JPH0773510B2

JPH0773510B2 - 微生物モニタリング装置

Info

Publication number: JPH0773510B2
Application number: JP4098368A
Authority: JP
Inventors: デヴィッド・ティー・スティット; グレゴリー・ジェイ・バレル; クゥオ−ユー・フー; ジェイムズ・エフ・モンソニー; ロバート・サピトウィッツ
Original assignee: ベクトン・ディッキンソン・アンド・カンパニー
Priority date: 1991-04-18
Filing date: 1992-04-18
Publication date: 1995-08-09
Anticipated expiration: 2010-08-09
Also published as: JPH05137596A; EP0509791A1; AU647609B2; CA2066329A1; US5567598A; DE69211895D1; CA2066329C; AU1482992A; DE69211895T2; EP0509791B1

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、液体または半固形培地
中に存在する微生物の存在の検出および微生物の代謝活
性を評価するための改良手段に関する。

【０００２】

【従来の技術】我々の環境は多数の微生物を包含し、我
々はそれらと継続的に相互作用している。これらの相互
作用は、例えばワイン、食酢または抗生物質を生産する
ための発酵の点では有益であり、ある場合には無害であ
り、あるいは感染性疾患の場合は有害でさえある。即ち
これら微生物の遍在性のため、そのような微生物の存在
または代謝活性の検出、同定および研究のための絶え間
ない要求が生じる。

【０００３】この２５年の間に微生物科学において顕著
な変化があったが、微生物の行動の同定および分析はい
まだ時間の浪費に終わっている。例えば、抗菌感受性試
験の分野においては、米国の病院のすべての試験のうち
のほぼ半分においてバウエル・カービーディスク法（Ｂ
ａｕｅｒ−ＫｉｒｂｙＤｉｓｃＭｅｔｈｏｄ）がい
まだに使用されている。この方法は、微生物の目に見え
る成長の存否により抗菌化合物の効果を示し、そして結
果を得ることができるまで微生物を生育させるために、
通常１８時間から２４時間を要する。そのような抗菌感
受性の情報を得るために必要な時間を短縮することが要
求される。

【０００４】抗菌感受性試験のための他の一般的な方法
は、培養液微生物希釈法、例えば生物の同定および抗菌
感受性試験のためのセプターシステム（ベクトンディキ
ンソン治療機器システムズ社、スパークス、ＭＤ）であ
る。このシステムは多数の低容積のクプラ（クプラあた
り計算上０．４ｍｌ）を有する使い捨てプラスチックパ
ネルを使用し、各々のクプラはクプラ表面上で乾燥させ
た、異なる試験化合物を含むかまたは濃度の異なる一つ
の試験化合物を含む。試験される生物は所望の試験培地
に懸濁され、そしてアリコートは試験パネルの個々のク
プラに到達する。パネル上で乾燥した溶剤で試料を溶解
し、次に生物が溶剤と相互作用を示しそして目に見える
成長が現れるのに十分なように、システムを一晩インキ
ュベートする（１８時間から２４時間）。次に、パネル
は成長の存否に関して視覚的に調べられ、それにより生
物がこうむる試験の感受性に関する情報が得られる。追
加のウエルは生物の同定の助けとなる。しかしながら、
この試験方法は長時間のインキュベーション時間をさら
に要する欠点を有する。

【０００５】インキュベート時間の短縮のための一つの
アプローチはコロニーの成長よりむしろ微生物の代謝活
性を監視することである。迅速でかつ正確にそのような
代謝活性を監視するための試みに関して、多くのアプロ
ーチが報告された。

【０００６】例えば、光散乱光学手段を利用する装置を
使用して、さまざまな抗微生物化合物の存在下で微生物
の大きさの変化または数を調べることにより感受性を決
定した。これらの法則を利用する市販の機器はバイテッ
クシステム（バイオメリュークスコーポレーション社）
に代表される。このシステムは多くの微生物と薬剤の組
み合わせについて、６時間以内で微生物の抗菌剤に対す
る感受性の情報が得られるとされている。他の組み合わ
せにおいては、生物の抗菌剤に対する感受性がこの機械
により決定できるまで１８時間以上を必要とする場合が
ある。

【０００７】さらに、バウエル・カービー法の修飾法が
開発され、４時間から６時間で特定の試料が読まれる。
しかしながら、そのようなシステムは破壊的性質を有
し、試験プレート上に発色色素の現像液をスプレーする
ことを必要とする。即ち、後で再インキュベートするこ
とおよび読み取ることが不可能であり、そして迅速な技
術に失敗すれば後の標準的評価のために実験を続けるこ
とができない。

【０００８】増殖している生物におけるＡＴＰの存在量
を基にした生物発光法において、特定の組成物に関して
は４時間半で抗菌感受性試験の結果が得られることが記
述された（ウイート（Ｗｈｅａｔ）ら）。しかしなが
ら、この方法はわずらわしくなりがちであり、広い適応
性は示されていなかった。

【０００９】他のアプローチは、ｐＨおよび／またはヘ
モグロビンの色の変化の測定、または液体試験培地の総
酸化還元の潜在能力に応答して色を変化させる染色液、
例えばトリフェニル−テトラゾリウムクロライドおよび
レゾアズリンの使用による微生物の酸素消費量の監視を
含んでいた。

【００１０】それら代謝マーカーとしての微生物による
溶解酸素の消費の監視が長年研究されてきた。例えば、
クリフトン（Ｃ．Ｆ．Ｃｌｉｆｔｏｎ）は、ワールブル
グフラスコを使用して１９３７年に数日間かかって微生
物の酸素消費を監視した。この方法は、遅くそして煩わ
しい方法で酸素濃度の変化を測定した。

【００１１】新しい電気化学的装置である「クラーク」
電極も溶解酸素の測定に通常使用される。不幸なこと
に、クラーク電極は使用中に酸素を消費し（それによっ
て微生物に利用される酸素を減少させる）、それゆえ、
電極が測定を干渉するのを防ぐため標準サイズの電極は
典型的には１００ｍｌ以上の体積を測定するためのみに
使用される。

【００１２】小型のクラーク電極が記述されているが、
この電極は複雑な多成分部品であり、やはり測定される
溶液と接触していなければならない。膜を透過できる酸
素を使用することにより、装置の電極成分が試験溶液の
成分と相互作用することを防ぐことができるが、それで
も酸素は試験溶液と測定システムとの間で平衡化しなけ
ればならず、それゆえ膜を越えると消費される。

【００１３】酸素濃度のデータを提供することができる
光学システムが開発されることにより、クラーク電極シ
ステムの欠点を克服した。そのような光学方法の主な利
点は、量的値の決定に必要な装置がそれ自体試験溶液と
物理的に接触しないことである。迅速でかつ再現性よく
実行される、酸素の測色分析および蛍光分析のための光
学技術は知られており、そしてそのような分析のコスト
はしばしば非常に低い。例えば、酸素の測定のための幾
つかの発光技術は記述されており、それらは酸素が、さ
まざまな化合物の蛍光発散または燐光発散を消す能力に
基づく。しかしながら、そのような方法は微生物の監視
に適用されなかった。

【００１４】微生物の存在、同定および抗菌感受性の情
報が８時間以下で提供される他のシステムが記述されて
いる。米国特許第４，２００，４９３号のウイルキンス
（Ｗｉｌｋｉｎｓ）とストーンズ（Ｓｔｏｎｅｓ）にお
いて開示されているシステムは、電極および高いインピ
ーダンスの電位差計を使用することにより微生物の存在
を測定する。ウイルキンス（Ｗｉｌｋｉｎｓ）らの米国
特許第３，９０７，６４６号において開示されている分
析法は、微生物の成長に伴う、フラスコ上部の空間の圧
力の変化を生物の検出および監視のために利用する。ア
ーネル（Ａｈｎｅｌｌ）の米国特許第４，２２０，７１
５号に開示されているシステムは、試験試料の上部の気
体を外部の酸素検出器に通すことにより微生物の存在を
測定する。アーネル（Ａｈｎｅｌｌ）の米国特許第４，
１５２，２１３号に開示されているシステムは、試験試
料上部の密閉空間内の生物を生育させて生じる真空を監
視することによる分析システムである。チャールズ（Ｃ
ｈａｒｌｅｓ）らの米国特許第４，１１６，７７５号
は、バクテリアの成長の検出および監視のために、生育
する生物の培養液の濁度または光学密度の増加に基づい
て光学手段を使用した例である。微生物を含む試験溶液
の複屈折の電気的測定および光学的測定の組み合わせが
ＥＰＯ００９２９５８（ロウ（Ｌｏｗｅ）とメルツアー
（Ｍｅｌｔｚｅｒ））において記述されている。

【００１５】広範囲の方法が微生物の検出および抗菌感
受性試験に応用されたことは明らかである。これらの方
法の多くは、この目的のための専用装置により監視する
ときにのみ有用なデータを提供することができる。即
ち、専用装置を必要とせずに微生物の存在および行動を
測定できるシステムの必要性がある。さらに、微生物の
習性を顕著に変えないよう、短時間で抗生物質のような
化合物の微生物試料への効果を測定するシステムの必要
性がある。

【００１６】

【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
目的は、液体または半固形培地中に存在する微生物の存
在の検出および微生物の代謝活性を評価するための改良
手段を提供することである。さらに、本発明の目的は、
単純に読み取ることができ、かつ視覚的に解釈でき、そ
して以前に達成された名目上の６時間以内よりも短時間
に結果が得られる微生物の監視装置またはシステムを提
供することである。さらに、本発明の目的は、専用の装
置を使用することなしに、酸素消費酵素または酵素系の
活性を検出および／または監視するための手段を提供す
ることである。

【００１７】

【課題を解決するための手段】上記および関連する目的
は本発明の方法により実現される。これらの方法は蛍光
検出系を使用し、その蛍光センサー化合物は酸素に暴露
したときに定量可能な程度のクエンチング（ｑｕｅｎｃ
ｈｉｎｇ）を示すものである。このセンサー化合物は試
験試料と共に接触させ（直接または酸素透過膜により分
離されて）、そして蛍光は適切な装置により測定または
視覚観察される。蛍光の増加は呼吸している好気的微生
物を示し、該微生物は試料中の酸素を利用（およびそれ
により減少）する。

【００１８】即ち、このシステムを使用することにより
さまざまな呼吸する微生物が検出される。さらに、この
システムを使用することにより酵素のような酸素依存性
組成物の存在が検出されることが認識される。

【００１９】本発明の方法は、呼吸している好気的微生
物の測定および／または検出のために、蛍光による測定
または視覚的な観察による、迅速で、容易で、かつ明瞭
な方法である。蛍光センサー化合物は蛍光を発する波長
を含む光で照射され、そして蛍光はあらゆる標準的な手
段により測定されるかまたは視覚的に評価される。

【００２０】蛍光化合物は、試験試料に見られる標準的
な濃度（通常は０．４％）の酸素に対する暴露と同時に
大きなクエンチングを示すものでなければならない。実
質的にはそのような化合物のあらゆるものが使用される
が、本発明の好ましい蛍光化合物はトリス−２，２’−
ビピリジルルテニウム（ＩＩ）塩、特にその塩化物の六
水化物（Ｒｕ（ＢｉＰｙ）₃Ｃｌ₂）、トリス−４，７−
ジフェニル−１，１０−ペナンスロリンルテニウム（Ｉ
Ｉ）塩、特に塩化物（Ｒｕ（ＤＰＰ）₃Ｃｌ₂）および
９，１０−ジフェニルアントラセン（ＤＰＡ）である。

【００２１】蛍光化合物は、試験試料の酸素と化学的流
通性をもたせて存在させることによりクエンチングを示
さねばならない。これは化合物を直接試料に接触して存
在させることにより実施されうる。しかしながら、好ま
しい態様においては、酸素透過性であるが、他の試料化
合物は相対的に透過させにくい膜の覆いの介在により化
合物と試料を互いに分離して、それにより試料と化合物
の相互作用を防ぐ。

【００２２】このシステムは、予め決定された量の時
間、未観察のまま相互作用させ、その後、蛍光の存否が
観察されそして適切な対照試料と比較されることによ
り、一回のそのような観察でしばしば得られる結果を生
じることができる。このシステムの特別な利点は、蛍光
の測定が非破壊的であり、そして一定時間後（例えば４
時間）に結果が確定されなくても、このシステムを後で
再びインキュベートし、そして再び読み取ることができ
ることである。さらに、結果は試薬対照と比較されるこ
とが認識されるが、そのような比較は絶対に必要ではな
く、そして蛍光化合物の適切な選択により、熟練した専
門家または技術者は、その結果が微生物の活性の存在を
示すか否かを対照を置かずに決定できると認識される。

【００２３】蛍光の強さの検出はそのような測定におい
て通常使用されているあらゆる手段、例えば蛍光計によ
り実施できる。別法として、蛍光の強さは視覚的に観察
でき、そして必要であれば試薬対照と比較される（例え
ば、生きた生物を含まないシステムまたは試験試薬を加
えないシステム）。即ち、この方法は、蛍光計を用いた
相対的活性の定量測定、または視覚による検査によりそ
のような活性のより定性的な評価を提供するために利用
できる。

【００２４】本発明の好ましい態様によれば、蛍光化合
物は酸素の存在下においてほとんどあるいはまったく蛍
光を発しないものの中から選択される。これは対照を必
要とせず、試験を行う人は感知されるあらゆる蛍光（即
ち、ごくわずかのバックグラウンドの蛍光以上のあらゆ
るもの）を微生物の活性の存在の指示として解釈するで
あろう。そのような結果は、蛍光計または他の測定器、
または好ましくは視覚による検査により得ることがで
き、そしてそのような活性の迅速な定性的評価が提供で
きる。この態様のための好ましい蛍光化合物はＲｕ（Ｂ
ｉＰｙ）₃Ｃｌ₂およびＲｕ（ＤＰＰ）₃Ｃｌ₂を含む。

【００２５】この試験は空中酸素から隔離されたシステ
ム内で行うことができるが、このシステムを空中酸素に
暴露したままでも正確な結果が得られうることもわかっ
た。事実、これは２時間以上生物がインキュベートされ
なければならず、さもなくば生物がシステム内のすべて
の溶解酸素を消費し、その結果間違った値を生じる傾向
があるときに望ましい。即ち、本発明のシステムは容易
に融通がきき、広範囲の条件で使用できる。

【００２６】本発明のさらなる利点は、ユニット化され
た装置を組み立てることができることである。簡単に言
えば、その装置は、試料を含む貯蔵所、またはより一般
的には多数の貯蔵所、即ち試験試料および他の液体およ
び特定の応用に必要とされるかもしれない可溶性化合物
（例えば、栄養等）を含むように設置された貯蔵所を含
む。貯蔵所は、溶液中の酸素レベルを監視するための蛍
光インディケーター成分も提供する。本発明のインディ
ケーター成分は、酸素に暴露されたときに蛍光放射の大
きなクエンチングを示すことが知られている。

【００２７】本発明の好ましい態様によれば、蛍光化合
物は、酸素を透過するが、水および非気体性溶解物は透
過しないプラスチックまたはゴムの層を通して混合およ
び分配されうる。シリコーンゴムはこの応用のために特
に有用な物質である。微生物を含む試験溶液をそのよう
な試料貯蔵所に入れると、生物の代謝活性により試料中
の溶解酸素のレベルの低下が引き起こされ、そして励起
と同時に試料はより高い蛍光シグナルを生じる。微生物
を含まない試料の液体は、酸素レベルの低下を示さず、
蛍光による、高い酸素クエンチングのため、低レベルの
蛍光を示すのみである。

【００２８】別法として、酸素感受性蛍光体をマイクロ
カプセルの形態または酸素透過性物質の顆粒の形態にで
きる。蛍光体は別々に製造される成分、例えばビーズ、
ディスク、またはプロン内に含ませることができ、別々
に試験溶液中に入れられうることも認識される。プロン
の使用は特に利点があり、蓋または他の装置に付けて容
易に操作できる。好ましい態様によれば、多数のプロン
を一つの膜または他のカバーにつけることにより、それ
らプロンが多数の貯蔵所を含む基体の貯蔵所に同様にし
て入れることができるように適切に配列されて保持され
る。適切な物質の選択により、プロンはインディケータ
ー分子および試料中の微生物を透過しないが酸素は透過
するように作ることができる。

【００２９】蛍光体は、インディケーター分子および試
料中の微生物を透過しないが酸素は透過する膜により分
析される溶液から分離された液体層中に存在させること
もできる。さらに、感受性を低めたセンサーは、酸素透
過性の低いポリマーを使用するか、または励起状態の寿
命がより短い化合物を使用することにより製造できる。

【００３０】さらに、本発明の方法は、化合物、例えば
生物の成長および／または代謝活性を激しく阻害できる
抗生物質に対する微生物の感受性を試験するためにも使
用できる。生物によって通常引き起こされる蛍光シグナ
ルの増加はそのような化合物の存在により抑圧される。
貯蔵所からの蛍光シグナルの動きは、試験化合物が貯蔵
所に加えられた生物の通常の酸素消費を低める作用をす
る能力を証明する。

【００３１】

【実施例】以下の実施例は、本発明のある好ましい態様
を例示するものであり、すべての態様を例示するための
ものでない。

【００３２】

【実施例１】酸素感受性インディケーターのマイクロタイトレーショ
ントレイの製造蛍光化合物トリス４，７−ジフェニル−１，１０−フェ
ナンスロリンルテニウム（ＩＩ）クロライド（Ｒｕ（Ｄ
ＰＰ）₃Ｃｌ₂）は、ワッツ（Ｗａｔｔｓ）とクロスビー
（Ｃｒｏｓｂｙ）（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９
３，３１８４（１９７１））の方法を用いることにより
合成された。総量３．６ｍｇの化合物を２．０ｍｌのジ
メチルスルフォキシド（Ｄ−５８７９，シグマケミカル
社、セントルイス、ＭＯ）に溶解し、次にその結果得ら
れた溶液を撹拌しながらゆっくりと１３００ｍｌのシリ
コーンゴム形成溶液（水基剤乳濁液、＃３−５０２４、
ダウコーニング社、ミッドランド、ＭＩ）に添加した。
次に、混合物の３５マイクロリットルのアリコートを９
６ウエルの平底の白いマイクロタイタートレイ（＃０１
１−０１０−７９０１、ダイナテック社、シャンティイ
ー、ＶＡ）の各ウエルに分配し、そして次にシステムを
低湿度（２５％ＲＨ未満）の６０℃インキュベーターで
一晩温置した。温置後、トレイは以下の試薬に浸けるか
またはそれぞれの試薬で数回各ウエルを満たして空ける
ことにより洗った：ａ）無水エタノール、ｂ）０．１Ｍ
リン酸緩衝液ｐＨ７．２、ｃ）暖めた蒸留水（約４５
℃）およびｄ）周辺温度と等しい温度の蒸留水。

【００３３】次に、３５％ミュエラーヒントン（Ｍｕｅ
ｌｌｅｒＨｉｎｔｏｎ）ＩＩ（ＢＢＬ＃１２４３２
２、ＢＤマイクロバイオロジーシステムズ社、コッキー
スビル、ＭＤ）、１５％ブルセラ（ＢＢＬ＃１１０８
８）、および５０％蒸留水からなるブロスＡ１５０マイ
クロリットルをトレイの各ウエルに分配し、そして次に
総圧力が１気圧になるようにトレイを窒素と混合し、所
望濃度の酸素を含むグローブボックスに入れた。トレイ
は、グローブボックスの中で少なくとも２４時間保ち、
その後裏面に接着剤をぬったマイラーシートで覆ってボ
ックスから取り出した。。

【００３４】次に、トレイの各ウエルの底の蛍光化合物
の蛍光放射は、マイクロタイターを読み取る付属物を備
えたパーキン−エルマーＬＳ−５Ｂを用いて、以下のよ
うに器具をセッティングして測定した：４８５ｎｍ励起
波長、放射窓中の５５０ｎｍカット−オンフィルター、
１０ｎｍの励起スリット、および５ｎｍの放射スリッ
ト。結果を表１に示す。

【００３５】

【表１】表１さまざまな酸素ガスレベルで平衡化したトレイの蛍光トレイ読み取り値の平均％酸素混合物（窒素中）１８０３０．００２７５９０．２８３７３８０．５３４５２４２．４５５４８４３．４０６４４５５．３５７２０８２０．９空中酸素中で平衡化されたトレイ中のウエル（トレイ
７）中のインディケーターは低濃度の酸素を含むガス混
合物で平衡化されたウエル（トレイ１−６）よりもはる
かに低い蛍光シグナルを示した。これは、シリコーンゴ
ム中に入れられた蛍光インディケーター化合物の蛍光放
射が酸素濃度と関連しており、そしてこのシステムは酸
素レベルの変化に容易に平衡化できることを示す。この
システムは９６の試料ウエル（０．１−０．３ｍｌの試
料を含む）を、る単一ユニット内に含むことができ、操
作を容易にする。

【００３６】

【実施例２】還元剤により生じた相対酸素濃度の測定のためのインデ
ィケーターシステムの使用実施例１の方法により作られたインディケーターマイク
ロタイタートレイのウエル内の酸素濃度は、強い還元剤
硫酸ナトリウム（酸素含量を低下させる）の添加により
変えられた。還元剤の１５０マイクロリットルのアリコ
ート（水中の硫酸イオンは０から１０８３ｐｐｍの範囲
の濃度で）をウエルのトレイにピペットで入れた。各ウ
エルは３０分間反応させ、空中に開放し、そして４６０
ｎｍの波長の励起帯域濾波器および５７０ｎｍの放射カ
ット−オンフィルターを有するフルオロスキャンＩＩ蛍
光計（フローラボラトリーズ社、マックリーン、ＶＡ）
によりインディケーターの蛍光を測定した。結果を表２
に示す。

【００３７】

【表２】表２蛍光への硫酸ナトリウムの効果硫酸イオンのｐｐｍ蛍光の強さ＊０３０９０６５３５１３１６３３５４５３２５４０３３５４２１１５７１１０８３１１８６３＊４ウエルの平均最高濃度の還元剤を含むウエル（そして結果として最も
酸素濃度が低い）は最高の蛍光の強さを有し、このこと
から酸素濃度と蛍光の関係が証明された。

【００３８】

【実施例３】微生物の存在を測定するためのインディケーターシステ
ムの使用Ａ−Ｊｕｓｔ比濁計（アボットラブズ社、シカゴ、Ｉ
Ｌ）を用いて、約１．５×１０⁸ＣＦＵ／ｍｌの大腸菌
（ＡＴＣＣ＃２５９２２）の０．５マックファーラン
ド懸濁液を調製した。ブロスＡ（実施例１を参照）中で
懸濁液を約１×１０⁷ＣＦＵ／ｍｌまで希釈した。この
懸濁液の１５０マイクロリットルのアリコートを実施例
１のとおりに調製したインディケータートレイウエルに
入れ、そして３７℃においてインキュベートした。１−
３時間半の間にときどき、フルオロスキャンＩＩ蛍光計
により蛍光を測定した。図１のとおり、蛍光シグナルの
増加が観察された。生物を含まないウエルからの蛍光シ
グナルはほとんど変化を示さなかった。生物を含むウエ
ルは、紫外線光源下において目で観察すると顕著に明る
かった。即ち、ウエル中の生物の代謝活性が蛍光シグナ
ルを増加させた（おそらく酸素濃度の低下による）らし
い。

【００３９】

【実施例４】生物濃度に対する蛍光の変化の依存性Ａ−Ｊｕｓｔ比濁計（アボットラブズ社、シカゴ、Ｉ
Ｌ）を用いて、滅菌トリプチカーゼ大豆ブロス（ＴＳ
Ｂ，ＢＢＬ＃１１７６８）中の大腸菌（ＡＴＣＣ＃２
５９２２）の０．５マックファーランド懸濁液を調製し
た。１×１０⁷ＣＦＵ／ｍｌから約１０ＣＦＵ／ｍｌま
での範囲の一連の大腸菌懸濁液を連続希釈法により作成
した。各懸濁液の２００マイクロリットルのアリコート
を実施例１のとおりに調製したインディケータートレイ
の８ウエルに入れた。次に、３７℃においてインキュベ
ートし、フルオロスキャンＩＩ蛍光計により３０分おき
に蛍光を測定した。８ウエルの蛍光を平均し、そして滅
菌ＴＳＢウエルのバックグラウンドの蛍光を差し引い
た。蛍光の変化を図２に示す。

【００４０】出発生物濃度を１０倍（１ログユニット）
変化させることにより、２０００蛍光ユニットを超える
のにウエル中の蛍光が約１時間遅れた。この遅れは一部
にはシステムが空中に開放されていることによると推察
される。空中酸素が置き換わろうとして自由に培地の中
に拡散でき、微生物により消費される。生物がその中に
十分な数存在するかまたは十分な数に増殖し、そして試
験溶液中に酸素が拡散する速度と同じかまたはそれ以上
の速度で酸素を消費するのに十分な代謝的活性を有する
ときにのみ、貯蔵所の底のインディケーター要素により
生じた蛍光シグナルが増加することも推察される。

【００４１】

【実施例５】別の蛍光指示薬分子を用いたインディケーターマイクロ
タイトレーショントレイの調製法９６ウエルのマイクロタイタートレイを本質的には実施
例１の方法により製造したが、シリコーン混合物中のＲ
ｕ（ＤＰＰ）₃Ｃｌ₂に換えて、トリス−（２，２’ビピ
リジル）−ルテニウム（ＩＩ）塩化無水物（アルドリッ
ヒケミカルカンパニー社、ミルウオーキー、ＷＩ）［Ｒ
ｕ（ＢｉＰｙ）₃Ｃｌ₂］を使用した。９，１０−ジフェ
ニルアントラセン（ＤＰＡ）を含む第二のトレイも製造
した。すべてのウエルにブロス中の１５０μｌの１×１
０⁷ＣＦＵ／ｍｌの大腸菌（ＡＴＣＣ＃２５９２２）
を入れた。表３は生物添加後０、１、２、３、および４
時間後の結果を示す。

【００４２】

【表３】表３別の蛍光体を用いた場合の装置の蛍光カウント数蛍光化合物シリーコン０時間１時間２時間３時間４時間 Ru(DPP)₃Cl₂(実施例3) Ａ 2300 2315 2560 8329 9000 Ru(BiPy)₃Cl₂(実施例5) Ａ 2866 -- 3449 3951 4109 DPA(実施例5) Ａ 1300 -- 1385 1456 1572 Ru(DPP)₃Cl₂(実施例6) Ｂ -- 995 4334 3775 3508 Ａ＝ダウコーニング社3-5024水基剤のシリコーンＢ＝ベッカーホワイトSWS-960+シリコーン両蛍光センサー化合物は大きな蛍光の増加を示したが、
このことはそれらがこのシステムにおける使用に適当で
あることを示唆する。

【００４３】

【実施例６】別のシリコーンを用いたインディケーターマイクロタイ
トレーショントレイの製造法別のマトリックスに詰められた場合に蛍光体が機能でき
ることを証明するために、９６ウエルのマイクロタイタ
ートレイを本質的に実施例１の方法により製造した。こ
の実施において、１リットルあたり１０マイクログラム
のRu(DPP)₃Cl₂を含む１０μｌのホワイトＳＷＳ−９６
０ＲＴＶシリコーン（ベッカーシリコーンズ社、アドリ
アン、ＭＩ）をトレイの各ウエルに分配して温置した。
結果を表３に示す。実施例１のように、ブロス中に１×
１０⁷ＣＦＵ／ｍｌの大腸菌（ＡＴＣＣ＃２５９２
２）１５０μｌを含むウエルは３７℃の温度で数時間
後、大変に強い蛍光をもっていた。

【００４４】

【実施例７】微生物の酸素消費に対する毒性基質の効果Ａ−Ｊｕｓｔ比濁計を用いて、ブロスＡ中のシュードモ
ナスエルギノーサ（Ps eudomonas aeruginosa）（ＡＴＣ
Ｃ＃１０１４５）約３×１０⁸ＣＦＵ／ｍｌを含む懸濁
液を調製した。総量１５０μｌの懸濁液を、実施例１の
方法により製造したインディケータートレイの各ウエル
に入れ；次にこれら懸濁液をフェノールまたは硫酸銅
（微生物の成長に有害である）で希釈して最終濃度１．
５×１０⁸ＣＦＵ／ｍｌにした。トレイを３７℃でイン
キュベートし、そしてそれらの蛍光をフルオロスキャン
ＩＩ蛍光計により１０分間隔で測定した。図３および図
４は、システムの応答に対するフェノールまたは硫酸銅
の効果を示す。

【００４５】高いレベルでの添加は成長を抑制し、測定
時間中に蛍光は増加しなかった。１グラム／リットル以
上のフェノールおよび５００ｍｇ／リットルを超える硫
酸銅を含むウエルは２時間未満では蛍光シグナルの増加
が見られず、このことから活性をもった代謝生物が存在
しないことが示唆された。即ち、酸素消費の測定を使用
することにより生物の代謝が検査できた。

【００４６】

【実施例８】大腸菌に対する抗生物質の効果Ａ−Ｊｕｓｔ比濁計（アボットラブズ社、シカゴ、Ｉ
Ｌ）を用いて、ブロスＡ（実施例１参照）中の大腸菌
（ＡＴＣＣ＃２５９２２）の０．５マックファーラン
ド懸濁液を調製した。その懸濁液を１×１０⁷ＣＦＵ／
ｍｌに希釈したが、インディケータートレイのウエルは
実施例１の方法で製造され、抗生物質シプロフロキサシ
ン、セフォキシチンおよびセフロキシムを最終濃度０．
５から８μｇ／ｍｌで含んだ。トレイを３７℃において
４時間インキュベートし、そしてそれらの蛍光をフルオ
ロスキャンＩＩ蛍光計により測定した。結果を表４に示
す。

【００４７】

【表４】表４大腸菌および抗生物質を含むインディケータートレイからの蛍光４時間後の蛍光の比較抗生物質濃度(μg/ml) シプロフロキサシンセフロキシムセフォキシチン０．５２５３７７９０２８１８１１２６２１７９８３８２７０２２４６１７１６１７１２０３２５２７７５９８３６９２４２４２４６４６９２９７４全濃度にわたって見られるとおり、大腸菌はシプロフロ
キサシンに感受性であり、低い蛍光カウントが観察され
た。大腸菌はこの濃度のセフロキシムに抵抗性であり、
高い蛍光カウントが観察された。大腸菌は０．５、１、
および２μｇ／ｍｌの濃度のセフォキシチンに抵抗性で
あり、４および８μｇ／ｍｌにおいて低いカウントが観
察された。即ち、蛍光と抗生物質濃度には関連があり、
このことから、本発明のシステムを使用することにより
抗生物質の効果を検査することができ、そして組成物の
最小効果濃度を決定できることが証明された。

【００４８】

【実施例９】Ｒｕ（ＢｉＰｙ）₃Ｃｌ₂蛍光体インディケーターを用い
た、大腸菌の酸素消費に対する抗生物質の効果Ａ−Ｊｕｓｔ比濁計を用いて、ブロスＡ（実施例１参
照）中の大腸菌（ＡＴＣＣ＃２５９２２）の０．５マッ
クファーランド懸濁液を調製した。その懸濁液を１×１
０⁷ＣＦＵ／ｍｌに希釈したが、インディケータートレ
イのウエルは実施例５の方法で製造され（Ｒｕ（ＢｉＰ
ｙ）₃Ｃｌ₂インディケーター）、抗生物質シプロフロキ
サシン、セフォキシチンおよびセフロキシムを最終濃度
０．５から８μｇ／ｍｌで含んだ。トレイを３７℃にお
いて４時間インキュベートし、そしてそれらの蛍光をフ
ルオロスキャンＩＩ蛍光計により測定した。結果を表５
に示す。

【００４９】

【表５】表５大腸菌および抗生物質を含むインディケータートレイからの蛍光４時間後の蛍光の比較抗生物質濃度(μg/ml) シプロフロキサシンセフロキシムセフォキシチン０．５５０７１１５５１１７１１４２８１５３９１４９１２３０８１１８３１３３８４４０３１１７０８３２８３２３１１９４５５９実施例８のように、これら濃度において大腸菌はシプロ
フロキサシンに感受性であり、低い蛍光カウントが観察
された。大腸菌はこれら濃度のセフォキシチンに抵抗性
であり、高い蛍光カウントが観察された。大腸菌は０．
５、１、および２μｇ／ｍｌの濃度のセフォキシチンに
抵抗性であり、高いカウントが観察された。高濃度のセ
フォキシチンに対しては感受性であり、４および８μｇ
／ｍｌにおいて低いカウントが観察された。即ち、この
結果からＲｕ（ＢｉＰｙ）₃Ｃｌ₂も蛍光体インディケー
ターに使用できることが示唆された。

【００５０】

【実施例１０】ＤＰＡ蛍光体インディケーターを用いた、微生物の酸素
消費に対する抗生物質の効果Ａ−Ｊｕｓｔ比濁計を用いて、ブロスＡ中の大腸菌（Ａ
ＴＣＣ＃２５９２２）の０．５マックファーランド懸
濁液を調製した。その懸濁液を１×１０⁷ＣＦＵ／ｍｌ
に希釈したが、インディケータートレイのウエルは実施
例５の方法で製造され（ＤＰＡインディケーター）、抗
生物質シプロフロキサシン、セフォキシチンおよびセフ
ロキシムを最終濃度０．５から８μｇ／ｍｌで含んだ。
トレイを３７℃において４時間インキュベートし、そし
てそれらの蛍光をフルオロスキャンＩＩ蛍光計により測
定した。結果を表６に示す。

【００５１】

【表６】表６大腸菌および抗生物質を含むインディケータートレイからの蛍光４時間後の蛍光の比較抗生物質濃度(μg/ml) シプロフロキサシンセフロキシムセフォキシチン０．５９１１８３１９２１１０９１９７１７３２９４１９５１６４４７４１６０１０１８６８１６１９５これら濃度において、大腸菌はシプロフロキサシンに感
受性であり、低い蛍光カウントが観察された。大腸菌は
これら濃度のセフロキシムに抵抗性であり、高い蛍光カ
ウントが観察された。大腸菌は０．５、１、および２μ
ｇ／ｍｌの濃度のセフォキシチンに抵抗性であり、高い
カウントが観察された。高濃度のセフォキシチンに対し
ては感受性であり、４および８μｇ／ｍｌにおいては実
施例８および９のように低いカウントが観察されたこと
から、ＤＰＡも蛍光体インディケーターに有用であるこ
とが示唆された。

【００５２】

【実施例１１】酸素測定に対する開放システムおよび密閉システムの効
果９６ウエルのマイクロタイタートレイを実質的には実施
例１の方法により製造した。トレイの中の２つのウエル
に抗生物質セフロキシムを０．２５から３２μｇ／ｍｌ
の範囲の濃度で追加した。１００マイクロリットルおよ
び５０マイクロリットルの大腸菌（ＡＴＣＣ＃１１７
７５）懸濁液をウエルに添加することにより約３×１０
⁷ＣＦＵ／ｍｌにした。各２ウエルの一つにミネラルオ
イルを重層することによりウエル中への酸素の拡散を予
防し、他方のウエルは空中に開放した。トレイを３７℃
において５時間インキュベートし、蛍光をフルオロスキ
ャンＩＩ蛍光計により測定し、そして抗生物質を含まな
い幾つかのウエルの平均と比較することにより抗生物質
の各濃度における成長対照のパーセントを算出した。図
５はセフロキシムを函数とした５時間の開放ウエルおよ
び密閉ウエルの変化を示す。図６は開放した場合または
ミネラルオイルで重層した場合の成長対照ウエルの蛍光
の変化を示す。

【００５３】ミネラルオイルを重層した「密閉システ
ム」は４および８μｇ／ｍｌの濃度の抗生物質では酸素
消費に対して効果を示さなかったが、ミネラルオイルを
重層していないウエルにおいてはこの生物がこれらの濃
度のセフロキシムに感受性であることが正確に示され
た。この違いは、おそらく抗生物質が生物に効果を示す
までに必要なタイムラグによる。この間、酸素は進行中
の生物の代謝活性により人工的に低レベルになると信じ
られている。

【００５４】即ち、生物に対する有毒物の効果を検出す
るために最大の感受性をもって本発明を利用するために
は、試料貯蔵所は空中酸素に開放した方がよい。

【００５５】

【実施例１２】インディケータートレイに対する試料体積の効果ブロスＡ中の大腸菌（ＢＤＭＳカルチャーコレクション
＃７１３３）の０．５マックファーランド懸濁液を１
×１０⁷ＣＦＵ／ｍｌに希釈した。異なる体積の（１０
μｌから３００μｌ）希釈懸濁液を、実施例１の方法に
より製造されたインディケータートレイのウエルに入れ
た。トレイを３７℃でインキュベートし、そして蛍光を
フルオロスキャンＩＩ蛍光計により３０分間隔で測定し
た。同じ体積の滅菌ブロスの蛍光を差し引くことによ
り、微生物により引き起こされる蛍光の変化が得られ
た。その結果を表７に示す。

【００５６】

【表７】表７インディケータートレイの蛍光に対する試料体積の効果蛍光の比較試料体積（μｌ） 0時間 1時間 2時間 2.5時間 3時間 3.5時間 4時間１００ 0 0 0 0 4 139 ２００ 0 275 795 814 1218 1958 ４００ 245 683 1883 2108 2613 3240 ６００ 80 1559 3497 4847 6226 6827 ８００ 82 1798 5340 8333 8810 8801 １０００ 31 1848 5952 7672 7962 7961 １２５０ 103 2798 6286 7580 7852 7852 １５００ 32 2539 6005 6568 6759 6686 １７５０ 51 2574 6149 6993 6987 6798 ２０００ 59 2376 5355 5742 5944 5826 ２５００ 115 2172 5373 5695 5822 5759 ３０００ 107 2538 4650 4727 4825 4778 簡単に言えば、２時間以上において、４０μｌ以下の試
料を用いたウエルは８０μｌ以上を用いたウエルにおい
て観察されたシグナルと比較して１／２を超えない増加
を示すことが観察された。４０μｌ以下を含むウエルに
おいては、生物のためにあまりにわずかな体積しか存在
しないため小体積の試料に酸素が拡散できるより速く酸
素を効率的に消費すると信じられている。

【００５７】

【実施例１３】蛍光計を用いたインディケーターシステムの使用インディケータートレイは実施例１の方法と同じ蛍光化
合物およびシリコーンを使用して調製されたが、トレイ
は透明プラスチックから作られ、ウエルは円形の底を有
する（＃４−３９１８−２、ＢＤラブウエアーリンカ
ーンパークＮＪ）。１０μｌシリコーン中の２ナノグ
ラムのＲｕ（ＤＰＰ）₃Ｃｌ₂をトレイの各ウエルに入
れ、洗浄段階を実施しなかった。シュードモナスエルギ
ノーサ（ＢＤＭＳカルチャーコレクション＃Ｎ１１
１）および大腸菌（ＡＴＣＣ＃２５９２２）の試料を
ブロスＡ（実施例１を参照）に希釈して、０から３２μ
ｇ／ｍｌのセフロキシム、０．１２から８μｇ／ｍｌの
シプロフロキサシンまたは０から３２μｇ／ｍｌのセフ
ォキチンを含むブロスＡ中に１×１０⁷ＣＦＵ／ｍｌに
なるようにし、そしてトレイに入れた。トレイを４時間
３７℃においてインキュベートし、そして次に励起源と
して使用される紫外線トランスイルミネーター（＃ＴＸ
−３６５Ａ、スペクトニクスコーポレーション社、ウエ
ストバリー、ＮＹ）の段階に置いた。その結果得られた
蛍光は５５０カット−オンフィルター（＃ＬＬ−５５０
−Ｓ−Ｋ９６２，コリオン社、ホリストン、ＭＡ）を通
して１フートの間隔で、トレイ上部から直接観察され
た。抗生物質を含まないかまたは生物に影響しない程度
の抗生物質を含むウエルは高いレベルの蛍光の証拠とな
ることが容易に観察された。生物を含まないかまたは高
いレベルの抗生物質を含まないウエルは大変に低いレベ
ルの蛍光を有した。各生物に対して蛍光放射を顕著に低
下させる抗生物質の最低濃度を、一晩のマイクロ希釈抗
微生物感受性試験を使用して決定されたＭＩＣ濃度によ
り表８に示す。

【００５８】

【表８】表８装置を使用せずに得られた蛍光の結果ＭＩＣセフロキシムシプロフロキサシンセフォキチン視覚対照視覚対照視覚対照 Ps . aeruginosa 〉64 〉64 １ 0.5 〉64 〉64E . coli #25922 16 8 〈0.12 〈0.12 8 4

【００５９】

【実施例１４】血液を含む培地中の低レベルのバクテリアの存在を検出
するためのインディケーターの使用６８ｎｇのＲｕ（ＤＰＰ）₃Ｃｌ₂を含むダウコーニング
社の水基剤乳濁液３ｍｌを一方の面にコートして組織培
養フラスコ（ファルコン＃３０８４、ＢＤラブウエア
ー社、リンカーンパーク、ＮＪ）を調製した。フラスコ
はエチレンオキシドを用いて滅菌した。約０．０５ＣＦ
Ｕ／ｍｌの大腸菌（ＡＴＣＣ＃２５９２２）を含む１
３５ｍｌのＴＳＢブロス（ＢＢＬ＃１１７６８）、お
よび１５ｍｌのフィブリン除去された羊の血液を一つの
フラスコに添加した。対照のフラスコは１３５ｍｌのＴ
ＳＢおよび１５ｍｌの血液を含むが生物は含まない。フ
ラスコのキャップはあまくして通気をよくさせ、そして
フラスコを垂直の位置で３７℃においてインキュベート
した。インキュベーターから数フィートの位置にあるパ
ーキンエルマー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）ＬＳ−５
Ｂスペクトロフルオロメーターを用いて、繊維状の光学
プローブによりフラスコからの蛍光が測定された。フル
オロメーターはフラスコを、１０ｎｍのスリット幅およ
び５５０ｎｍのカット−オン放射フィルターを用いて４
８５ｎｍの励起波長で測定した。帯状のチャートをフル
オロメーターに装着して蛍光を１６時間続けて監視し
た。インキュベートの間の７．５時間、１０．５時間お
よび１６時間目に１００μｌのアリコートを試験フラス
コから取り出して、滅菌ＴＳＢ中で１：１００に希釈
し、そして希釈液１００μｌをそれぞれ３つのＴＳＡプ
レートにまくことによりフラスコに存在するＣＦＵ／ｍ
ｌ数値を測定した。結果を図７にグラフで示す。

【００６０】本発明の非侵略的技術は血液中の生物の検
出、極めて重大でかつ苛酷な課題のために使用されう
る。フラスコは極めて濁った溶液を含み、該溶液は１６
時間連続的に監視され、そして蛍光の測定により生物の
成長との直接の関連性が示された。この成長は、生物の
濃度がちょうど１０⁶ＣＦＵ／ｍｌを超えた、１１時間
後に容易に検出された。

【００６１】

【実施例１５】ＦＡＳＴトレイ蓋のプロンの球状末端にコートされたイ
ンディケーターこの実施例は、商標名ＦＡＳＴトレイ（ベクトンディキ
ソン社）の蓋のプロンの球状末端にコートされた酸素イ
ンディケーターを用いてバクテリアの呼吸を監視した。
３つの異なるインディケーターについて評価した。

【００６２】調製された第一のインディケーターは、Ｒ
ｕ（ＤＰＰ）₃Ｃｌ₂の２ｍｇ／ｍｌのジクロロメタン溶
液１ｍｌとダウ−コーニング３−５０２４水基剤乳濁液
１０ｍｌの混合物である。ＦＡＳＴトレイ蓋のプロンの
球状末端をインディケーター溶液の浅い貯蔵所に浸し、
除き、プロン側面をラックの下に入れ、そして蒸発させ
て放置した。第二のインディケーターは３ｍｌのベッカ
ー（Ｗａｃｋｅｒ）ＳＷＳ−９６０透明シリコーン分散
液、６ｍｌのペトロリュームエーテル、および０．５ｍ
ｌのＲｕ（ＤＰＰ）₃Ｃｌ₂の２ｍｇ／ｍｌのジクロロメ
タン溶液を混合して調製した。ＦＡＳＴトレイ蓋のプロ
ンの球状末端は第一のインディケーターと同じ方法によ
りこのインディケーターを用いてコートされ、この溶剤
の蒸発させて放置し、そして大気水分で反応させた。第
三のインディケーターは第二の方法と同じように調製さ
れたがベッカー（Ｗａｃｋｅｒ）ＳＷＳ−９６０白色シ
リコーンを使用した。

【００６３】ミュエラーヒントン（ＭｕｅｌｌｅｒＨ
ｉｎｔｏｎ）ブロス中の１×１０⁷ＣＦＵ／ｍｌの大腸
菌（ＡＴＣＣ＃２５９２２）懸濁液を調製した。１５
０マイクロリットルのアリコートをピペットでマイクロ
タイタートレイの奇数ナンバーの列に加え、未接種のミ
ュエラーヒントンブロスの１５０マイクロリットルのア
リコートを偶数ナンバーの列のウエルにピペットで加え
た。プロンでコートされたインディケーターを含む蓋を
トレイ上に置いた。蓋をしたトレイを３７℃の高湿度イ
ンキュベーター中に３時間置いた。

【００６４】３時間インキュベートした後、トレイを透
明ガラス板の上に置いた。トレイの底が鏡に映るように
鏡をガラス板の下に置いた。トレイ全体を平均的に照ら
す３６５ｎｍ紫外線源をトレイ上部から約１インチの位
置に置いた。鏡を通して見ることができる小さい窓をも
つ箱を該アッセンブリーの上に置くことにより部屋の明
かりを遮断し、そして５５０ｎｍカットーオンフィルタ
ーを箱の窓に入れた。このアッセンブリーを用いて、イ
ンディケーターでコートされたＦＡＳＴトレイ蓋のプロ
ンの球状末端からの蛍光がトレイの底を通して視覚化で
きた。表９はこの方法により評価されたトレイの視覚的
観察の結果を含む。

【００６５】

【表９】表９トレイの底を通して見られた、インディケーターをコートした蓋のプロンの視覚的観察シリコーン観察ダウ−コーニング球面からの極めて明るい蛍光が生物を含むウエル中に侵入した。未接種ウエル内のプロンからの蛍光は極めて弱い蛍光であった。

【００６６】ベッカー透明プロン間で幾つかの視覚的に異なる蛍光が接種ウエルおよび未接種ウエルに侵入した。違いはダウ−コーニングを用いた場合よりもはるかに観察しにくかった。

【００６７】ベッカー白色球面からの極めて明るい蛍光が接種されたウエル中に侵入し、その強さはダウ−コーニングとほぼ等しかった。未接種ウエル内の球面からの蛍光は相当弱かった。

【００６８】即ち、３つすべてのインディケーターシス
テムは所望の結果を提供し、ダウ−コーニングとベッカ
ー白色は接種ウエルと未接種ウエルの間で明確に区別で
きる大きな違いを示した。

【００６９】

【実施例１６】紫外線硬化性シリコーンゴム内に詰められたシリカゲル
粒子に吸収されたＲｕ（ＤＰＰ）₃Ｃｌ₂からなるインデ
ィケーターＲｕ（ＤＰＰ）₃Ｃｌ₂をシリカゲル粒子に吸収させ、そ
してこれらの粒子をロクタイトヌヴァ−シル（Ｌｏｃｔ
ｉｔｅＮｕｖａ−Ｓｉｌ）シリコーンゴムに詰めるこ
とにより、インディケーターが調製された。異なるメッ
シュサイズ、異なる量の吸収蛍光体、異なるシリカゲル
／シリコーン比、および２種類のロクタイトヌヴァ−シ
ル（Ｎｕｖａ−Ｓｉｌ５０９１およびＮｕｖａ−Ｓｉ
ｌ５１４７）を使用して、さまざまなインディケータ
ーが調製された。表１０は調製されたインディケーター
の特徴および微生物懸濁液に接触させたインディケータ
ーから得られた視覚結果を含む。インディケーターの調
製のために使用された典型的な方法は以下に示す。

【００７０】１０グラムの１００−２００メッシュのダ
ビシル（Ｄａｖｉｓｉｌ）シリカゲル（アルドリッヒ
社、ミルウオーキー、ＷＩ）を秤量して５００ｍｌの丸
底蒸発フラスコに入れた。Ｒｕ（ＤＰＰ）₃Ｃｌ₂の０．
１４ｍｇ／ｍｌエタノール溶液４３ｍｌをピペットでフ
ラスコに入れた。エタノールを回転真空蒸発により除去
し、Ｒｕ（ＤＰＰ）₃Ｃｌ₂をシリカゲルに吸収させて濃
度を０．６ｍｇＲｕ（ＤＰＰ）₃Ｃｌ₂／ｇｍシリカゲル
にした。このシリカゲル４グラムを１６グラムのロクタ
イトヌヴァ−シル（Ｎｕｖａ−Ｓｉｌ）５０９１（ロク
タイト社、ニューイングトン、ＣＴ）と混合して２０％
ｗ／ｗのシリカ／シリコーン比にした。この混合物の
２５マイクロリットルのアリコートをピペットでマイク
ロタイタートレイのウエルに入れた。シリコーンは強い
紫外線照射に１５秒間、ロクタイトゼータ７２００紫外
線温置チェンバー中で暴露することにより温置した。表
１０の他のインディケーターは同様にして調製した。

【００７１】インディケーターを評価するために、ミュ
ーラーヒントンＩＩブロス（ＢＢＬ）中の１×１０⁷Ｃ
ＦＵ／ｍｌ大腸菌（ＡＴＣＣ＃２５９２２）懸濁液１
５０マイクロリットルを、マイクロタイタートレイの選
択されたウエルにピペットで入れ、未接種のブロスを他
のウエルにピペットで入れた。このトレイを高湿度３５
℃インキュベーターの中で３時間インキュベートした。
インディケーターからの蛍光を視覚化するために、トレ
イを３６５ｎｍ紫外線トランスイルミネーターの段階に
置き、インディケーターからの蛍光を５５０ｎｍカット
ーオンフィルターを通して上から観察した。表１０の応
答カラムの＋のサインは、視覚により識別できる蛍光の
増加が、生物を含むウエルから観察されたことを示唆す
る。

【００７２】

【表１０】表１０インディケーターの組成および応答メッシュサイズ Ru(DPP)₃Cl₂ mg/gシリカシリカの重量% シリコーン応答 60-100 0.2,0.4,0.6 5,10,20 5091,5147 ＋＊ 100-200 0.2,0.4,0.6 5,10,20 5091,5147 ＋＊ 200-425 0.2,0.4,0.6 5,10,20 5091,5147 ＋＊＊は全１８回の試験の結果を表す（シリコーン５０９１、５１４７についてそれぞれ９回）。

【００７３】微生物を含まないウエルを利用した繰り返
しの試験において、インディケーターはほとんどまたは
全く光を示さなかった（高濃度（０．６ｍｇ／ｇｍ）の
インディケーターにおいてはかすかな蛍光を示した
が）。

【００７４】上述の本発明は、その趣旨および目的から
離れる事なく多くの修飾および変化がなされてよいこと
は明らかである。記述された特定の態様は例示としての
み提供されたものであり、本発明は特許請求の範囲によ
ってのみ制限される。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、生物を含むブロスと生物を含まないブ
ロスに接触させたインディケーターの蛍光の強さを時間
の函数として表したグラフである。

【図２】図２は、異なる濃度の微生物を接種したブロス
に接触させたインディケーターの蛍光の強さを時間の函
数として表したグラフである。

【図３】図３は、同じ数の生物を接種し、異なる濃度の
フェノールを含むブロスと接触させたインディケーター
の蛍光の強さを時間の函数として表したグラフである。

【図４】図４は、同じ数の生物を接種し、異なる量の硫
酸銅を含むブロスと接触させたインディケーターの蛍光
の強さを時間の函数として表したグラフである。

【図５】図５は、同じ数の生物を接種し、異なる濃度の
セフロキシムを含むブロスと接触させたインディケータ
ーの蛍光の強さを時間の函数として表したグラフであ
る。幾つかのウエルはミネラルオイルで覆うことによ
り、酸素がウエルの中に拡散するのを防いだ。

【図６】図６は、オイルを重層するかまたは空中に開放
し、そして幾つかの異なる時間において測定されたウエ
ル中の蛍光を成長対照のパーセントとして表したグラフ
である。

【図７】図７は、連続して１６時間以上測定した場合の
血液培養ボトル内のインディケーターの蛍光の強さを表
したグラフである。矢印は、存在する生物の濃度を定量
するために試料を取り出したときを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者グレゴリー・ジェイ・バレルアメリカ合衆国ペンシルバニア州17356, レッド・ライオン，アコーン・レーン 3055 (72)発明者クゥオ−ユー・フーアメリカ合衆国メリーランド州21042，エリコット・シティー，ラムズ・ホーン・ロウ 8741 (72)発明者ジェイムズ・エフ・モンソニーアメリカ合衆国メリーランド州21209，ボルティモア，ベイリーフ・コート 2310 (72)発明者ロバート・サピトウィッツアメリカ合衆国メリーランド州21009，アビンドン，ローレル・ヴァレー・コート 124

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】微生物の代謝活性により液体中の溶解酸
素のレベルの低下が引き起こされることに基づいて、液
体中の呼吸している微生物の存在を検出する方法であっ
て、（ｉ）蛍光を生じさせる波長を含む光を照射されると酸
素への暴露と同時に蛍光の強さが低下する蛍光化合物を
上記液体中の酸素に暴露するが、その際、上記暴露は、
上記蛍光化合物と上記液体とを直接接触させるかまたは
実質的に酸素のみを透過する膜により上記蛍光化合物と
上記液体とを隔てることにより行い；（ｉｉ）上記蛍光化合物に蛍光を生じさせる波長を含む
光を上記蛍光化合物に照射し；（ｉｉｉ）上記蛍光化合物からの蛍光の強さを測定する
かまたは視覚により観察し；そして（ｉｖ）呼吸している微生物を含まない対照の測定値と
上記測定値とを比較したときに、蛍光の強さの増加分が
呼吸している微生物の存在を示すことからなる、上記方
法。
【請求項２】上記膜により蛍光化合物と液体とを隔て
て上記蛍光化合物を上記液体中の酸素に暴露するが、そ
の際、上記膜内に上記蛍光化合物が含まれており、か
つ、上記膜が、水および非気体性溶解物は相対的に透過
しにくいが酸素の透過性が高いマトリックスである、請
求項１記載の方法。
【請求項３】上記蛍光化合物がトリス−４，７−ジフ
ェニル−１，１０−フェナンスロリンルテニウム（Ｉ
Ｉ）塩およびトリス−２，２’−ビピリジルルテニウム
（ＩＩ）塩からなるグループから選択される、請求項１
記載の方法。
【請求項４】微生物の代謝活性により液体中の溶解酸
素のレベルの低下が引き起こされることに基づいて、呼
吸している微生物への抗生物質または抗微生物組成物の
効果を測定する方法であって、（ｉ）微生物のブロスを調製し；（ｉｉ）蛍光を生じさせる波長を含む光を照射されると
酸素への暴露と同時に蛍光の強さが低下する蛍光化合物
を上記ブロス中の酸素に暴露するが、その際、上記暴露
は、上記蛍光化合物と上記ブロスとを直接接触させるか
または実質的に酸素のみを透過する膜により上記蛍光化
合物と上記ブロスとを隔てることにより行い；（ｉｉｉ）上記ブロスを所定量の抗生物質または抗微生
物組成物と混合し；（ｉｖ）上記蛍光化合物に蛍光を生じさせる波長を含む
光を上記蛍光化合物に照射し；（ｖ）上記蛍光化合物からの蛍光の強さを測定するかま
たは視覚により観察し；そして（ｉｖ）呼吸している微生物と接触させない陰性対照の
測定値と上記測定値とを比較したときに、対照と比較し
た蛍光の強さの増加分が呼吸する微生物の存在を示すこ
とにより、前記所定量の抗生物質または抗微生物組成物
の非有効性を示すことからなる、上記方法。
【請求項５】上記膜により蛍光化合物と液体とを隔て
て上記蛍光化合物を上記液体中の酸素に暴露するが、そ
の際、上記膜内に上記蛍光化合物が含まれており、か
つ、上記膜が、水および非気体性溶解物は相対的に透過
しにくいが酸素の透過性が高いマトリックスである、請
求項４記載の方法。
【請求項６】上記蛍光化合物がトリス−４，７−ジフ
ェニル−１，１０−フェナンスロリンルテニウム（Ｉ
Ｉ）塩およびトリス−２，２’−ビピリジルルテニウム
（ＩＩ）塩からなるグループから選択される、請求項４
記載の方法。
【請求項７】水および非気体性溶解物は相対的に透過
しにくいが酸素の透過性が高いマトリックス内に含まれ
る蛍光センサーおよび試料を含むように適合された、ひ
とつまたは複数のウエルを有する本体を含むが、上記蛍
光センサーは、蛍光を生じさせる波長を含む光で照射し
た場合に、酸素への暴露と同時に蛍光の強さが低下する
蛍光化合物を含むことを特徴とする、呼吸している微生
物の在否を蛍光により試験する装置。
【請求項８】上記蛍光化合物がトリス−４，７−ジフ
ェニル−１，１０−フェナンスロリンルテニウム（Ｉ
Ｉ）塩およびトリス−２，２’−ビピリジルルテニウム
（ＩＩ）塩からなるグループから選択される、請求項７
記載の装置。
【請求項９】微生物の代謝活性により液体中の溶解酸
素のレベルの低下が引き起こされることに基づいて、液
体中の呼吸している微生物の存在を検出する方法であっ
て、（ｉ）トリス−４，７−ジフェニル−１，１０−フェナ
ンスロリンルテニウム（ＩＩ）クロライドおよびトリス
−２，２’−ビピリジルルテニウム（ＩＩ）クロライド
六水化物からなるグループから選択される蛍光化合物を
上記液体中の酸素に暴露するが、その際、上記暴露は、
上記蛍光化合物と上記液体とを直接接触させるかまたは
実質的に酸素のみを透過する膜により上記蛍光化合物と
上記液体とを隔てることにより行い；（ｉｉ）上記蛍光化合物に蛍光を生じさせる波長を含む
光を上記蛍光化合物に照射し；そして（ｉｉｉ）上記蛍光化合物からの蛍光の強さを測定する
かまたは視覚により観察し、識別されるあらゆる蛍光活
性が呼吸している微生物の存在を示すことからなる、上
記方法。
【請求項１０】微生物の代謝活性により液体中の溶解
酸素のレベルの低下が引き起こされることに基づいて、
呼吸している微生物への抗生物質または抗微生物組成物
の効果を測定する方法であって、（ｉ）微生物のブロスを調製し；（ｉｉ）トリス−４，７−ジフェニル−１，１０−フェ
ナンスロリンルテニウム（ＩＩ）クロライドおよびトリ
ス−２，２’−ビピリジルルテニウム（ＩＩ）クロライ
ド六水化物からなるグループから選択される蛍光化合物
を上記ブロス中の酸素に暴露するが、その際、上記暴露
は、上記蛍光化合物と上記ブロスとを直接接触させるか
または実質的に酸素のみを透過する膜により上記蛍光化
合物と上記ブロスとを隔てることにより行い；（ｉｉｉ）上記ブロスを所定量の抗生物質または抗微生
物組成物と混合し；（ｉｖ）上記蛍光化合物に蛍光を生じさせる波長を含む
光を上記蛍光化合物に照射し；そして（ｖ）上記蛍光化合物からの蛍光の強さを測定するかま
たは視覚により観察し、識別されるあらゆる蛍光活性が
呼吸している微生物の存在を示すことにより、前記所定
量の抗生物質または抗微生物組成物の非有効性を示すこ
とからなる、上記方法。