JPS6153221A - 新規多糖体ｒｉｎ物質，その製造法およびそれを有効成分とする抗腫瘍剤，免疫調節剤並びに感染症予防治療剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規多糖体ＲＩＮ物質、その製造法およびそれ
を有効成分とする抗腫瘍剤、免疫調節剤および感染症予
防治療剤に関し、詳しくは優れた抗腫瘍活性、免疫調節
活性および感染防御活性を有する新規多糖体ＲＩＮ物質
と、米糠を原料として当該物質を抽出、精製する当該物
質の製造法に関する。

かつて、穀粒、豆粒等あるいはこれらの表層部を原料と
して生理活性を有する物質を製造する方法が提案されて
いるが、これらの方法は収得量が非常に少ない、毒性が
みられる等の問題点がある。

本発明はこれらの問題点を解消すべく鋭意研究を続けた
結果なされたものである。

本発明の多糖体ＲＩＮ物質は米糠を熱水処理して得られ
る抽出液に極性有機溶媒を加えるか、あるいは塩析剤を
加え、生じた沈でんを分取したのち水に溶解し、必要に
応じて除蛋白操作、その他の精製処理を行なうことによ
って製造することができる。

本発明に用いられる原料米糠は通常の精米において発生
する米糠であり、当該米糠の発生源である玄米の品種、
産地および精白歩留等を問わないが、この原料米糠から
の多糖体ＲＩＮ物質の抽出。

精製に先立って当該原料中に混在する砕米等は可及的に
除去し、洗浄することが望ましい。また、米糠油を抽出
した後の残渣である脱脂糠等のようＫ、他の目的に使用
された後の米糠であっても本発明に使用することができ
る。

米糠の抽出液は、米糠を熱水処理することにより得られ
る。熱水処理は米糠に対し２〜１００倍量、好ましくは
５〜１０倍量の水を加え、０〜９０　ｋｇ　／　ｃａｌ
　。

好ましくはＯ〜５．０　ｋｇ／ａｎ！（７）圧力、５０
〜３ｏｏ℃、好ましくは１００〜１５０℃の温度で１ｏ
分〜２４時間、好ましくは０．５〜５時間抽出を行なう
、実用上は０〜３．０　ｋｇ／　ｃｍ”ノ圧カ、１００
−１４０　℃（７）温度で１〜５時間の熱水処理が適当
である。

熱水処理により得られた抽出液は濾過あるいは遠心分離
等の操作によって固形分と分離し、必要に応じて適当な
手段、たとえば減圧濃縮、限外濾過等の手段を単独もし
くは組合せて行ない適当量まで濃縮する。

この抽出液に対して水に可溶な極性有機溶媒もしくは塩
析剤を加え、生じた沈でんを分取することによって多糖
体ＲｒＮ物質を含む両分を得ることができる。ここで用
いる極性有機溶媒としては、たとえばメタノール、エタ
ノール、プロパツール。

アセトン等がある。極性有８１溶媒の使用量は抽出液中
における目的物質の含有量等を考慮して決定するが、エ
タノールを用いる場合を例にすると、エタノール濃度が
３０〜５０％（Ｖ／Ｖ）になるように添加すればよい。

なお、生じた沈でんは前記エタノール等の有機溶媒で洗
浄することが好ましい。

一方、塩析剤としては塩化ナトリウム、硫酸アンモニウ
ム、塩化カリウム等があり、通常は熱水抽出液に対し塩
析剤が飽和度０．５〜１になるまで加えて沈でんを生成
せしめる。

本発明では、極性有機溶媒もしくは塩析剤を熱水抽出液
に加える前あるいは上記の如くこれら物質を添加して沈
でんを生成せしめ、次いで水に溶解した後Ｋ、必要に応
じて除蛋白処理、その他の精製処理および粉末化処理を
単独であるいは適宜組合せて行なうことができる。除蛋
白処理や精製処理としては種々の操作を適用することが
できる。

たとえば多糖体ＲＩＮ物質を含有する溶液に澱粉分解酵
素および／または蛋白分解酵素を作用させて混在してい
る澱粉、蛋白質などの不純物を低分子化する。低分子化
されたものは後の精製工程で除去される。

他の除蛋白処理および精製処理として、前記多糖体ＲＩ
Ｎ物質含有水溶液に塩酸、タンニン酸。

トリクロル酢酸などの無機酸あるいは有機酸を０．１〜
１０％、好ましくは３〜５％程度加え、沈でんが生成し
たならば濾過、遠心分離等の操作により除き、続いて残
存する酸、無機イオンおよび低分子区分を流水または蒸
留水中で１〜３日透析する方法、セバーク法、イオン交
換処理方法１分画分子ｆｆ１１０，０００〜１００．０
００の膜を使用する限外濾過方法、ゲル濾過、遠心分離
、活性炭処理、濃縮等を単独であるいは組み合わせて適
用して分画除去して精製する。さらＫ、酸や酵素等によ
る低分子化処理を適用することもできる。

上記したプロテアーゼまたは酸処理により多糖体ＲＩ　
Ｎ９Ｊ質に夾雑した蛋白質の大部分は除去される。

上記した有機溶媒による洗浄、酵素処理、除蛋白、イオ
ン交換処理５限外濾過、ゲル濾過、遠心分離、活性炭処
理および濃縮等の精製処理は、その操作順序１組み合わ
せ方などに制限はなく必要に応じて単独もしくは２種以
上を組み合わせて適用すればよい。

前記の操作により精製された高分子の多糖体ＲＩＮ物質
を含む水溶液を凍結乾燥、噴霧乾燥、極性有機溶媒によ
る沈でんなどを行なって白色の粉末状とすることができ
る。

このようにして得られた多糖体ＲＩＮ物質は次のような
理化学的性質を有している。

下記の繰返し単位を有している。

（但し、Ｇはα−Ｄ−グルコピラノシル基を示し、ｎ＋
ｎ・＝４である。）また、繰返し単位の数（Ｎ）はＮ〉
１０である。透析膜を通過しない（したがって、分子量
は約１万以上であると認められる。）、有機酸または有
機溶媒、たとえばアルコール、アセトン、ヘキサン、ベ
ンゼン、酢酸エチル、リグロイン、四塩化炭素、クロロ
ホルム。

エーテル等に不溶であるが、水、ジメチルスルホキシド
、ホルムアミド等には可溶である。また、本物質の１％
水溶液のｐＨは中性である０本物質は一定の融点を示さ
ず、２２０℃で褐変し、２８０℃で黒変して炭化が起る
。後記製造例１による本物質の元素分析の結果は炭素４
１３９％、水素６．０９％。

窒素０．１３％、灰分３．２０％で、１％水溶液の呈色
反応はアンスロン硫酸反応、フェノール硫酸反応。

また、本物質の比旋光度は （Ｑ’）　”、’＝　＋１４２°　〜＋１４５°　（Ｈ
！Ｏ）　で、埃＃無機質については主としてＳｉ、Ｐ、
Ｋ、Ｎａ、Ｃａ、Ｍｇ＋Ｃｔなどが含まれていることを
確認した。これら元素はＲＩＮ物質をセファローズＣＬ
−６Ｂ　（ファルマシア製）にてゲル濾過したとき、糖
成分と挙動を共にし、ボイドポリニームに現われること
から考えて、無機質として単独でＲＩＮ物質に夾雑して
いるのではなく、ＲＩＮ物質の骨格成分に化学的に結合
して存在しているものと推定される。

また、ＲＩＮ物質の硫酸およびギ酸による完全加水分解
物の薄層クロマトグラフィーを下記の４種類の展開溶媒
で展開したところ、いずれもグルコース以外の糖スポッ
トを検出しないので、本物質はグルコースのみを構成糖
とする多糖であることが判明した。

（１）酢酸エチル：メタノールコ酢ｒＪ１　：水６５　
　　：　　　１５　　　　：１０：１０（２）酢１９エ
チル：イソプロパノール：水６５　　　：　　　　２３
　　　　　：１２（３）イソプロパツール：ピリジン：
水：酢酸８　　　　　：８：４＝１ （４）ｎ−ブタノール　：ピリジン：水６　　　　：　
４　８３ さらＫ、本物質は第１図に示す紫外部吸収スペクトル、
第２図に示す赤外部吸収スペクトルおよび第３図に示す
”Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。

これらのスペクトルの解析と比旋光度の結果から、α結
合の存在が推定される。また、本物質が透析膜を通過せ
ず、セファローズＣＬ−６Ｂ　（ファルマシア製）のゲ
ル濾過でボイドボリュームに現われる点から、本物質は
グルコースを唯一の糖構成成分とする多糖体であると認
められる。

また、ＲＩＮ物質は過ヨウ素酸酸化実験によりグルコー
ス残基１個当り約１．７８モルの過ヨウ素酸を消費し、
約０４１．モルのギ酸を生ずること、スミス分解を行な
った溶液をペーパークロマトグラフィーで分析すると、
多量のグリセリンを検出すること、メチル化粧のガス２
０マドグラフによる定量分析の結果、、　３．　４．　
６−チトラメチルグルコース（１）、２，３．４−）ジ
メチルグルコース（ｎ）、、３−ジメチルグルコース（
ＩＩＩ）が検出され、それぞれの相対的存在比は１：Ｉ
［：Ｉ［Ｉ冨ｔ：４：ｔ であった、これらの解析結果から本物質は下記のような
繰返し単位を有していると考えられる。

（但し、Ｇはα−Ｄ−グルコピラノシル基を示し、ｎ　
＋　ｎ’　ｗ　４である。） このことは１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルの解析結果からも
矛盾なく支持される。

本発明により得られる多糖体ＲＩＮ物質は、抗腫瘍活性
、免疫調節活性、感染防御活性等の種々の生理活性を有
していることが判明した。以下にそれぞれの生理活性に
ついてその検定法および後述する製造例１で得られた多
糖体ＲｒＮ物質を投与した実験での検定結果について詳
述する。

（１）抗１１ｆｆｔ瘍活性について （イ）同系腫瘍メス−Ａに対するＲＩＮ物質の腹腔投与
の効果 ６週令メス、平均体重２０ｇ（ＤＢＡＬＢ／Ｃ−ＣＲＪ
マウスに１週間、同系のマウスの腹腔内で継代した癌細
胞メス−Ａをマウス１匹当りｌＸｌ０’個を腹腔内に移
植し、対照群２０匹（１群）、試験群各１０匹（３群）
の計４群に分けた。癌細胞を移植した翌日から連続５日
間、試験群には生理食塩水に溶解したＲＩＮ物質をマウ
ス１匹の体重１　ｋｇ当り各１０．３０．１００　ｔｒ
ｉをＯ，１ｔａｊ！ずつ腹腔内に投与し、対照群には同
様にして生理食塩水のみを投与した。

以後、生存日数を観察し、延命効果を次式により算出し
た。

（ロ）同系腫瘍メス−Ａに対するＲ　Ｉ　Ｎ＠Ｊ質の経
口投与の効果 ６週令メス、平均体重２０ｇのＢＡＬＢ／Ｃ−ＣＲＪマ
ウスに１週間、同系のマウスの腹腔内で継代した癌細胞
メス−Ａをマウス１匹当りｌＸｌ０’個を右腋下皮下に
移植し、対照群２０匹（１群）、試験群各１０匹（３群
）の計４群に分けた。癌細胞を移植した翌日から連続１
０日間、試験群には生理食塩水に溶解したＲＩＮ物質を
マウス１匹の体重１　ｋｇ当り各１０．３０．１００　
ｒｒｔを０．２ｍｌずつ経口ゾンデを用いて胃内に投与
し、対照群には同様にして生理食塩水のみを投与した。

癌細胞を移植してから３５日後に各マウスを層殺し、増
殖した腫瘍を切り出し重量を測定した。なお、阻止率は
次式により算出した。

上記（イ）、（ロ）の方法により検定したＲＩＮ物質の
抗腫瘍効果は下表の通りであった。

上表より明らかなようＫ、腹腔投与、経口投与ともにマ
ウス体重１　ｋｇ当り３０■付近を至適投与量としてＲ
ｒＮ物質は強い抗腫瘍活性を有していることが判明した
。

その他にＲＩＮ物質は同系腫瘍ルイス肺癌、メラノーマ
　Ｂ−１６，同種腫瘍ザルコーマ１８０．エールリッヒ
腫瘍等に対し、投与量１０〜１００■／ｋｇの範囲で腹
腔投与または経口投与によりｌｌｆｆ１瘍阻止率３０〜
７０％の効果が確認されており、後述するように毒性が
全く見られない点とも合わせて極めて有効な抗腫瘍剤と
なりうると考えられる。

（２）免疫調節活性について （イ）カーボンクリアランステスト（ＯＣＴ）本性は免
疫調節作用のうちマクロファージの食細胞活性の増強効
果について調べるものである。

４週令メス、平均体重２０ｇのＩＣＲ−ＣＲＪマウス１
群６匹Ｋ、生理食塩水に溶解したＲＩＮ物質を２日間腹
腔投与しく対照群は生理食塩水のみを投与）、３日目に
カーボン液（ペリカン製黒インク、商品名：ファウント
　インディア、を生理食塩水で５倍に希釈した液）をマ
ウス尾静脈より０．２５ｍＩ！注入し、注入直後および
１０分後に眼窩静脈叢より０．０２５ｍｊ！採血し、３
．５ｍＪの０．０１モル炭酸ナトリウム溶液に懸濁溶解
させ、６５０　ｎｍの吸光度（ＯＤｈｓ。）を測定し、
血中カーボン濃度の減少率を調べた。効果は次式に示す
貧食係数で表わした。

＊Ｔ１時におけるｏＤ　＆５０をＣｔ、Ｔｚ時における
０ＤｔｈｓｏをＣ２とする。

なお、担癌マウスについてはｔＮ物質の投与開始より７
日前にザルコーマ１８０１１１胞をｌＸｌ０’個大腿部
筋肉に移植し、以下同様に試験した。結果は下表の通り
であり、正常マウス、担癌マウスともにＲＩＮ物質のｉ
ｏ〜３０■／ｋｇ、特に３０■／　ｋｇの投与によりマ
ウスの紬調内皮系の機能が冗進し、マクロファージの貧
食能が大幅に増強されていることが判明した。

（ロ）プラークフォーミングセル法（Ｐ　Ｆ　Ｃ）本性
は免疫調節作用のうち、宿主のＢ細胞の賦活による抗体
産生能の増強効果を調べるものである。

４週令メス、平均体重２０ＨのＩＣＲ−ＣＲＪマウス１
群６匹Ｋ、生理食塩水に溶解し、たＲＩＮ物質を３日間
連続して腹腔内に投与しく対照群は生理食塩水のみを投
与）、４日目と１１１日目それぞれ羊赤血球４Ｘ１０’
個を尾静脈より注入感作せしめ、その４日後にカニンガ
ムの方法でマウス牌細胞のプラーク形成能を測定した。

結果は下表の通りであり、ｔＮ物質は１０−１００■／
ｋ［ｒの投与により抗体産生能を著しく増強しているこ
とが示された。

（ハ）遅延型皮膚反応法（ＤＨＲ） 本性は免疫調節作用のうち宿主のＴ細胞の賦活による細
胞性免疫の作用の増強効果を調べるものである。

８週令メス、平均体重２７ｇのＩＣＲ−ＣＲＪマウス１
群６匹Ｋ、生理食塩水に溶解したＲＩＮ物質を８日間連
続して経口投与しく対照群は生理食塩水のみを投与）、
投薬開始後４日目にマウスの刺毛腹部に５％の塩化ピク
リルエタノール溶液を塗布して一次感作し、１１１日目
１％ピクリルオリーブ油溶液をマウス両耳の表裏に塗布
して二次感作し、その２４時間後に篤厚の増加をゲージ
で測定し、塗布前の篤厚との差から篤厚の増加量をみた
。

一方、担癌マウスについてはザルコーマ１８０１ｍ水型
１１ｆｆｉ瘍細胞をｌＸｌ０’個を投薬開始前日にマウ
ス腹腔内に移植し、以下同様に試験した。

結果は下表の通りであり、ＲＩＮ物質は試験した３０〜
５００■／ｋｇの経口投与により、正常マウス。

担癌マウスともに細胞性免疫能を著しく増強しているこ
とが示された。

以上、（イ）、（ロ）、（ハ）の各免疫実験によりＲＩ
Ｎ物質はメカニズムの異なる免疫作用をそれぞれ顕著に
凡退させていることがわかった。

免疫調節剤は一般には生体の免疫機能が低下したり、異
種抗原認識機能が弱い場合などに使用され得ることから
、特に微生物感染症や悪性腫瘍の治療剤、治療補強剤ま
たは併用剤、予防剤あるいは術後回復促進剤としての薬
剤用途が期待される。

以上の免疫賦活回復機能の他にも、免疫調節剤は異常に
先進した生体免疫反応を正常化し、たとえばリウマチ、
膠原病、アレルギー等の自己免疫疾患にも適用できる場
合が考えられる。

（３）感染防御活性について 生体の細菌による感染症に対する防御作用としては、侵
入細菌に対する抗体産生による、いわゆる体液性免疫作
用によるものと、マクロファージやＴ細胞が侵入細菌と
斗う、いわゆる細胞性免疫によるものがあることが知ら
れている。一般には生体はこれら異種細菌の侵入に対し
ては充分な防御作用を持っているが、担癌状態、特に癌
の末期には著しく防御作用が低下することが知られてお
り、通常宿主と共生している非病源菌によってさえ重篤
な結果を招来することが知られている。

そこでＲＩＮ物質が、：れらの細菌の感染症に対して宿
主の防御活性を増強するかどうか、体液性免疫が関与す
るといわれる代表的感染菌である工び細胞性免疫が関与
するといわれるリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓ
ｔｅｒｉａ　　ｍｏｎｏｃ　ｔｏ　ｅｎｅｓ）感染に対
するＲＩＮ物質の効果を調べた。

７週令メス、平均体重２６ｇのＩ　ＣＲ−ＣＲＪマウ嘉
群。。Ｉ２！、ずつ用い、生理食塩水、溶解、え。

ＩＮ物質を１０〜１００■／ｋｇ（対照群は生理食塩水
のみ）マウスの背中皮下に細菌感染１日前、１日後に各
１回投与した。エシェリヒア・コリの場合は２Ｘ１０’
個を背中皮下Ｋ、リステリア・モノサイトゲネスの場合
は２Ｘ１０’個を腹腔内に感染させ、それぞれ１週間観
察して、生残マウス数を比較した。防御効果は次式によ
り算出した。

結果は下表に示す通りであり、ＲＩＮ物質の１０〜１０
０■／　ｋｇの事前投与により、エシェリヒア・コリ感
染に対しては非常に強い防御作用が生じ、リステリア・
モノサイトゲネス感染に対しても有意な防御作用の増強
効果がみられた。また、感染後投与の場合でも、両感染
菌に対して存意な治療効果を示した。

後述するようＫ、ＲＩＮ物質は毒性が全く見られない点
とも合わせて、極めて有効な感染症予防治療剤となりう
ると考えられる。

次Ｋ、ＲＩＮ物質の急性毒性について言及する。

５週令オスの５Ｄ−ＣＲＪ　　ラット、体重１２０〜ろ
、金側死亡例がなく体重増加も対照と変わらず、しかも
外観上や剖検上も全く異常が認められなかった。したが
って、Ｌ　Ｄｉｏ＞１５ｇ　／　ｋｇと考えられ、急性
毒性はないものと判断される。

このように優れた抗腫瘍活性、免疫調節活性。

感染防御活性を示す多糖体ＲＩＮ物質が比較的容易な操
作の組み合わせにより下記製造例に示されるように大量
に得られるので、米糠から生理活性多糖を工業的に製造
する技術上に与える効果は非常に大なるものである。

さらＫ、インターフェロン誘起能がみられることからヘ
ルペス、インフルエンザ等のウィルス性疾患に対する予
防治療効果が期待できる。

ＲＩＮ物質は経口的または非経口的に投与できるので、
極めて存用な抗腫瘍剤、免疫調節剤あるいは感染症予防
治療剤として期待される。

なお、実際の製剤化については、本物質を単独で、ある
いは賦形剤（水、生理食塩水、ポリエチレングリコール
、グリセロゼラチン、澱粉、デキストリン、乳糖など）
と組み合わせて水剤、丸剤。

錠剤、散剤、半量などの剤型にて製造することができる
。

次Ｋ、本物質の製造を以下の製造例によって説明する。

製造例１ 市販の米糠を用い篩で砕米等を除いたもの２５ｋｇに水
道水１２５／を加え、１２０’ｃで１時間、その後さら
に１００℃で５時間加熱し攪拌しながら抽出を行なった
。

抽出液を濾過後、４ＯＮに減圧濃縮し、水酸化ナトリウ
ムでｐＨを６．７とした後、５ｏｏ■のα−アミラーゼ
（長潮産業製）を加え、７０’Ｃで１時間酵素処理を行
なった。反応後、１００　’Ｃまで加熱し酵素を失活さ
せ、遠心分離により不溶物を除去し、最終濃度が３０％
（Ｖ／Ｖ）となるようにエタノールを加えて、生じた沈
でんを分離した０分離後、水に溶解せしめて不溶物を除
き、凍結乾燥を行なっタトころ、５０８ｇの淡黄色粉末
を得た。この淡黄色粉末４ｇを再度イオン交換水に溶が
し、不溶物を遠心分離で除去した後、セファローズＣＬ
−６Ｂ（ファルマシア製）によりゲル濾過し、そのボイ
ドボリュームに溶出された両分を集め、さらにこの両分
を陰イオン交換体ＤＥＡＥ−セファローズＣＬ−６Ｂ　
（ファルマシア製）のカラムにかけて吸着させた。これ
に０．１規定の食塩水を通すことによって溶出する両分
を集めて濃縮後、脱塩のため蒸留水に対して２日間透析
を行ない、内液を凍結乾燥して白色粉末２００■を得た
。

製造例２ 市販の米糠２５ｋｇをヘキサン１００　Ｎで還流脱脂し
たのち乾燥した米糠を製造例１と同様の方法で抽出回収
処理して淡黄色粉末４５０ｇを得た。この粉末４ｇを用
いて製造例１と同様の方法で処理して２００　Ｎの白色
粉末を得た。

製造例３ 市販の脱脂ＩＮ３　ｋｇに水２０ｊ！を加え攪拌しなが
ら１２０℃で２時間加圧加熱下で抽出した。抽出液を減
圧濃縮して得た５Ｅの濃縮液に結晶α−アミラーゼ（長
潮産業製）０．３ｇを加えて６０℃で５時間保持した。

しかる後、１００℃に加温した後、遠心分離して上清４
，９　Ｊを得た。この上清にエタノールを加えてエタノ
ール濃度４０％とし、生じた沈でんを分取した０次いで
、これを凍結乾燥して淡黄褐色粉末８８ｇを得た。。

この粉末４ｇを用いて製造例１と同様に処理して１９０
■の白色粉末を得た。

製造例４ 市販の米Ｗ２０ｋｇを３０メツシユの篩でふるって砕米
等の夾雑物を除去した後、イオン交換樹脂で処理した水
道水１００１で洗浄した。次いで、洗浄した米糠に蒸留
水５ＯＮを加え攪拌しながら１１０℃で３時間加圧加熱
下で抽出した後、濾過した。得られた濾液を減圧Ｂ縮し
、さらに遠心分離して上清１０１を得た。この上清に結
晶α−アミラーゼ２５０　Ｎを添加し、６５℃で２４時
間作用せしめた後、１００℃に加温した。次いで、エタ
ノチル濃度３０％になるようにエタノールを加え生じた
沈でんを遠心分離によって採取した。この沈でんに水３
１を加えて溶解した後、遠心分隔を行なって上清を得た
。この上滑を１１１となるまで減圧濃縮し、さらに遠心
分離して上清を得、これを流水に対して２日間透析し、
遠心分離を行なって上ｆＲＬｌを得た。

この上清１１に陰イオン交換体ＤＥＡＥ−セファローズ
ＣＬ−６Ｂを３００ｇ加え室温で１時間ゆっくり攪拌し
た後、遠心分離にて陰イオン交換体を集め、一度蒸留水
で洗浄した後、０．１規定の食塩水ｌＩｌに加え室温で
１時間ゆっくり攪拌して吸着物を溶出した。その後、遠
心分離して陰イオン交換体を除き、上清を濃縮、凍結乾
燥して白色粉末５０ｇを得た。

製造例５ 製造例４で透析後遠心分離して得られた上滑ｌβに活性
炭１０ｇを加え、３０分後に遠心分離を行ない上清を得
た。この上清を製造例４と同様の方法でイオン交換処理
および凍結乾燥処理を行なって白色粉末３０ｇを得た。

製造例６ 製造例４で透析後遠心分離して得られた上清１１のうち
２０ｍｊ！をセファローズＣＬ−６Ｂ　（ファルマシア
製）でゲル濾過し、そのボイドボリューム画分を集めて
１００ｍ　ｌとした。この液を製造例１と同様にイオン
交換処理および凍結乾燥処理を行なって白色粉末５００
■を得た。

製造例７ 製造例１でα−アミラーゼ処理物をエタノール沈でんさ
せて得られた沈でん物を再び１０２の水に溶解し、分画
分子量８万のウルトラフィルター膜を用いて低分子画分
を除去すると同時に３１になるまで濃縮し、生じた沈で
んを遠心分離して除去し、８１の上清を得た。この上清
３０ｍ１！を製造例１と同様にイオン交換処理および凍
結乾燥処理を行なって１２０　ｍｇの白色粉末を得た。

製造例８ 製造例１でα−アミラーゼ処理し１００℃で１時間加熱
して酵素を失活させた液Ｋ、最終濃度４０％（Ｖ／Ｖ）
となるようにアセトンを加え、生じた沈でんを１０１の
水に溶解した。以後、製造例７におけるウルトラフィル
ター膜を用いた処理以後の工程を行ない１５０■の白色
粉末を得た。

製造例９ 製造例１でα−アミラーゼ処理し１００℃で１時間加熱
して酵素を失活させた液Ｋ、飽和度７０％になるように
硫酸アンモニウムを加えて塩析を行ない、生じた沈でん
を遠心分離で集め３１の水に溶解し、流水に対して２日
間透析を行なった。この透析内液にトリクロル酢酸を濃
度７％になるように添加して沈でんを生ぜしめ、生じた
沈でんを遠心分離で除去し、上清を再び流水に対して２
日間透析し、透析内液を凍結乾燥して淡黄色粉末５０３
ｇを得た。この粉末４ｇをイオン交換水に溶解し、以下
製造例１と同様にゲル濾過、イオン交換および凍結乾燥
を行ない白色粉末１００　ｍｇを得た。

製造例１０ 製造例１でα−アミラーゼ処理を行なった液をそのまま
４０°Ｃまで下げ、蛋白分解酵素（プロナーゼＥ、科研
化学製）６００■を加えて２４時間反応させた。反応液
を１００　℃で１時間加熱して酵素を失活させた後、遠
心分離して不溶物を除去した上滑Ｋ、最終濃度３０％（
Ｖ／Ｖ）となるようにエタノールを加え、生じた沈でん
を遠心分離で集め、１゜ｌの水に溶解した。以後、製造
例７におけるウルトラフィルター膜を用いた処理以後の
工程を行ない白色粉末１５０■を得た。

製造例１１ 製造例８と同様の工程を経て得られたウルトラフィルタ
ー膜処理上清３１に陰イオン交換樹脂アンバーライトＩ
Ｒ−４Ｂ　（ＯＨ型）を５０（ｌ　ｇ加、ｔ、室温で１
時間攪拌した後、樹脂を濾別し、この樹脂を１βの蒸留
水で洗浄し、次いで０．１規定の食塩水２１に加えて、
室温で１時間攪拌して吸着物を溶出せしめ樹脂を濾別し
た。このようにして得られた上清２１を凍結乾燥して白
色粉末１５ｇを得た。

製造例１２ 製造例１１でイオン交換処理を行なった上澄液に最終濃
度が４０％（Ｖ／Ｖ）となるようにエタノールを加え、
生じた沈でんを遠心分離で集め、さらに３回エタノール
で洗浄・脱水した後、真空乾燥して白色粉末１３ｇを得
た。

製造例１３ 製造例１と同様にして製造した白色粉末２ｇに２％の硫
酸−ギ酸混液１００ｍ　ｌを加え、６０℃で４時間加水
分解を行なった。分解液に炭酸バリウムを加えて中和し
、遠心分離にて上澄液を得、この半量をセファローズＣ
Ｌ−２Ｂのカラムにかけてゲル濾過を行ない、ボイドボ
リュームに溶出する画分Ｆｌ　　（分子量２，０００万
以上）、中間分子量約１００万の画分Ｆ２を得た。また
、残り半量をセファデックスＧ−２００にかけ中間分子
量約１０万、約１万の画分Ｆ、、Ｆ４を得た。それぞれ
の百分を凍結乾燥してＦ＋　　：３８０　ｍｇ、　　Ｆ
ｚ　　：２５５　ｍｇ、　　Ｆｓ　　：２１Ｅｍ　ｇ　
＋　　Ｆ　ａ　　：　２５５　ｍ　ｇの白色粉末を得た
。

それぞれの百分の生理活性を「発明の詳細な説明」の項
で述べた方法に従って調べた結果は次の通りであり、い
ずれの両分にも加水分解前のサンプルに劣らない活性が
あることが判明した。その詳細は下記に示す通りである
。

（１）抗腫瘍活性について 同系腫瘍メス−Ａに対する投与１１ｆｔ３０■／ｋｇ、
経ロ投与での効果は次表の通りであった。

（２）免疫調節活性について （イ）カーボンクリアランステスト（ＣＣＴ）担癌マウ
スを用い投与ｆｆ１３０■／ｋｇ、腹腔投与での効果は
次表の通りであった。

（ロ）プラークフォーミングセル（Ｐ　Ｆ　Ｃ）正常マ
ウスを用い投与量３０■／ｋｇ、Ｉｔ！腔投与で４日目
に羊赤血球で感作した場合の結果は次表の通りであった
。

（ハ）遅延型皮膚反応（ＤＩＲ） 担癌マウスを用い投与量３０ＩＩｖ／ｋｇ、腹腔投与で
の結果は次表の通りであった。

（３）感染防御活性について 感染１日前に３０■／　ｋｇを皮下投与した場合の防御
活性は次表に示す通りであった。

また、感染１日後に３０■／　ｋｇを皮下投与した場合
の防御活性は次表に示す通りであった。

製造例１４ 製造例１と同様にして製造した白色粉末１ｇをセバーク
法による除蛋白操作、すなわち１００　　ｍｊ！のイオ
ン交換水に溶解させ、クロロホルム、０　）ｍ　ｊ！　
。

ｎ−ブタノール４　ｍｊ＋とともに分液濾斗を用いて６
０分間振とうし、低速で遠心すると、水層とクロロホル
ム層の間に変性蛋白質の白い層ができた。

水層部分を取出し、再び同比率のクロロホルム右よびｎ
−ブタノールを加えて振とうした。この操作を変性蛋白
質の白い層が出なくなるまで約３０回繰返した後、水層
部分を凍結乾燥させて完全除蛋白された白色粉末１３２
０■を得た。

この物質の元素分析の結果は炭素４、４％、水素６、．
５％、灰分３．Ｏ′％で、あった、また、その１％水溶
液の呈色反応については、アンスワン硫酸反応。

フェノール硫酸反応およびクロモトロープ硫酸反応が腸
性でありヘビューレフト反応、ローリ−・フォーリン反
応、エルソン・モルガン反応およびヨード反応がそれぞ
れ陰性であった。

この物質について抗腫瘍活性等の生理活性を調べたとこ
ろ、製造例１３の１１画分と同等であった。

【図面の簡単な説明】

第１メルよ多糖体ＲＩＮ物質の紫外部吸収スペクトル、
第２図は同物質の赤外部吸収スペクトル、第３図は同物
質の”Ｃ−ＮＭＲスペクトルである。 特許出願人　サッポロビール株式会社 ダイセル化学工業株式会社 第１図 （ｎｍＪ 第２図 ４ｋ ま数（ｃｍＪ 手続辛甫正吉（白心） 昭和６０年！１月７　日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、グルコースを唯一の糖構成成分とし、α結合のみか
   ら成り、下記に示す繰返し単位および諸性質を有する新
   規多糖体ＲＩＮ物質。 （１）繰返し単位： ▲数式、化学式、表等があります▼および／または▲数
   式、化学式、表等があります▼ （但し、Ｇはα−Ｄ−グルコピラノシル基を示し、ｎ＋
   ｎ′＝４である。） （２）透析膜を通過しない （３）アルコール、アセトン、ヘキサン、ベンゼン、酢
   酸エチル、四塩化炭素、クロロホルムおよびエーテルに
   不溶であり、水、ホルムアミドおよびジメチルスルホキ
   シドに可溶である （４）１％水溶液は中性である （５）少量の無機質（Ｓｉ、Ｐ、Ｋ、Ｎａ、Ｃａ、Ｍｇ
   、Ｃｌなど）を結合状態で含有する （６）比旋光度：〔α〕＾２＾０＿Ｄ＝＋１４２°〜＋
   １４５°（Ｈ＿２Ｏ）（７）融点：明確な融点を示さず
   、２２０℃で褐変し、２８０℃で黒変して炭化する （８）第１図に示す紫外部吸収スペクトルを示す（９）
   第２図に示す赤外部吸収スペクトルを示す（１０）第３
   図に示す＾１＾３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す２、米糠
   を熱水抽出して得られる抽出液に極性有機溶媒または塩
   析剤を加え、生じた沈澱を分取し、必要に応じて精製処
   理を行なうことを特徴とする、グルコースを唯一の糖構
   成成分とし、α結合のみから成り、下記に示す繰返し単
   位および諸性質を有する新規多糖体ＲＩＮ物質の製造法
   。 （１）繰返し単位： ▲数式、化学式、表等があります▼および／または▲数
   式、化学式、表等があります▼ （但し、Ｇはα−Ｄ−グルコピラノシル基を示し、ｎ＋
   ｎ′＝４である。） （２）透析膜を通過しない （３）アルコール、アセトン、ヘキサン、ベンゼン、酢
   酸エチル、四塩化炭素、クロロホルムおよびエーテルに
   不溶であり、水、ホルムアミドおよびジメチルスルホキ
   シドに可溶である （４）１％水溶液は中性である （５）少量の無機質（Ｓｉ、Ｐ、Ｋ、Ｎａ、Ｃａ、Ｍｇ
   、Ｃｌなど）を結合状態で含有する （６）比旋光度：〔α〕＾２＾０＿Ｄ＝＋１４２°〜＋
   １４５°（Ｈ＿２Ｏ）（７）融点：明確な融点を示さず
   、２２０℃で褐変し、２８０℃で黒変して炭化する （８）第１図に示す紫外部吸収スペクトルを示す（９）
   第２図に示す赤外部吸収スペクトルを示す（１０）第３
   図に示す＾１＾３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す３、グル
   コースを唯一の糖構成成分とし、α結合のみから成り、
   下記に示す繰返し単位および諸性質を有する新規多糖体
   ＲＩＮ物質を有効成分とする抗腫瘍剤。 （１）繰返し単位： ▲数式、化学式、表等があります▼および／または▲数
   式、化学式、表等があります▼ （但し、Ｇはα−Ｄ−グルコピラノシル基を示し、ｎ＋
   ｎ′＝４である。） （２）透析膜を通過しない （３）アルコール、アセトン、ヘキサン、ベンゼン、酢
   酸エチル、四塩化炭素、クロロホルムおよびエーテルに
   不溶であり、水、ホルムアミドおよびジメチルスルホキ
   シドに可溶である （４）１％水溶液は中性である （５）少量の無機質（Ｓｉ、Ｐ、Ｋ、Ｎａ、Ｃａ、Ｍｇ
   、Ｃｌなど）を結合状態で含有する （６）比旋光度：〔α〕＾２＾０＿Ｄ＝＋１４２°〜＋
   １４５°（Ｈ＿２Ｏ）（７）融点：明確な融点を示さず
   、２２０℃で褐変し、２８０℃で黒変して炭化する （８）第１図に示す紫外部吸収スペクトルを示す（９）
   第２図に示す赤外部吸収スペクトルを示す（１０）第３
   図に示す＾１＾３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す４、グル
   コースを唯一の糖構成成分とし、α結合のみから成り、
   下記に示す繰返し単位および諸性質を有する新規多糖体
   ＲＩＮ物質を有効成分とする免疫調節剤。 （１）繰返し単位： ▲数式、化学式、表等があります▼および／または▲数
   式、化学式、表等があります▼ （但し、Ｇはα−Ｄ−グルコピラノシル基を示し、ｎ＋
   ｎ′＝４である。） （２）透析膜を通過しない （３）アルコール、アセトン、ヘキサン、ベンゼン、酢
   酸エチル、四塩化炭素、クロロホルムおよびエーテルに
   不溶であり、水、ホルムアミドおよびジメチルスルホキ
   シドに可溶である （４）１％水溶液は中性である （５）少量の無機質（Ｓｉ、Ｐ、Ｋ、Ｎａ、Ｃａ、Ｍｇ
   、Ｃｌなど）を結合状態で含有する （６）比旋光度：〔α〕＾２＾０＿Ｄ＝＋１４２°〜＋
   １４５°（Ｈ＿２Ｏ）（７）融点：明確な融点を示さず
   、２２０℃で褐変し、２８０℃で黒変して炭化する （８）第１図に示す紫外部吸収スペクトルを示す（９）
   第２図に示す赤外部吸収スペクトルを示す（１０）第３
   図に示す＾１＾３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す５、グル
   コースを唯一の糖構成成分とし、α結合のみから成り、
   下記に示す繰返し単位および諸性質を有する新規多糖体
   ＲＩＮ物質を有効成分とする感染症予防治療剤。 （１）繰返し単位： ▲数式、化学式、表等があります▼および／または▲数
   式、化学式、表等があります▼ （但し、Ｇはα−Ｄ−グルコピラノシル基を示し、ｎ＋
   ｎ′＝４である。） （２）透析膜を通過しない （３）アルコール、アセトン、ヘキサン、ベンゼン、酢
   酸エチル、四塩化炭素、クロロホルムおよびエーテルに
   不溶であり、水、ホルムアミドおよびジメチルスルホキ
   シドに可溶である （４）１％水溶液は中性である （５）少量の無機質（Ｓｉ、Ｐ、Ｋ、Ｎａ、Ｃａ、Ｍｇ
   、Ｃｌなど）を結合状態で含有する （６）比旋光度：〔α〕＾２＾０＿Ｄ＝＋１４２°〜＋
   １４５°（Ｈ＿２Ｏ）（７）融点：明確な融点を示さず
   、２２０℃で褐変し、２８０℃で黒変して炭化する （８）第１図に示す紫外部吸収スペクトルを示す（９）
   第２図に示す赤外部吸収スペクトルを示す（１０）第３
   図に示す＾１＾３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す