JPS61216695A - Production of pyruvic acid - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To produce pyruvic acid at a low cost, by adding an aminopolycarboxylic acid-type chelating agent to a reaction system for the production of pyruvic acid from L-tartaric acid in the presence of cultured product of microorganism containing L-tartaric acid dehydratase. CONSTITUTION:A microorganism containing L-tartaric acid dehydratase and belonging to Pseudomonas genus, e.g. Pseudomonas putida, Pseudomonas espi, etc., is cultured, and pyruvic acid is produced and accumulated from L-tartaric acid or its salt in the presence of the cultured product or its treated product. The yield of pyruvic acid is improved by adding an aminopolycarboxylic acid- type chelating agent such as ethylenediaminetetraacetic acid, diaminopropanoltetraacetic acid, glycol ether diaminetetraacetic acid, etc., to the reaction system. The pyruvic acid produced and accumulated in the system can be separated by conventional method.

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、Ｌ−酒石酸デヒドラターゼを有する微生物の
培養物又はその処理物の存在下％Ｌ−酒石酸またはその
塩からピルビン酸を生成蓄積せしめ採取する方法に関す
る。Detailed Description of the Invention [Industrial Application Field] The present invention is directed to the production, accumulation and collection of pyruvic acid from L-tartaric acid or its salts in the presence of a culture of a microorganism having L-tartrate dehydratase or a processed product thereof. Regarding how to.

ピルビン酸は生体代謝の重要な中間体であり、各種医薬
、農薬等の有用な合成原料であるのみならず酵素法によ
るＩａ−）リデトファン、Ｌ　−Ｖスティン、−−チロ
シフ等のアミノ酸合成の主要原料である。よって安価ｃ
Ｉｌ造し得れば、種々の合成原料として有用である。Pyruvate is an important intermediate in biological metabolism, and is not only a useful raw material for the synthesis of various medicines and agricultural chemicals, but also a key ingredient in the synthesis of amino acids such as Ia-)ridetophan, L-V stin, and tyrosif by enzymatic methods. It is a raw material. Therefore, cheapc
If it can be produced, it will be useful as a raw material for various synthetics.

〔従来の技術〕[Conventional technology]

従来、ピルビン酸を微生物により製造する方法としては
、酵母の変異株や担子菌類または特殊なバワテリアによ
る方法が知られているが、培地組成が複雑であり、副生
物が多（、工業的に満足すべきものではなかった。Conventionally, known methods for producing pyruvic acid using microorganisms include using mutant strains of yeast, basidiomycetes, or special Bawateria, but the culture medium composition is complex, there are many by-products (and industrially unsatisfactory). It wasn't something that should have been done.

酵素法によるＬ−酒石酸からピルビン酸の製造に関して
は、わずかｃＬ−酒石酸を脱水してオキザロ酢酸を生成
させ、化学的、生化学的に脱炭酸してピルビン酸を生成
せしめるも一酒石酸デヒドラターゼの精嶺傳素の研究（
ＭｅｔｈＱへ８ｉｎ　　ＩＣｎｚｙｗｏｌｏｇｙ　　’
Ｉｏ工、　！！　　、　　６８Ｇ（＋９６６）　　）　
　力；有力な方法として知られているに過ぎない。Regarding the production of pyruvic acid from L-tartaric acid by an enzymatic method, a small amount of cL-tartaric acid is dehydrated to produce oxaloacetate, which is then chemically and biochemically decarboxylated to produce pyruvic acid. Research on Minedenso (
8in ICnzywology to MethQ'
Io engineering! ! , 68G (+966))
Power: It is only known as a powerful method.

〔発明が解決しようとする問題点〕[Problem that the invention seeks to solve]

しかしながら、かかる従来法はＬ−酒石酸デヒドラター
ゼの精製酵素のみについての研究であり、工業的に有利
な該酵素を含む生菌体を用いての検討は全くなされてい
なかった。しかも、従来法に従って、実際す一酒石酸を
用いて酵素筐底を行ってみると、長時間度広に於て活性
持続が困難であり反応を終結させるためには大量の菌体
を用いる他、手段がなかった。また生成ピルビン酸が生
化学的に分解されるためピルビン酸の収率が著しく低下
することがわかった。However, this conventional method is a study only on the purified enzyme of L-tartrate dehydratase, and there has been no study using live bacterial cells containing the enzyme, which is industrially advantageous. Moreover, when using monotartaric acid to prepare the enzyme casing according to the conventional method, it was difficult to maintain the activity over a long period of time, and a large amount of bacterial cells were required to terminate the reaction. I didn't have the means. It was also found that the yield of pyruvic acid was significantly reduced because the pyruvic acid produced was biochemically decomposed.

〔問題点を解決するための手段および作用〕本発明者ら
は、工業的に有利な生菌体またはその簡単な処理物を用
いてＬ−酒石酸からピルビン酸を酵素法により一造する
方法を搗供するとともに、従来技術の問題点を解消し、
生成したピルビン酸の分解を抑制し、少量の菌体な用い
て、ピルビン酸を高収率で取得するための工業的に実用
化可能な方法を搗供すべく鋭意研究した結果、本発明に
到達した。[Means and effects for solving the problem] The present inventors have developed a method for producing pyruvic acid from L-tartaric acid by an enzymatic method using industrially advantageous viable bacterial cells or simply processed products thereof. At the same time, we solved the problems of the conventional technology,
The present invention was achieved as a result of intensive research to develop an industrially practical method for suppressing the decomposition of the pyruvate produced and obtaining it at a high yield using a small amount of bacterial cells. did.

すなわち、本発明は、Ｌ−酒石酸デヒドラターゼを有す
る微生物の培養物又はその処理物の存在下、Ｌ−酒石酸
またはその塩からピルビン酸を生成蓄積せしめ採取する
際、系中にアミノポリカルボン酸系のキレート剤を添加
することを特徴とするビルピノ酸の製造方法である。That is, the present invention provides for the production and accumulation of pyruvic acid from L-tartaric acid or its salts in the presence of a culture of a microorganism having L-tartrate dehydratase or a treated product thereof. This is a method for producing bilpinoic acid, which is characterized by adding a chelating agent.

本発明にお８いて、−一酒石酸デヒドツターゼを有する
微生ｉとして、シュードモナス（Ｐａｅｕｄｏｍ＋ｏｎ
ａｓ　）属に・属する微生物を用ｕすることは、好まし
い実施態様である。In the present invention, the microorganism i having -bitartrate dehydotutase is Pseudomonas (Paeudom+on).
It is a preferred embodiment to use microorganisms belonging to the genus As).

以下、本発明を具体的に説明する。The present invention will be specifically explained below.

本発明では原料としてＬ−酒石酸またはその塩及び、生
酒石などの非精製天然物を用いる。In the present invention, unrefined natural products such as L-tartaric acid or its salt and raw tartar are used as raw materials.

Ｌ−酒石酸の塩としては１例えばそのナトリウ゛ム塩、
カリウム塩、力〃シウム塩、アンモニウム塩などの無機
塩が用いられる。使用するＬ−酒石酸またはその塩の系
中での一度は（Ｌｌ〜Ｓｍｏ１７ｇが好ましく、（Ｌ　
１〜１．０　ｍｏｌ／ｌがさらに好ましい。Examples of salts of L-tartaric acid include its sodium salt,
Inorganic salts such as potassium salts, potassium salts, and ammonium salts are used. Once in the system of L-tartaric acid or its salt used, (Ll ~ Smo 17 g is preferable, (L
1 to 1.0 mol/l is more preferable.

Ｌ−酒石酸の系中への供給方法は特に限定されない９例
えばＬ−酒石酸が消費されるに従って固形状もしくは濃
厚液状のＬ−酒石酸またはその塩を遂次添加し、常にＬ
−酒石酸の濃度が一定になるように維持するのも良い方
法である。The method of supplying L-tartaric acid into the system is not particularly limited.9 For example, as L-tartaric acid is consumed, solid or concentrated liquid L-tartaric acid or its salt is successively added, and L-tartaric acid is constantly added.
- It is also a good idea to maintain a constant concentration of tartaric acid.

本発明□では、Ｉａ−酒石酸デヒドラターゼを有する微
生物の培養物又は、その処理物の存在下に酵素度広を行
なう。In the present invention □, enzyme enrichment is carried out in the presence of a culture of a microorganism having Ia-tartrate dehydratase or a treated product thereof.

本発明で使用する微生物としては％Ｌ−酒石酸デヒドラ
ターゼ、すなわちＬ−酒石酸をピルビン酸へ変換する能
力を有する被生物であればいずれを用いることもできる
。As the microorganism used in the present invention, any living organism having % L-tartrate dehydratase, that is, the ability to convert L-tartaric acid to pyruvic acid, can be used.

例えば、シュードモナス属に属する微生物を用いること
ができ、具体的には、シュードモナス拳プチダ（ｐａｅ
ｕａｏｍｏｎａａ　Ｐｕｔｉ４ａ　Ｊ　（ＡＴ　ｃ　ｃ
１７６４２３．３’ニードモナス−プチダ（ＡＴｅａ１
５１’７５Ｊ、シュードモナス・エスピー（ｐｓｅｕａ
ｏｍｏｎａｓ　ｗ８ｐ１）　（ＡＴ　ＣＣｌ　５９１５
　）、シュードモナス拳フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓｙｌｕｏｒｅｓａｅｎｓｅ　Ｊ　（ＡＴＯ
Ｃ＋　７６５４３などが好ましく用いられる。For example, microorganisms belonging to the genus Pseudomonas can be used, specifically, Pseudomonas fistida (pae
uaomonaa Puti4a J (AT c c
176423.3'Needomonas putida (ATea1
51'75J, Pseudomonas sp.
omonas w8p1) (AT CCl 5915
), Pseudomonas Fist Fluorescence (Pseud
omonasyluoresaense J (ATO
C+ 76543 and the like are preferably used.

本発明では、微生物の培養物又はその処理物を使用する
。すなわち、生菌体、真空乾燥、凍結乾燥、アセトン乾
燥などによる各種乾燥菌体、　　　□′菌体処理物、抽
出液、粗酵素などの状態で使用することができる。精製
酵素の使用は工業□的で　　　　５ないので好ましくな
い。In the present invention, a culture of microorganisms or a processed product thereof is used. That is, it can be used in the form of live bacterial cells, various dried bacterial cells such as vacuum-dried, freeze-dried, acetone-dried, etc., processed bacterial cells, extracts, crude enzymes, and the like. The use of purified enzymes is undesirable because it is not suitable for industrial use.

本発明においｔ系中で使用する微生物の量は、乾燥菌体
濃度に換算して１〜５０ｇ／ｌが好ましく、より好まし
くは・５〜２０　ｇ／ｌの範囲で使用される。In the present invention, the amount of microorganisms used in the t-system is preferably 1 to 50 g/l, more preferably 5 to 20 g/l in terms of dry cell concentration.

本発明で使用できるアミノポリカルボン酸系のキＶ−）
剤としては、例えばエチレンジアミン四酢酸、ジアミノ
デロノぐノール四酢酸、ジアミノプロパン四酢酸、ジエ
チレントリアミン五酢酸、グリコールエーテルジアミン
四酢酸、エチレンジアミン二酢酸、２−しドロキシエチ
ルエチレンジアミン三酢酸などが挙げられ、好ましくは
エチレンジアミン四酢酸、ジアミノプロパン四酢酸、ジ
アミノゾロパノール四酢酸、ジエチレントリアミン五酢
酸、グリコールエーテ〃ジアミン四酢酸等が用いられる
。Aminopolycarboxylic acid-based compound V-) that can be used in the present invention
Examples of the agent include ethylenediaminetetraacetic acid, diaminoderonoltetraacetic acid, diaminopropanetetraacetic acid, diethylenetriaminepentaacetic acid, glycol etherdiaminetetraacetic acid, ethylenediaminediacetic acid, 2-droxyethylethylenediaminetriacetic acid, etc., and preferably Ethylenediaminetetraacetic acid, diaminopropanoltetraacetic acid, diaminozolopanoltetraacetic acid, diethylenetriaminepentaacetic acid, glycol ether diaminetetraacetic acid, and the like are used.

かかるキレート剤の系中での使用量は、キレート剤の系
中濃度で通常、２〜８０　ｍｍｏｌ／Ｊであり、好まし
くは５〜５０　ｍｍｏｌ／Ｊである。The amount of such a chelating agent used in the system is usually 2 to 80 mmol/J, preferably 5 to 50 mmol/J.

本発明の系は、微生物の培養物又はその処理物が系中で
懸濁状で存在しているが、かかる系のｐＦＩは通常５〜
１１、好ましくは７〜９であり、反応温度は通常２０〜
６０℃、好ましくは２５〜４５℃である。In the system of the present invention, a culture of microorganisms or a processed product thereof exists in suspension, and the pFI of such a system is usually 5 to 5.
11, preferably 7 to 9, and the reaction temperature is usually 20 to 9.
The temperature is 60°C, preferably 25-45°C.

反応終了後、系中に生成蓄積したピルビン酸は常法によ
り、単離採取することができる。例、ｔＧ？、フェニル
ヒドラゾンとして沈殿単離することもできる。After the reaction is completed, the pyruvic acid produced and accumulated in the system can be isolated and collected by a conventional method. For example, tG? , it can also be isolated by precipitation as phenylhydrazone.

〔実施例〕〔Example〕

以下、実施例によって本発明を説明する。 The present invention will be explained below with reference to Examples.

実施例において生成したピルビン酸及び減少したＬ−酒
石酸の確認と定量は、高速液体クロマトグラフィーによ
り行った。Confirmation and quantitative determination of the pyruvic acid produced in the examples and the decreased L-tartaric acid were performed by high performance liquid chromatography.

実施例１ Ｌ−酒石酸デヒドラターゼ生産直であるシュードモナス
・プチダ（ＡＴＯＯ１７６４２）を１１のエーレンマイ
ヤーフラスコ中の第１表に示す組成の培地１００ｍＪｃ
接種し、５０℃で１５時間培養した。培養終了後、ｚａ
ｍｌずつ分注して遠心して集菌した。この２０　ｔａｇ
分の菌体なｌ　ＯｍＪの蒸留水（ＫＯＦＩ−Ｔ：ｐＨａ
５ｃ調整）Ｃ懸濁し、Ｌ−酒石酸二カリウム塩なａ　６
７７　ｇ　（（Ｌ　２８８　ｍｏｌ／Ｊ　）　、キレー
ト剤でアルエチレンジアミ・ン四酢酸（以下ＩＤＴＡと
略す）を、第２表の濃度になるように添加した後、５０
℃で振とうし、５５時間後の生成ピルビン酸及び減少り
一酒石酸量を測定した。結果として第２表に示すように
、！！ＤＴＡを添加することにより反応が終結し、収率
も向上した。Example 1 Pseudomonas putida (ATOO17642), a direct producer of L-tartrate dehydratase, was grown in 100 mJc of a medium with the composition shown in Table 1 in 11 Erlenmeyer flasks.
The cells were inoculated and cultured at 50°C for 15 hours. After culturing, za
Bacteria were collected by dispensing each ml and centrifuging it. These 20 tags
Distilled water (KOFI-T: pH
5c Adjustment) C Suspend L-tartrate dipotassium salt a 6
After adding 77 g ((L 288 mol/J) of alethylene diamine tetraacetic acid (hereinafter abbreviated as IDTA) as a chelating agent to the concentration shown in Table 2, 50
The mixture was shaken at 0.degree. C., and the amount of pyruvic acid produced and the amount of monotartaric acid decreased after 55 hours was measured. As a result, as shown in Table 2,! ! By adding DTA, the reaction was terminated and the yield was also improved.

第　　１　　表 Ｌ−酒石ｌ！　　　　　　　１５ｇ 塩化アンモニウム　　　　５６ Ｍｇ５Ｏａ・７Ｆｉ＠Ｏ（Ｌｌｇ ＣａＯｌｇ　４Ｈ１０ａ　２　ｇ ＦｅＯｌｌ　　　　　　　　　　　（Ｌ　Ｏ５ｇ酵母エ
キス　　　　　　　１２ｇ 第　　２　　表 実施例２ 実施例１で、第１表のｂ−酒石酸１５ｇの代わりに、生
酒石５０ｇＣ１，−酒石酸含量約５０％（Ｗ、／Ｗ））
を用いて、実施例１と同様に培養し、集菌した。この培
養液２０　ｍＪ分の菌体ヒ、生酒石（Ｌ９ｇをｌ　Ｏｍ
ｌの蒸留水（にＯＨでｐＨａ　ｓ　Ｃａｌ！１　）　Ｃ
１１１１＆濁シ、ｒ＋ｏｒａｔ２ｏｍｍ添、ｍしたもの
としないものを、３０℃で振とうし、５５時間後の生成
ピルビン酸及び減少り一酒石酸量を測定した。結果を第
３表に示した。Table 1 L - Tartar stone! 15 g Ammonium chloride 56 Mg5Oa・7Fi@O(Llg CaOlg 4H10a 2 g FeOll (L O5g Yeast extract 12g Table 2 Example 2 In Example 1, instead of 15 g of b-tartaric acid in Table 1, raw tartaric acid 50 g C1,- Tartaric acid content approximately 50% (W, /W))
The cells were cultured and collected in the same manner as in Example 1. Add 20 mJ of this culture solution, raw tartar (9 g to 1 Om)
l of distilled water (pH in OH Cal!1) C
1111&turbidity, with and without r+orat2omm were shaken at 30°C, and the amount of pyruvic acid produced and the amount of monotartaric acid decreased after 55 hours was measured. The results are shown in Table 3.

第　　３　　表　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　・ミリモｌＬ／／ｌ 実施例５ 実施例１と同様にして菌体を集菌し、２　ＯＩＩＬ１分
ｔＤＭ体ヲＩＯＩ！ＩＩｔノ蒸留水（ＩＣＯＨ”ＱｐＨ
＆５１Ｃ１１ｉＩ盛ＪＣＩＩ濁し、−一酒石酸二カリウ
ム塩をｔ　ｔ　ｙ　ｓ　ｇ　（ａ　ｓ　ｍｏ１／ｌ　Ｊ
　、及び第３！！！に示すキレート剤を１５　ｍＭ添加
し、５０℃で振とうし、１６時間後、５５時間後の生成
ピルビン酸の量を測定した。Table 3
・Millimol lL//l Example 5 Collect bacteria in the same manner as in Example 1, 2 OIIL 1 minute tDM cells! IIt distilled water (ICOH”QpH
&51C11iI JCII cloudy, -monotartrate dipotassium salt
, and the third! ! ! 15 mM of the chelating agent shown above was added, the mixture was shaken at 50°C, and the amount of pyruvic acid produced was measured 16 and 55 hours later.

結果を第４表に示した。The results are shown in Table 4.

第　　４　　表 生成量を１００とした相対値で示した。Table 4 It is expressed as a relative value with the production amount as 100.

実施例４ シュードモナス・グチダ（ＡＴＯＯ１７６４２）の代わ
りに、第４表に示す微生物及びキレート剤を用いる以外
は、実施例２と同様の操作を行ない、結果を第５表に示
した。Example 4 The same operations as in Example 2 were carried out, except that the microorganism and chelating agent shown in Table 4 were used instead of Pseudomonas gutida (ATOO17642), and the results are shown in Table 5.

第　　５　　表 巖フ　キレート剤無添加系の１６時間後のピルビン讃の
生成量＠１１３０とした相対値で示した。Table 5: The amount of pyrubinsan produced after 16 hours in the system without the addition of a chelating agent is expressed as a relative value @1130.

（発明の効果〕 本発明によれば、−系中にアミノポリカルボン酸系のキ
Ｖ−）剤を添加することにより、工業的に有利な生コ体
またはその簡単な処理物の使用を可能にし、酵素の安定
性が増し、生成ビルビン酸の分解が抑えられることによ
り入手が容品で、安価なシー酒石酸よりピ〃ビン酸が高
収率で得られる。(Effects of the Invention) According to the present invention, by adding an aminopolycarboxylic acid-based agent to the - system, it is possible to use industrially advantageous raw materials or easily processed products thereof. By increasing the stability of the enzyme and suppressing the decomposition of the produced biruvic acid, pivic acid can be obtained in higher yields than the readily available and inexpensive sea tartaric acid.

Claims (2)

【特許請求の範囲】[Claims] （１）Ｌ−酒石酸デヒドラターゼを有する微生物の培養
物又はその処理物の存在下、Ｌ−酒石酸またはその塩か
らピルビン酸を生成蓄積せしめ採取する際、系中にアミ
ノポリカルボン酸系のキレート剤を添加することを特徴
とするピルビン酸の製造方法。(1) When producing and collecting pyruvic acid from L-tartaric acid or its salts in the presence of a culture of a microorganism having L-tartrate dehydratase or a processed product thereof, an aminopolycarboxylic acid-based chelating agent is added to the system. A method for producing pyruvic acid, which comprises adding pyruvic acid. （２）Ｌ−酒石酸デヒドラターゼを有する微生物がシュ
ードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する微生
物である特許請求の範囲第１項記載のピルビン酸の製造
方法。(2) The method for producing pyruvic acid according to claim 1, wherein the microorganism having L-tartrate dehydratase is a microorganism belonging to the genus Pseudomonas.