JPS5816692A - Preparation of l-tryptophan by enzyme - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To form the titled substance in high yield and to collect it, by reacting <= a fixed amount of indole with L-serine in the presence of tryptophan synthetase. CONSTITUTION:In the presence of tryptophan synthetase obtained from a bacterium belonging to the genus Escherichia coli indole is reacted with L-serine. In the reaction, indole is added continuously or termittently in such a way that the indole concentration in the reaction solution is maintained in <=0.1wt%. The addition is carried out by adding powder indole, adding liquefied indole dropwise, or adding indole dissolved in methanol, etc. Consequently, the desired L- tryprophan slightly containing remaining indole in the reaction solution is obtained in high yield from indole and L-serine.

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、インドールとＬ−セリンからエソシエリヒア
・コリ（Ｆｉｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　）　　
の生産するトリプトファン・シンセターゼの作用でＬ−
）リプトファンを製造する際に、原料であるインドール
を連続または断続的に添加することによって反応液中の
インドール濃度を０．１重量％以下のような低濃度に制
御し、該酵素による反応を効率よく進行させるＬ−トリ
プトファンの製造方法に関するものである。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention provides a method for preparing Fischerichia coli from indole and L-serine.
L- by the action of tryptophan synthetase produced by
) When producing liptophan, the indole concentration in the reaction solution is controlled to a low concentration of 0.1% by weight or less by continuously or intermittently adding the raw material indole, and the reaction by the enzyme is controlled. The present invention relates to an efficient method for producing L-tryptophan.

近年、Ｌ−）ＩＪブトファンは医薬用のみならず飼料添
加物としての効果が世の注目を集めるに至シ、工業的規
模による安価な本物質生産の期待が高まってきている。In recent years, L-)IJ butophane has attracted attention not only for its medicinal use but also for its effectiveness as a feed additive, and expectations for the inexpensive production of this substance on an industrial scale are increasing.

Ｌ−）リプトファンを生産せしめる方法として、化学合
成法および発酵法が数多く知られているが、化学合成法
の場合はＤＬ体が合成されるためにＬ体を得るのに光学
分割しな“ければならないという欠点があり、又、発酵
法の場合は蓄積量、収率、精製、廃水処理などに欠点が
あっていずれも工業上有利な生産方法には至ってい々い
。これらの方法に代って最近酵素法によるＬ−）リプト
ファンの生産が脚光を浴びてきており、中でもトリプト
ファン・シンセターゼを用いて、インドールとＬ−セリ
ンからＬ−）リプトファンを製造する方法は工業上、非
常に有望と考えられる。Many chemical synthesis methods and fermentation methods are known as methods for producing L-)liptophan, but in the case of chemical synthesis, the DL form is synthesized, so optical resolution is not required to obtain the L form. In addition, the fermentation method has drawbacks in terms of accumulation amount, yield, purification, wastewater treatment, etc., and these methods are far from being industrially advantageous production methods. Instead, the production of L-) liptophan by enzymatic methods has recently been in the spotlight, and in particular, the method of producing L-) liptophan from indole and L-serine using tryptophan synthetase is industrially very important. It is considered to be promising.

従来、トリプトファン・シンセターゼがインドールとＬ
−セリンからＬ−トリプトファンを合成する反応を触媒
することは知られているが、本発明者らの知見によれば
反応基質であるインドールが通常０１重量％以上の高濃
度になると酵素活性を阻害するために反応開始時に高濃
度のインドールを一括して仕込むことが出来ず、従って
インドール濃度を低濃度として反応を行わざるを得ない
ために生成するＬ−）リブトファンの濃度は通常数ｔμ
程度と非常に低く、実用的な製造方法にはＡシ得なかっ
た。この問題を解決する他の方法として、反応液中に非
イオン性の界面活性剤を添加してインドールとミセルを
形成させ、インドールの反応液中への溶解をコントロー
ルする方法が知られているが、この方法の場合は通常５
重量％以上のようなかなりの高濃度の界面活性剤を添加
する必要がありコスト上の問題に加えて、反応液からの
トリプトファンの精製分離或いは□反応廃液の廃水処理
に問題があって工業上有利な方法とは言い難いものであ
った。Traditionally, tryptophan synthetase has been synthesized by indole and L.
-It is known that it catalyzes the reaction to synthesize L-tryptophan from serine, but according to the findings of the present inventors, indole, which is a reaction substrate, inhibits enzyme activity when it reaches a high concentration of 0.1% by weight or higher. Therefore, it is not possible to charge a high concentration of indole all at once at the start of the reaction, and therefore the reaction must be carried out with a low indole concentration, so the concentration of L-)ributophane produced is usually several tμ.
The degree of oxidation was so low that it could not be used as a practical manufacturing method. Another method known to solve this problem is to add a nonionic surfactant to the reaction solution to form micelles with indole to control the dissolution of indole into the reaction solution. , this method usually has 5
It is necessary to add a surfactant at a fairly high concentration (more than 1% by weight), which causes problems in terms of cost, as well as problems in the purification and separation of tryptophan from the reaction solution or the wastewater treatment of the reaction waste solution, making it difficult for industrial use. It could hardly be called an advantageous method.

本発明者らは、酵素の活性を低下させることなく、反応
終了後の反応液中に残存インドールがなくしかもＬ−）
リプトフ７ノを高濃度で生成する反応条件を種々検討し
た結果、反応液中のインドール濃度を０．１重量％以下
に保つようにインドールを連続または断続的に添加して
反応せしめることにより、酵素の活性の低下もなくしか
も高収量でＬ−）ＩＪブトファンが生成することを見出
し本発明を完成した。The present inventors have discovered that there is no residual indole in the reaction solution after the completion of the reaction, and L-) without reducing the activity of the enzyme.
As a result of various studies on reaction conditions for producing Liptov 7 at a high concentration, we found that indole was added continuously or intermittently to keep the indole concentration in the reaction solution at 0.1% by weight or less. The present invention was completed by discovering that L-)IJ butophane can be produced in high yield without any decrease in activity.

本発明の方法によれば、トリプトファンを高＾ 収量で生成させるだけでなく、反応液中のインドール濃
度は常に低濃度に制御されているので、反応終了時に反
応液中にインドールが殆んど残存しない利点もあり、こ
のことは後続の精製にか＼る負担を著しく軽減するもの
である。これに反し、高濃度のインドールを反応開始時
に一括に仕込む方法では、Ｌ−トリプトファンは非常に
低濃度でしか得られないばかりか、反応終了時の反応液
中の残インドール量が著しく多くなるという欠点を有し
ている。According to the method of the present invention, not only tryptophan is produced in a high yield, but also the indole concentration in the reaction solution is always controlled to a low concentration, so that almost no indole remains in the reaction solution at the end of the reaction. There is also the advantage of not having to do so, which significantly reduces the burden of subsequent purification. On the other hand, when high-concentration indole is added all at once at the start of the reaction, L-tryptophan can only be obtained at a very low concentration, and the amount of indole remaining in the reaction solution at the end of the reaction increases significantly. It has its drawbacks.

本発明に使用するトリプトファン・シンター生産菌とし
てはエソシェリヒア・コリに属する微生物、例えばエッ
シェリヒア・コリＭＴ−１ｏ２ｓ２（ＦＫＲＭ　　ＢＰ
−１９）、エッシェリヒアーコリＭ　Ｔ　−１０２４２
（ＩＦＫＲＭ　　ＢＰ−２０）など、が使用され、本酵
素を反応で使用するときには精製された酵素または菌体
または菌体を破砕して得られる無細胞抽出液、或いは酵
素または菌体を固定化して得られる固定化物を酵素源と
して使用することが出来る。インドールを連続または断
続的に添加する方法としては、インドールを粉体フィー
ダーなどを用いて粉体の状態で添加する方法、５２℃以
上に加温してインドールを溶融して液状のインドールを
滴下またはポンプで添加する方法またはメタノール、エ
タノールなどのアルコールにインドールを溶解させた後
ポンプなどで添加する方法などが使用できる。The tryptophan sinter-producing bacteria used in the present invention include microorganisms belonging to Escherichia coli, such as Escherichia coli MT-1o2s2 (FKRM BP
-19), Escherichiacoli M T -10242
(IFKRM BP-20), etc. are used, and when using this enzyme in a reaction, purified enzyme or bacterial cells, a cell-free extract obtained by crushing bacterial cells, or immobilized enzymes or bacterial cells are used. The resulting immobilized product can be used as an enzyme source. Methods for continuously or intermittently adding indole include adding indole in powder form using a powder feeder, heating to 52°C or higher to melt indole, and adding liquid indole dropwise. A method of adding with a pump or a method of dissolving indole in an alcohol such as methanol or ethanol and then adding with a pump or the like can be used.

反応液中のインドール濃度をｏ、　ｉ重量％以下に保ち
ながら基質のインドールを添加するためには、反応液中
のインドール濃度を連続または断続的に測定し、この値
をフィーダー（粉体フィーダーまたはポンプなど）にフ
ィードバックする必要があるが、この反応液中のインド
ール濃度を定量する方法としては、例えば、ＰＢ０２０
Ｍのカラムを用いてガス・クロマトグラフィーで測定す
る方法または反応液中のインドールをｎ　−ヘキサンな
どで抽出して２５０−２７０ｎｍに於けるインドールの
紫外部吸収を測定する方法などを採用することができる
。In order to add the substrate indole while keeping the indole concentration in the reaction solution below o, i% by weight, the indole concentration in the reaction solution is measured continuously or intermittently, and this value is added to the feeder (powder feeder or However, as a method for quantifying the indole concentration in this reaction solution, for example, PB020
A method of measuring by gas chromatography using a M column or a method of extracting indole in the reaction solution with n-hexane etc. and measuring the ultraviolet absorption of indole at 250-270 nm can be adopted. can.

本発明の製造方法によれば、インドールとＬ−セリンか
ら高収量で且つ反応液中の残インドールが殆んどなく目
的とするＬ−）リプトファンを得ることができるので、
本発明はＬ−トＩＪブトファンの工業的生産に大いに貢
献するものと思われる。According to the production method of the present invention, the desired L-)liptophan can be obtained from indole and L-serine in high yield and with almost no residual indole in the reaction solution.
It is believed that the present invention will greatly contribute to the industrial production of L-toIJ butophane.

以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。Hereinafter, the present invention will be explained in more detail with reference to Examples.

実施例１ トリプトファン・シンターゼ生産菌であるエツンエリヒ
ア・コリＭ　Ｔ　−１ｏ２３２（ＦＥＲＭ　ＢＰ−１９
）を５００ｍ１の坂ロフラスコ中の第１表に示す組成の
培地１００ｍ１に接種し、３５℃で２４時間培養した。Example 1 Tryptophan synthase-producing bacterium Etunerichia coli MT-1o232 (FERM BP-19)
) was inoculated into 100 ml of a medium having the composition shown in Table 1 in a 500 ml Sakaro flask, and cultured at 35° C. for 24 hours.

この培養液２ｏｏｍ／（フラスコ２本）を３０ｔのジャ
ーファーメンタ−中ρ第２表に示す組成の培地１５ｔに
接種し、３５℃、ｐＨ６，８（２８％アンモニア水でコ
ントロール）テ３０時間培養した。培養終了後、該培養
液を遠心集菌して湿菌体を４０２ずつ分取し、−１５℃
で２日間凍結した。この凍結菌体を反応直前に解凍し、
酵素源と、して使用した。第６表に示す組成の反応液１
ｔを用いて、反応液中のインドールは、ガスクロマトグ
ラフィーで分析しながら、消費された時点で０１１重量
％なるように断続的に添加し、最終的にインドール添加
濃度が２重量％に相当する量になる迄反応を実施した。Two ounces of this culture solution (two flasks) was inoculated into 15 tons of a medium with the composition shown in Table 2 in a 30-ton jar fermenter, and cultured at 35°C, pH 6.8 (controlled with 28% ammonia water) for 30 hours. did. After culturing, the culture solution was collected by centrifugation, and 402 wet cells were collected at -15°C.
It was frozen for 2 days. Thaw the frozen bacterial cells immediately before the reaction,
It was used as an enzyme source. Reaction solution 1 with the composition shown in Table 6
Using t, indole in the reaction solution was intermittently added to 0.11% by weight when it was consumed while being analyzed by gas chromatography, and the final concentration of indole added corresponded to 2% by weight. The reaction was carried out until the amount was reached.

反応温度は３５℃、ｐＨ８，５で反応に要した時間は２
４時間であった。比較例として、反応開始時にインドー
ル濃度を２チとして一括仕込んだ組成の反応液（他の成
分は第３表に同じ）を用いて２４時間反応を実施した。The reaction temperature was 35°C, the pH was 8.5, and the time required for the reaction was 2.
It was 4 hours. As a comparative example, a reaction was carried out for 24 hours using a reaction solution having a composition (other components were the same as in Table 3) that was charged at once with an indole concentration of 2 at the start of the reaction.

結果を第４表に示した。The results are shown in Table 4.

第　　１　　表 エールリッヒ肉エキス　　　　　１０ｆポリペプトン　
　　　　　　　　１０グＮａＣ１５ｆ 蒸溜水１ｔに希釈して使用（ｐＨ６，８）第　　２　　
表 グルコース　　　　　　　　　１０　　　ｆ（ＮＨ，）
２ＳＯ，１，５ｆｔ’ に２ＨＰ０．　　　　　　　　　　　　１　　９ＭＹ　
　Ｓｏ、拳７Ｈ２０１ｆ ポリペプトン　　　　　　　　　ｏ５　グ酵母エキス　
　　　　　　　　　ｏ５　グＬ−トリプトファン　　　
　　　０．１５ｆアデカノールＬＧ−８０５５ｆ 蒸溜水で１ｔに希釈して使用（ｐＨ６，８）第　　６　
　表 インドール　　　　　　　　１２ Ｌ−セリフ　　　　　　　２０１Ｆ ピリドキサプレ５′−リン酸　　　　　　　　０．１２
（ＮＨ，）２Ｓｏ、　　　　　　　　　　　　　　１　
Ｏｆ湿菌体　　　　　　　　　４０２ 蒸溜水で１ｔに希釈して使用 第　　４　　表 実施例２ 反応液中のインドール濃度はｎ−ヘキサンで抽出して２
Ｓ６ｎｍに於けるインドールの紫外部吸収を測定する方
法で反応進行中連続的に測定し、この分析装置をインド
ールの粉体フィーダーに連動させて、反応液中のインド
ール濃度を２００ｐｐｍに制御しながら反応を行った他
は実施例１と同様の操作を施した。反応時間は１６時間
であシ、得られた結果を第５表に示した。Table 1 Ehrlich meat extract 10f polypeptone
10g NaC15f Diluted in 1t of distilled water and used (pH 6,8) 2nd
Table glucose 10 f(NH,)
2SO, 1.5ft' with 2HP0. 1 9MY
So, fist 7H201f polypeptone o5 yeast extract
o5 G-L-tryptophan
0.15f Adekanol LG-8055f Diluted to 1t with distilled water and used (pH 6, 8) No. 6
Table Indole 12 L-Serif 201F Pyridoxapre 5'-phosphoric acid 0.12
(NH,)2So, 1
Of wet bacterial cells 402 Diluted to 1 t with distilled water and used Table 4 Example 2 The indole concentration in the reaction solution was extracted with n-hexane and used.
The ultraviolet absorption of indole at S6nm was continuously measured during the progress of the reaction, and this analyzer was linked to an indole powder feeder to control the indole concentration in the reaction solution to 200 ppm while the reaction was carried out. The same operations as in Example 1 were performed except that. The reaction time was 16 hours, and the results are shown in Table 5.

第　　５　　表 実施例３ トリプトファン・シンセターゼ生産菌であるエッシエリ
ヒア・コリＭ　Ｔ　−１０２４２（Ｆ’ＥＲＭＢＰ−２
０）を用いて実施例２と同様の操作を行なった。得られ
た結果を第６表に示した。Table 5 Example 3 Tryptophan synthetase producing bacterium Escherichia coli MT-10242 (F'ERMBP-2
The same operation as in Example 2 was performed using 0). The results obtained are shown in Table 6.

第　　６　　表 特許出願人 三井東圧化学株式会社Table 6 patent applicant Mitsui Toatsu Chemical Co., Ltd.

Claims (1)

【特許請求の範囲】 エノシエリヒア・コリに属する微生物の生産するトリプ
トファン・シンセターゼの存在下インドールとＬ−セリ
ンとを反応させてＬ−）リプトファンを製造する方法に
おいて、反応液中のインドール濃度を、０１重量％以下
に保つようハ ンの製造方法。[Claims] A method for producing L-)liptophan by reacting indole and L-serine in the presence of tryptophan synthetase produced by a microorganism belonging to Enoschierichia coli, wherein the indole concentration in the reaction solution is 0. A method of manufacturing han to keep it below 1% by weight.