JPS61502584A - 微量化学試験および微生物学試験を行なうための方法および材料 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、微量化学試験および微生物試験を行なうための方法および材料に関す るものであり、特に少量の亜硝酸塩生物による。たとえば培地に供給した硝酸塩 （ｎｉｔｒａｔｅ）の還元による亜硝酸塩の生成を検出するためのこの種の試験 の適用に関するものである。

少量の亜硝酸塩に関する充分確立された試験は、グリース試験として知られてい る。この試験は、亜硝酸塩を含有すると思われる水性物質を強酸溶液（たとえば ５Ｎ酢酸）中のｐ−アミノベンゼンスルホン酸で処理しかつ同様に強酸溶液中の α−ジメチルアミノナフタレンで処理することに基づいている。

この試験では亜硝酸塩が存在すると赤色染料の色を呈するが。

亜硝酸塩を含有しない試料に対してこの試験を行なうと発色しない。

この試験は、細菌の糧をその培養および化学特性により同定しかつ分類するため の技術の１部としてム＜応用されており。

その形態において多（の臨床微生物実験室において使用されている。さらに、こ の試験を使用して他の試料、１ことえば公衆衛生実験室において分析すべき水試 料に含まれる微量の亜硝酸塩を検出することもできる。

現状では、この試験は一般に発色の肉眼評価を必要とし、しかも若干有害でかつ 公知の発癌物質に化学的に近縁の２種の芳香族アミン試薬を使用しかつ取扱う。

本発明の目的は、結果として得られる試験物質の螢光によって測定しうる亜硝酸 塩）試験を提供することである。また本発明の目的は、特にたとえば恐ら〈従来 は化学的に無関係であった別の微生物試験におけると同様な励起波長および放出 波長を使用する（したがって類似のまたは同じ装置を用いて同時にすなわち同じ バッチで測定し５る）螢光定量法による自動螢光定量測定に適した形態の螢光結 果を示しうる試験を提供することである。さらに本発明の目的は、微生物培養ｉ の〆硝酸（塩）還元能力を測定してたとえばその同定に役立たせる微生物学的用 途に適合し１発色結果を検定するだめの有毒試薬の使用を最小化しまたは回避す る亜硝酸（塩）検出試験を提供することである。

本発明によれば、少量の亜硝酸（＠）を含有している可能性のある試料、特にた とえば、適度に亜硝酸（塩）を含有しない硝酸（塩）の存在下でもし起こるなら ば硝酸（塩）を還元しうる期間にわたり培養した微生物の懸濁物もしくは培養′ Ｊｍ％または地下水のような水性試料中の亜硝酸Ｃ塩）を検出するために。

この試料を、実質的に螢光に寄与するアミノ基を含有−１，＃：酸に安定な完壁 元口（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒ）少量と酸（性）条件下で従触させて１完壁元口の アミン基と存在するあらゆる亜硝酸（塩〕との間の反応を酸（性）条件下で生ぜ しめ、この反応の結果として完壁元口の螢光に現われる変化によって亜硝酸（塩 ）の存在または量を検定する。

本発明による。接種試料中の硝酸（塩）還元微生物の存在を検出するだめの微生 物培養試験法は、 １＠１　適切に亜硝酸（堰）を含有しない硝酸（塩）の存在下で。

硝酸（塩）を亜硝酸（塩）に還元する能力を有する何らかの微生物（もし存在す れば）が硝酸（塩）を還元するのに充分な期間（たとえば１〜６時間）にわたっ て試験すべき微生物を培養し。

ｉｂｌ　培養後の培地をアミノ含有完壁元口（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒ）の存在下 で（ジアゾ化用）酸性条件に露出させることにより、培地中に存在するあらゆる 亜硝酸（塩）の程度まで完壁元口をジアゾ化させて、前記アミノ含有の完壁元口 よりも実質的に螢光性の低い（または実質的に異なる波長で螢光を発する）ジア ゾニウム誘導体（またレエこれからさらに反応が進んだ生成物）を生成させ。

ｌｃｌ　工程（ｂｌで処理された培地の螢光を測定することによつ℃。

硝酸（塩）還元微生物の存在下での螢光の減少を示す（記録する〕 ことからなる。

好ましくを工、発蛍光団（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒ）はそれ自身酸性条件下で螢光 を発するが、亜硝酸（塙・）との酸性反応生成物は酸性条件下でほとんど螢光性 がないようなものであり、かつ生成物がまだ酸性条件下にある間に螢光を評価ま たは測定する。

本発明に使用しうる発蛍光団（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒ）の適する例は。

クマリンもしくはフラボンのアミノ誘導体、たとえば７−アミノクマリン（また は３−アミノ−フラボン）、特にたとえば７−アミノ−４−メチルクマリン（以 下ＭＣＡと云う）である・この試験は、添加したアミン試薬と酸性条件下で亜硝 酸（塩゛λの存在下試験中に形成される対応のジアゾニウム誘導体との間の螢光 の差を利用すると思われる。

ジアゾ化用の酸性条件は、試験すべぎ試料と発蛍光団（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒ） との水性混合物をたとえば塩酸もしくは酢酸のような強酸もしくは中程度の強酸 の２Ｎ−３Ｎの濃度まで酸性化して達成することができる。

亜硝酸（塩）を検出するための上記方法を使用する硝酸（堰）還元のための微生 物試験において、適する条件はたとえば次の１ａ当り約１０７個の微生物（最終 濃度）と、さらに下記する最終濃度の成分とを含有する微生物接種物を作成する ：オキソ１ド（Ｏｘｏ　ｉ　ｄ）栄養プロス４２（商標）２ｓｇ／ｌ硝酸カリウ ム（亜硝酸塩を含有しない）　１９７１塩化ナトリウム　８．５９／Ｉ ＭＣＡ（７−アミノ−４−メチルクマリン）　１５ｕＭ（Ｚ６４〜／ｌに相当） 。

各試験試料では１００　ｕｌの基準量を処理するのが便利であ机 勿論、培地中（プロス）に存在する他の物質および他の試薬は、ジアゾ化反応の 進行とは無関係に関連する螢光を消光しないよ５なものから選択される。

この接種物と培地試薬との混合物を３７℃にて約１時間〜約６時間にわたり培養 （インキュベーション）し、次いで５Ｎ酢敵浴液を滴下して酸性化させる。

さらに短時間の後、試験混合物の螢光を対照混合物の螢光と比較し、螢光の実質 的減少を調べて微生物が硝酸塩を還元することにより生成した亜硝酸塩の存在を 示すことができる。

試験混合物を６時間よりずっと長く、たとえば約１８時間にわたって１晩培養す れば、成る池の硝酸塩遺児微生物は亜硝酸塩をさらに還元（ｄｅｎｉｔｒｉｆ） ’）　して窒素にまですることがある。

このような場合、この試駆で得られる螢光の低下は亜硝酸塩の存在を示さない。

しかしながら、従来の試験と同様に、これらの脱窒（ｄｅｎｉｔｒｌｆｙ）性徴 生物は、測定によって亜硝酸塩が存在しないことか確かめられた後に、それ自身 硝酸塩を亜硝酸塩に還元する還元剤（たとえば酸性条件下における亜鉛粉末）を 酸塩を亜硝酸塩まで還元すると、特徴的な螢光の低下を示すであろう。外部から 還元剤を添加した後にもこの試験が螢光の低下を示さなければ、これは硝酸塩と これから生成された亜硝酸塩との両者が消費された。すなわち脱室性微生物の作 用により消費されたことを示す。

しかしながら、この試験を実施する好適方法は、約１〜６時間のみ接２＋！混合 物を培養することであり、このような短時間においては脱窒性微生物でさえそれ までに生成した亜硝酸塩を除去することがないことが判る。すなわち、これら条 件下において、脱窒性および非脱窒性の両硝酸塩還元微生物（レデューサ−）ハ 同様な亜硝酸陽性結果を与える。

ここに記載した試験の幾つかの具体例を実施する際、酸性試験混合物をその螢光 の測定もしくは評価の前に再アルカリ化す避するのが推奨されると思われる。

上記の説明から判るように、本発明は亜硝酸塩の検出もしくは評価法および微生 物における硝酸塩還元の性質の検出方法を提供する。さらに本発明は、これら試 験を実施するだめの材料をも包含する。特に、これら材料は、たとえば上記した ような酸性化試薬と組合せて使用する。適当量（たとえば上記に詳細に示した伊 ）の硝酸塩（殆んど亜硝酸塩を含有しない）とアミノ含有完壁元口（ｆｌｕｏｒ ｏｐｈｏｒ）とを（通常の微生物培地成分の他に）含有する微生物培地（プロス ）から構成することができる。所望により、示した培地成分〔または必須の硝酸 塩と任意の発蛍光団とを含めて選択した成分〕を、微生物培養試験を実施するの に使用する既製（一般に殺菌済）のマイクロタイタートレイ（一般に着脱自在な 接着性封止カバーで保護されている）な具体例を使用することができろ。代案と しての乾燥形態は、の、たとえはこれら材料の乾燥調製物を内部に官有する−ま たはその他の容器。或いは、この糧の壜の蓋、たとえばねじ蓋の形態があり、そ の表面には前記材料の乾燥調製物が担持されており、この表面は使用に際し材料 が全体に分散されるように接種物と接触する。たとえばねじ蓋の内面またはねじ 蓋内に設けたパツキン（ｗａｄ）の表面である。また或いは、この種の接種物へ または培養ウェルへ添加するのに適したキャリヤ材料に担持された乾燥状態があ り、これら材料は接種物または培養懸濁物全体に分散されるようになっており、 このキャリヤとしてはたとえば紙やその他のセルロース質または非セルロース質 で繊維質もしくは非繊維質のキャリヤシート材料の帯片（ストリップ）または円 盤（ディスク）がある。

この棟の調製物は全て、使用前たとえば無菌の封止用ホイルまたは包装材料中に 封入して乾燥状態および無菌状態に維持するのが望ましい。

ここに記載した方法の格別の利点の１つは、硝酸塩還元試験によって、種々異な る螢光結果を示す他の多（の（それ自体公知）の微生物培養試験（たとえば釉に の量ｆたは種類の抗生物質の存在下）と同じ励起／放出波長にて光学測定しつる 螢光透視／螢光定量の結果が得られることである。このような微生物培養試験と はたとえば、４−メチルウンベリフェロンホスフェートまたはその他のエステル および／またはアミノアシルもし、　旨ど′ （はペプチジル７−ア（ノーメチルクマリンのような完壁光性基質（ｆｌｕｏｒ ｏｇｅｎｉｃ　５ｕｂｓｔｒａｔｅ）が、もし増殖が起これば微生物の増殖の際 に１完壁元口（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒ）まで加水分解されるような培養試験であ る。

したがって、硝酸塩還元試験のための培養およびこの埒の抗生物質培養試験を含 む組合試験も本発明の範囲内に包含される。

上記開示を読めば１本発明の範囲内における他の改変および変更は当業者に明ら かであり、かつ例として示した幾つかの特徴は所望の任意の組合せで得ることが できろ。

国際調査報告 ＡＮＮＥＸ　Ｔｏ　ｒａ　ＺＮＴＥＲＮＡＴｒＯＮＡＬ　５ＥＡＲＣＨＲＥＰＯ ＲＴ　ｕＮ

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．（ａ）試験すべき微生物を、適切に亜硝酸塩を含有しない硝酸塩の存在下で 、硝酸塩を亜硝酸塩に還元する能力を有する微生物が（もし存在すれば）硝酸塩 を還元するのに充分な時間（たとえば１〜６時間）にわたり培養し、（ｂ）培養 後の培地をアミノ含有発螢光団の存在下で（ジアゾ化用）酸性条件に露出させる ことにより、培地中に存在するあらゆる亜硝酸塩の程度まで発螢光団をジアゾ化 させて、前記アミノ含有発螢光団上りも実質的に螢光性の低い（または実質的に 異なる波長で螢光を発する）ジアゾニウム誘導体（またはさらに反応した生成物 ）を生成させ、（ｃ）工程（ｂ）で処理された培地の螢光を検定することによつ て硝酸塩還元性微生物の存在下での螢光の減少を示すことからなる、接種試料中 の硝酸塩還元性微生物の存在を検出するための微生物培養試験法。
2. ２．発螢光団が螢光性アミノクマリンである請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．発螢光団が７−アミノ−４−メチルクマリンである請求の範囲第２項記載の 方法。
4. ４．微生物を、亜硝酸塩を含有しない硝酸カリウムの存在下で培養する請求の範 囲第１項、第２項または第３項記載の方法。
5. ５．工程（ｂ）の（ジアゾ化用）酸性条件を、たとえば塩酸もしくは酢酸のよう な酸を約２Ｎ〜３Ｎ）の範囲の酸濃度を与えるように培養物へ添加して生ぜしめ る請求の範囲第１項乃至第４項のいずれかに記載の方法。
6. ６．培地の螢光を、工程（ｂ）で設定した酸性条件下で検定する請求の範囲第５ 項記載の方法。
7. ７．通常の微生物培地成分（適切に亜硝酸塩を含有しない）の他に、硝酸塩およ びジアノ化しうるアミノ基を含有する発螢光団とを含み、この発蛍光団はジアゾ 化後に酸性条件下で検定すると発螢光団よりも低いまたは異なる螢光を有する生 成物を生成しうる、請求の範囲第１項記載の培養試験法を実施するのに適した微 生物培養試験培地。
8. ８．＆発螢光団が螢光性アミノクマリンである請求の範囲第７項記載の微生物培 養試験培地。
9. ９．発螢光団が７−アミノ−４−メチルクマリンである請求の範囲第８項記載の 微生物培養試験培地。
10. １０．接種懸濁物を調製するための複数の受器（ｒｅｃｅｐｔａｃｌｅｓ）およ び／または容器を備え、これら受器または容器の１個もしくはそれ以上に培養試 験を実施するための試薬を乾燥状態で含有してなる既製試験トレイからなり、前 記試薬は亜硝酸塩を含有しない硝酸塩と、ジアゾ化後に酸性条件下で検定すると 発螢光団よりも低いまたは異なる螢光を有する生成物を生成しうるジアゾ化可能 なアミノ基含有発螢光団とからなる請求の範囲第１項記載の微生物培養試験を実 施するための既製乾燥試薬を含む試験キツト。
11. １１．上記の説明および実施例の幾つかの特徴に関し実質的に記載した微生物試 験法およびその材料。