。
- ８．請求の範囲第１項から第７項のいずれかに記載のモノクローナル抗体を分泌 するハイブリドーマ。
- ９．生物試料中の対応するポリペプチド又はＬＡＶ感染リンパ球上の対応する発 現産物を１ｎｖｉｔｒｏ検出するために使用される請求の範囲第１項から第７項 のいずれかに記載のモノクローナル抗体の使用法。
- １０．生物試料中に可溶化形態で合有されており、請求の範囲第１項から第７項 のいずれかに記載のモノクローナル抗体のいずれか１個により認識されるエピト ープを含むポリペプチドの精製方法であって、ポリペプチドー抗体複合体を形成 するべく、該ポリペプチドを固定化モノクローナル抗体に固定するための不溶化 支持体に結合又は固定化された対応するモノクローナル抗体に前記生物媒質を接 触させる段階と、固定されていないポリペプチドを分離する段階と、前記ポリペ プチドー抗体複合体の解離により前記固定された抗体を回収する段階とを含んで いる前記方法。
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