JPS63159399A - B細胞刺激因子 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
(産業上の利用分野)
本発明は免疫学の分野に関し、より詳細にはB細胞刺激
因子の精製、クローニングおよび同定に関する。
因子の精製、クローニングおよび同定に関する。
(従来技術)
3972球(B細胞)は恐らく骨髄でプレB細胞に分化
する幹細胞前駆体から発生する。プレB細胞はB細胞に
成熟し、その後B細胞は適当な刺激により抗体産生形質
細胞に分化する。Bi砲の成熟/分化は2段階で起こる
と考えられる。第1段階において、Bla胞は免疫グロ
ブIJ 7M (IgM)を発現し得る形質細胞に成熟
する。これらの細胞。
する幹細胞前駆体から発生する。プレB細胞はB細胞に
成熟し、その後B細胞は適当な刺激により抗体産生形質
細胞に分化する。Bi砲の成熟/分化は2段階で起こる
と考えられる。第1段階において、Bla胞は免疫グロ
ブIJ 7M (IgM)を発現し得る形質細胞に成熟
する。これらの細胞。
のいくつかは血液、肺臓および末梢リンパ節に移動して
、IgMを産生じ続ける。第2成熟段階では、他のB細
胞が免疫グロブリンG (I、G)を産生じ得る形質細
胞に分化し、そのうちのいくつかは周辺組織に移動する
が、他のものは骨髄中に残って、あとで免疫グロブリン
A(IgA)産生細胞になる。
、IgMを産生じ続ける。第2成熟段階では、他のB細
胞が免疫グロブリンG (I、G)を産生じ得る形質細
胞に分化し、そのうちのいくつかは周辺組織に移動する
が、他のものは骨髄中に残って、あとで免疫グロブリン
A(IgA)産生細胞になる。
種々のB細胞因子はB細胞の成熟抗体分泌形質細胞への
生長を調節するが、別のB細胞因子は抗体分泌形質細胞
の分化を調節し、またさらに別の因子はB細胞前駆体集
団、すなわち1プレB細泡1の生長および分化を調節す
ると考えられる。
生長を調節するが、別のB細胞因子は抗体分泌形質細胞
の分化を調節し、またさらに別の因子はB細胞前駆体集
団、すなわち1プレB細泡1の生長および分化を調節す
ると考えられる。
77ラー(Farrar)らのJ、 Immunol、
131:1838(1983) ;およびハワート”
(Howard)らのJ。
131:1838(1983) ;およびハワート”
(Howard)らのJ。
EXpoMed、 155:914(1982) は
B細胞の生長または増殖を刺激すると書かれたB細胞刺
激因子(”BCGF”または”BSF’−1” とも
呼ばれる)を開示している。このB細胞因子はホルボー
ルミリステートアセテート(PMA)で刺激したTヘル
パー線中1から誘導された。さらに、ダット:/ (D
utton)らのJ、 工mmunoL 132 :
2451(1984)は、B細胞を大型の抗体産生形質
細胞へ分化させると書かれたB細胞因子(’BCGF’
[[”または“BCDF”として知られる)の単離を
報告した。比較的最近の研究は、恐ら(BSF−1が休
止B細胞に作用して、その後の抗免疫グロブリンとの相
互作用の際にそれらが8期に入るのを促進する旨示唆し
た。ラビン(Rabin)らのProc、 Nat’1
. Acad、 Sci。
B細胞の生長または増殖を刺激すると書かれたB細胞刺
激因子(”BCGF”または”BSF’−1” とも
呼ばれる)を開示している。このB細胞因子はホルボー
ルミリステートアセテート(PMA)で刺激したTヘル
パー線中1から誘導された。さらに、ダット:/ (D
utton)らのJ、 工mmunoL 132 :
2451(1984)は、B細胞を大型の抗体産生形質
細胞へ分化させると書かれたB細胞因子(’BCGF’
[[”または“BCDF”として知られる)の単離を
報告した。比較的最近の研究は、恐ら(BSF−1が休
止B細胞に作用して、その後の抗免疫グロブリンとの相
互作用の際にそれらが8期に入るのを促進する旨示唆し
た。ラビン(Rabin)らのProc、 Nat’1
. Acad、 Sci。
(USA) 82 : 2935(1985) ;
およびオリバー(Oliver)らのProc、 N
atl Acad、Sci、(USA)82 : 24
65(1985)を参照されたい。これらの研究はBS
F−1が実際に生長因子ではなくむしろ分化因子であり
うることを示した。生長型であろうと分化型であろうと
、B細胞刺激因子として役立つと考えられるホルモン類
の機能に関する混同、ならびにこれらの因子の同定の不
足は、B細胞が短命であって約15日のみの寿命を有す
ることに少なくとも幾分か原因がある。
およびオリバー(Oliver)らのProc、 N
atl Acad、Sci、(USA)82 : 24
65(1985)を参照されたい。これらの研究はBS
F−1が実際に生長因子ではなくむしろ分化因子であり
うることを示した。生長型であろうと分化型であろうと
、B細胞刺激因子として役立つと考えられるホルモン類
の機能に関する混同、ならびにこれらの因子の同定の不
足は、B細胞が短命であって約15日のみの寿命を有す
ることに少なくとも幾分か原因がある。
B細胞因子の分析および同定がほとんど進行しなかった
他の理…は、これらの因子を効果的に研究するのに十分
な量および純度でそれらを生産する方法が今まで開発さ
れなかったということにある。十分な量の均質β細胞因
子の利用可能性は、B細胞が幹細胞から分化してその後
形質細胞に成熟する経路を研究するのに有用であるばか
りでなく、特にB細胞の欠乏によって起こる免疫不全症
で苦しむ患者の治療の際の精製因子の使用可能性を研究
する上でも極めて価値があるだろう。
他の理…は、これらの因子を効果的に研究するのに十分
な量および純度でそれらを生産する方法が今まで開発さ
れなかったということにある。十分な量の均質β細胞因
子の利用可能性は、B細胞が幹細胞から分化してその後
形質細胞に成熟する経路を研究するのに有用であるばか
りでなく、特にB細胞の欠乏によって起こる免疫不全症
で苦しむ患者の治療の際の精製因子の使用可能性を研究
する上でも極めて価値があるだろう。
さらに、B細胞因子は広範囲の病気の治療のためのヒト
モノクローナル抗体の生産に使用されるだろう。大部分
のモノクローナル抗体は、特定抗原に対する抗体を産生
ずる短命の正常B細胞と、いつまでも限シなく生存する
ことができる悪性B細胞と、の輪金により形成されるハ
イプリトーマ細胞によって生産される。このハイプリド
−マを培養して、特定抗原に特異的なモノクローナル抗
体を得る。ネズミモノクローナル抗体はすでに生産され
て同定されたが、ヒトハイブリド−マからの有意量のヒ
トモノクローナル抗体の生産はほとんど成功1〜なかっ
た。十分量の均質B細胞因子の利用可能性は、通常短命
の抗体産生ヒ)B細胞の大規模連続培養を維持するため
にこの種の因子の使用可能性を高める。これはヒトモノ
クローナル抗体を開発しようと試みるときに現存する諸
問題を解決するかも知れない。さらに、B細、中因子の
この用途は、ハイブリド−マ技術に存在するB細胞への
呼瘍遺伝子の導入を排除するであろう。
モノクローナル抗体の生産に使用されるだろう。大部分
のモノクローナル抗体は、特定抗原に対する抗体を産生
ずる短命の正常B細胞と、いつまでも限シなく生存する
ことができる悪性B細胞と、の輪金により形成されるハ
イプリトーマ細胞によって生産される。このハイプリド
−マを培養して、特定抗原に特異的なモノクローナル抗
体を得る。ネズミモノクローナル抗体はすでに生産され
て同定されたが、ヒトハイブリド−マからの有意量のヒ
トモノクローナル抗体の生産はほとんど成功1〜なかっ
た。十分量の均質B細胞因子の利用可能性は、通常短命
の抗体産生ヒ)B細胞の大規模連続培養を維持するため
にこの種の因子の使用可能性を高める。これはヒトモノ
クローナル抗体を開発しようと試みるときに現存する諸
問題を解決するかも知れない。さらに、B細、中因子の
この用途は、ハイブリド−マ技術に存在するB細胞への
呼瘍遺伝子の導入を排除するであろう。
比較的多量の均質B細胞因子を得るための1つの可能な
方法は組換えDNA技術による。タンパク質系物質を生
産するだめの組換えDNA技術の一般的議論は5cie
nce、 Vol 196(1977) の編集補助
論文に説明されている。しかしながら、この種の技術を
首尾よく使用するには、天然および組換えB細胞因子ま
たはその活性を確実に測定しうるばかりでなく、天然産
物と組換え産物の両方を均質になる壕で精製しうろこと
もまた必要である。
方法は組換えDNA技術による。タンパク質系物質を生
産するだめの組換えDNA技術の一般的議論は5cie
nce、 Vol 196(1977) の編集補助
論文に説明されている。しかしながら、この種の技術を
首尾よく使用するには、天然および組換えB細胞因子ま
たはその活性を確実に測定しうるばかりでなく、天然産
物と組換え産物の両方を均質になる壕で精製しうろこと
もまた必要である。
(発明の構成)
本発明はB細胞刺激因子(BSF−1)、天然および組
換えBSF−1の均質精製、均質BSF’−1の同定、
BSF’−1をコードする遺伝子のクローニング、成熟
BSF−1を発現させるだめの上記遺伝子の使用、なら
びに天然および組換えBSF’−1の信頼しうる検定法
に関する。本発明によれば、粗製BSF’−1調製物は
吸着、イオン交換クロマトグラフィーおよび高性能液体
クロマトグラフィー法の組合せにより精製される。精製
工程からの分画はドデシル硫酸ナトリウムポリアクリル
アミド9ゲル電気泳動(SDS−PAGE)およびその
後の銀染色により監視された。ひとたび均質に精製され
ると、BSF−1モジユールのアミノ酸配列が分析され
る。
換えBSF−1の均質精製、均質BSF’−1の同定、
BSF’−1をコードする遺伝子のクローニング、成熟
BSF−1を発現させるだめの上記遺伝子の使用、なら
びに天然および組換えBSF’−1の信頼しうる検定法
に関する。本発明によれば、粗製BSF’−1調製物は
吸着、イオン交換クロマトグラフィーおよび高性能液体
クロマトグラフィー法の組合せにより精製される。精製
工程からの分画はドデシル硫酸ナトリウムポリアクリル
アミド9ゲル電気泳動(SDS−PAGE)およびその
後の銀染色により監視された。ひとたび均質に精製され
ると、BSF−1モジユールのアミノ酸配列が分析され
る。
アミノ酸配列の情報は、BSF’−1のアミノ酸配列の
一部に対応する合成ポリオリゴヌクレオチドプローブの
作製のために使用される。このプローブを用いて、比較
的高レベルのBSF’−1’e産生ずると考えられる細
胞から抽出されたmRNAより作製されたcDNAライ
ブラリーからBSF’−1遺伝子を単離することができ
る。この目的のために、この種の細胞から全RNA
″f:抽出する。全RNA抽出物からポIJ A+mR
NA f単離する。cDNAライブラリーは逆転写酵
素による4 1J A mRNA の逆転写により作
製される。そのDNAはDNAポリメラーゼエi用いて
二本鎖となし、適当なりローニングベクターに挿入する
。得られる組換えクローニングベクターを使って、適当
な原核生物または真核生物宿主全形質転換する。
一部に対応する合成ポリオリゴヌクレオチドプローブの
作製のために使用される。このプローブを用いて、比較
的高レベルのBSF’−1’e産生ずると考えられる細
胞から抽出されたmRNAより作製されたcDNAライ
ブラリーからBSF’−1遺伝子を単離することができ
る。この目的のために、この種の細胞から全RNA
″f:抽出する。全RNA抽出物からポIJ A+mR
NA f単離する。cDNAライブラリーは逆転写酵
素による4 1J A mRNA の逆転写により作
製される。そのDNAはDNAポリメラーゼエi用いて
二本鎖となし、適当なりローニングベクターに挿入する
。得られる組換えクローニングベクターを使って、適当
な原核生物または真核生物宿主全形質転換する。
形質転換宿主を同定し、プール別に分け、サブ。
ンブロノト法によりスクリーニングする。この方法にお
いて、これらのプールから一部されたプラスミド″DN
Aは、BSF−1のアミノ酸配列の一部に対応する放射
性標識された合成オリゴヌクレオチドプローブとハイブ
リダイズさせる。プローブに対して陽性信号を与えるク
ローンのプールを同定し、その後そのプールを直接コロ
ニースクリーニングにより選別する。このスクリーニン
グ法では、陽性プールからの個々の形質転換細胞を平板
培養して、その培養物からプラスミドDNA’ip製す
る。そのプラスミドDNAを全RNAとハイブリダイズ
させ、それはin VitrOで翻訳させたときにBS
F−1生物活性(BSF’−1活性mRNA)を生ずる
ことがわかった。この方法により、BSF’−1をコー
ドするプラスミドDNAを含む個々の形質転換細胞が同
定される。その形質転換細胞からプラスミド5DNAを
調製し、そしてその遺伝子のヌクレオチピ組成および配
列を確立するために塩基配列の決定を行う。
いて、これらのプールから一部されたプラスミド″DN
Aは、BSF−1のアミノ酸配列の一部に対応する放射
性標識された合成オリゴヌクレオチドプローブとハイブ
リダイズさせる。プローブに対して陽性信号を与えるク
ローンのプールを同定し、その後そのプールを直接コロ
ニースクリーニングにより選別する。このスクリーニン
グ法では、陽性プールからの個々の形質転換細胞を平板
培養して、その培養物からプラスミドDNA’ip製す
る。そのプラスミドDNAを全RNAとハイブリダイズ
させ、それはin VitrOで翻訳させたときにBS
F−1生物活性(BSF’−1活性mRNA)を生ずる
ことがわかった。この方法により、BSF’−1をコー
ドするプラスミドDNAを含む個々の形質転換細胞が同
定される。その形質転換細胞からプラスミド5DNAを
調製し、そしてその遺伝子のヌクレオチピ組成および配
列を確立するために塩基配列の決定を行う。
このクローニング法は初めに特定動物種から作製された
cDNAライブラリーに対して行われる。
cDNAライブラリーに対して行われる。
ひとたび初期動物種のBSF−1遺伝子を含むCDNA
が単離・同定されると、その遺伝子またはその一部をプ
ローブとして用いて別の種からのcDNAライブラリー
をスクリーニングし、それにより第2の種の相同BSF
−1遺伝子が単離される。
が単離・同定されると、その遺伝子またはその一部をプ
ローブとして用いて別の種からのcDNAライブラリー
をスクリーニングし、それにより第2の種の相同BSF
−1遺伝子が単離される。
意図するBSF’−1遺伝子は適当な原核または真核細
胞系にクローニングして成熟BSF’−1を発現させる
。その後、天然BSF’−1’et’lする際に使用し
たHPLC法と同じ方法を用いて、組候えBSF−1を
均質になるまで精製する。
胞系にクローニングして成熟BSF’−1を発現させる
。その後、天然BSF’−1’et’lする際に使用し
たHPLC法と同じ方法を用いて、組候えBSF−1を
均質になるまで精製する。
本発明はさらにコト″/の付加、置換または欠失により
野生型BSF−1遺伝子の類似体を作製し、それにより
BSF−1タンパク質産物の生物活性に実質的に影響を
及ぼすことなく1個またはそれ以上のアミノ酸残基が付
加、置換または欠失さ扛たBSF−1’に発現させるこ
とに関する。
野生型BSF−1遺伝子の類似体を作製し、それにより
BSF−1タンパク質産物の生物活性に実質的に影響を
及ぼすことなく1個またはそれ以上のアミノ酸残基が付
加、置換または欠失さ扛たBSF−1’に発現させるこ
とに関する。
本発明はまた発現されたタンパク質産物が実際にBSF
’−tであることを確かめるためのバイオアッセイ、な
らびに本発明方法の使用によ!7M製された天然および
組換えBSF″−1の均質性を定量するためのバイオア
ッセイに関する。精製操作中の全分画は同時にBSF’
−1、インターロイキン2(IL−2) およびイン
ターロイキン3 (工L−3)活性について監視され、
そして5DS−PAGEおよび銀染色法によシ分析され
る。
’−tであることを確かめるためのバイオアッセイ、な
らびに本発明方法の使用によ!7M製された天然および
組換えBSF″−1の均質性を定量するためのバイオア
ッセイに関する。精製操作中の全分画は同時にBSF’
−1、インターロイキン2(IL−2) およびイン
ターロイキン3 (工L−3)活性について監視され、
そして5DS−PAGEおよび銀染色法によシ分析され
る。
好ましくは、粗BSF−1調製物はin yitroで
BSF−1を産生ずることが知られている細胞を血清含
有培地中で種々の添加物および活性化剤(例えば植物マ
イトジェンまたはホルボールエステル)の存在下に培養
することによってつくられる。適当な培養期間後に培地
を収穫し、 BSF’−1をより濃縮された形へ精製す
べく処理する。
BSF−1を産生ずることが知られている細胞を血清含
有培地中で種々の添加物および活性化剤(例えば植物マ
イトジェンまたはホルボールエステル)の存在下に培養
することによってつくられる。適当な培養期間後に培地
を収穫し、 BSF’−1をより濃縮された形へ精製す
べく処理する。
本発明によれば、正常T細胞および悪性腫瘍細胞を含め
た多種多様の細胞および細胞株が、粗BSF−1の生産
のために利用し得る。呻瘍細胞株はいろいろな方法、例
えば自然発生、ウィルスによる形質転換または放射線照
射によって発生する。
た多種多様の細胞および細胞株が、粗BSF−1の生産
のために利用し得る。呻瘍細胞株はいろいろな方法、例
えば自然発生、ウィルスによる形質転換または放射線照
射によって発生する。
本発明はネズミ悪性細胞株EL4を用いて有利に行われ
た。この細胞株は米国メリーランド州20852、ロッ
クビル、パークローン上9ライブ12301、アメリカ
ン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)
から入手可能である。EL4細胞は研究者の間に広く
行き渡っており、一般に多くの源から入手しうる。本発
明において使用される正常T細胞を含む組織の例には末
梢血液白血球、牌細胞、リンパ節細拘および胸腺または
扁桃腺細吻が含まれる。
た。この細胞株は米国メリーランド州20852、ロッ
クビル、パークローン上9ライブ12301、アメリカ
ン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)
から入手可能である。EL4細胞は研究者の間に広く
行き渡っており、一般に多くの源から入手しうる。本発
明において使用される正常T細胞を含む組織の例には末
梢血液白血球、牌細胞、リンパ節細拘および胸腺または
扁桃腺細吻が含まれる。
前記の細胞株と共に、粗ESF−1の生産のために用い
られる培地は例えばロスウェル・パーク・メモリアル・
インスチチュー) (RPMI)−1600培地、イー
グルの最少必須培地(MEM)、 ダルベツコの修飾イ
ーグル培地(DMEM) およびクリソロス培地のよ
うな市販されている培地でありうる。
られる培地は例えばロスウェル・パーク・メモリアル・
インスチチュー) (RPMI)−1600培地、イー
グルの最少必須培地(MEM)、 ダルベツコの修飾イ
ーグル培地(DMEM) およびクリソロス培地のよ
うな市販されている培地でありうる。
BSF−1細胞の培養に用いられる血清はウシ胎児血清
(Fe2 )、正常ヒト血清および他の血清のような種
々の源から誘導される。ペニシリン、ストレプトマイシ
ンおよびゲンタマイシンのような各種の抗生物質を含め
た添加物も個々にまたは組合せで培地に添加されうる。
(Fe2 )、正常ヒト血清および他の血清のような種
々の源から誘導される。ペニシリン、ストレプトマイシ
ンおよびゲンタマイシンのような各種の抗生物質を含め
た添加物も個々にまたは組合せで培地に添加されうる。
その他の添加物にはHEPES緩衝剤(N−2−ヒトゝ
ロキシエチルピペラジンーN−2−エタン−スルホン酸
)のような種々の緩衝剤が含まれる。さらに別の添加物
には1−グルタミン、NaHCOaおよび2−メルカプ
トエタノールが含まれる。
ロキシエチルピペラジンーN−2−エタン−スルホン酸
)のような種々の緩衝剤が含まれる。さらに別の添加物
には1−グルタミン、NaHCOaおよび2−メルカプ
トエタノールが含まれる。
本発明においてBSF’−1分泌を誘発するために用い
られる好適な促進剤にはフイトヘマグルチニ7(PHA
)、コンカナバリン−A (Con−A)およびアメリ
カヤマゴボウマイトジェンのような種々の植物マイトジ
ェン類が含まれる。さらにPMAのようなホルボールエ
ステルも促進剤として使用し得る。
られる好適な促進剤にはフイトヘマグルチニ7(PHA
)、コンカナバリン−A (Con−A)およびアメリ
カヤマゴボウマイトジェンのような種々の植物マイトジ
ェン類が含まれる。さらにPMAのようなホルボールエ
ステルも促進剤として使用し得る。
腫瘍細胞を培養してBSF’−1の分泌を誘発させる本
発明方法はいろいろな環境条件下で実施される。しかし
ながら、好ましくは培養物は約5〜10%CO2/空気
の湿潤雰囲気巾約35〜38℃の温度範囲に保持される
。理想的には、培地のpHがわずかにアルカリ性条件(
約7.0〜7.4の範囲)に保たれるべきである。
発明方法はいろいろな環境条件下で実施される。しかし
ながら、好ましくは培養物は約5〜10%CO2/空気
の湿潤雰囲気巾約35〜38℃の温度範囲に保持される
。理想的には、培地のpHがわずかにアルカリ性条件(
約7.0〜7.4の範囲)に保たれるべきである。
腫瘍細胞の活性化剤による刺激によって放出されるBS
F−1の量は時間とともに変化する。本発明者らは刺激
の約24時間後にBSF−1発現が最適レベルに達する
ことを見出した。
F−1の量は時間とともに変化する。本発明者らは刺激
の約24時間後にBSF−1発現が最適レベルに達する
ことを見出した。
検定−分析
産生されたBSF’−1を同定し、またこの因子の精製
方法を監視するために、いろいろな検定法が本発明にお
いて利用される。本発明で使用される第1のタイプの検
定法は、サブマイトジェン濃度の抗免疫グロブリンM(
抗1gM)(例えばヤギ、ウサギまだはラットの抗マウ
スエgM)の存在下で精製B7allNの増殖を刺激す
る推定上のBSF’−1試料の能力を調べることにより
、BSF−1の存在について試験するものである。この
検定法は例えば牌細胞(T細胞を除いたもの)から得ら
れる精製B細胞を使用する。上で述べたように、研究者
によってBSF−1の結果とみなされた1つの活性は、
サブマイトジェン濃度の技工gM の存在下で精製B
細胞の増殖を刺激する能力である。ハワードらの上記文
献およびファラーらの上記文献を参照されたい。本発明
者らは、本発明によって単離されたBSF−1が実際に
このような設定のもとて精製B細胞の増殖を誘発するこ
とを見出した。
方法を監視するために、いろいろな検定法が本発明にお
いて利用される。本発明で使用される第1のタイプの検
定法は、サブマイトジェン濃度の抗免疫グロブリンM(
抗1gM)(例えばヤギ、ウサギまだはラットの抗マウ
スエgM)の存在下で精製B7allNの増殖を刺激す
る推定上のBSF’−1試料の能力を調べることにより
、BSF−1の存在について試験するものである。この
検定法は例えば牌細胞(T細胞を除いたもの)から得ら
れる精製B細胞を使用する。上で述べたように、研究者
によってBSF−1の結果とみなされた1つの活性は、
サブマイトジェン濃度の技工gM の存在下で精製B
細胞の増殖を刺激する能力である。ハワードらの上記文
献およびファラーらの上記文献を参照されたい。本発明
者らは、本発明によって単離されたBSF−1が実際に
このような設定のもとて精製B細胞の増殖を誘発するこ
とを見出した。
本発明によって単離精製されたBSF−1はまたIL−
2依存性T細胞の増殖を刺激するその能力について検定
した。IL−2は悪性細胞の破壊を含むいろいろな免疫
作用を行うT細胞の増殖を誘発するリンフ才力インであ
る。T細胞の増殖を誘発するその能力により、■L−2
はin VitrOおよびin vivo の両方で
正常免疫応答を増大させ且つ欠損免疫応答を回復させる
ことがわかっている。IL−2依存性細胞の増殖を誘発
するBSF’ −1の能力についての試験は、IL−2
が推定上のESF’−1試料中に存在するかどうかおよ
びBSF’−1が’l’ +)ンパ球の増殖を促進する
能力をもつかどうかを確かめるという2重の目的にかな
っている。
2依存性T細胞の増殖を刺激するその能力について検定
した。IL−2は悪性細胞の破壊を含むいろいろな免疫
作用を行うT細胞の増殖を誘発するリンフ才力インであ
る。T細胞の増殖を誘発するその能力により、■L−2
はin VitrOおよびin vivo の両方で
正常免疫応答を増大させ且つ欠損免疫応答を回復させる
ことがわかっている。IL−2依存性細胞の増殖を誘発
するBSF’ −1の能力についての試験は、IL−2
が推定上のESF’−1試料中に存在するかどうかおよ
びBSF’−1が’l’ +)ンパ球の増殖を促進する
能力をもつかどうかを確かめるという2重の目的にかな
っている。
IL−2増殖検定法はCT6 細胞またはギリス(G
t 111 s )らのJ、 Immunol、 1
20 : 2027(1978)に記載されるようなC
TLL と呼ばれるネズミ細胞毒性TR1胞株を含め
た種々の工L−2依存性細胞株を用いて実施される。
t 111 s )らのJ、 Immunol、 1
20 : 2027(1978)に記載されるようなC
TLL と呼ばれるネズミ細胞毒性TR1胞株を含め
た種々の工L−2依存性細胞株を用いて実施される。
本発明方法によって単離されて均質に精製されたBSF
’−1はIL−2細胞増殖検定においてポジティブの評
価を得、このことはBSF″−1がB細胞系列のほかに
多数の細胞系列に作用し得ることを示している。
’−1はIL−2細胞増殖検定においてポジティブの評
価を得、このことはBSF″−1がB細胞系列のほかに
多数の細胞系列に作用し得ることを示している。
本発明のBSF−1’z同定し且つBSF’−1の精製
を監視するために用いられる第2の検定法は、コロニー
刺激因子(C3F)依存性細胞、特に工L−3依存性細
胞の増殖を誘発するBSF’−1の能力を調べることを
伴う。IL−3は造血幹細胞から誘導される前駆細胞を
各種の成熟コロニー形成細胞(顆粒球およびマクロファ
ージを含む)へ分化させる能力をもつ多能性因子でちる
。レミック(Remick)らのJ。
を監視するために用いられる第2の検定法は、コロニー
刺激因子(C3F)依存性細胞、特に工L−3依存性細
胞の増殖を誘発するBSF’−1の能力を調べることを
伴う。IL−3は造血幹細胞から誘導される前駆細胞を
各種の成熟コロニー形成細胞(顆粒球およびマクロファ
ージを含む)へ分化させる能力をもつ多能性因子でちる
。レミック(Remick)らのJ。
い。IL−3依存性細胞株の例には(1) レトロウ
ィルス感染C3H−HeJマウス骨髄培養物から誘導さ
れる32D、グリーンバーガー(Greenberge
r)らのFed、 Proc、 42 : 2762(
1983)’e参照;および(2)ネズミ骨髄から誘導
されるF’DC−P2、F’PC−P2−1aおよびr
pc−p1細胞、デクスター(Dexter)=747
〜759(1983)全参照;が含まれる。
ィルス感染C3H−HeJマウス骨髄培養物から誘導さ
れる32D、グリーンバーガー(Greenberge
r)らのFed、 Proc、 42 : 2762(
1983)’e参照;および(2)ネズミ骨髄から誘導
されるF’DC−P2、F’PC−P2−1aおよびr
pc−p1細胞、デクスター(Dexter)=747
〜759(1983)全参照;が含まれる。
本発明方法によって単離されて均質に精製され九BSF
−1は、32DおよびF’DC−P2細飽増殖検定にお
いてポジティブの評価を得た。このことは本発明のBS
F’−1がC3F(工L−3)依存性細胞の増殖を促進
し得ることを示している。この結果は。
−1は、32DおよびF’DC−P2細飽増殖検定にお
いてポジティブの評価を得た。このことは本発明のBS
F’−1がC3F(工L−3)依存性細胞の増殖を促進
し得ることを示している。この結果は。
IL−2依存性細胞株の増殖を直接刺激する本発明のB
SF’−1の上記能力と共に、BSF’−1がB細胞系
列以外の標的細胞をもつ増殖因子であることを示してい
る。従って、BSF−1はB細胞の増殖および成熟を調
節するほかに重要な作用を有するかも知れない。
SF’−1の上記能力と共に、BSF’−1がB細胞系
列以外の標的細胞をもつ増殖因子であることを示してい
る。従って、BSF−1はB細胞の増殖および成熟を調
節するほかに重要な作用を有するかも知れない。
BSF’−1の手前製
本発明方法によって生産された組換えBSF−1および
天然BSF−1は、吸着それに続くカチオンおよびアニ
オン交換クロマトグラフィーを含めた一連の技法により
、はぼ均質になるまで精製した。
天然BSF−1は、吸着それに続くカチオンおよびアニ
オン交換クロマトグラフィーを含めた一連の技法により
、はぼ均質になるまで精製した。
その後、部分精製したBSF’−1は多段逆相高性能液
体クロマトグラフィー(HPLC)により均仙に精製し
た。それぞれの精製工程のあとに、BSF’−1の存在
および純度を上記のバイオアッセイにより分析した。ま
た、精製工程からの生物学的に活性な分画を5DS−P
AGEおよび銀染色法により分析した。さらに、被検分
画中に存在する全タンパク質はズラッビフォートゝ(B
radford)タンパク質検定(カリフォルニア州す
ッチモント9.バイオラッド・ラボラトリーズ)を用い
て測定した。
体クロマトグラフィー(HPLC)により均仙に精製し
た。それぞれの精製工程のあとに、BSF’−1の存在
および純度を上記のバイオアッセイにより分析した。ま
た、精製工程からの生物学的に活性な分画を5DS−P
AGEおよび銀染色法により分析した。さらに、被検分
画中に存在する全タンパク質はズラッビフォートゝ(B
radford)タンパク質検定(カリフォルニア州す
ッチモント9.バイオラッド・ラボラトリーズ)を用い
て測定した。
BSF’−1は初めに比較的不活性の極性吸着剤(例え
ばシリカまたはアルミナ)を用いる吸着法によって濃縮
される。吸着剤はいろいろな物理的形状1例えばゲルま
たはビーズ(球形または他の形)であり得る。好ましく
は、吸着剤はメチルシリル−シリカ材料から成り、理想
的にはトリメチルシリルーンリカ(TMS−ノリ力)か
ら成る。
ばシリカまたはアルミナ)を用いる吸着法によって濃縮
される。吸着剤はいろいろな物理的形状1例えばゲルま
たはビーズ(球形または他の形)であり得る。好ましく
は、吸着剤はメチルシリル−シリカ材料から成り、理想
的にはトリメチルシリルーンリカ(TMS−ノリ力)か
ら成る。
BSF’−1は当分野でよく知られた方法で吸着カラム
から溶離される。適当な溶離剤にはアセトニトリルおよ
びN−プロパツールが含まれる。吸着カラムの溶出液は
、以下の実施例Aで詳しく述べるB細ゆ増殖検定法を用
いてBSF−1活性について分析した。溶出液は回収タ
ンパク質1マイクログラム当たり約100単位の活性レ
ベルのBSF−1活性をもつことが判明したが、出発粗
上清はBSF−1活性が約3単位/マイクログラム(U
/μ9)タンパク質であった。先に述べたように、全回
収タンパク質はプラッビフォードタンパク質検定を用い
て測定した。
から溶離される。適当な溶離剤にはアセトニトリルおよ
びN−プロパツールが含まれる。吸着カラムの溶出液は
、以下の実施例Aで詳しく述べるB細ゆ増殖検定法を用
いてBSF−1活性について分析した。溶出液は回収タ
ンパク質1マイクログラム当たり約100単位の活性レ
ベルのBSF−1活性をもつことが判明したが、出発粗
上清はBSF−1活性が約3単位/マイクログラム(U
/μ9)タンパク質であった。先に述べたように、全回
収タンパク質はプラッビフォードタンパク質検定を用い
て測定した。
本発明方法で使用するイオン交換クロマトグラフィー法
では、タン・ξり質の酸−塩基特性の関数であるタンパ
ク質の電荷の差に基づいてBSF’〜1を他のタンパク
質から分離した。上述のように、吸着カラムから溶離さ
れたBSF−1は順次カチオンおよびアニオン交換クロ
マトグラフィーを用いてさらに分画化した。カチオン交
俣クロマトグラフィー用の適当なカラム材料にはセルロ
ースの合成誘導体が含まれ、例えば中性pHで陰電荷基
を含むカルボキシメチルセルロース(CM−セルロース
)である。CM−セルロースカラムは広く市販されてい
る。他の適当なカチオン交換カラム材料はスルホプロピ
ルセファデックスにュージャージー州ピスカタウェー、
ファーマシア・ファイン・ケミカルズ)である。カチオ
ン交換カラムに結合されたBSF−1は次第に増大する
イオン強度の直線状NaCe勾配により溶離する。本発
明者らは、カチオン交換クロマトクラフィーを使用する
ことにより、BSF−1の比活性が吸着カラムから回収
されたBSF−1の活性レベルの少なくとも5倍だけ増
加することを見出した。
では、タン・ξり質の酸−塩基特性の関数であるタンパ
ク質の電荷の差に基づいてBSF’〜1を他のタンパク
質から分離した。上述のように、吸着カラムから溶離さ
れたBSF−1は順次カチオンおよびアニオン交換クロ
マトグラフィーを用いてさらに分画化した。カチオン交
俣クロマトグラフィー用の適当なカラム材料にはセルロ
ースの合成誘導体が含まれ、例えば中性pHで陰電荷基
を含むカルボキシメチルセルロース(CM−セルロース
)である。CM−セルロースカラムは広く市販されてい
る。他の適当なカチオン交換カラム材料はスルホプロピ
ルセファデックスにュージャージー州ピスカタウェー、
ファーマシア・ファイン・ケミカルズ)である。カチオ
ン交換カラムに結合されたBSF−1は次第に増大する
イオン強度の直線状NaCe勾配により溶離する。本発
明者らは、カチオン交換クロマトクラフィーを使用する
ことにより、BSF−1の比活性が吸着カラムから回収
されたBSF−1の活性レベルの少なくとも5倍だけ増
加することを見出した。
カチオン交換クロマトグラフィー法からプールされた活
性分画はさらにアニオン変態クロマトグラフィーにより
精製する。この方法に適するカラム材料にはアミノエチ
ルセルロース誘導体1例えば第4アミノエチルセルロー
スまたはジエチルアミンエチルセルロース(DE AE
−セルロース)カ含まれる。これらの型のアニオンクロ
マトグラフィーカラム材料は広く市販されている。アニ
オンカラムは、BSF’−1含有試料をカラムに装填す
る前に、緩衝液で平衡化する。溶離は初めに出発緩衝液
を用いて行い、次に直線状NaC4勾配を用いて行う。
性分画はさらにアニオン変態クロマトグラフィーにより
精製する。この方法に適するカラム材料にはアミノエチ
ルセルロース誘導体1例えば第4アミノエチルセルロー
スまたはジエチルアミンエチルセルロース(DE AE
−セルロース)カ含まれる。これらの型のアニオンクロ
マトグラフィーカラム材料は広く市販されている。アニ
オンカラムは、BSF’−1含有試料をカラムに装填す
る前に、緩衝液で平衡化する。溶離は初めに出発緩衝液
を用いて行い、次に直線状NaC4勾配を用いて行う。
分画を集めて、上記のように分析する。
本発明者らは、アニオン交換クロマトグラフィーを使用
することにより、カチオン交換クロマトグラフィーカラ
ムから溶離されたBSF−1の精製が少なくとも5倍増
加することを見出した。
することにより、カチオン交換クロマトグラフィーカラ
ムから溶離されたBSF−1の精製が少なくとも5倍増
加することを見出した。
アニオン交換クロマトグラフィーカラムから溶離された
生物学的に活性な分画はプールして、さらに多段HPL
C法により精製する。本発明方法において使用するHP
LC工程は、好ましくはタンバク質系BSF−1と共に
最適に使用される十分な大きさの孔サイズ(すなわち少
なくとも+00 Aの孔サイズ)をもつ逆相オクタデシ
ル結合シリカカラムを使用する。
生物学的に活性な分画はプールして、さらに多段HPL
C法により精製する。本発明方法において使用するHP
LC工程は、好ましくはタンバク質系BSF−1と共に
最適に使用される十分な大きさの孔サイズ(すなわち少
なくとも+00 Aの孔サイズ)をもつ逆相オクタデシ
ル結合シリカカラムを使用する。
本発明の実施において使用する適当な逆相HPLCは市
販製品である。好適なカラムにはカリフォルニア州へス
にリア、セパレーションズーグループから市販されてい
るバイダック(Vydac)系カラム、またはメイン州
ミルフォートゝ、ウォーターズ・アンシェーツから市販
されているラジオパック(Radiopak)およびボ
ラシル(Porasil、)系のカラムが含まれる。好
適なカラム充填材料にはシリカゲルの表面に1例えばシ
ロキサン(珪素−酸素−珪素)結合によって、共有結合
されたオフタデシルシラン基が含まれる。
販製品である。好適なカラムにはカリフォルニア州へス
にリア、セパレーションズーグループから市販されてい
るバイダック(Vydac)系カラム、またはメイン州
ミルフォートゝ、ウォーターズ・アンシェーツから市販
されているラジオパック(Radiopak)およびボ
ラシル(Porasil、)系のカラムが含まれる。好
適なカラム充填材料にはシリカゲルの表面に1例えばシ
ロキサン(珪素−酸素−珪素)結合によって、共有結合
されたオフタデシルシラン基が含まれる。
HPLCカラムにBSF−1を装填する前に、予め部分
精製されたBSF−1調製物は適当な緩衝液、例えばト
リフルオロ酢酸(TFA)、 ヘプタフルオロ酪酸(H
FBA)および酢酸で平衡化する。HPLCカラムから
のタンパク質の溶離は当分野でよく知られた方法で行わ
れる。オクタデシルカラムから結合タンパク質を除くた
めの適当な溶離法は直線状溶離勾配、例えばTF’A、
HF’BA または酢酸中のアセトニトリルまたはN
−プロパツール緩衝溶液の使用をともなう。溶離剤とし
てアセトニトリルを使用する場合、好適な勾配は1%T
FA 中の0〜70(v/v)%アセトニトリルから
成9.1分画たり約1%アセトニl−IJルの速度で加
える。溶離剤がN−プロパツール緩衝溶液である場合、
好適な組成はN、N’−ジイソプロピルエチルアミン(
D工EA−Ac)中の4(1−60(v/v )%N−
プロパツールである。溶離剤は市販されている溶剤送出
装置、例えばベックマンモデル344(カリフォルニア
州アービン、−4ツクマン・インスツルメント)を用い
てカラムに添加する。
精製されたBSF−1調製物は適当な緩衝液、例えばト
リフルオロ酢酸(TFA)、 ヘプタフルオロ酪酸(H
FBA)および酢酸で平衡化する。HPLCカラムから
のタンパク質の溶離は当分野でよく知られた方法で行わ
れる。オクタデシルカラムから結合タンパク質を除くた
めの適当な溶離法は直線状溶離勾配、例えばTF’A、
HF’BA または酢酸中のアセトニトリルまたはN
−プロパツール緩衝溶液の使用をともなう。溶離剤とし
てアセトニトリルを使用する場合、好適な勾配は1%T
FA 中の0〜70(v/v)%アセトニトリルから
成9.1分画たり約1%アセトニl−IJルの速度で加
える。溶離剤がN−プロパツール緩衝溶液である場合、
好適な組成はN、N’−ジイソプロピルエチルアミン(
D工EA−Ac)中の4(1−60(v/v )%N−
プロパツールである。溶離剤は市販されている溶剤送出
装置、例えばベックマンモデル344(カリフォルニア
州アービン、−4ツクマン・インスツルメント)を用い
てカラムに添加する。
溶離されたタンパク質は当分野でよく知られた検出系を
用いて有利に監視しうる。例えば、スティン(Stei
n) およびモスケラ(Moschera)のMet
h、 Enzymol、 78 : 435(1981
)に記載されるような自動螢光検出系が使用される。ま
た、HPLCカラムから集められた分画の相対的タンパ
ク質濃度は、紫外線分光光度計を用いて214ナノメー
トルの波長で溶離された物質の吸光度を測定することに
より求めることができる。適当な自動紫外線吸光度検出
装置は市販製品であり、例えばウォーターズ・アソシェ
ーツおよびスウェーデン国ブロマ、LKBから市販され
ている。
用いて有利に監視しうる。例えば、スティン(Stei
n) およびモスケラ(Moschera)のMet
h、 Enzymol、 78 : 435(1981
)に記載されるような自動螢光検出系が使用される。ま
た、HPLCカラムから集められた分画の相対的タンパ
ク質濃度は、紫外線分光光度計を用いて214ナノメー
トルの波長で溶離された物質の吸光度を測定することに
より求めることができる。適当な自動紫外線吸光度検出
装置は市販製品であり、例えばウォーターズ・アソシェ
ーツおよびスウェーデン国ブロマ、LKBから市販され
ている。
回収されたHPLC分画の生物学的活性は上記のバイオ
アッセイにより分析される。活性分画はまたゲル電気泳
動/銀染色法およびブラッドフォー1タンパク質検定法
によりそれぞれ活性レイルおよび全タンパク質量につい
て測定する。
アッセイにより分析される。活性分画はまたゲル電気泳
動/銀染色法およびブラッドフォー1タンパク質検定法
によりそれぞれ活性レイルおよび全タンパク質量につい
て測定する。
十分なタンパク質の精製が最初のHPLC法で達成され
ない場合は、同じカラムまたは別のカラムを使ってそれ
を繰り返すことができる。別のカラムは支持材料が異な
る組成または形状でありまた結合相物質が異なる化学的
組成である充填材料を使用しうる。さらに、溶離剤は同
一であっても異なっていてもよい。十分なタンバ2質精
製が第2のHPLC法からも得られない場合は、BSF
−1の均質性が達成されるように、さらにHPLC法を
繰り返す。本発明者らは、最初のオクタデシルンランH
PLCカラムを直線状アセトニトリル勾配で溶離し、続
いて酢酸で平衡化した同じカラム全直線状N−プロパツ
ール勾配で溶離することにより。
ない場合は、同じカラムまたは別のカラムを使ってそれ
を繰り返すことができる。別のカラムは支持材料が異な
る組成または形状でありまた結合相物質が異なる化学的
組成である充填材料を使用しうる。さらに、溶離剤は同
一であっても異なっていてもよい。十分なタンバ2質精
製が第2のHPLC法からも得られない場合は、BSF
−1の均質性が達成されるように、さらにHPLC法を
繰り返す。本発明者らは、最初のオクタデシルンランH
PLCカラムを直線状アセトニトリル勾配で溶離し、続
いて酢酸で平衡化した同じカラム全直線状N−プロパツ
ール勾配で溶離することにより。
BSF−1は生物学的活性の単一対称ピークとして均質
に精製されることを見出した。第1図および第2図全参
照されたい。また第1図に示すように。
に精製されることを見出した。第1図および第2図全参
照されたい。また第1図に示すように。
HPLCで精製したBSF−1の5DS−PAGEおよ
び銀染色は約184キロダルトンの分子量をもつBSF
’−1活性の単一バンドを固定した。この均質BSF−
1の比活性は約3.28 X 105U/μ9タンパク
質であるとわかった。
び銀染色は約184キロダルトンの分子量をもつBSF
’−1活性の単一バンドを固定した。この均質BSF−
1の比活性は約3.28 X 105U/μ9タンパク
質であるとわかった。
本発明のBSF’−1は均質に精製されるので、本発明
者らはこのタンパク質分子のN末端部分のアミノ酸配列
を決定することができた。この情報はBSF’−I M
伝子のクローニングおよび臨床試験のための、最終的に
は広範囲の医療用途のための純粋な形のBSF−1の大
量生産に役立つ。さらに。
者らはこのタンパク質分子のN末端部分のアミノ酸配列
を決定することができた。この情報はBSF’−I M
伝子のクローニングおよび臨床試験のための、最終的に
は広範囲の医療用途のための純粋な形のBSF−1の大
量生産に役立つ。さらに。
この均質BSF−1の利用可能性は、同時に生産される
他のB細胞因子の汚染を免れて、その活性の正確な生物
学的研究を可能にするであろう。
他のB細胞因子の汚染を免れて、その活性の正確な生物
学的研究を可能にするであろう。
従来技術は高度に精製されたBSF−1調製物を得たと
述べているが、このような調製物全本発明のHPLC法
で出発物質として使用したとき、その物質はBSF’−
1活性と関連のない多数の別々のタンパク質ヒ0−夕に
分割されることがわかった。このような観察に基づくと
、この種の調製物は15%以下の純度であり、いくつか
の場合には1%未満の純度でさえありうると考えられる
。
述べているが、このような調製物全本発明のHPLC法
で出発物質として使用したとき、その物質はBSF’−
1活性と関連のない多数の別々のタンパク質ヒ0−夕に
分割されることがわかった。このような観察に基づくと
、この種の調製物は15%以下の純度であり、いくつか
の場合には1%未満の純度でさえありうると考えられる
。
本発明の均質BSF’−1試料は、例えばニンヒドリン
または気相検出のいずれかを使用する自動シークエンサ
ーを用いて、アミノ酸配列について分析される。この種
の装置は市販されている。例えば、それらは英国ケンブ
リッジのLKB (モデル4150アルフア)またはア
プライドゝ・バイオシステムズ(モデル470A )か
ら入手しうる。本発明者らは本発明のネズミBsF”−
tのアミン末端部分の最初の加残基が次の配列: Hi
s−工1e−H1θ−G17−Cy e−Asp−Ly
s−Asn−Hl s −Leu−Arg−Glu−工
1e−工1s−Gly−11e−Leu−Asn−Gl
u−Valから成ることを見出した。
または気相検出のいずれかを使用する自動シークエンサ
ーを用いて、アミノ酸配列について分析される。この種
の装置は市販されている。例えば、それらは英国ケンブ
リッジのLKB (モデル4150アルフア)またはア
プライドゝ・バイオシステムズ(モデル470A )か
ら入手しうる。本発明者らは本発明のネズミBsF”−
tのアミン末端部分の最初の加残基が次の配列: Hi
s−工1e−H1θ−G17−Cy e−Asp−Ly
s−Asn−Hl s −Leu−Arg−Glu−工
1e−工1s−Gly−11e−Leu−Asn−Gl
u−Valから成ることを見出した。
第5番目の残基はCysであると推定された。自動アミ
ノ酸配列決定法の第5サイクルにおいて。
ノ酸配列決定法の第5サイクルにおいて。
他の残基はどれも高収率で得られなかった。このことは
第5番目の残基がCyθ(エドマン分解によっては肯定
的に検出されない)、グリコジル化トレオニンまたはグ
リコジル化セリン残基から成るという結論に導く。これ
らの後者の2つの可能性は、グルコサミ/またはガラク
トサミンがアミノ酸組成の分析から観察されなかったの
で排除された。これは第5番目の残基がCysであると
いう結論に導く。
第5番目の残基がCyθ(エドマン分解によっては肯定
的に検出されない)、グリコジル化トレオニンまたはグ
リコジル化セリン残基から成るという結論に導く。これ
らの後者の2つの可能性は、グルコサミ/またはガラク
トサミンがアミノ酸組成の分析から観察されなかったの
で排除された。これは第5番目の残基がCysであると
いう結論に導く。
BSF’−1産生細胞からのRNAの調製BSF−1’
に産生しうる細胞からの全RNA は、チャーライ/(
Chirgwin)らの(Biochemistry。
に産生しうる細胞からの全RNA は、チャーライ/(
Chirgwin)らの(Biochemistry。
18、 5294(1979)および’v=アチス(M
aniatis)らのMo1ecular CCl0n
in、 A LaboratoryManual 、
コールドゝ・スプリング・バーバー−ラボラトリ−
、コールド・スプリング・ハーバ−。
aniatis)らのMo1ecular CCl0n
in、 A LaboratoryManual 、
コールドゝ・スプリング・バーバー−ラボラトリ−
、コールド・スプリング・ハーバ−。
ニューヨーク(1982)に記載されるような標準方法
によって抽出される。本発明において使用される好適な
りSF’−1産生細胞には上記のEL4細胞が含まれる
。
によって抽出される。本発明において使用される好適な
りSF’−1産生細胞には上記のEL4細胞が含まれる
。
よく知られているように、細胞からRNA i抽出す
る場合、抽出の初期段階の間中リボヌクレアーゼ(RN
ase)活性を最小限に抑えることが重要である。これ
を達成する1つの方法は、RNaseによるRNA
の加水分解速度を超える速度で、紙中タンパク質(RN
ase f含む)を変性することである。
る場合、抽出の初期段階の間中リボヌクレアーゼ(RN
ase)活性を最小限に抑えることが重要である。これ
を達成する1つの方法は、RNaseによるRNA
の加水分解速度を超える速度で、紙中タンパク質(RN
ase f含む)を変性することである。
チャーウィンらの上記文献およびマニアチスらの上記文
献196に記載の方法では、これを行うために2−メル
カプトエタノール(タンノeり質のジスルフィド結合を
切断する)のような還元剤と共にグアニジニウムチオシ
アネーIf使用している。
献196に記載の方法では、これを行うために2−メル
カプトエタノール(タンノeり質のジスルフィド結合を
切断する)のような還元剤と共にグアニジニウムチオシ
アネーIf使用している。
RNAは例えばフェノール/クロロホルム抽出。
エタノール沈殿または塩化セシウムによる沈降のような
標準方法によりタンパク質から分離される。
標準方法によりタンパク質から分離される。
また別法として、RNAはグアニジンI′8に酸塩によ
る抽出、その後のフェノール/クロロホルム抽出により
タンパク質から分離しうる。
る抽出、その後のフェノール/クロロホルム抽出により
タンパク質から分離しうる。
次に、ポリA+mRNA が抽出タンパク質から分離
される。この分離工程を行うためにいくつかの技法が開
発されたが、1つの好適な方法はエドモント?(Edm
onds)らのProc;Natl、Acad、Sci
、 68 :1336(1971) ;アビプ(Avi
v)およびレーダー1408(1972) ;およびマ
ニアチスらの上記文献197に記載されるように、ポリ
A+mRNA fオリゴ(aT)セルロースによるク
ロマトグラフィーにかけることである。オリゴ(aT)
セルロースカラムはローディング緩衝g (loadi
ng buffer)を用いて調製し1次いでmRNA
ftカラムに装填する。
される。この分離工程を行うためにいくつかの技法が開
発されたが、1つの好適な方法はエドモント?(Edm
onds)らのProc;Natl、Acad、Sci
、 68 :1336(1971) ;アビプ(Avi
v)およびレーダー1408(1972) ;およびマ
ニアチスらの上記文献197に記載されるように、ポリ
A+mRNA fオリゴ(aT)セルロースによるク
ロマトグラフィーにかけることである。オリゴ(aT)
セルロースカラムはローディング緩衝g (loadi
ng buffer)を用いて調製し1次いでmRNA
ftカラムに装填する。
その後、カラムは初めに緩衝溶液で洗浄して、t−01
JA不含のmRNA f除き、次に緩衝化低イオン強度
溶離剤を用いてポリAmRNA1カラムから溶出する。
JA不含のmRNA f除き、次に緩衝化低イオン強度
溶離剤を用いてポリAmRNA1カラムから溶出する。
ポIJ A+mRNAの完全性はゲル電気泳動により証
明される。
明される。
その後、ポリA+m RN Aはメチル水銀アガロース
による電気泳動で分画化する。異なる大きさのmRNA
に対応するゲル分画は、パルミター2095(1973
) ;ペルハA (Pelham)およびジャクソン(
Jackson)のEur、 J、 Biochem、
67 :246(1976) ;およびリー(Lee
)らのJ、Biox。
による電気泳動で分画化する。異なる大きさのmRNA
に対応するゲル分画は、パルミター2095(1973
) ;ペルハA (Pelham)およびジャクソン(
Jackson)のEur、 J、 Biochem、
67 :246(1976) ;およびリー(Lee
)らのJ、Biox。
Chem、 253 : 3494(197B)に記載
されるような標準ウサギ網状赤血球溶解液法を用いて、
1nVitrOで翻訳される。ウサギ網状赤血球検定用
のキットはメリーランド州ガイサースバーグ、ベセスダ
・リサーチ・ラボラトリーズまたはマサチューセッツ州
ホストン、ニューイングランド9・ヌクレアーのような
多くの源から市販されている。
されるような標準ウサギ網状赤血球溶解液法を用いて、
1nVitrOで翻訳される。ウサギ網状赤血球検定用
のキットはメリーランド州ガイサースバーグ、ベセスダ
・リサーチ・ラボラトリーズまたはマサチューセッツ州
ホストン、ニューイングランド9・ヌクレアーのような
多くの源から市販されている。
また、mRNAの翻訳は、ストマ(Stoma)らのM
e th。
e th。
Enzym、 79 : 68(1981)に記載され
るような標準技術を用いて、アフリカッメガエル(Xe
nopuslasvis ; X、 1aevis)の
卵母細飽内へのmRNAの微量注射により実施される。
るような標準技術を用いて、アフリカッメガエル(Xe
nopuslasvis ; X、 1aevis)の
卵母細飽内へのmRNAの微量注射により実施される。
その後 網状赤血球溶解液翻訳またはmRNA微量注射
卵母細飽から遊離された液体は、以下で詳しく述べる上
記の検定法を用いて、BSF’−1活性の存在について
試験する。in vitroで翻訳させたときにBSF
’−1活性を示したmRNAゲル分画を、cDNA作製
のためのmRNA源として選択する。
卵母細飽から遊離された液体は、以下で詳しく述べる上
記の検定法を用いて、BSF’−1活性の存在について
試験する。in vitroで翻訳させたときにBSF
’−1活性を示したmRNAゲル分画を、cDNA作製
のためのmRNA源として選択する。
m RN AからのcDNAの作製
mRNAに対応する2本領cDNAのライブラリーは逆
転写酵素を使用する既知方法によって作製される。本発
明にかいて使用しつる1つのこのような方法はマニアチ
スらの上記文献230に詳述されているが、それはガプ
ラー(Gublθr)およびホフマン(Hoffman
)のGene 25 : 26:3〜269(1983
)により変更された。簡単に説明すると、ポリ酎mRN
Aは第1のcDNA鎖のためのプライマーとしてmRN
AのボIJ A化尾部にハイブリダイズさせたオリゴ(
dT)e使用することにより逆転写される。
転写酵素を使用する既知方法によって作製される。本発
明にかいて使用しつる1つのこのような方法はマニアチ
スらの上記文献230に詳述されているが、それはガプ
ラー(Gublθr)およびホフマン(Hoffman
)のGene 25 : 26:3〜269(1983
)により変更された。簡単に説明すると、ポリ酎mRN
Aは第1のcDNA鎖のためのプライマーとしてmRN
AのボIJ A化尾部にハイブリダイズさせたオリゴ(
dT)e使用することにより逆転写される。
第2cDNA41はDNAポリメラーゼエ、RNase
Hおよび大腸菌D N A IJガーゼの諸酵素全用
いて合成する。この方法は初めのcDNA鎖の3′末端
に形成されるヘアピンループの81スクレアーゼ媒介切
断を排除するものであるが、マニアチスらの標準cDN
A合成法を単に使用する場合は前記の切断を必要とする
であろう。2零個cDNAは慣用方法で分画化して比較
的短い鎖を除き、それにより小さいcDNA分画の不必
要なりローニングテ膳ける。
Hおよび大腸菌D N A IJガーゼの諸酵素全用
いて合成する。この方法は初めのcDNA鎖の3′末端
に形成されるヘアピンループの81スクレアーゼ媒介切
断を排除するものであるが、マニアチスらの標準cDN
A合成法を単に使用する場合は前記の切断を必要とする
であろう。2零個cDNAは慣用方法で分画化して比較
的短い鎖を除き、それにより小さいcDNA分画の不必
要なりローニングテ膳ける。
本発明によれば、別のF 準方法全使用することによっ
てもmRNAから2本領cDNAi作製し得ると理解す
べきである。1つのこのような別法はランド(La n
d )らのNucl Ac1ds Res、 9 :
2251(1981)に開示されている。ラント9らの
方法では、ヘアピンループを第2 CDNA鎖のだめの
プライマーとして使用しない。むしろ、第1cDNA1
iの3′末端にターミナルデオキシヌクレオチジルトラ
ンスフェラーゼ(TaT)k用いてaCMP残基が付加
される。これはポリC残基の3′尾部をもたらす。
てもmRNAから2本領cDNAi作製し得ると理解す
べきである。1つのこのような別法はランド(La n
d )らのNucl Ac1ds Res、 9 :
2251(1981)に開示されている。ラント9らの
方法では、ヘアピンループを第2 CDNA鎖のだめの
プライマーとして使用しない。むしろ、第1cDNA1
iの3′末端にターミナルデオキシヌクレオチジルトラ
ンスフェラーゼ(TaT)k用いてaCMP残基が付加
される。これはポリC残基の3′尾部をもたらす。
その後、第2鎖の合成がその3′尾部にハイブリダイズ
されたオリゴdGによって開始される。この技法は、マ
ニアチスらの方法のようなヘアピンが81ヌクレアーゼ
によって切断される場合に起こりうる芭2cDNA5J
jの5′尾部の欠(i部分金貸けるのに役立つと言われ
ている。
されたオリゴdGによって開始される。この技法は、マ
ニアチスらの方法のようなヘアピンが81ヌクレアーゼ
によって切断される場合に起こりうる芭2cDNA5J
jの5′尾部の欠(i部分金貸けるのに役立つと言われ
ている。
次に、2本領cDNAiクローニングベクター内に挿入
し、それを用いてベクター複製に適する原核生物または
真核生物宿主を形質転換する。その後、形質転換体を同
定して、その形質転換体からプラスミドDNA全調製す
る。
し、それを用いてベクター複製に適する原核生物または
真核生物宿主を形質転換する。その後、形質転換体を同
定して、その形質転換体からプラスミドDNA全調製す
る。
本発明全実施するために、種すのクローニングベクター
が使用される。好適なものはプラスミド8であるが、ベ
クターはバクテリオファージまたはコスミト9であって
もよい。クローニングを呻乳動物細吻内でおこなう場合
は、ウィルスもベクターとして使用できる。
が使用される。好適なものはプラスミド8であるが、ベ
クターはバクテリオファージまたはコスミト9であって
もよい。クローニングを呻乳動物細吻内でおこなう場合
は、ウィルスもベクターとして使用できる。
プラスミドヲ使用する場合、それは天然諒または人工的
に合成されたものから得ることができる。
に合成されたものから得ることができる。
選ばれる特定プラスミドは、それが大腸菌や酵母のよう
な細菌であろうと他の単細胞微生物であろうと、意図す
る形質転換宿主と適合すべきである。
な細菌であろうと他の単細胞微生物であろうと、意図す
る形質転換宿主と適合すべきである。
プラスミドは使用される特定宿主細胞のだめの適当な複
製起点をもつべきである。また、プラスミドは形質転換
された宿主細胞を容易に同定して、形質転換を受けてい
ない、?(!ll泡から分離することができるようにす
る表現型特性をもつべきである。
製起点をもつべきである。また、プラスミドは形質転換
された宿主細胞を容易に同定して、形質転換を受けてい
ない、?(!ll泡から分離することができるようにす
る表現型特性をもつべきである。
このような表現型特性には増殖抑制物質(例えば抗生物
質)に対する耐性を付与する遺伝子が含まれる。種々の
抗生物儂(テトラサイクリン、ストレプトマイシン、サ
ルファ剤、ペニシリンおよびアンピシリンを含む)に対
する耐性遺伝子をコードするプラスミドは市販されてい
る。
質)に対する耐性を付与する遺伝子が含まれる。種々の
抗生物儂(テトラサイクリン、ストレプトマイシン、サ
ルファ剤、ペニシリンおよびアンピシリンを含む)に対
する耐性遺伝子をコードするプラスミドは市販されてい
る。
大腸菌を宿主細胞として使用する場合は1本発明におい
て使用し得る多くの適当なりローニングプラスミドが市
販されている。本発明を実施する上で好適なプラスミド
はpBR322でj、る。このプラスミドゝはサトクリ
フ(Sutcliffe) のC01d77C1979
)に記載されるように完全に塩基配列が決定されている
。このプラスミドの顕著な利点は、それが11個の既知
のユニークな制限部位(アンピノリン耐性遺伝子中のP
st工部工部台む)をもつということである。この特徴
はホモポリマー付加法によるクローニングにとりわけ有
用である。
て使用し得る多くの適当なりローニングプラスミドが市
販されている。本発明を実施する上で好適なプラスミド
はpBR322でj、る。このプラスミドゝはサトクリ
フ(Sutcliffe) のC01d77C1979
)に記載されるように完全に塩基配列が決定されている
。このプラスミドの顕著な利点は、それが11個の既知
のユニークな制限部位(アンピノリン耐性遺伝子中のP
st工部工部台む)をもつということである。この特徴
はホモポリマー付加法によるクローニングにとりわけ有
用である。
プラスミド9の代わりにバクテリオファージを使用する
場合、このようなファージもプラスミドの選択について
先に述べた特性と実質的に同じ特性をもつべきである。
場合、このようなファージもプラスミドの選択について
先に述べた特性と実質的に同じ特性をもつべきである。
これには表現型マーカーの存在および外来遺伝子を挿入
するだめの連結可能な末端が含まれる。
するだめの連結可能な末端が含まれる。
本発明では、好ましくは、平滑末端をもつ2重鎖cDN
Aがホモポリマー付加法によりプラスミドベクター内に
挿入される。当分針でよく知られているように、この技
術においては、相補的ホモポリマートラックがcDNA
鎖およびプラスミド?DNAに付加される。その後、ベ
クターおよび2重鎖cDNAは相補的ホモポリマー尾部
間の水素結合によって一緒に連結され、それにより大腸
菌のような宿主細胞を形質転換しうる開環状ハイプリン
ト分子が形成される。
Aがホモポリマー付加法によりプラスミドベクター内に
挿入される。当分針でよく知られているように、この技
術においては、相補的ホモポリマートラックがcDNA
鎖およびプラスミド?DNAに付加される。その後、ベ
クターおよび2重鎖cDNAは相補的ホモポリマー尾部
間の水素結合によって一緒に連結され、それにより大腸
菌のような宿主細胞を形質転換しうる開環状ハイプリン
ト分子が形成される。
1つのホモポリマー付加法では、約50〜150 dA
ヌクレオチド残基が線状プラスミ)’DNAの3′末端
に付加される。同じ数のaTヌクレオチド残基が2重鎖
cDNAの3′末端に付加され、その後cDNAとプラ
スミドベクー緒に連結する。
ヌクレオチド残基が線状プラスミ)’DNAの3′末端
に付加される。同じ数のaTヌクレオチド残基が2重鎖
cDNAの3′末端に付加され、その後cDNAとプラ
スミドベクー緒に連結する。
別の好適な方法では、60尾部が適当な制限酵素で切断
されたクローニングベクターの3′末端に付加される。
されたクローニングベクターの3′末端に付加される。
例えばpBR322プラスミドヲ使用する場合は、制限
酵素PstIi使用してアンピシリン耐性遺伝子のとこ
ろでこのプラスミドベクターしうる。相補的60尾部が
2重鎖cDNAの3′末端に付加され、その後そのcD
NAセグメントヲ適当なアニーリング緩衝液を用いてプ
ラスミド内に挿入する。
酵素PstIi使用してアンピシリン耐性遺伝子のとこ
ろでこのプラスミドベクターしうる。相補的60尾部が
2重鎖cDNAの3′末端に付加され、その後そのcD
NAセグメントヲ適当なアニーリング緩衝液を用いてプ
ラスミド内に挿入する。
2重鎖cDNAは他のいろいろな標準方法によりプラス
ミドクローニングベクター内に挿入しうると理解すべき
である。1つのこのような別法は。
ミドクローニングベクター内に挿入しうると理解すべき
である。1つのこのような別法は。
c D N A鎖の末端にD N A IJガーゼを使
って合成ヌクレオチドリンカーを結合させることを伴う
。リンカ−は制限酵素で切断すると、同じ制限酵素で切
断したプラスミド内への挿入のだめの接着末端を形成す
る。シェラ−(Scheller)らの5cience
196 : 177〜180(1977) ;マニア
チスらの上記文献219を参照されたい。
って合成ヌクレオチドリンカーを結合させることを伴う
。リンカ−は制限酵素で切断すると、同じ制限酵素で切
断したプラスミド内への挿入のだめの接着末端を形成す
る。シェラ−(Scheller)らの5cience
196 : 177〜180(1977) ;マニア
チスらの上記文献219を参照されたい。
上記のようにして作製した組換えDNAプラスミドは宿
主細胞を形質転換するために使用される。
主細胞を形質転換するために使用される。
宿主は原核または真核細胞のいずれであってもよいが、
好ましくは大腸菌や酵母菌株のような明確に定められた
細菌である。この種の宿主は容易に形質転換されて、培
養下で急速に増殖することができる。サルモネラ菌や肺
炎球菌のような他の種類の細菌を大腸菌の代わりに使用
してもよい。細菌の代わりに、真菌や藻類のような他の
単細胞微生物も使用し得る。どのような宿主が選ばれよ
うと、それは組換えプラスミドを切断する制限酵素を含
むべきでない。
好ましくは大腸菌や酵母菌株のような明確に定められた
細菌である。この種の宿主は容易に形質転換されて、培
養下で急速に増殖することができる。サルモネラ菌や肺
炎球菌のような他の種類の細菌を大腸菌の代わりに使用
してもよい。細菌の代わりに、真菌や藻類のような他の
単細胞微生物も使用し得る。どのような宿主が選ばれよ
うと、それは組換えプラスミドを切断する制限酵素を含
むべきでない。
大腸菌を宿主として使用する場合、好適な菌株はM M
294およびRRI である。M M 294宿主
をプラスミドベクターで形質転換する方法は、マニアチ
スらの上記文献255およびハナノ・ン(Hanaha
n)のJ、MOl、 Biol、 166 : 557
(1983)に記載されるようによく知られている。R
RI宿主をプラスミド9ベクターで形質転換する方法も
、ポリバー(Bolivar)らのGene 2 :
95(1977)およびピーActa、 655 :
243(1981)に記載されるようによく知られてい
る。適当な宿主として役立つ大腸菌の他の菌株にはDH
1(ATCC33849)およびC600が含まれる。
294およびRRI である。M M 294宿主
をプラスミドベクターで形質転換する方法は、マニアチ
スらの上記文献255およびハナノ・ン(Hanaha
n)のJ、MOl、 Biol、 166 : 557
(1983)に記載されるようによく知られている。R
RI宿主をプラスミド9ベクターで形質転換する方法も
、ポリバー(Bolivar)らのGene 2 :
95(1977)およびピーActa、 655 :
243(1981)に記載されるようによく知られてい
る。適当な宿主として役立つ大腸菌の他の菌株にはDH
1(ATCC33849)およびC600が含まれる。
これらの菌株およびM M 294およびRRI菌株は
広く商業的に入手可能である。
広く商業的に入手可能である。
マニアチスらおよびノ・ナノ・ンの上記文献に記載のも
のを含めた形質転換法では、細胞によるプラスミドの取
込みが制限されるために、はんの少しの宿主細胞が実際
に形質転換されるにすぎない。
のを含めた形質転換法では、細胞によるプラスミドの取
込みが制限されるために、はんの少しの宿主細胞が実際
に形質転換されるにすぎない。
形質転換された細胞は、適当な増殖培地および表現型同
定剤(例えば抗生物質)ヲ含む寒天平板上でその細胞を
培養することによって同定される。
定剤(例えば抗生物質)ヲ含む寒天平板上でその細胞を
培養することによって同定される。
j竜当′な耐性遺伝子(例えば抗生物質耐性)を含む細
胞のみが生き残るであろう。組換えpBR322プラス
ミドを使用して大腸菌株M M 294を形質転換する
場合は、表現型同定剤としてテトラサイクリンを使用す
ることにより形質転換細0が同定される。
胞のみが生き残るであろう。組換えpBR322プラス
ミドを使用して大腸菌株M M 294を形質転換する
場合は、表現型同定剤としてテトラサイクリンを使用す
ることにより形質転換細0が同定される。
見
上記のようにして作製されたcDNAライブラリー4−
スクリーニングするためのプローブとじて、放射性標識
オリゴヌクレオチドゝが合成される。このプローブは先
に決定されたBSF’−1分子のアミノ酸配列の一部に
対応する。合成オリゴヌクレオチドプローグとクローン
のライブラリーから調製されたプラスミドcDNAとの
ノ・イブリダイゼーションは、オートラジオグラフィー
によって確認される。
スクリーニングするためのプローブとじて、放射性標識
オリゴヌクレオチドゝが合成される。このプローブは先
に決定されたBSF’−1分子のアミノ酸配列の一部に
対応する。合成オリゴヌクレオチドプローグとクローン
のライブラリーから調製されたプラスミドcDNAとの
ノ・イブリダイゼーションは、オートラジオグラフィー
によって確認される。
1つの好適な組成として、オリゴヌクレオチドプローグ
はBSF’−1の最初の9個のアミノ酸:すなわちHi
s−11e−His−Lye−Cys−Asp−Lys
−Asn−Hisの領域に及ぶ。より詳細には、このク
ローンはBSF−1の最初の9アミノ酸に対応するアン
チセンス配列から成る。遺伝暗号の縮重ゆえに、クロー
ンとして選ばれたBSF’−1分子の領域のアミノ酸配
列に対応しうる核酸配列に相当する異なる組成のクロー
ンが作られる。理想的には、オリゴヌクレオチドプロー
グはBSF−1遺伝子のクローンとして有用であるのに
十分な情報を含む長さであるが、比較的容易に合成でき
る長さであるべきである。
はBSF’−1の最初の9個のアミノ酸:すなわちHi
s−11e−His−Lye−Cys−Asp−Lys
−Asn−Hisの領域に及ぶ。より詳細には、このク
ローンはBSF−1の最初の9アミノ酸に対応するアン
チセンス配列から成る。遺伝暗号の縮重ゆえに、クロー
ンとして選ばれたBSF’−1分子の領域のアミノ酸配
列に対応しうる核酸配列に相当する異なる組成のクロー
ンが作られる。理想的には、オリゴヌクレオチドプロー
グはBSF−1遺伝子のクローンとして有用であるのに
十分な情報を含む長さであるが、比較的容易に合成でき
る長さであるべきである。
上記のオリゴヌクレオチドゝ配列は本発明の合成クロー
ンの好適な組成を構成するが、 BSF’−1分子の別
のアミノ酸配列に対応する他の組成のプローブも本発明
の精神または範囲から逸脱することなく使用しうると理
解すべきである。
ンの好適な組成を構成するが、 BSF’−1分子の別
のアミノ酸配列に対応する他の組成のプローブも本発明
の精神または範囲から逸脱することなく使用しうると理
解すべきである。
−合成オリゴヌクレオチド9プローブはホスホジエステ
ルまたはトリエステル法のような公知技術を用いて容易
に化学的に合成される。トリエステル合成法の詳細は例
えばソード(Sood)らのI’J’u c 1゜Ac
1a Res、 4 : 2557(1977)および
ヒロセ(Hirose)らのTet、 Lett、 2
8 + 2449(1978)に記載されている。合成
後、オリゴヌクレオチドプローグはT4ボリヌクレオチ
ビキナーゼおよび32P−ATPにより標識する。標識
化法の標準技法はマニアチスらの上記文献122に記載
されている。
ルまたはトリエステル法のような公知技術を用いて容易
に化学的に合成される。トリエステル合成法の詳細は例
えばソード(Sood)らのI’J’u c 1゜Ac
1a Res、 4 : 2557(1977)および
ヒロセ(Hirose)らのTet、 Lett、 2
8 + 2449(1978)に記載されている。合成
後、オリゴヌクレオチドプローグはT4ボリヌクレオチ
ビキナーゼおよび32P−ATPにより標識する。標識
化法の標準技法はマニアチスらの上記文献122に記載
されている。
有利には、オリゴヌクレオチドプローブはOH5/末端
をもつように合成され、それにより一般に必要とされる
ホスファターゼ処理を避ける。
をもつように合成され、それにより一般に必要とされる
ホスファターゼ処理を避ける。
cDNAライブラリーのスクリーニング本発明のスクリ
ーニング法では、初めに形質転換細胞が比較的大きいグ
ループ(各グループは数十個の形質転換細胞から成る)
にプールされる。
ーニング法では、初めに形質転換細胞が比較的大きいグ
ループ(各グループは数十個の形質転換細胞から成る)
にプールされる。
複製プラスミド5をアルカリ溶解のような公知方法のい
ずれかを用いて形質転換体から抽出する。プラスミドD
NAは抽出プラスミドを適当な制限酵素で切断すること
により調製する。得られたDNAセグメント全アガロー
スゲル電気泳動により分画化し、その後サザy (So
uthern)のJoMol。Biol。
ずれかを用いて形質転換体から抽出する。プラスミドD
NAは抽出プラスミドを適当な制限酵素で切断すること
により調製する。得られたDNAセグメント全アガロー
スゲル電気泳動により分画化し、その後サザy (So
uthern)のJoMol。Biol。
98 : 503(1975)に記載されるサザンプロ
ノト法により直接分析する。サザンブロソト法によりニ
トロセルロースフィルターに固定したDNAフラグメン
トは、標識オリゴヌクレオチドプローグとハイブリダイ
ズさせる。プローブとハイブリダイズした特定DNAフ
ラグメントはオートラジオグラフィーにより確認される
。
ノト法により直接分析する。サザンブロソト法によりニ
トロセルロースフィルターに固定したDNAフラグメン
トは、標識オリゴヌクレオチドプローグとハイブリダイ
ズさせる。プローブとハイブリダイズした特定DNAフ
ラグメントはオートラジオグラフィーにより確認される
。
オートラジオグラフィー中に強いバンドヲ示したクロー
ンの推定上のプールは形質転換細胞のより小さいグルー
プに分け、その後オリゴヌクレオチドプローグを使用す
る上記のスクリーニング法を繰り返す。クローンの推定
上のプールを再分割して形質転換細胞をスクリーニング
するこの方法は、個々の陽性コロニーが同定されるまで
繰り返される。その後、同定された特定陽性コロニーか
らプラスミ)”DNA1調製し、そして核酸配列決定に
付す。
ンの推定上のプールは形質転換細胞のより小さいグルー
プに分け、その後オリゴヌクレオチドプローグを使用す
る上記のスクリーニング法を繰り返す。クローンの推定
上のプールを再分割して形質転換細胞をスクリーニング
するこの方法は、個々の陽性コロニーが同定されるまで
繰り返される。その後、同定された特定陽性コロニーか
らプラスミ)”DNA1調製し、そして核酸配列決定に
付す。
また、直接コロニーハイブリダイゼーション(ハイブリ
ッド選択法)を使用してBSF’−1の単一クローンを
単離することもできる。この公知方法はダルンスタイン
(Grunatein) およびホダネ(USA)
72 : 3961(1975)に記載されている。
ッド選択法)を使用してBSF’−1の単一クローンを
単離することもできる。この公知方法はダルンスタイン
(Grunatein) およびホダネ(USA)
72 : 3961(1975)に記載されている。
ハイブリッド選択去では、個々の形η転換ai胞がスク
リーニングのために選ばれる。を質転換細胞を液体培養
基中で増殖させ、その後、アルカリ溶解のような公知技
術のいずれかを用いて形質転換細胞から複製プラスミド
ヲ抽出する。プラスミドDNAは社製プラスミド中のユ
ニークな制限部位でそのプラスミドヲ切断することによ
り調製する。
リーニングのために選ばれる。を質転換細胞を液体培養
基中で増殖させ、その後、アルカリ溶解のような公知技
術のいずれかを用いて形質転換細胞から複製プラスミド
ヲ抽出する。プラスミドDNAは社製プラスミド中のユ
ニークな制限部位でそのプラスミドヲ切断することによ
り調製する。
得うれた線状DNAセグメントをニトロセルロースへ移
行させる。プラスミ)’DNAIニトロセルロース上に
固定して遊離のDNAを除いた後、フィルターに固定さ
れたDNA1上記のようにして調製した全(BSF’−
1活性)mRNA とハイブリダイズさせる。ハイブ
リダイゼーション後、未結合RNA1フィルターから除
去する。その後、結合ハイズリノドの選択されたmRN
A f溶離して、先に詳述したウサギ網状赤血球溶解
液またはアフリカッメガエル卵母細胞の技法を用いてi
n VitrOで翻訳させる。その後、網状赤血球溶解
液翻訳またはmRNA微量注射卵母細胞から遊離された
液体は、上記のバイオアッセイを用いてBSF−1の存
在について試験する。
行させる。プラスミ)’DNAIニトロセルロース上に
固定して遊離のDNAを除いた後、フィルターに固定さ
れたDNA1上記のようにして調製した全(BSF’−
1活性)mRNA とハイブリダイズさせる。ハイブ
リダイゼーション後、未結合RNA1フィルターから除
去する。その後、結合ハイズリノドの選択されたmRN
A f溶離して、先に詳述したウサギ網状赤血球溶解
液またはアフリカッメガエル卵母細胞の技法を用いてi
n VitrOで翻訳させる。その後、網状赤血球溶解
液翻訳またはmRNA微量注射卵母細胞から遊離された
液体は、上記のバイオアッセイを用いてBSF−1の存
在について試験する。
上記方法によって、本発明者らは1つの陽性コロニーを
発見した。MusIL−4と名づけたプラスミドDNA
は単離・同定されたその陽性コロニーから得られた。そ
の後、MusIL−4クローンは“スクリーニングされ
たcDNAの性状決定1のところで後述する方法を用い
てヌクレオチドゝの塩基配列決定により同定した。Mu
sIL−4クローンのDNA配列は第4図に示され、こ
れはネズミBSF−1遺伝子のDNA組成を示すもので
ある。第4図に示すMusIL−4クローンはBSF’
−1遺伝子の5′および3′隣接領域部分を含む。
発見した。MusIL−4と名づけたプラスミドDNA
は単離・同定されたその陽性コロニーから得られた。そ
の後、MusIL−4クローンは“スクリーニングされ
たcDNAの性状決定1のところで後述する方法を用い
てヌクレオチドゝの塩基配列決定により同定した。Mu
sIL−4クローンのDNA配列は第4図に示され、こ
れはネズミBSF−1遺伝子のDNA組成を示すもので
ある。第4図に示すMusIL−4クローンはBSF’
−1遺伝子の5′および3′隣接領域部分を含む。
の作製
上記のネズミCDNA またはその比較的大きい部分は
、他の動物種(例えばヒト、ウシ、ヒツジまたはブタ)
からBSF−1遺伝子を単離するためのクローンとして
使用される。1つの例として(限定するものではない)
、ネズミcDNAプローズは第4図に示すように、ネズ
ミBSF−1遺伝子のコード領域の5′末端に近接した
Rsa I 部位(核酸番号67)から、その遺伝子
のコード領域の3′末端に近接したRsa 工部位(核
酸番号440)まで、延びるcDNAフラグメントから
成る。この比較的大きいサイズのプローグは、ネズミc
DNAプローズが他の動物種のcDNAライブラリー中
に存在する相同BSF”−1遺伝子とハイブリダイズす
る可能性を実質的に増大させる。第4図に示すネズミc
DNAフラグメントのヌクレオチビ配列の他の部分に対
応するプローグも1本発明の精神または範囲から逸脱す
ることなく使用し得ることを理解すべきである。
、他の動物種(例えばヒト、ウシ、ヒツジまたはブタ)
からBSF−1遺伝子を単離するためのクローンとして
使用される。1つの例として(限定するものではない)
、ネズミcDNAプローズは第4図に示すように、ネズ
ミBSF−1遺伝子のコード領域の5′末端に近接した
Rsa I 部位(核酸番号67)から、その遺伝子
のコード領域の3′末端に近接したRsa 工部位(核
酸番号440)まで、延びるcDNAフラグメントから
成る。この比較的大きいサイズのプローグは、ネズミc
DNAプローズが他の動物種のcDNAライブラリー中
に存在する相同BSF”−1遺伝子とハイブリダイズす
る可能性を実質的に増大させる。第4図に示すネズミc
DNAフラグメントのヌクレオチビ配列の他の部分に対
応するプローグも1本発明の精神または範囲から逸脱す
ることなく使用し得ることを理解すべきである。
ネズミcDNAプローブは、他の動物種のcDNAライ
ブラリープールとハイブリダイズさせる前に放射性標識
される。比較的大きいサイズのクローンであるために、
いろいろな標識方法が使用しうるが、好ましくはプロー
ブは1ニンクトランスレーシヨン1により標識される。
ブラリープールとハイブリダイズさせる前に放射性標識
される。比較的大きいサイズのクローンであるために、
いろいろな標識方法が使用しうるが、好ましくはプロー
ブは1ニンクトランスレーシヨン1により標識される。
リグビー(Rlgby)f−)ノJ、 )Aol、
Bio、 113 : 237(1977)およびマ
ニアチスらの上記文献108に論じられるような公知方
法では、DNaaeI による非常に制限された処理
によりDNAのかなり離れた部位にニックが導入され、
それによって各ニックは遊離の3′−OH基をもつよう
になる。DNA4リメラーゼ工を使用して3’−OH末
端に適当な放射性標識デオキシヌクレオチド9三リン酸
(32P−dNTP)i取り込ませ、同時にニックの5
′側のヌクレオチドヲ取り除いて、DNAに沿ってニッ
クを逐次移動させる。
Bio、 113 : 237(1977)およびマ
ニアチスらの上記文献108に論じられるような公知方
法では、DNaaeI による非常に制限された処理
によりDNAのかなり離れた部位にニックが導入され、
それによって各ニックは遊離の3′−OH基をもつよう
になる。DNA4リメラーゼ工を使用して3’−OH末
端に適当な放射性標識デオキシヌクレオチド9三リン酸
(32P−dNTP)i取り込ませ、同時にニックの5
′側のヌクレオチドヲ取り除いて、DNAに沿ってニッ
クを逐次移動させる。
cDNAライブラリーは先に説明した方法?用いてmR
NAから作製される。これらの他の押のmRN AはB
SB’−1k産生ずることが知られている源から抽出さ
れる。例えば、ヒトの場合はマイトジェンで刺激したヒ
トT細1泡からライズラリ−を作製しうる。ヒト細胞か
らのmRNAは上記のような標準方法によっ′て抽出し
、その後ボIJ A+mRNAを例えばオリ:+’(a
T)セルロースのクロマトグラフィーにより抽出タンパ
ク質から分離する。ヒトmRNAに対応する2本領cD
NAのライブラリー(1、上記の方法音用いて作製する
。その後c D N Aライブラリーがサチンプロット
法および/またはコロニー・・イブリダイゼーション法
により放射性標識子ズミcDNAプローブを用いてスク
リーニングされる。この方法により、上記のネズミBs
F−1遺伝子に対して十分な相同性を示してネズミcD
NAプローブと・・イブリダイズする他の動物種のBS
F’−1遺伝子を単離することが可能である。
NAから作製される。これらの他の押のmRN AはB
SB’−1k産生ずることが知られている源から抽出さ
れる。例えば、ヒトの場合はマイトジェンで刺激したヒ
トT細1泡からライズラリ−を作製しうる。ヒト細胞か
らのmRNAは上記のような標準方法によっ′て抽出し
、その後ボIJ A+mRNAを例えばオリ:+’(a
T)セルロースのクロマトグラフィーにより抽出タンパ
ク質から分離する。ヒトmRNAに対応する2本領cD
NAのライブラリー(1、上記の方法音用いて作製する
。その後c D N Aライブラリーがサチンプロット
法および/またはコロニー・・イブリダイゼーション法
により放射性標識子ズミcDNAプローブを用いてスク
リーニングされる。この方法により、上記のネズミBs
F−1遺伝子に対して十分な相同性を示してネズミcD
NAプローブと・・イブリダイズする他の動物種のBS
F’−1遺伝子を単離することが可能である。
ネズミ、ヒ)または他の源から上記のようにして作製さ
れたプラスミドゝcDNAはそのDNAの核酸配列、特
にその中に含まれるBSF−1遺伝子の塩基配列を調べ
るために分析される。プラスミドDNAの塩基配列を決
定する1つの公知方法は、初めにサンガー(Sange
r)らのProc、 Natl。
れたプラスミドゝcDNAはそのDNAの核酸配列、特
にその中に含まれるBSF−1遺伝子の塩基配列を調べ
るために分析される。プラスミドDNAの塩基配列を決
定する1つの公知方法は、初めにサンガー(Sange
r)らのProc、 Natl。
Acad、 Sci、(USA) 70 : 546
3(1977)に発表されたチェイン−ターミネーショ
ン法である。また、米国特許第4322499号を参照
されたい。チェイン−ターミネーション塩基配列決定法
はM13クャムハ7 )’ズック(Amersham
Hanabook) 、 ズレンハイム・クレセント
、ロンドン(1983) lL後1アマーシャムハン
ビプノク“と呼ぶ);メッ72、43〜48(1979
) ;フラング−(Horrander)らのGene
26 : 101(1983) ; セVッチ(Ce
rretti )る。M13線維状ファージは対象のD
NA配列をクローニングするためのベクターとして使用
される。
3(1977)に発表されたチェイン−ターミネーショ
ン法である。また、米国特許第4322499号を参照
されたい。チェイン−ターミネーション塩基配列決定法
はM13クャムハ7 )’ズック(Amersham
Hanabook) 、 ズレンハイム・クレセント
、ロンドン(1983) lL後1アマーシャムハン
ビプノク“と呼ぶ);メッ72、43〜48(1979
) ;フラング−(Horrander)らのGene
26 : 101(1983) ; セVッチ(Ce
rretti )る。M13線維状ファージは対象のD
NA配列をクローニングするためのベクターとして使用
される。
これらのファージベクターはチェイン−ターミネーショ
ン法によって容易に塩基配列が決定される1本領DNA
テンブレーIf与える。チェイン−ターミネーション法
は1本鎖テンプレート分子に遊離3′−ヒト90キシル
基をもつ短いプライマー鎖をアニーリングし、次にDN
Aポリメラーゼ(K1enowフラグメント)ヲ用いて
4種類すべてのデオキシリボヌクレオチド三リン酸:す
なわちaATP、aCTP、 aGTPおよびaTT
P (集合的に”aNTP“ と記す)(aNTP
のうち1種は放射性標識される)の存在下に鎖伸長反応
でテンプレート鎖全コピーすることを包含する。この合
成反応において、3′ヒドロキシル末端を欠くヌクレオ
チドゝ特異的チェインターミネータ−1例えば2′。
ン法によって容易に塩基配列が決定される1本領DNA
テンブレーIf与える。チェイン−ターミネーション法
は1本鎖テンプレート分子に遊離3′−ヒト90キシル
基をもつ短いプライマー鎖をアニーリングし、次にDN
Aポリメラーゼ(K1enowフラグメント)ヲ用いて
4種類すべてのデオキシリボヌクレオチド三リン酸:す
なわちaATP、aCTP、 aGTPおよびaTT
P (集合的に”aNTP“ と記す)(aNTP
のうち1種は放射性標識される)の存在下に鎖伸長反応
でテンプレート鎖全コピーすることを包含する。この合
成反応において、3′ヒドロキシル末端を欠くヌクレオ
チドゝ特異的チェインターミネータ−1例えば2′。
3′−ジデオキ7ヌクレオチド三リン酸(aaNTP)
を使用すると、一連の鎖長の異なるDNA分子が合成さ
れる。このターミネータ−は伸長しつつあるDNA鎖に
取り込まれるように通常の5′末端をもつが、3′ヒド
ロキシル末端を欠いている。ひとたびターミネータ−が
DNA鎖に組み込まれると。
を使用すると、一連の鎖長の異なるDNA分子が合成さ
れる。このターミネータ−は伸長しつつあるDNA鎖に
取り込まれるように通常の5′末端をもつが、3′ヒド
ロキシル末端を欠いている。ひとたびターミネータ−が
DNA鎖に組み込まれると。
もはやデオキシヌクレオチビ三リン酸は付加されず、こ
うして鎖伸長が停止する。4種類のヌクレオチF−″’
aNTP :すなわちaATP、aCTP、aGTPお
よびaTTPのうち1種類のddNTP′ft含む4つ
の別個の合成反応が実施される。aNTPのうち1種類
は放射性標識され、従って合成釦はポリアクリルアミド
ゝゲルでの分画化の後オートラジオグラフィーにかける
ことができる。4つの反応からの鎖伸長DNA分子は別
々のダルレーンに並置する。
うして鎖伸長が停止する。4種類のヌクレオチF−″’
aNTP :すなわちaATP、aCTP、aGTPお
よびaTTPのうち1種類のddNTP′ft含む4つ
の別個の合成反応が実施される。aNTPのうち1種類
は放射性標識され、従って合成釦はポリアクリルアミド
ゝゲルでの分画化の後オートラジオグラフィーにかける
ことができる。4つの反応からの鎖伸長DNA分子は別
々のダルレーンに並置する。
こうして、オートラジオグラフィーからのフラグメント
のパターンはクローン化DNAの核酸配列に一致する。
のパターンはクローン化DNAの核酸配列に一致する。
第4図は上記のMusIL−4プラスミドDNA中に含
まれるネズミBSF’−1遺伝子のヌクレオチドゝ配列
を示し、ヌクレオチドは5′末端の最初から番号が付け
られる。遺伝子の対応するアミノ酸組成もまた第4図に
示され、アミノ酸残基はヌクレオチ)/%、17のMe
t残基の最初から番号が付けられる。
まれるネズミBSF’−1遺伝子のヌクレオチドゝ配列
を示し、ヌクレオチドは5′末端の最初から番号が付け
られる。遺伝子の対応するアミノ酸組成もまた第4図に
示され、アミノ酸残基はヌクレオチ)/%、17のMe
t残基の最初から番号が付けられる。
本発明者らは、成熟タン・ξり質が/1621のHis
残基(ヌクレオチドゝ腐154)から始まって7M、1
40のSer残基(ヌクレオチドゝ、% 436)まで
延びていると考える。
残基(ヌクレオチドゝ腐154)から始まって7M、1
40のSer残基(ヌクレオチドゝ、% 436)まで
延びていると考える。
塩基配列決定法の準備のために、DNA挿入物を含むプ
ラスミド”DNAはM13フ了−ジばフタ−にサメクロ
ーニングして1本鎖DNAテンプレートを作る。共通の
プライマーを使用してセンス鎖およびアンチセンス鎖の
h糸配列全決定する。1回のチェイン−ターミネーショ
ン法による全長フラグメントの塩基配列決定から得られ
た結果全信頼するよりもむしろ、別の合成プライマーを
使用してサブクローン化DNAフラグメントの長さに沿
った中間位置からチェインーターミネーンヨン法全開始
する。合成プライマーの組成は共通プライマーを用いて
得られた塩基配列情報に基づいていた。この方法によっ
て、サブクローン化DNAフラグメントの両鎖は部分的
に重複する形で塩基配列が決定され、それによりその塩
基配列を重複して確認するのに役立つ。
ラスミド”DNAはM13フ了−ジばフタ−にサメクロ
ーニングして1本鎖DNAテンプレートを作る。共通の
プライマーを使用してセンス鎖およびアンチセンス鎖の
h糸配列全決定する。1回のチェイン−ターミネーショ
ン法による全長フラグメントの塩基配列決定から得られ
た結果全信頼するよりもむしろ、別の合成プライマーを
使用してサブクローン化DNAフラグメントの長さに沿
った中間位置からチェインーターミネーンヨン法全開始
する。合成プライマーの組成は共通プライマーを用いて
得られた塩基配列情報に基づいていた。この方法によっ
て、サブクローン化DNAフラグメントの両鎖は部分的
に重複する形で塩基配列が決定され、それによりその塩
基配列を重複して確認するのに役立つ。
上に概説したチェイン−ターミネーション法金使用する
よりもむしろ他の既知方法を使用して、本発明の精神ま
たは範囲から逸脱することなくクローン化つシcDNA
挿入物の塩基配列を決定し得ると理解すべきである。例
えば、Proc、 Natl。
よりもむしろ他の既知方法を使用して、本発明の精神ま
たは範囲から逸脱することなくクローン化つシcDNA
挿入物の塩基配列を決定し得ると理解すべきである。例
えば、Proc、 Natl。
Acad、 5ci(USA) 74 : 560(
1977) に記、成されるようなマクサム(Max
am)およびギルバート(Gilbert) の化学
的分解法を使用することができる。
1977) に記、成されるようなマクサム(Max
am)およびギルバート(Gilbert) の化学
的分解法を使用することができる。
cDNAクローンからの機能的BSF’−1の発現プラ
スミ)”Mu日IL−4中に含まれるBSF’−1遺伝
子のcDNAコートゝ領域が機能的BSF’−1’iミ
ーコードするかどうかを調べるために、その遺伝子は酵
母発現系において発現させる。その後、得られた発現産
物2BSF−1活性を示すその能力について試験する。
スミ)”Mu日IL−4中に含まれるBSF’−1遺伝
子のcDNAコートゝ領域が機能的BSF’−1’iミ
ーコードするかどうかを調べるために、その遺伝子は酵
母発現系において発現させる。その後、得られた発現産
物2BSF−1活性を示すその能力について試験する。
実施例Aを参照されたい。
酵母発現系では、実質的にBSF’−1遺伝子の全コー
ド領域から成るcDNAフラグメントが、酵母宿主細胞
からの成熟BSF’−]の直接的合成および分泌のため
に考案された発現ベクター(第5図参照)内に挿入され
る。その発現ベクター(例えばはクレーpY(If B
SF −1)は好ましくは複製起点およびアンピシリン
耐性遺伝子(Ampr) k含むプラスミ)pBR32
2由来の配列(第5図の太線部分)を含有する。また、
好ましくは発現ベクターは酵母由来の配列、例えば選択
マーカーとしてのトリプトファン−1遺伝子(Trp−
1)および2μ酵母複製起点(第5図の細線部分)を含
む。理想的には、発現にクレーはさらに酵母宿主内での
BSF’−1の合成計よび分泌をつかさどるリーダー配
列と共に有効なプロモーターとしての酵母α因子(例え
ば第5図の点描ボックス部分)、そのあとに続<BSF
’−1コード領域の配列(開放ボックス部分)全含む。
ド領域から成るcDNAフラグメントが、酵母宿主細胞
からの成熟BSF’−]の直接的合成および分泌のため
に考案された発現ベクター(第5図参照)内に挿入され
る。その発現ベクター(例えばはクレーpY(If B
SF −1)は好ましくは複製起点およびアンピシリン
耐性遺伝子(Ampr) k含むプラスミ)pBR32
2由来の配列(第5図の太線部分)を含有する。また、
好ましくは発現ベクターは酵母由来の配列、例えば選択
マーカーとしてのトリプトファン−1遺伝子(Trp−
1)および2μ酵母複製起点(第5図の細線部分)を含
む。理想的には、発現にクレーはさらに酵母宿主内での
BSF’−1の合成計よび分泌をつかさどるリーダー配
列と共に有効なプロモーターとしての酵母α因子(例え
ば第5図の点描ボックス部分)、そのあとに続<BSF
’−1コード領域の配列(開放ボックス部分)全含む。
α因子遺伝子の構造はカージャン(Kurjan)およ
びハースコビッ7 (Herskowitz)のC81
130: 933〜943(1982)に論じられてい
る。
びハースコビッ7 (Herskowitz)のC81
130: 933〜943(1982)に論じられてい
る。
当な菌株を形質転換する。好適な菌株には酵母菌株79
、X2181− IB、 DBY746、YNN282
.20B−12が含まれるが、これらに限定されない。
、X2181− IB、 DBY746、YNN282
.20B−12が含まれるが、これらに限定されない。
これらの菌株はすべてα因子プロモーターとの適合性の
ために、およびTrp+形質転換細胞の選択のためにα
、Trp lである。これらの菌株はすべて広く入手可
能であり、例えば菌株79はカリフォルニア州9470
2 、バークレー、カリフォルニア大学、生物物理・医
学物理部、イースト・ジェネテテイノク・ストック・セ
ンター(Ysast GθnetiC8tock Ce
nter)から入手しうる。
ために、およびTrp+形質転換細胞の選択のためにα
、Trp lである。これらの菌株はすべて広く入手可
能であり、例えば菌株79はカリフォルニア州9470
2 、バークレー、カリフォルニア大学、生物物理・医
学物理部、イースト・ジェネテテイノク・ストック・セ
ンター(Ysast GθnetiC8tock Ce
nter)から入手しうる。
BSF’−1遺伝子を含む組換え発現プラスミドによる
酵母宿主の形質転換は公知方法(スフェロプラストヲ形
成し、その後プラスミドの取込みに先立って洗浄する)
に従って実施される。この方法のだめの標準的な実験手
段は確立されている。べ(1978)およびヒネ7 (
HLnnen)らのProc、 Natl。
酵母宿主の形質転換は公知方法(スフェロプラストヲ形
成し、その後プラスミドの取込みに先立って洗浄する)
に従って実施される。この方法のだめの標準的な実験手
段は確立されている。べ(1978)およびヒネ7 (
HLnnen)らのProc、 Natl。
Acad、 5ci(USA) 75 : 1929
(1978)k参照されたい。
(1978)k参照されたい。
組換えBSF−1は先に論じたものと同じHPLC法を
用いて酵母培養上清から精製され、次いで精製された組
換え産物は活性化ネズミB細胞の増殖を支持するその能
力により生物学的活性について検定される。BSF−1
活性検定の詳細は実施例Aで説明する。この検定におい
て、酵母上清は比較的高レイルのBSF’−1活性を示
すことがわかった。
用いて酵母培養上清から精製され、次いで精製された組
換え産物は活性化ネズミB細胞の増殖を支持するその能
力により生物学的活性について検定される。BSF−1
活性検定の詳細は実施例Aで説明する。この検定におい
て、酵母上清は比較的高レイルのBSF’−1活性を示
すことがわかった。
対照として、その発現プラスミドと同じ構成であるがB
SF’−1配列を欠くプラスミドヲ用いて酵母宿主を形
質転換した。検定の際に、この対照プラスミドから誘導
された上清からは生物学的活性が全く検出されなかった
。
SF’−1配列を欠くプラスミドヲ用いて酵母宿主を形
質転換した。検定の際に、この対照プラスミドから誘導
された上清からは生物学的活性が全く検出されなかった
。
本発明はまたBSF−1の野生型遺伝子をコドンの付加
、コドンの置換またはコトゝンの欠失によって変更する
ことによるBSF−1類似体の作製全包含する。BSF
−1遺伝子類似体を作製する1つの理由は、成熟BSF
−1の発現を天然型遺伝子金側って得られるレベルより
も増大させることである。
、コドンの置換またはコトゝンの欠失によって変更する
ことによるBSF−1類似体の作製全包含する。BSF
−1遺伝子類似体を作製する1つの理由は、成熟BSF
−1の発現を天然型遺伝子金側って得られるレベルより
も増大させることである。
例えば、本発明者ならびに共同研究者は、いくつかの酵
母発現系において産生されるタンパク質産物のレベルが
2つの塩基性アミノ酸残基、すなわちタンパク質産物の
アミノ酸配列に沿って位置づけられた2個の隣接塩基性
アミノ酸残基、の存在によって制限されるということ全
発見した。この場合に、タンパク質の発現レベルの増加
は、塩基性アミノ酸をコードするコドンを取り換えて多
重塩基性アミノ酸を排除するか、あるいは塩基性アミノ
酸をコードするコト9ンを欠失させて多重塩基性アミノ
酸の存在を排除することにより、野生型遺伝子を変換す
ることによって達成される。コドンの付加、置換または
欠失方法は米国特許出願第763130号に記載されて
おり、この特許出願は参照によりここに引用される。
母発現系において産生されるタンパク質産物のレベルが
2つの塩基性アミノ酸残基、すなわちタンパク質産物の
アミノ酸配列に沿って位置づけられた2個の隣接塩基性
アミノ酸残基、の存在によって制限されるということ全
発見した。この場合に、タンパク質の発現レベルの増加
は、塩基性アミノ酸をコードするコドンを取り換えて多
重塩基性アミノ酸を排除するか、あるいは塩基性アミノ
酸をコードするコト9ンを欠失させて多重塩基性アミノ
酸の存在を排除することにより、野生型遺伝子を変換す
ることによって達成される。コドンの付加、置換または
欠失方法は米国特許出願第763130号に記載されて
おり、この特許出願は参照によりここに引用される。
BSF’−1類似体は上で説明した同じ酵母発現系を使
用することにより変換BSF’−1遺伝子から発現され
る。得られたタンパク質産物は野生型遺伝子に関して先
に述べた同じ方法で精製される。また、精製されたタン
・ξり質産物は野生型遺伝子に関して先に説明し且つ以
下の実施例Aで詳述するようにBSF−1活性について
検定して、BSF’−1類似体の活性が野生型BSF−
1遺伝子によって発現された組換え産物と同じであるこ
とを確かめる。
用することにより変換BSF’−1遺伝子から発現され
る。得られたタンパク質産物は野生型遺伝子に関して先
に述べた同じ方法で精製される。また、精製されたタン
・ξり質産物は野生型遺伝子に関して先に説明し且つ以
下の実施例Aで詳述するようにBSF−1活性について
検定して、BSF’−1類似体の活性が野生型BSF−
1遺伝子によって発現された組換え産物と同じであるこ
とを確かめる。
本発明の方法および産物はさらに、本発明で使用される
・特定方法のアルファベットで表示した実施例および番
号を付した実施例によってホされる。
・特定方法のアルファベットで表示した実施例および番
号を付した実施例によってホされる。
以下の実施例は単に代表例であり、それらは本発明を例
示するために、あるいは本発明の利用に際して当業者を
助けるために提供される。これらの実施例はいずれにし
ても本発明の範囲または特許証によって許可される保泗
の範囲を制限するものではない。
示するために、あるいは本発明の利用に際して当業者を
助けるために提供される。これらの実施例はいずれにし
ても本発明の範囲または特許証によって許可される保泗
の範囲を制限するものではない。
(実施例)
実施例A
この検定では、サブマイトジェン濃度の抗免疫グロブリ
ンの存在下でB細胞の増殖全刺激する本発明のBSF−
1の能力をWかめた。この検定は自然界でBSF’−1
を産生ずる細胞型および組換えBSF’−1を発現する
形質転換宿主細胞の培養上清中のBSF−1の存在につ
いて試験するために使用された。この検定はまた本発明
のBSF−1精製法を監視するために使用された。
ンの存在下でB細胞の増殖全刺激する本発明のBSF−
1の能力をWかめた。この検定は自然界でBSF’−1
を産生ずる細胞型および組換えBSF’−1を発現する
形質転換宿主細胞の培養上清中のBSF−1の存在につ
いて試験するために使用された。この検定はまた本発明
のBSF−1精製法を監視するために使用された。
この検定では、生後8〜12週目の雌C57B1/6
J マウ、t、 (M E 、バーハーバ−、ジャクタ
ンラボラトリー)に、腹水調製物としての30 H12
ラツト抗マウスThyIモノクロ一ナル抗体0.2mg
k腹腔内注射することによって、精製B細胞を調製し
た。このモノクローナル抗体を産生ずる細胞株はATC
Cから寄託番号T I B 107のもとに入手可能で
ある。3日後、マウスの牌@を摘出し、30 H12モ
ノクロ一ナル抗体(腹水の1 : 1000希釈物)、
GKI、5 ラット抗マウスL3T4モノクローナル抗
体(ATCC寄託番号TlB207)(腹水のに500
希釈物)、ウサギ抗マウス胸腺細胞血清(肝臓および骨
髄により吸収されたもの) (1: 1000希釈物)
およびウサギ補体(1: 10希釈物、アガロースによ
シ吸収されたもの)(AR,ロガース、はル・フリーズ
・バイオメデカルズ)の?見合iでin vitroに
処理し2.それによりfll HB胞からT細胞を除い
た。その後、T細胞欠除牌細ヴはゲル濾過クロマトグラ
フィー(セファデックスG−10分離樹脂、ファーマシ
ア・ファイン・ケミカルズ)で処理して付着細胞を除い
た。B細胞はヤギ抗マウスIgM (P A、 メル
バーン、クーパー・バイオメディカル)を被覆しだベト
リ皿上でパンニングすることにより選別した。
J マウ、t、 (M E 、バーハーバ−、ジャクタ
ンラボラトリー)に、腹水調製物としての30 H12
ラツト抗マウスThyIモノクロ一ナル抗体0.2mg
k腹腔内注射することによって、精製B細胞を調製し
た。このモノクローナル抗体を産生ずる細胞株はATC
Cから寄託番号T I B 107のもとに入手可能で
ある。3日後、マウスの牌@を摘出し、30 H12モ
ノクロ一ナル抗体(腹水の1 : 1000希釈物)、
GKI、5 ラット抗マウスL3T4モノクローナル抗
体(ATCC寄託番号TlB207)(腹水のに500
希釈物)、ウサギ抗マウス胸腺細胞血清(肝臓および骨
髄により吸収されたもの) (1: 1000希釈物)
およびウサギ補体(1: 10希釈物、アガロースによ
シ吸収されたもの)(AR,ロガース、はル・フリーズ
・バイオメデカルズ)の?見合iでin vitroに
処理し2.それによりfll HB胞からT細胞を除い
た。その後、T細胞欠除牌細ヴはゲル濾過クロマトグラ
フィー(セファデックスG−10分離樹脂、ファーマシ
ア・ファイン・ケミカルズ)で処理して付着細胞を除い
た。B細胞はヤギ抗マウスIgM (P A、 メル
バーン、クーパー・バイオメディカル)を被覆しだベト
リ皿上でパンニングすることにより選別した。
得られた精製B細胞は検出レベル以下のT細胞と98%
以上のB細胞を含むことがわかった。これは3O−H1
2および抗L3T4ラノトモノクローナル抗体を使用し
次いでFITC結合ウ結合ウサギトラット免疫グロブリ
ンgM、 工ta GおよびIgA)(CA、マウンテ
ンビュー、反りトンーディソキンタン)を使用してT細
拘ヲ検出し、さらにF’ITC結合ウサギ抗つウスエg
M (PA、ウェストセスタ−1力にノドラボラトリー
ズ)全使用してB細胞を検出するフローサイトメーター
分析(エピノクスーCフローサイトメーター;FL、ヒ
アリー、クールターコープ)により確かめた。また、上
記のようにして調製したB細胞集団は、T細胞マイトジ
ェンのCon、 A (M O、セントルイス、シグマ
ケミカル)に全く応答しないが、B細胞マイトジェンの
LPSに完全に応答することが見出された。
以上のB細胞を含むことがわかった。これは3O−H1
2および抗L3T4ラノトモノクローナル抗体を使用し
次いでFITC結合ウ結合ウサギトラット免疫グロブリ
ンgM、 工ta GおよびIgA)(CA、マウンテ
ンビュー、反りトンーディソキンタン)を使用してT細
拘ヲ検出し、さらにF’ITC結合ウサギ抗つウスエg
M (PA、ウェストセスタ−1力にノドラボラトリー
ズ)全使用してB細胞を検出するフローサイトメーター
分析(エピノクスーCフローサイトメーター;FL、ヒ
アリー、クールターコープ)により確かめた。また、上
記のようにして調製したB細胞集団は、T細胞マイトジ
ェンのCon、 A (M O、セントルイス、シグマ
ケミカル)に全く応答しないが、B細胞マイトジェンの
LPSに完全に応答することが見出された。
この検定法では、推定上のBSF’−1含有被検試料の
段階的希釈物が平底96−ウェルマイクロタイタープレ
ート(3596; MA、ケンブリッジ、データパッケ
ージング、コスタ−)中のアフィニティー精製ヤギ抗マ
ウスI9M(クーパー・バイオメゾイカA′)3〜5μ
9/ml k含む培地200μg中で、先に調製した1
05個のB細つとの培養下に置かれる。この培地は10
% F’C8、ペニシリン(15μg/mlり、 スト
レプトづイン7 (50pg/me) 、ゲンタマイン
7 (+00 tt g/ml)、 L−グルタミン(
2mM)および2−メルカプトエタノール(5X 10
−5M)全補足したRPM工1640 (N、Yo、ク
ランドアイランド、ギブコ・ラボラトリーズ)から成っ
ていた。培養物は7.5%CO□/空気を含む湿潤雰囲
気中37℃でインキ−R−ジョンした。72時間後、培
養物は2.0μC1のトリチウム化チミジン(3H−T
dr)(MA、ボストン、ニューイングランド9・ヌク
レアー;比活性75C1/mM) ′!i″6時間(7
) 間受’rj 取す、その後例えば多重自動試料収穫
機を使ってガラス繊維濾過枠上に収穫した。3H−Td
rの取込みは液体シンチレーションカウンターで測定し
た。
段階的希釈物が平底96−ウェルマイクロタイタープレ
ート(3596; MA、ケンブリッジ、データパッケ
ージング、コスタ−)中のアフィニティー精製ヤギ抗マ
ウスI9M(クーパー・バイオメゾイカA′)3〜5μ
9/ml k含む培地200μg中で、先に調製した1
05個のB細つとの培養下に置かれる。この培地は10
% F’C8、ペニシリン(15μg/mlり、 スト
レプトづイン7 (50pg/me) 、ゲンタマイン
7 (+00 tt g/ml)、 L−グルタミン(
2mM)および2−メルカプトエタノール(5X 10
−5M)全補足したRPM工1640 (N、Yo、ク
ランドアイランド、ギブコ・ラボラトリーズ)から成っ
ていた。培養物は7.5%CO□/空気を含む湿潤雰囲
気中37℃でインキ−R−ジョンした。72時間後、培
養物は2.0μC1のトリチウム化チミジン(3H−T
dr)(MA、ボストン、ニューイングランド9・ヌク
レアー;比活性75C1/mM) ′!i″6時間(7
) 間受’rj 取す、その後例えば多重自動試料収穫
機を使ってガラス繊維濾過枠上に収穫した。3H−Td
rの取込みは液体シンチレーションカウンターで測定し
た。
この方法によると、BSF−1の存在下で培養したB細
胞のみが用量に依存して3H−Tdr’i取込むことが
わかった。BSF’−1の不在下で培養したB細胞はパ
ックグラウンドレベルの3H−Tarのみを取込んだ。
胞のみが用量に依存して3H−Tdr’i取込むことが
わかった。BSF’−1の不在下で培養したB細胞はパ
ックグラウンドレベルの3H−Tarのみを取込んだ。
活性の単位は最大チミジン取込みの50%を誘発するB
SF−1の号として計算した。従って、100μaの試
料が1:20の希釈で最大チミジン取込みの1/!ヲも
たらしたとすると、1単位は100μeの17/!o、
すなわち5μeに含まれるとみなされた。
SF−1の号として計算した。従って、100μaの試
料が1:20の希釈で最大チミジン取込みの1/!ヲも
たらしたとすると、1単位は100μeの17/!o、
すなわち5μeに含まれるとみなされた。
こうして、この試料は1000を5で割った値、すなわ
ち200単位/ミリリットル(U/ae)の活性を含む
であろう。
ち200単位/ミリリットル(U/ae)の活性を含む
であろう。
実施例B
IL−2増殖検定
BSI’−1試料はIL−2依存性細胞の増殖を誘発す
る能力について検定し、それにより本発明のBSF−1
精製工程中のBSF’−1の均質性全監視し、またひと
たび均質に精製されたBSF’−1がIL−2依存性細
1泡株の活性を刺激する能力をもつかどうかについて調
べだ。
る能力について検定し、それにより本発明のBSF−1
精製工程中のBSF’−1の均質性全監視し、またひと
たび均質に精製されたBSF’−1がIL−2依存性細
1泡株の活性を刺激する能力をもつかどうかについて調
べだ。
IL−2増殖検定はCTLL IL−2依存性ネズミT
細胞1株を用いて行った。この細胞株はATCCから寄
託番号T I B 214のもとに入手可能である。
細胞1株を用いて行った。この細胞株はATCCから寄
託番号T I B 214のもとに入手可能である。
この@0味は10%F’C8、ベニシリア(50U/m
/)、ストレプトマイシン(50tig/me)および
100 U / rugのIL−2i含むクリック培地
(WI、リバーフオールズ、アトリック・アン7エーツ
)中で培養下に保持し、2〜4日おきに継代培養する。
/)、ストレプトマイシン(50tig/me)および
100 U / rugのIL−2i含むクリック培地
(WI、リバーフオールズ、アトリック・アン7エーツ
)中で培養下に保持し、2〜4日おきに継代培養する。
この検定法では2×103個のCTLL細胞がBSF’
−1含有被検試料の段階的希釈物と共にF′C3(10
%)、ハニシリン(50μe/rnl)、ストレフトマ
イシン(50μg/m/)’に含むクリック培地1O(
1μg中で培養される。培養物は7.5%CO2/空気
の湿潤雰囲気中37℃でインキュベーションした。24
時間後。
−1含有被検試料の段階的希釈物と共にF′C3(10
%)、ハニシリン(50μe/rnl)、ストレフトマ
イシン(50μg/m/)’に含むクリック培地1O(
1μg中で培養される。培養物は7.5%CO2/空気
の湿潤雰囲気中37℃でインキュベーションした。24
時間後。
コノ培養物は2.0 μCiの3H−Tdr (75C
1/mlりにューイングラントゝ・ヌクレアー)を6時
間の間受は取った。その後培養物を、例えば多重自動試
料収穫機を使って、ガラス繊維濾過枠上に収穫した。3
H−Tdr の取込みは液体シンチレーションカウン
ターで測定した。
1/mlりにューイングラントゝ・ヌクレアー)を6時
間の間受は取った。その後培養物を、例えば多重自動試
料収穫機を使って、ガラス繊維濾過枠上に収穫した。3
H−Tdr の取込みは液体シンチレーションカウン
ターで測定した。
この方法によると、本発明のESF’−1の存在下また
はIL−2の存在下で培養したC T L L 44旧
泡のみが用量に依存して3H−Tdri取込むことがわ
かった。この因子の不在下で培養したCTLL細やはバ
ックグラウンド゛レベルの3H−Tdr のみを取込
んだ。活性の単位は実S例Aで詳述したようにして計算
した。
はIL−2の存在下で培養したC T L L 44旧
泡のみが用量に依存して3H−Tdri取込むことがわ
かった。この因子の不在下で培養したCTLL細やはバ
ックグラウンド゛レベルの3H−Tdr のみを取込
んだ。活性の単位は実S例Aで詳述したようにして計算
した。
実施例に
の検定では、本発明に従って生産および精製されたBS
F−1が長期骨髄培養物から誘導されたネズミF’DC
−P2 細胞株の増殖を誘発する能力をもつかどうかに
ついて調べた。この細胞株は連続増殖のためにコロニー
刺激因子(工L−3) の存在を必要とする細胞株と
して同定された。デクスタ(Dextθr)らの上記文
献参照。F’DC−P2 細胞株は研究者の間に広く行
き渡っており、種々の源から入手可能である。
F−1が長期骨髄培養物から誘導されたネズミF’DC
−P2 細胞株の増殖を誘発する能力をもつかどうかに
ついて調べた。この細胞株は連続増殖のためにコロニー
刺激因子(工L−3) の存在を必要とする細胞株と
して同定された。デクスタ(Dextθr)らの上記文
献参照。F’DC−P2 細胞株は研究者の間に広く行
き渡っており、種々の源から入手可能である。
FOC−P2細f泡株はウマ血清(20V/V%)、−
”ニジリン(50U/me)、ストレプトマイシン(5
0μg/m/)、 2−メルカプトエタノール(50μ
M)および10% WEHI−3細胞株調整培地を補足
したRPMI −1640培地中で培養する。この調整
培地はWEHI −3細砲(培地1 ntl当たり1〜
5×106細皓)をウマ血清(5〜20v/v%)、は
ニジリン(50U / ml )、ストレプトマイシン
(50μg/mg)、新鮮L−グルタミン(300μg
/rne’) および2−メルカプトエタノール(2
5×10−5M)を補足したRPMニー1640培地中
で48時間培養することによシ得られる。FDC−P2
細胞は2〜4日ごとに継代培養する。これに関しては
細胞全計数して、組織培養フラスコ中の培地25〜50
mlに0.1〜1×105細胞/meの密度で細胞を
まく。細申1は1〜2日ごとに数が倍増するであろう。
”ニジリン(50U/me)、ストレプトマイシン(5
0μg/m/)、 2−メルカプトエタノール(50μ
M)および10% WEHI−3細胞株調整培地を補足
したRPMI −1640培地中で培養する。この調整
培地はWEHI −3細砲(培地1 ntl当たり1〜
5×106細皓)をウマ血清(5〜20v/v%)、は
ニジリン(50U / ml )、ストレプトマイシン
(50μg/mg)、新鮮L−グルタミン(300μg
/rne’) および2−メルカプトエタノール(2
5×10−5M)を補足したRPMニー1640培地中
で48時間培養することによシ得られる。FDC−P2
細胞は2〜4日ごとに継代培養する。これに関しては
細胞全計数して、組織培養フラスコ中の培地25〜50
mlに0.1〜1×105細胞/meの密度で細胞を
まく。細申1は1〜2日ごとに数が倍増するであろう。
増殖検定は実施4/llBに記載の方法と同じようにし
てBSF’−1の被検試料に関して行った。捷だ。
てBSF’−1の被検試料に関して行った。捷だ。
活性の単位は実施例Aのようにして計算した。
実施例り
先に述べたように、この検定では工L−3依存性細胞で
ある32Dの増殖を誘発する本発明BSF’ −1の能
力について調べる。この細胞株はレトロウィルスに感染
したC3H−HeJ マウス骨髄培養物から誘導された
。グリーンバーガー(Greenberger)らの上
記文献参照。これらの細胞は10%F’C8(IQv
/ v%)、WEHI −3細胞株調整培地(10v/
v%)、ペニシリン(50U / m/ ) 、ストレ
プトマイノン(50μ鍾/耐)およびゲンタマイシン(
100μ9/m1)k含むクリック培地中に保持する。
ある32Dの増殖を誘発する本発明BSF’ −1の能
力について調べる。この細胞株はレトロウィルスに感染
したC3H−HeJ マウス骨髄培養物から誘導された
。グリーンバーガー(Greenberger)らの上
記文献参照。これらの細胞は10%F’C8(IQv
/ v%)、WEHI −3細胞株調整培地(10v/
v%)、ペニシリン(50U / m/ ) 、ストレ
プトマイノン(50μ鍾/耐)およびゲンタマイシン(
100μ9/m1)k含むクリック培地中に保持する。
32 D 、1+BI胞は2〜4日おきに継代培養する
。これに関しては、Yal 1泡を計数して、組織培養
フラスコ中に1〜4×104細口/ WLlの密度で細
胞をまく。この細胞は12〜24時間おきに数が倍増す
るであろう。32D細胞は研究者の間に広く行き渡って
おり、多くの源から人手可能である。
。これに関しては、Yal 1泡を計数して、組織培養
フラスコ中に1〜4×104細口/ WLlの密度で細
胞をまく。この細胞は12〜24時間おきに数が倍増す
るであろう。32D細胞は研究者の間に広く行き渡って
おり、多くの源から人手可能である。
32 D細胞およびBSF’−1の被検試料を使用する
検定は実施例Bに記載の方法を用いて実施した。
検定は実施例Bに記載の方法を用いて実施した。
また、活性の単位は実施例Aのようにして計算した。
実施例E
ゲル電気泳動
培養上清および本発明精製法からの分画は5DS−PA
GEによって分析して、本発明精製法を監視した。この
検定はレムリ(Laemmli)のNature(Lo
ndon) 227 : 680(1970)にti己
載のゲル法に従って行った。この検定は10〜20%勾
配のポリアクリルアミド9を使用する0、7mm S
DS スラブゲルを用いた。ゲルは20 m Aの定
常電流で泳動させた。得られたゲル試料はオークレー(
Oakley)らのAnal、 Biochem、 1
05 : 361(1980) に記載の方法によっ
て銀染色した。
GEによって分析して、本発明精製法を監視した。この
検定はレムリ(Laemmli)のNature(Lo
ndon) 227 : 680(1970)にti己
載のゲル法に従って行った。この検定は10〜20%勾
配のポリアクリルアミド9を使用する0、7mm S
DS スラブゲルを用いた。ゲルは20 m Aの定
常電流で泳動させた。得られたゲル試料はオークレー(
Oakley)らのAnal、 Biochem、 1
05 : 361(1980) に記載の方法によっ
て銀染色した。
高濃度の塩を含む特定の検定試料は初め0.1mMNH
4HCO3中ノO91%SDSニ対シテ透析し、その後
真空下で乾燥させた。この乾燥残留物は、5DS−PA
GE 法に先立って、還元緩衝液(2% 5DS)、
1%2−メルカプトエタノール中に溶解した。
4HCO3中ノO91%SDSニ対シテ透析し、その後
真空下で乾燥させた。この乾燥残留物は、5DS−PA
GE 法に先立って、還元緩衝液(2% 5DS)、
1%2−メルカプトエタノール中に溶解した。
実施例F
列決定
MueIL−4クローンを含めたDNAフラグメントは
、以下で説明する変法テともなう上記のアマ−ジャム・
ハンドブックに記載の標準テエインーターミネーンヨン
法を用いて、その塩基配列全決定した。
、以下で説明する変法テともなう上記のアマ−ジャム・
ハンドブックに記載の標準テエインーターミネーンヨン
法を用いて、その塩基配列全決定した。
DNAフラグメントはPsdおよび/またばRst工で
踏fヒし、その後M131本鎖線維状ファージベクター
のmp18およヒmp19(工L、アーリントンハイソ
、アマ−ジャム)にサブクローニングした。フラング−
(Norrander) らの上記文献に記載される
ように、mp18およびmp19 ファージベクター
は次の唯一のクローニング部位: Hlnd l[;
5phI; PstI;5aII; AccI; H1
nc旧XbaI; BamHI; XmaI;SmaI
; Kpn工; 5stI;およびEcoRI を含
む。
踏fヒし、その後M131本鎖線維状ファージベクター
のmp18およヒmp19(工L、アーリントンハイソ
、アマ−ジャム)にサブクローニングした。フラング−
(Norrander) らの上記文献に記載される
ように、mp18およびmp19 ファージベクター
は次の唯一のクローニング部位: Hlnd l[;
5phI; PstI;5aII; AccI; H1
nc旧XbaI; BamHI; XmaI;SmaI
; Kpn工; 5stI;およびEcoRI を含
む。
mp 1s ベクターおよびmp19ベクターの組成は
、cDNA挿入物の両鎖が上記2つのベクターにより有
利に塩基配列決定されるように上記の制限部位の順序が
mp19 ベクターでは逆になっているということを
除いて、同一である。cDNAの対応する鎖全含むmp
18およびmp19ベクターを用いて大腸菌株に12の
5M107 (MD、ベセスダ、ベセスダ・リサーチ・
ラボラトリーズ)を形質転換し、それによりセンス鎖お
よびアンチセンス鎖の一本鎖挿入物を含む多数の1本鎖
DNAテンプレートを得た。
、cDNA挿入物の両鎖が上記2つのベクターにより有
利に塩基配列決定されるように上記の制限部位の順序が
mp19 ベクターでは逆になっているということを
除いて、同一である。cDNAの対応する鎖全含むmp
18およびmp19ベクターを用いて大腸菌株に12の
5M107 (MD、ベセスダ、ベセスダ・リサーチ・
ラボラトリーズ)を形質転換し、それによりセンス鎖お
よびアンチセンス鎖の一本鎖挿入物を含む多数の1本鎖
DNAテンプレートを得た。
共通の合成プライマー: 5’−CCCAGTCACG
ACGTT−3I(W工、ミルウォーキー、 P−L
バイオケミカルズ)は12tJIIDNAテンプレー
トにアニーリングして、上記のようにDNA合成全開始
させるために使用した。その後、鎖伸長フラグメンIf
ゲル電気泳動で大きさに基づいて分離し、オートラジオ
グラフィーにかけてフラグメントのヌクレオチド配列を
推定した。
ACGTT−3I(W工、ミルウォーキー、 P−L
バイオケミカルズ)は12tJIIDNAテンプレー
トにアニーリングして、上記のようにDNA合成全開始
させるために使用した。その後、鎖伸長フラグメンIf
ゲル電気泳動で大きさに基づいて分離し、オートラジオ
グラフィーにかけてフラグメントのヌクレオチド配列を
推定した。
ジデオキシ塩基配列決定反応では、デオキシアデノシ7
5′(α−〔35S〕チオ)三リン酸(以後”aATP
[α−35S〕“と略す)を放射性標識として使用
した。また、アマ−ジャム・ノ・ンドズツク36頁に記
載のゲルを使用せずに、6%ホリアクリルアミビゲル(
厚み0.4咽;7M尿素、loomM)リスホウ酸(p
H8,1)および2mM EI)TAG含む)を使用
した。
5′(α−〔35S〕チオ)三リン酸(以後”aATP
[α−35S〕“と略す)を放射性標識として使用
した。また、アマ−ジャム・ノ・ンドズツク36頁に記
載のゲルを使用せずに、6%ホリアクリルアミビゲル(
厚み0.4咽;7M尿素、loomM)リスホウ酸(p
H8,1)および2mM EI)TAG含む)を使用
した。
実施例I
BSF−1はネズミEL4胸腺腫細胞(ATCC寄託番
号T I B 181)から生産した。これらの細つは
Fe2(5v/v%)、ハニシリy(50U/me)、
ストレプトマイシン(50μg/n1t>およびグルタ
ミン(2mM)を補足したRPMI−1640培地中に
培養下で保持する。これらの細胞は2〜4日おきに継代
培養する。リンフ才力インの生産全誘発するために、E
L4細%’、 (106/m/)はlv/v% PHA
(Ml、デトロイト、ジフコ・ラボラトリーズ)および
10ng/meの4β−ホルボール12β−ミリステー
ト12α−アセテート(NO、セントルイス、シグマ・
ケミカル・カンパニー) と共にはニジリン(50U/
1Ill)、ストレプ1−−r インン(50、ug/
rrte)およびグルタミン(2mM)z−補充したR
PMニー1640の存在する多数の30 ml培地中で
培養する。
号T I B 181)から生産した。これらの細つは
Fe2(5v/v%)、ハニシリy(50U/me)、
ストレプトマイシン(50μg/n1t>およびグルタ
ミン(2mM)を補足したRPMI−1640培地中に
培養下で保持する。これらの細胞は2〜4日おきに継代
培養する。リンフ才力インの生産全誘発するために、E
L4細%’、 (106/m/)はlv/v% PHA
(Ml、デトロイト、ジフコ・ラボラトリーズ)および
10ng/meの4β−ホルボール12β−ミリステー
ト12α−アセテート(NO、セントルイス、シグマ・
ケミカル・カンパニー) と共にはニジリン(50U/
1Ill)、ストレプ1−−r インン(50、ug/
rrte)およびグルタミン(2mM)z−補充したR
PMニー1640の存在する多数の30 ml培地中で
培養する。
この培養物は10%CO2/空気の湿潤雰囲気中37℃
で2.1時間インキュベーションした。次いで、培養上
清を収穫し、遠心し、そして濾過滅菌した。
で2.1時間インキュベーションした。次いで、培養上
清を収穫し、遠心し、そして濾過滅菌した。
その後培地はすぐに使用するか、あるいは将来の分画化
のために凍結した。
のために凍結した。
実施例、2
BSF−1の初期精へ
A、吸着
実施例1のようにして調製した粗上清は初めにTMS−
シリカ(C−1セプラライト;CA、バーバージティー
、アナリティケム・インターナショナル)への吸着によ
って濃縮した。この吸着法では、粗上清ヲ0.1%TF
’Aで酸性化し、その後TMS−シリカを上清(T1i
’Aの使用により達成された上清のI)He定める)1
リツトル当た。9109のTMS−シリカ量で加えた。
シリカ(C−1セプラライト;CA、バーバージティー
、アナリティケム・インターナショナル)への吸着によ
って濃縮した。この吸着法では、粗上清ヲ0.1%TF
’Aで酸性化し、その後TMS−シリカを上清(T1i
’Aの使用により達成された上清のI)He定める)1
リツトル当た。9109のTMS−シリカ量で加えた。
11/!時間攪拌後。
上清をデカントした。次いで、TMS−シリカをカラム
(50rtrm X 200 mm ) の中に注入
し、初めに加%アセトニトリルで洗い、その後01%
T F’Aで洗った。BSF’−1は75%アセトニト
リルおよび0.1%TFAの溶液でカラムから溶出した
。溶出液から回転蒸発によりアセトニトリルを除去した
。
(50rtrm X 200 mm ) の中に注入
し、初めに加%アセトニトリルで洗い、その後01%
T F’Aで洗った。BSF’−1は75%アセトニト
リルおよび0.1%TFAの溶液でカラムから溶出した
。溶出液から回転蒸発によりアセトニトリルを除去した
。
粗BSF’−1上清71.51は21.4 X 1O−
6Uの総括性および3U/μ9の比活性(B細胞増殖検
定)全もつことがわかった。吸着法の後のBSF−1は
。
6Uの総括性および3U/μ9の比活性(B細胞増殖検
定)全もつことがわかった。吸着法の後のBSF−1は
。
同じ検定を使用して、19.7 X 1O−6U の
総括性および約Ion U /μ9の比活性をもつこと
が判明した。
総括性および約Ion U /μ9の比活性をもつこと
が判明した。
また、ブラッドフォードタンパク質検定を使用しテ、総
タンパク質収率は約92% であった。このことは吸着
法がBSF−1の精製において約33倍の増加をもたら
したことを示している。
タンパク質収率は約92% であった。このことは吸着
法がBSF−1の精製において約33倍の増加をもたら
したことを示している。
実施例+2Aからの部分精製BSF’−tは逐次カチオ
ンおよびアニオン交換クロマトグラフィーによりさらに
精製した。これらのクロマトグラフィー法は4℃で行わ
れ、ここで使用した樹脂は0.1%トリトン−Xおよび
Fe2(10v/v%)で予備処理して、樹脂へのBs
F−1活性の非特異的吸着を減少させた。
ンおよびアニオン交換クロマトグラフィーによりさらに
精製した。これらのクロマトグラフィー法は4℃で行わ
れ、ここで使用した樹脂は0.1%トリトン−Xおよび
Fe2(10v/v%)で予備処理して、樹脂へのBs
F−1活性の非特異的吸着を減少させた。
カチオン交換クロマトグラフィー法では、吸着法から得
られる水相のイオン強度15mMクエン酸ナトリウムお
よび50mM NaCg (pH5,5)に調整した。
られる水相のイオン強度15mMクエン酸ナトリウムお
よび50mM NaCg (pH5,5)に調整した。
このように調整した水相は、予め同じ紗衝液で平衡化し
ておいた2、5X2t)cmのカルボキシメチルセルロ
ースカラム(0M52;NJ、 り+)フトン、ワット
マン・ケミカル・セパレーション)に60me/時間の
速度で装填した。
ておいた2、5X2t)cmのカルボキシメチルセルロ
ースカラム(0M52;NJ、 り+)フトン、ワット
マン・ケミカル・セパレーション)に60me/時間の
速度で装填した。
装填完了後、200mJの5mMクエン酸ナトリウム、
50 mM NaCg (pH5,5)でカラA4
−洗って未結合タンパク質を除いた。結合タン・ξり質
は60m1/時間の速度でカラムに加えられる線状Na
Cl勾配(50mM〜500 m M ) 2開いてカ
ラムから溶出した。カラム分画を集めて上記のように検
定した。
50 mM NaCg (pH5,5)でカラA4
−洗って未結合タンパク質を除いた。結合タン・ξり質
は60m1/時間の速度でカラムに加えられる線状Na
Cl勾配(50mM〜500 m M ) 2開いてカ
ラムから溶出した。カラム分画を集めて上記のように検
定した。
本発明者らは、約200 m M でカチオン交換カラ
ムから溶出されたBSF−1が約13.7X10−6U
の総活性および約2.5 X 103U/μ9の比活性
(B細胞増殖検定)を示し、それによって初期BSF’
−1タンノぐり質の約64%を保持しつつ吸着法からの
f38F’−1活性を約5倍増加しうろこと全見出した
。
ムから溶出されたBSF−1が約13.7X10−6U
の総活性および約2.5 X 103U/μ9の比活性
(B細胞増殖検定)を示し、それによって初期BSF’
−1タンノぐり質の約64%を保持しつつ吸着法からの
f38F’−1活性を約5倍増加しうろこと全見出した
。
カチオン交換カラムからのプールした活性分画U、第4
アミノエチルセルロース(QA52;ワットマン・ケミ
カル・七/8レーション)の1.6 X 10cmカダ
ムによるアニオン交換クロマトグラフィーを用いてさら
に精製した。カラムは使用前に20mMトリス−HCe
(pH9,0)で平衡化した。アニオン交換カラムに
装填する前に、カチオン交換カラムからの分画は20m
M)’Jス(pH9,0)に対して透析し、その後i5
mA’/時間の速度でカラムに装填した。
アミノエチルセルロース(QA52;ワットマン・ケミ
カル・七/8レーション)の1.6 X 10cmカダ
ムによるアニオン交換クロマトグラフィーを用いてさら
に精製した。カラムは使用前に20mMトリス−HCe
(pH9,0)で平衡化した。アニオン交換カラムに
装填する前に、カチオン交換カラムからの分画は20m
M)’Jス(pH9,0)に対して透析し、その後i5
mA’/時間の速度でカラムに装填した。
装填完了後、カラムを3倍のカラム容量の同じ平衡化緩
衝液で洗い、次いで20mM トリス−HCg(+)H
9,0)中の0〜500mMNaCeの直巌状勾配で溶
出した。
衝液で洗い、次いで20mM トリス−HCg(+)H
9,0)中の0〜500mMNaCeの直巌状勾配で溶
出した。
本発明者らは、 BSF’−1活性カ0.50〜1.0
0 MNaC/!で鋭いピークとして溶出すること全見
出した。カラム溶出液の分析は5.6 X 1O−6U
の総活性および2.6 X I O’ U/μ9 の比
活性(B細胞増殖検定)ならびに約26%のタンパク質
収率を示した。
0 MNaC/!で鋭いピークとして溶出すること全見
出した。カラム溶出液の分析は5.6 X 1O−6U
の総活性および2.6 X I O’ U/μ9 の比
活性(B細胞増殖検定)ならびに約26%のタンパク質
収率を示した。
実施例3
実施例2のイオン交換クロマトグラフィー法から得られ
る生物学的に活性な分画は、HPLC法の出発物質とし
て使用するためにプールする。プールした分画は、ベッ
クマンモデル344溶剤送出装e(CA、マウンテンビ
ュー、ベクトンーディッキンタン)を使用して4,6
X 250 rranバイダックC18カラム(218
TP、 サ・セパレーションズ・グループ)に注入す
る@K、0.1%TFAでpH2,0に調整した。カラ
ムは使用に先立って約0.8rnl1分の流速で0.1
%TFA 水溶液により平衡化した。
る生物学的に活性な分画は、HPLC法の出発物質とし
て使用するためにプールする。プールした分画は、ベッ
クマンモデル344溶剤送出装e(CA、マウンテンビ
ュー、ベクトンーディッキンタン)を使用して4,6
X 250 rranバイダックC18カラム(218
TP、 サ・セパレーションズ・グループ)に注入す
る@K、0.1%TFAでpH2,0に調整した。カラ
ムは使用に先立って約0.8rnl1分の流速で0.1
%TFA 水溶液により平衡化した。
装填したカラムは初めに0.1%TFAで10分間洗っ
て未結合成分を除き、次にそのカラムラ10%アセトニ
トリル(0,1%TFA含有)へ2分間にわたって至ら
しめ、その後10%アセトニトリルでさらに8分間平衡
化した。結合タンパク質の溶離は、0.1 v/v%T
FA中の10〜70%アセトニトリルの直線状勾配を1
分画たり1%の割合で60f+間にわたって加えること
により達成された。BSF−1タンパク質は42%アセ
トニトリル分画中にカラムから溶出されることがわかっ
た。
て未結合成分を除き、次にそのカラムラ10%アセトニ
トリル(0,1%TFA含有)へ2分間にわたって至ら
しめ、その後10%アセトニトリルでさらに8分間平衡
化した。結合タンパク質の溶離は、0.1 v/v%T
FA中の10〜70%アセトニトリルの直線状勾配を1
分画たり1%の割合で60f+間にわたって加えること
により達成された。BSF−1タンパク質は42%アセ
トニトリル分画中にカラムから溶出されることがわかっ
た。
1分の分画(0,8me )を集め、各分画から20〜
50μeアリコーIfバイオアツセイおよび5DS−P
AGEその後の銀染色による分析のために取り出した。
50μeアリコーIfバイオアツセイおよび5DS−P
AGEその後の銀染色による分析のために取り出した。
第1図に示すように、5DS−PAGEゲルの銀染色に
よって18.4キロダルトンに強いバント9が検出され
た(レー/l(SM)を参照)。B細胞増殖検定法から
、このバンドは5.I X 106Uの総生物学的活性
および約12.7 X 10’ U/μ9 の比活性お
よび約24%のタンパク質収率を示した。
よって18.4キロダルトンに強いバント9が検出され
た(レー/l(SM)を参照)。B細胞増殖検定法から
、このバンドは5.I X 106Uの総生物学的活性
および約12.7 X 10’ U/μ9 の比活性お
よび約24%のタンパク質収率を示した。
高純度のBSF’−1が第1のHPLC法で得られたが
、BSF−1タンパク質の真の均質性を達成するために
第2のHPLC法を使用した。この目的のために、第1
のHPLC法から得られたBSF−1活性を含む分画(
分画番号59〜64)をプールして。
、BSF−1タンパク質の真の均質性を達成するために
第2のHPLC法を使用した。この目的のために、第1
のHPLC法から得られたBSF−1活性を含む分画(
分画番号59〜64)をプールして。
250μe の濃度に真空濃縮した。この濃縮物を上で
使用したカラムと同じカラム(0,7mJ/分の流速で
DIEA−AcでpH4,5に調整した50mM酢酸を
用いて平衡化したもの)に注入した。装填カラムは初め
に5分間DIEA−Acで洗って未結合成e’i除き1
次にカラムを2分間にわたって5%N−プロパツールへ
至らしめ、その後5%N−プロパツールでさらに8分間
平衡化した。結合タンパク質の溶離は、D工Eへ−Ac
中の5〜40%N−プロパツールの直線状勾配を1分画
たり0.5%の割合で70分間にわたり加えることによ
り達成された。
使用したカラムと同じカラム(0,7mJ/分の流速で
DIEA−AcでpH4,5に調整した50mM酢酸を
用いて平衡化したもの)に注入した。装填カラムは初め
に5分間DIEA−Acで洗って未結合成e’i除き1
次にカラムを2分間にわたって5%N−プロパツールへ
至らしめ、その後5%N−プロパツールでさらに8分間
平衡化した。結合タンパク質の溶離は、D工Eへ−Ac
中の5〜40%N−プロパツールの直線状勾配を1分画
たり0.5%の割合で70分間にわたり加えることによ
り達成された。
1分ごとの分画(0,7m/)e集め、各分画から20
〜50μeアリコーifバイオアツセイおよび5DS−
PAGE、その後の銀染色による分析のために取り出し
た。第1図に示すように、約184キロダルトンの分子
量をもつBSF−1生物活性の鋭いピークが32%N−
プロパツールで溶出された。B細胞増殖検定法から、こ
のBSF−1は1.6 X 106Uの総生物学的活性
および約3.28 X 10 U/μ9 の比活性およ
び約8%の収率を示した。第2図に示す銀染色5DS−
PAGEおよび対応する比活性レベルから明らかなよう
に、第2HPLC法によって回収され)たBSF’−1
は真に均質であった。この事実はこのタンパク質産物の
アミノ酸配列を確かめる本発明者らの能力によって確認
された。
〜50μeアリコーifバイオアツセイおよび5DS−
PAGE、その後の銀染色による分析のために取り出し
た。第1図に示すように、約184キロダルトンの分子
量をもつBSF−1生物活性の鋭いピークが32%N−
プロパツールで溶出された。B細胞増殖検定法から、こ
のBSF−1は1.6 X 106Uの総生物学的活性
および約3.28 X 10 U/μ9 の比活性およ
び約8%の収率を示した。第2図に示す銀染色5DS−
PAGEおよび対応する比活性レベルから明らかなよう
に、第2HPLC法によって回収され)たBSF’−1
は真に均質であった。この事実はこのタンパク質産物の
アミノ酸配列を確かめる本発明者らの能力によって確認
された。
第2HPLC法からの分画61および62はCTLLお
よびFDC−P2 増殖検定で試験した。第2図に示す
ように、 BSF’−1はこれらの検定においてB細胞
増殖検定で監視された生物学的活性の鋭いピークに対応
する鋭いピークを示した。
よびFDC−P2 増殖検定で試験した。第2図に示す
ように、 BSF’−1はこれらの検定においてB細胞
増殖検定で監視された生物学的活性の鋭いピークに対応
する鋭いピークを示した。
第3図に示すように、B細胞および因子依存性細胞株の
増殖を刺激する本発明の均質BSF−1の能力、ならび
にIL−2およびIL−3の能力が試験された。BSF
”−1(ロ)、 IL−2(△)およびIL−3(○)
の3倍希釈物が500U/mlから出発して試験された
。試験結果はcpm X 10−3 で示す。
増殖を刺激する本発明の均質BSF−1の能力、ならび
にIL−2およびIL−3の能力が試験された。BSF
”−1(ロ)、 IL−2(△)およびIL−3(○)
の3倍希釈物が500U/mlから出発して試験された
。試験結果はcpm X 10−3 で示す。
3種類の均ηリンフォカインのB細胞を刺激する能力は
第3図の・ξネルAに示され、FDC−P2細胞全刺激
する能力はパネルBに示され、32D細胞を刺激する能
力はパネルCに示され、そしてCTLL細Ill刺激す
る能力はパネルDに示される。
第3図の・ξネルAに示され、FDC−P2細胞全刺激
する能力はパネルBに示され、32D細胞を刺激する能
力はパネルCに示され、そしてCTLL細Ill刺激す
る能力はパネルDに示される。
第3図のパネルAは、均質BSF−1が精製B#I胞全
高度に刺激する。■L−2および工L−3はこれらの細
胞に対して全く影響を及ぼさないことを示している。予
期されたように、IL−3はF’DC−P2および32
D細胞の高レベル刺激を誘発した(第3図のパネルBお
よびC)。しかしながら、BSF’−1もまたF’DC
−P2 および32D細胞を有意に刺激する能力を示し
た。・2ネルDに示されまた予期されたように、IL−
2はCTLL細賂の著しい刺激全誘発した。それより劣
るが、本発明の均質BSF−1もまたCTLL細胞の増
殖を刺激した。しかしIL−3はこれらの細胞に対して
ほとんど影響を及ぼさなかった。
高度に刺激する。■L−2および工L−3はこれらの細
胞に対して全く影響を及ぼさないことを示している。予
期されたように、IL−3はF’DC−P2および32
D細胞の高レベル刺激を誘発した(第3図のパネルBお
よびC)。しかしながら、BSF’−1もまたF’DC
−P2 および32D細胞を有意に刺激する能力を示し
た。・2ネルDに示されまた予期されたように、IL−
2はCTLL細賂の著しい刺激全誘発した。それより劣
るが、本発明の均質BSF−1もまたCTLL細胞の増
殖を刺激した。しかしIL−3はこれらの細胞に対して
ほとんど影響を及ぼさなかった。
B細胞増殖を刺激するBSF−1の前記能力は、それが
Ba胞の増殖因子であることを示している。
Ba胞の増殖因子であることを示している。
他方、■L−2およびIL−3依存性細胞株の増殖を刺
激する均質BSF−1の能力は、それがまた多数の細胞
系列に作用する能力を兼ね備えた因子であることを示し
ている。今までBSF’−1のこの性質は証明されてい
なかった。
激する均質BSF−1の能力は、それがまた多数の細胞
系列に作用する能力を兼ね備えた因子であることを示し
ている。今までBSF’−1のこの性質は証明されてい
なかった。
実施例4
第2 HPLC法から回収した分画番号61および62
からの均質BSF−1を真空濃縮して最終容量刃μgと
し、次いで調整シークエンサーフイルター上においた。
からの均質BSF−1を真空濃縮して最終容量刃μgと
し、次いで調整シークエンサーフイルター上においた。
フィルター上のBSF’−1のアミノ酸組成は、アプラ
イド・バイオシステムズ モデル470Aタンパク質シ
ークエンサーを用いて分析した。
イド・バイオシステムズ モデル470Aタンパク質シ
ークエンサーを用いて分析した。
配列決定サイクルからの分画はサバント・スピード9−
バック(Savant Speed−Mac、 N、Y
、 、 ヒックスビル)で蒸発乾固し、その後アミノ酸
残基の同定のためにHPLCカラムに注入する前にDI
EA−ACおよびアセトニトリル(50: 50 )中
に再懸濁した。
バック(Savant Speed−Mac、 N、Y
、 、 ヒックスビル)で蒸発乾固し、その後アミノ酸
残基の同定のためにHPLCカラムに注入する前にDI
EA−ACおよびアセトニトリル(50: 50 )中
に再懸濁した。
多くのアミノ酔配列決定実験が行われたが、上記精製法
によりほぼ均質になるまで精製されたBSF−1と一致
するただ1つのBSF’−1配列が得られた。BSF−
1分子のN末端部分の最初の加残基は次の配列: Hi
s−11e−His−Gly−Cys−Asp−Lys
−Asn−His−Leu−Arg−Glu−11e−
11e−Gly−11e−Leu−Asn−Glu−V
al 、から成ることが決定された。このアミノ酸配列
はナショナル・バイオメディカル・リサーチ・ファウン
デーションの、’27 A り’JJ 7’ −タヘ−
ス’ S E A RCH’ (1985年11月)中
に含まれる既知タンパク質配列と比較したが、このデー
タベースに含まれるどのタンパク質配列とも有意に均等
でなかった。上記配列の第5番目の残基は、自動アミノ
酸配列決定法の第5サイクルにおいて他の残基がなにも
高収率で得られなかったという点で、Cysであると推
定された。
によりほぼ均質になるまで精製されたBSF−1と一致
するただ1つのBSF’−1配列が得られた。BSF−
1分子のN末端部分の最初の加残基は次の配列: Hi
s−11e−His−Gly−Cys−Asp−Lys
−Asn−His−Leu−Arg−Glu−11e−
11e−Gly−11e−Leu−Asn−Glu−V
al 、から成ることが決定された。このアミノ酸配列
はナショナル・バイオメディカル・リサーチ・ファウン
デーションの、’27 A り’JJ 7’ −タヘ−
ス’ S E A RCH’ (1985年11月)中
に含まれる既知タンパク質配列と比較したが、このデー
タベースに含まれるどのタンパク質配列とも有意に均等
でなかった。上記配列の第5番目の残基は、自動アミノ
酸配列決定法の第5サイクルにおいて他の残基がなにも
高収率で得られなかったという点で、Cysであると推
定された。
さらに、アミノ酸組成分析からグルコサミンまたはガラ
クトサミンが観察されなかったので、BSF−1の第5
残基はCysであるという結論に到達した。
クトサミンが観察されなかったので、BSF−1の第5
残基はCysであるという結論に到達した。
実施例5
EL4胸腺種細胞全実施例1に記載したように1 v/
v% PHA、5v/v% FC8および10ng/
me P M Aの存在下で18時間培養した。全RN
へは一般にチャーウィン(Chirgwin)らの上記
文献に記載される方法を用いて、活性化 EL4細1泡
から抽出した。この方法では、グアニジニウムチオシア
ネートを用いて、RNass によるRNA加水分解
速度を超える速度でRNass を含めた細胞タンパ
ク質を変性した。mRNAはエタノール沈殿、続いて8
MグアニジンHCI%25 m M酢酸ナトリウムによ
る再懸濁(抽出)によって細胞タンパク質から分離した
。グアニジンHCe 抽出されたRNAはその後等容量
のフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール(
25:24:1の容量比)で再抽出した。このような抽
出法から得られるRNA含有水相f 50 m M酢酸
ナトリウムとなし。
v% PHA、5v/v% FC8および10ng/
me P M Aの存在下で18時間培養した。全RN
へは一般にチャーウィン(Chirgwin)らの上記
文献に記載される方法を用いて、活性化 EL4細1泡
から抽出した。この方法では、グアニジニウムチオシア
ネートを用いて、RNass によるRNA加水分解
速度を超える速度でRNass を含めた細胞タンパ
ク質を変性した。mRNAはエタノール沈殿、続いて8
MグアニジンHCI%25 m M酢酸ナトリウムによ
る再懸濁(抽出)によって細胞タンパク質から分離した
。グアニジンHCe 抽出されたRNAはその後等容量
のフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール(
25:24:1の容量比)で再抽出した。このような抽
出法から得られるRNA含有水相f 50 m M酢酸
ナトリウムとなし。
0.6 容量のエタノール全添加して沈殿させた。
RNAは一加℃で凍結し、その後遠心することによって
回収した。
回収した。
その後、ポ’)A+mRNA はマニアチスらの上記文
献197に記載の方法を使ってオリゴ(aT)セルロー
スクロマトグラフィーにより抽出タンパク質から分離し
た。簡単に説明すると、カラムはΔ)mM) IJス−
Hcg (pH7,6)、 0.5 M NaCg
、 1 mM エチレンジアミン四酢酸(EDTA
) および0.1%トゞテシル硫酸ナトリウム(SD
S)から成る装填緩衝液で調整した。タンパク質にレッ
トに水および装填緩衝液に溶解し、カラムに加えた。非
吸着物質:ま装填緩衝液による籾量洗浄、その後の0.
IMNaCj?e含む装填緩衝液による追加洗浄によっ
てカラムから溶出した。保持されたポリA+mRNAは
10mM トリス−HCl(pH7,5)、1mM
f2DTAおよび0605%SDS から成るイオン
強度の低下した緩衝液で溶出した。溶出したポlJA+
mRNAは1/1o容量の酢酸ナトリウム(3M、 p
H5,2) オヨび2.2容量のエタノールを用いて一
20℃で沈殿させた。ポリA+mRNA fオリゴ(a
’r)セルロースカラムから溶出した後、ポリA+mR
NAの完全性全マニアチスらの上記文献199に詳述さ
れるアガロースゲルによる電気泳動によって確かめた。
献197に記載の方法を使ってオリゴ(aT)セルロー
スクロマトグラフィーにより抽出タンパク質から分離し
た。簡単に説明すると、カラムはΔ)mM) IJス−
Hcg (pH7,6)、 0.5 M NaCg
、 1 mM エチレンジアミン四酢酸(EDTA
) および0.1%トゞテシル硫酸ナトリウム(SD
S)から成る装填緩衝液で調整した。タンパク質にレッ
トに水および装填緩衝液に溶解し、カラムに加えた。非
吸着物質:ま装填緩衝液による籾量洗浄、その後の0.
IMNaCj?e含む装填緩衝液による追加洗浄によっ
てカラムから溶出した。保持されたポリA+mRNAは
10mM トリス−HCl(pH7,5)、1mM
f2DTAおよび0605%SDS から成るイオン
強度の低下した緩衝液で溶出した。溶出したポlJA+
mRNAは1/1o容量の酢酸ナトリウム(3M、 p
H5,2) オヨび2.2容量のエタノールを用いて一
20℃で沈殿させた。ポリA+mRNA fオリゴ(a
’r)セルロースカラムから溶出した後、ポリA+mR
NAの完全性全マニアチスらの上記文献199に詳述さ
れるアガロースゲルによる電気泳動によって確かめた。
ポリA mRNAはメチル水銀アガロースによる電気
泳動によって大きさにより分画化した。その後、異なる
大きさのmRN八に対応するダル分画は、先に記載した
ウサギ網状赤血球溶解液法またはアフリカッメガエル卵
母細胞中への微量注射のいずれかを使用することによっ
てin vitroで翻訳させた。網状赤血球翻訳また
はmRNA注射卯母細胞によって遊離された液体は、上
記の検定法を用いてBSF’−1活性の存在について試
験した。1nvitroで翻訳させたときにBSF”−
1活性を生じたmRNAゲル分画をcDNA作製のため
のmRNA源として選択した。
泳動によって大きさにより分画化した。その後、異なる
大きさのmRN八に対応するダル分画は、先に記載した
ウサギ網状赤血球溶解液法またはアフリカッメガエル卵
母細胞中への微量注射のいずれかを使用することによっ
てin vitroで翻訳させた。網状赤血球翻訳また
はmRNA注射卯母細胞によって遊離された液体は、上
記の検定法を用いてBSF’−1活性の存在について試
験した。1nvitroで翻訳させたときにBSF”−
1活性を生じたmRNAゲル分画をcDNA作製のため
のmRNA源として選択した。
実施例6
mRNAに対応する2本領cDNAのライブラリーは、
ガブラー(Gubler)およびホフ−v 7 (Ho
ffman)の上記文献によって変更されたマニアチス
らの上記文献229に記載の標準方法を用いて、実施例
5の精製mRNA から作製した。オリゴ−dTは第
1のcDNA鎖の逆転写用プライマーとして使用するた
めに、mRNAのポリAから成る尾部にハイブリダイズ
させた。トリ骨髄芽球症ウィルス(AMV)の逆転写酵
素を用いて、mRNA全テンプレート(鋳型)として第
1のcDNA鎖を合成した。簡単に述べると、第1cD
NA鎖の合成は50mM1ス・HCE(pH8,3)、
lomM M9C12,10mM ジチオトレイト
ー/L、(DTT)、 4 mMピロリン酸Na。
ガブラー(Gubler)およびホフ−v 7 (Ho
ffman)の上記文献によって変更されたマニアチス
らの上記文献229に記載の標準方法を用いて、実施例
5の精製mRNA から作製した。オリゴ−dTは第
1のcDNA鎖の逆転写用プライマーとして使用するた
めに、mRNAのポリAから成る尾部にハイブリダイズ
させた。トリ骨髄芽球症ウィルス(AMV)の逆転写酵
素を用いて、mRNA全テンプレート(鋳型)として第
1のcDNA鎖を合成した。簡単に述べると、第1cD
NA鎖の合成は50mM1ス・HCE(pH8,3)、
lomM M9C12,10mM ジチオトレイト
ー/L、(DTT)、 4 mMピロリン酸Na。
1.25mM aGTP、 1.25mM aATP
、1.25mMTTP、0.5mM aCTP、15〜
20μC1の〔α−32P〕aCTP (3000C1
/ IJ モル) 、10011g/mlのオリゴ(
dT12−18)、150 p9/ml mRNA
(実m 例5から)、3000単位/ me A M
V 逆転写酵素f含む反応容量20〜40μβ中で
実施した。この反応を43℃で30分間行い、その後E
DTAを20mMまで加えて反応を停止させた。反応生
成物をフェノールで抽出し、岡山およびベルブ(Be
rg)のMol。
、1.25mMTTP、0.5mM aCTP、15〜
20μC1の〔α−32P〕aCTP (3000C1
/ IJ モル) 、10011g/mlのオリゴ(
dT12−18)、150 p9/ml mRNA
(実m 例5から)、3000単位/ me A M
V 逆転写酵素f含む反応容量20〜40μβ中で
実施した。この反応を43℃で30分間行い、その後E
DTAを20mMまで加えて反応を停止させた。反応生
成物をフェノールで抽出し、岡山およびベルブ(Be
rg)のMol。
CoI2.13io1.2 : 161〜170(19
82)に記載されるように、反応生成物をフェノールで
抽出し、2M酢酸アンモニウムを加えてエタノール沈殿
させた。
82)に記載されるように、反応生成物をフェノールで
抽出し、2M酢酸アンモニウムを加えてエタノール沈殿
させた。
第2のcDNA鎖は20mM トリス・HCII (p
H7,5)、5mM MgC11,tomM(NH4
)2So4. loOmMKCl、0.15 m M
β−NAD、50μg/m/ BSA、4゜μm
aNTP%8.5単位/ mlの大腸菌RNase H
1232単位/meのDNAポリメラーゼエ、10単位
/耐の大腸菌D N A リガーゼを含む反応容3j
100μl中で合成した。この混合物は12℃で1時間
、次いで22℃でさらに1時間インキエバーションした
。
H7,5)、5mM MgC11,tomM(NH4
)2So4. loOmMKCl、0.15 m M
β−NAD、50μg/m/ BSA、4゜μm
aNTP%8.5単位/ mlの大腸菌RNase H
1232単位/meのDNAポリメラーゼエ、10単位
/耐の大腸菌D N A リガーゼを含む反応容3j
100μl中で合成した。この混合物は12℃で1時間
、次いで22℃でさらに1時間インキエバーションした
。
その後、EEDTAi20mMまで加えて反応ケ停止さ
せた。得られた2本鎖cDNAは上記のようにフェノー
ルで抽出した。
せた。得られた2本鎖cDNAは上記のようにフェノー
ルで抽出した。
2本鎖cDNAはセファクリル5−400(ファーマシ
ア・ファイン・ケミカルズ)カラムクロマトグラフィー
により大きさに基づいて分画化し、そして分子量マーカ
ーとしてpBR322DNAの末端標識フラグメントラ
使用して、アルカリ性アガロース電気泳動による分析に
よって監視した。鎖長が500 bp よシ小さいDN
A鎖は、これらの短鎖cDNA分1面の不必要なりロー
ニングを避けるために選別して除去した。
ア・ファイン・ケミカルズ)カラムクロマトグラフィー
により大きさに基づいて分画化し、そして分子量マーカ
ーとしてpBR322DNAの末端標識フラグメントラ
使用して、アルカリ性アガロース電気泳動による分析に
よって監視した。鎖長が500 bp よシ小さいDN
A鎖は、これらの短鎖cDNA分1面の不必要なりロー
ニングを避けるために選別して除去した。
上記のようにして作製した2本鎖cDNA分画は、マニ
アチスらの上記文献239に記載の方法によっテPBR
322プラスミドS(ファーマシア・ファイン・ケミカ
ルズ)のPs を工部位に挿入した。この方法で2本鎖
cDNAの3′末端にポIJ(dC)全付加した。
アチスらの上記文献239に記載の方法によっテPBR
322プラスミドS(ファーマシア・ファイン・ケミカ
ルズ)のPs を工部位に挿入した。この方法で2本鎖
cDNAの3′末端にポIJ(dC)全付加した。
プラスミドpBR322はPstエエントゝヌクレアー
ゼで消化した後、その3′末端にポIJ(dG)t−付
加した。ポリ(aG)付加プラスミドとポIJ(dC)
付加CDNAとはアニーリング緩衝液(0,I M N
aCe。
ゼで消化した後、その3′末端にポIJ(dG)t−付
加した。ポリ(aG)付加プラスミドとポIJ(dC)
付加CDNAとはアニーリング緩衝液(0,I M N
aCe。
10mMトリス−HCe(pH7,8)および10 m
M EDTA)を用いてアニーリングさせて新規な組
換えプラスミドゝを作製した。ここに記載のすべての制
限酵素はマサチューセンツ州ベバリー、ニューイングラ
ンド・バイオラズズ社から市販されている。
M EDTA)を用いてアニーリングさせて新規な組
換えプラスミドゝを作製した。ここに記載のすべての制
限酵素はマサチューセンツ州ベバリー、ニューイングラ
ンド・バイオラズズ社から市販されている。
この組換えプラスミドゝはハナハン(Hanahan)
の上記文献記載の方法により大腸菌株MM294(この
大腸菌側0は高濃厩のMg2+中で増殖させることによ
シ調興した)を形質転換するために使用した。形質転換
宿主は平板培養し、その後表現型同定剤としてテトラサ
イクリンを用いて同定した。この手法によって1本発明
者らは約1.2X104個の独立形質転換細胞を得た。
の上記文献記載の方法により大腸菌株MM294(この
大腸菌側0は高濃厩のMg2+中で増殖させることによ
シ調興した)を形質転換するために使用した。形質転換
宿主は平板培養し、その後表現型同定剤としてテトラサ
イクリンを用いて同定した。この手法によって1本発明
者らは約1.2X104個の独立形質転換細胞を得た。
実施例7
の作製
合成オリゴヌクレオチドは実施例6のようにして作製し
たcDNAライノラリーをスクリーニングする際のプロ
ーブとして使用した。このプローブの組成は実施例4で
決定したBSF−1分子のアミノ酸配列の一部に対応す
る。プローブ(BSF−1分子のN末端の第1アミノ酸
全コート8するアンチセンス鎖の第1核酸から第9アミ
ノ酸をコードする第2核酸まで伸長する)は次の組成=
3°−GTGTAG GTCCCG ACG CTG
TTT TTA GT−5’から成っていた。オリゴヌ
クレオチビプローズはンートゝ(Sood)らの上記文
献およびヒロセ(H1roθe)らの上記文献に詳述さ
れるトリエステル法により化学的に合成された。
たcDNAライノラリーをスクリーニングする際のプロ
ーブとして使用した。このプローブの組成は実施例4で
決定したBSF−1分子のアミノ酸配列の一部に対応す
る。プローブ(BSF−1分子のN末端の第1アミノ酸
全コート8するアンチセンス鎖の第1核酸から第9アミ
ノ酸をコードする第2核酸まで伸長する)は次の組成=
3°−GTGTAG GTCCCG ACG CTG
TTT TTA GT−5’から成っていた。オリゴヌ
クレオチビプローズはンートゝ(Sood)らの上記文
献およびヒロセ(H1roθe)らの上記文献に詳述さ
れるトリエステル法により化学的に合成された。
化学合成の完了後、オリゴヌクレオチドプローブの5′
末端は32pで標識した。標識化を促進するために、オ
リゴヌクレオチドの5′末端はOH末端をもつように合
成され、それによってDNAフラグメン[1−標識する
ときに一般に必要とされるホスファターゼ処理を省く。
末端は32pで標識した。標識化を促進するために、オ
リゴヌクレオチドの5′末端はOH末端をもつように合
成され、それによってDNAフラグメン[1−標識する
ときに一般に必要とされるホスファターゼ処理を省く。
標識方法は合成オリゴヌクレオチドlalを16μlの
32P −ATP (3000Ci/mM)、l11/
(IOU)のT4ポリヌクレオチドゞキナーゼおよび2
μeの10 Xキナーゼ緩衝液工に添加することを含む
。IOX キナーゼ緩衝液工は0.5 M トリス
−HCI (pH7,6)、0.1 M MgC6
2,50m Mジチオトレイトール、1mMスペルミジ
ンおよび1 mM EDTAから成っていた。この反応
を37℃で加分間実施し、その後合成されたオリゴヌク
レオチドヲフェノール/クロロホルムで抽出した。標識
プローブはセファデックスG−50カラム(ファーマン
ア・ファイン・ケミカルズ)によるクロマトグラフィー
または遠心により未標識オリゴヌクレオチド9から分離
した。
32P −ATP (3000Ci/mM)、l11/
(IOU)のT4ポリヌクレオチドゞキナーゼおよび2
μeの10 Xキナーゼ緩衝液工に添加することを含む
。IOX キナーゼ緩衝液工は0.5 M トリス
−HCI (pH7,6)、0.1 M MgC6
2,50m Mジチオトレイトール、1mMスペルミジ
ンおよび1 mM EDTAから成っていた。この反応
を37℃で加分間実施し、その後合成されたオリゴヌク
レオチドヲフェノール/クロロホルムで抽出した。標識
プローブはセファデックスG−50カラム(ファーマン
ア・ファイン・ケミカルズ)によるクロマトグラフィー
または遠心により未標識オリゴヌクレオチド9から分離
した。
実施例8
cDNAライブラリーのスクリーニング実施例6のよう
にして作製したcDNAライブラリーの初期スクリーニ
ングを促進するために、形質転換細菌培養物を約10o
o 個の異なるクローンから成るグループにプールした
。プラスミドDNAはインーホロビッツ(1日h−Ho
rowicz)およびパーク(Burk13)のNuc
l、 Ac1ds Res、 9 : 2989(19
81)に詳述される標準アルカリ溶菌法によって宿主細
菌の試料から分離した。分離したプラスミl−”t−2
つのフラグメントに切断した。これはプラスミMtPv
ulIおよびHlnd[1で完全消化することによって
達成された。この目的のために、プラスミド9は加μe
のl XHlnd Ill緩衝液(7mM トリス(p
H7,4)、7mM塩化マグネシウム、5Q m MN
aCl)中に再溶解し1次にlμlのPvullおよび
1μgのH1ndlll制限エンド9ヌクレアーゼ金加
えた。
にして作製したcDNAライブラリーの初期スクリーニ
ングを促進するために、形質転換細菌培養物を約10o
o 個の異なるクローンから成るグループにプールした
。プラスミドDNAはインーホロビッツ(1日h−Ho
rowicz)およびパーク(Burk13)のNuc
l、 Ac1ds Res、 9 : 2989(19
81)に詳述される標準アルカリ溶菌法によって宿主細
菌の試料から分離した。分離したプラスミl−”t−2
つのフラグメントに切断した。これはプラスミMtPv
ulIおよびHlnd[1で完全消化することによって
達成された。この目的のために、プラスミド9は加μe
のl XHlnd Ill緩衝液(7mM トリス(p
H7,4)、7mM塩化マグネシウム、5Q m MN
aCl)中に再溶解し1次にlμlのPvullおよび
1μgのH1ndlll制限エンド9ヌクレアーゼ金加
えた。
この混合物ヲ37℃で2時間インキュば一ンヨンした。
次に、プラスミビ消化物は適当なサイズのマーカー金柑
いて0.8%アガロースゲルによる電気泳動によって分
画化した。アガロースダルはサザン(Southern
)の上記文献に記載の標準方法全便ってニトロセルロー
スフィルターに移行させた。移行後、フィルターを自然
乾燥させ、真空下に約80℃で2時間焼き付けし、DN
Aフラグメントtニトロセルロースに固定させた。
いて0.8%アガロースゲルによる電気泳動によって分
画化した。アガロースダルはサザン(Southern
)の上記文献に記載の標準方法全便ってニトロセルロー
スフィルターに移行させた。移行後、フィルターを自然
乾燥させ、真空下に約80℃で2時間焼き付けし、DN
Aフラグメントtニトロセルロースに固定させた。
ニトロセルロースフィルターに固定したDNAは次に標
準オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせた
。簡単に述べると、暁き付けしたニトロセルロース’k
10〜50Bgの6×ク工ン酸ナトリウム食嘴水(S
SC)(20xSSCはH2O800m/中のNa1J
175.39およびクエン酸ナトリウム88.29
から成り、1oN NaOHでpH7,ofc調整す
る)中に予備浸漬し、その後6xSSC,0,5%NP
・IO界面活性剤、01%サルコシル、 5 X De
n−hardt’a溶1.(IX=0.02%フィコー
ル、0.02%ポリビニルピロリビン、002%BSA
)および100μ9/me変性サケ***DNA(シグマ
iII型、ナトリウム塩)から成る10〜50μeのプ
レハイブリダイゼーション緩衝液中で2〜4時間50’
Cでインキユバーノヨンした。その後、フィルター全上
記のハイプリダイゼー7ヨ/溶液中で32p−標識オリ
ゴヌクレオチドプローブ(1106cp/μg) (
実施例7から)と50’Cで一晩インキユイーションし
た。−晩のハイズリダイゼーショ/後、フィルターを6
x SSCで室温にて十分に洗い、さらに6xSSCで
50℃にて5分間洗浄した。自然乾燥後、フィルタター
全一70℃でオートラジオグラフィーにかけた。
準オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせた
。簡単に述べると、暁き付けしたニトロセルロース’k
10〜50Bgの6×ク工ン酸ナトリウム食嘴水(S
SC)(20xSSCはH2O800m/中のNa1J
175.39およびクエン酸ナトリウム88.29
から成り、1oN NaOHでpH7,ofc調整す
る)中に予備浸漬し、その後6xSSC,0,5%NP
・IO界面活性剤、01%サルコシル、 5 X De
n−hardt’a溶1.(IX=0.02%フィコー
ル、0.02%ポリビニルピロリビン、002%BSA
)および100μ9/me変性サケ***DNA(シグマ
iII型、ナトリウム塩)から成る10〜50μeのプ
レハイブリダイゼーション緩衝液中で2〜4時間50’
Cでインキユバーノヨンした。その後、フィルター全上
記のハイプリダイゼー7ヨ/溶液中で32p−標識オリ
ゴヌクレオチドプローブ(1106cp/μg) (
実施例7から)と50’Cで一晩インキユイーションし
た。−晩のハイズリダイゼーショ/後、フィルターを6
x SSCで室温にて十分に洗い、さらに6xSSCで
50℃にて5分間洗浄した。自然乾燥後、フィルタター
全一70℃でオートラジオグラフィーにかけた。
強いバンドを含む形質転換細胞のプール(オリゴヌクレ
オチド8とハイブリダイズする多数のcDNAの存在を
示す)は直接細菌コロニーハイノリダイゼーションによ
りスクリーニングした。プラスミドDNA1含む数個の
単一コロニー(そのうちの1つはMus工L−4と名づ
けられた)が同定された。
オチド8とハイブリダイズする多数のcDNAの存在を
示す)は直接細菌コロニーハイノリダイゼーションによ
りスクリーニングした。プラスミドDNA1含む数個の
単一コロニー(そのうちの1つはMus工L−4と名づ
けられた)が同定された。
さらに、初期スクリーニングプールからの形質転換細胞
の約10%のコロニー全敗り出して、テトラサイクリン
(25〜75μg/rnl)k補足したルリアズロス(
109/lトリプトン、5971酵母エキス、59 /
e Na(J? )から成る液体培地中で96ウエル
プレートにて増殖させた。取り出したコロニーのうち、
それぞれ100個のクローンから成る1oのプールをス
クリーニングのために選択した。プラスミ)’DNAは
インーホロビッツおよびパークの上記文献に詳述される
標準アルカリ溶菌法、その後の七フアクリルS −40
0カラム(ファーマシアlファイン・ケミカルズ)によ
るゲル濾過クロマトグラフィーによって宿主細菌試料か
ら分離した。
の約10%のコロニー全敗り出して、テトラサイクリン
(25〜75μg/rnl)k補足したルリアズロス(
109/lトリプトン、5971酵母エキス、59 /
e Na(J? )から成る液体培地中で96ウエル
プレートにて増殖させた。取り出したコロニーのうち、
それぞれ100個のクローンから成る1oのプールをス
クリーニングのために選択した。プラスミ)’DNAは
インーホロビッツおよびパークの上記文献に詳述される
標準アルカリ溶菌法、その後の七フアクリルS −40
0カラム(ファーマシアlファイン・ケミカルズ)によ
るゲル濾過クロマトグラフィーによって宿主細菌試料か
ら分離した。
そのプラスミドはBamH工 制限酵素で完全消化す
ることにより線状化した。この目的のために、プラスミ
ド″′を5〜100μl (理想的には約50μe)の
緩衝液(7mMトリス(pH7,4)、7mM塩化マグ
ネシウム、5 m M NaC1)中に再溶解し、次
いで約1〜10μe(理想的には約57ig) のB
amHI制限エン制限エンドアヌクレアーゼ。この混合
物ヲ37℃で1時間インキュベーションした。
ることにより線状化した。この目的のために、プラスミ
ド″′を5〜100μl (理想的には約50μe)の
緩衝液(7mMトリス(pH7,4)、7mM塩化マグ
ネシウム、5 m M NaC1)中に再溶解し、次
いで約1〜10μe(理想的には約57ig) のB
amHI制限エン制限エンドアヌクレアーゼ。この混合
物ヲ37℃で1時間インキュベーションした。
次に、5μ9のプラスミドDNAは約100〜1500
μe (理想的には約750μl)の20mMトリス−
HCe、1 m M EDTA (pH7,5)
を加えて約10分間沸騰させることによって、パンセ
ス(Panseθ)2253 (1981)に記載の方
法に従ってニトロセルロースブロッティングのために調
製した。プラスミドDNAはさらに0.2〜2.0μ7
1!(理想的には約0.75tillンのI N N
aOH’!r室温で10〜40分間(理想的には約加分
間)添加することによって変性した。
μe (理想的には約750μl)の20mMトリス−
HCe、1 m M EDTA (pH7,5)
を加えて約10分間沸騰させることによって、パンセ
ス(Panseθ)2253 (1981)に記載の方
法に従ってニトロセルロースブロッティングのために調
製した。プラスミドDNAはさらに0.2〜2.0μ7
1!(理想的には約0.75tillンのI N N
aOH’!r室温で10〜40分間(理想的には約加分
間)添加することによって変性した。
この混合物をその後約1〜10rn/(理想的には約4
、!1yxlりの緩衝に!L(250mM 1−リス
−HCg(pH8,0)、150 m M クエン酸ナ
トリウム、1.5 M NaCg、0.25M H
O2)中に再懸濁した。
、!1yxlりの緩衝に!L(250mM 1−リス
−HCg(pH8,0)、150 m M クエン酸ナ
トリウム、1.5 M NaCg、0.25M H
O2)中に再懸濁した。
その後、プラスミド消化物はシーレイチャー(Schl
eicher)およびシ:L x ル(Schuell
)のマニホールド・ドツト・プロット装置を使ってニト
ロセルロースフィルターへ移した。、tl[、フィルタ
ー11乾し、約80℃で約2時間焼き付けてDNAフラ
グメントをニトロセルロースへ固定シた。次に、個々の
クローンプールに対応するニトロセルロースのそれぞれ
の円形ディスク(約o、s cm )をニトロセルロー
スシートから切り取り、約5〜15分(好ましくは約1
0分)2mgのH2Cの中で沸騰させた。そのニトロセ
ルローススポラトラ80℃で2時間乾かした。
eicher)およびシ:L x ル(Schuell
)のマニホールド・ドツト・プロット装置を使ってニト
ロセルロースフィルターへ移した。、tl[、フィルタ
ー11乾し、約80℃で約2時間焼き付けてDNAフラ
グメントをニトロセルロースへ固定シた。次に、個々の
クローンプールに対応するニトロセルロースのそれぞれ
の円形ディスク(約o、s cm )をニトロセルロー
スシートから切り取り、約5〜15分(好ましくは約1
0分)2mgのH2Cの中で沸騰させた。そのニトロセ
ルローススポラトラ80℃で2時間乾かした。
ニトロセルロースディスクに固定したDNAは次に、予
めエタノール沈殿させてハイブリダイゼーション溶液中
に再懸濁しておいた全BSF−を活性mRNAとハイブ
リダイズさせた。この目的のために、約1〜100μg
(好ましくは約5μ9)の全mRNA f約1〜5μ
71!(好ましくは約2.5μj)のH2C、約2〜l
Oμg(好ましくは約5μe)のホルムアミドおよび約
1〜10μl(好ましくは約25μl)の4×ハイブリ
ダイゼーシヨン塩(400mM PIPES 緩衝
液(pI(6,4) 、1.6 mM NaCdおよ
び40mM EDTA(pH8,0) )中に懸濁し
た。ハイブリダイゼーション法において1円形ニトロセ
ルロースシートソトはマイクロタイタープレートの個々
のウェル中へ約5〜25μe (好ましくは約10μe
)の上記mRNA と共に加え、その後約加〜150
μe(好ましくは約100μg)の滅菌パラフィン油で
覆った。このマイクロタイタープレートラ約50℃の水
浴上に一晩浮かべた。−晩のノ・イブリダイゼーション
後、フィルター全敗り出して個々のポIJ フロピレン
管の中に入れ、次いで1xSSCおよび0.2%SDS
で約50〜65℃(好ましくは約65℃)にて10回(
1分/洗浄)洗った。その後、フィルターを0.2XS
SCで1〜10回(好ましくは約5回)洗った。
めエタノール沈殿させてハイブリダイゼーション溶液中
に再懸濁しておいた全BSF−を活性mRNAとハイブ
リダイズさせた。この目的のために、約1〜100μg
(好ましくは約5μ9)の全mRNA f約1〜5μ
71!(好ましくは約2.5μj)のH2C、約2〜l
Oμg(好ましくは約5μe)のホルムアミドおよび約
1〜10μl(好ましくは約25μl)の4×ハイブリ
ダイゼーシヨン塩(400mM PIPES 緩衝
液(pI(6,4) 、1.6 mM NaCdおよ
び40mM EDTA(pH8,0) )中に懸濁し
た。ハイブリダイゼーション法において1円形ニトロセ
ルロースシートソトはマイクロタイタープレートの個々
のウェル中へ約5〜25μe (好ましくは約10μe
)の上記mRNA と共に加え、その後約加〜150
μe(好ましくは約100μg)の滅菌パラフィン油で
覆った。このマイクロタイタープレートラ約50℃の水
浴上に一晩浮かべた。−晩のノ・イブリダイゼーション
後、フィルター全敗り出して個々のポIJ フロピレン
管の中に入れ、次いで1xSSCおよび0.2%SDS
で約50〜65℃(好ましくは約65℃)にて10回(
1分/洗浄)洗った。その後、フィルターを0.2XS
SCで1〜10回(好ましくは約5回)洗った。
その後、ハイブリダイズしたmRNAはフィルターディ
スクに約1〜15μ9/ml (好ましくは約6.6
p g /rnl ) の酵母tRNA (M O
,セントルイス。
スクに約1〜15μ9/ml (好ましくは約6.6
p g /rnl ) の酵母tRNA (M O
,セントルイス。
シグマケミカル社)を含むH2Cから成る約(資)〜4
00μe(好ましくは約200μ/りの溶離溶液を加え
、沸l(水浴中で約1〜10分(好ましくは約3分)イ
ンキュベーションし、次いで管を水中に浸漬して冷却す
ることによりDNA結合フィルターから溶出した。この
溶液を滅菌1.5 ml遠心管に移した。約20〜25
0μl(好ましくは約100μe)の追加量の溶離it
L’eフィルターに加え、インキュベーションおよび冷
却を繰り返した。これを前記の溶離液でプールした。次
いで、この溶出液(総容量300μe)にNaC/を加
えて約0,3 M NaCe とした。その後、2倍容
量のエタノールを加え、この混合物を−70℃に凍結し
、遠心によりRNAを回収した。
00μe(好ましくは約200μ/りの溶離溶液を加え
、沸l(水浴中で約1〜10分(好ましくは約3分)イ
ンキュベーションし、次いで管を水中に浸漬して冷却す
ることによりDNA結合フィルターから溶出した。この
溶液を滅菌1.5 ml遠心管に移した。約20〜25
0μl(好ましくは約100μe)の追加量の溶離it
L’eフィルターに加え、インキュベーションおよび冷
却を繰り返した。これを前記の溶離液でプールした。次
いで、この溶出液(総容量300μe)にNaC/を加
えて約0,3 M NaCe とした。その後、2倍容
量のエタノールを加え、この混合物を−70℃に凍結し
、遠心によりRNAを回収した。
ハイブリッド選択、エタノール沈殿させたmRNAは上
述のアフリカッメガエル卵母細胞の使用によりin v
itroで翻訳させた。卵母細胞の翻訳によって遊離さ
れた液体は、上記のバイオアッセイを用いてBSF−1
活性の存在について試験した。
述のアフリカッメガエル卵母細胞の使用によりin v
itroで翻訳させた。卵母細胞の翻訳によって遊離さ
れた液体は、上記のバイオアッセイを用いてBSF−1
活性の存在について試験した。
上記方法により陽性の信号を与えたクローンのプールは
それぞれ10個のコロニーから成るプールにさらに分割
し、そして上記ノ・イブリダイゼー7ヨン選択方法を繰
り返した。この方法により本発明者らは3つの陽性プー
ルを発見した。陽性信号を与えたクローンのプールを単
一コロニーに分け゛て、上記ノ・イブリダイゼーション
法を繰り返した。
それぞれ10個のコロニーから成るプールにさらに分割
し、そして上記ノ・イブリダイゼー7ヨン選択方法を繰
り返した。この方法により本発明者らは3つの陽性プー
ルを発見した。陽性信号を与えたクローンのプールを単
一コロニーに分け゛て、上記ノ・イブリダイゼーション
法を繰り返した。
この方法により本発明者らは単一の陽性コロニーを発見
した。MusIL−4と名づけたプラスミドDNAは上
記の標準アルカリ溶菌法によってこの特定陽性コロニー
から得られた。
した。MusIL−4と名づけたプラスミドDNAは上
記の標準アルカリ溶菌法によってこの特定陽性コロニー
から得られた。
実施例9
MusIL−4クローンは上記の実施例Fに記載される
ジデオキシチェインーターミネーシ−aノ法によってそ
の塩基配列を決定した。MuF3工L−4クローンのヌ
クレオチド9配列は第4図に示され、これはBSF−1
遺伝子のDNA組成のほかにこの遺伝子の5′および3
′隣接領域を含む。第4図において、ヌクレオチドはD
NA配列の最初から番号が付いている。BSFl−1遺
伝子のコード領域はヌクレオチド番号17 (Met残
基)からヌクレオチド番号436(ser残基)まで伸
長しており、成熟タンノξり質はアミノ酸残基His(
ヌクレオチド番号77)から始まる。ヌクレオチド9配
列から決定された対応するアミノ酸は適切なコドンの下
に示される。
ジデオキシチェインーターミネーシ−aノ法によってそ
の塩基配列を決定した。MuF3工L−4クローンのヌ
クレオチド9配列は第4図に示され、これはBSF−1
遺伝子のDNA組成のほかにこの遺伝子の5′および3
′隣接領域を含む。第4図において、ヌクレオチドはD
NA配列の最初から番号が付いている。BSFl−1遺
伝子のコード領域はヌクレオチド番号17 (Met残
基)からヌクレオチド番号436(ser残基)まで伸
長しており、成熟タンノξり質はアミノ酸残基His(
ヌクレオチド番号77)から始まる。ヌクレオチド9配
列から決定された対応するアミノ酸は適切なコドンの下
に示される。
実施例10
酵母宿主による成熟BSF−1の発現
酵母宿主細麹によるBSF−1の高しイル発現金導くた
めに、BSF−1遺伝子のコートゝ領域および3′隣接
領域の部分全第4図のBSF−1cDNA クローン
から取り出し、リンキングオリゴヌクレオチド″ヲ用い
てシラスミド″′pα3に挿入して組換え発現プラスミ
ド″(pYαBSF’−1と命名)を作製した。出発プ
ラスミドpα3はATCCに寄託番号53220として
寄託されている。第5図に示すように、pα3はプラス
ミ)”pBR322由来の複製起点およびAmpr
耐性遺伝子(太線部分)を含む。
めに、BSF−1遺伝子のコートゝ領域および3′隣接
領域の部分全第4図のBSF−1cDNA クローン
から取り出し、リンキングオリゴヌクレオチド″ヲ用い
てシラスミド″′pα3に挿入して組換え発現プラスミ
ド″(pYαBSF’−1と命名)を作製した。出発プ
ラスミドpα3はATCCに寄託番号53220として
寄託されている。第5図に示すように、pα3はプラス
ミ)”pBR322由来の複製起点およびAmpr
耐性遺伝子(太線部分)を含む。
pα3プラスミドはまた2μサ一クル複製起点および形
質転換酵母宿主(Trp栄養要求株)選択用のTrpI
遺伝子(細線部分)を含む。BSF−1配列(開放ボッ
クス部分)は以下でより詳しく論するように、合成オリ
ゴヌクレオチドの使用によりα因子配列の下流(3′)
末端に融合される。
質転換酵母宿主(Trp栄養要求株)選択用のTrpI
遺伝子(細線部分)を含む。BSF−1配列(開放ボッ
クス部分)は以下でより詳しく論するように、合成オリ
ゴヌクレオチドの使用によりα因子配列の下流(3′)
末端に融合される。
pα3プラスミビはまた。第5図に示すように、Kpn
I 5’および3′接着末端および種々の制限酵素切
断部位(意図するcDNAクローニングフラグメントに
都合よく連結するためのPstI、 Avr■およびN
eo工部位を含む)を有するリンキングオリゴヌクレオ
チビ(斜線ボックス部分)を含む。
I 5’および3′接着末端および種々の制限酵素切
断部位(意図するcDNAクローニングフラグメントに
都合よく連結するためのPstI、 Avr■およびN
eo工部位を含む)を有するリンキングオリゴヌクレオ
チビ(斜線ボックス部分)を含む。
この発現ベクターを制限酵素NcoIで消化した。
NcoIにより生成した5′突出部分を過剰のデオキシ
ヌクレオチド9三リン酸の存在下にT4DNAポリメラ
ーゼを用いて修復して平滑末端を作った。
ヌクレオチド9三リン酸の存在下にT4DNAポリメラ
ーゼを用いて修復して平滑末端を作った。
その後ベクターを酵素KpnIで消化し、そしてKpn
工から平滑末端までの大きいベクターフラグメントを
精製した。
工から平滑末端までの大きいベクターフラグメントを
精製した。
Sau 3 A (ヌクレオチド番号111)からSe
p工制限酵素部位(ヌクレオチド番号501)−1での
BSF−1遺伝子の5′コード領域の大部分および3′
隣接領域の一部は1例えばマニアチスらの上記文献に記
載される標準方法を用いて、5au3AおよびS日p工
制限酵素の使用によりMusIL−4クローンから分離
した。
p工制限酵素部位(ヌクレオチド番号501)−1での
BSF−1遺伝子の5′コード領域の大部分および3′
隣接領域の一部は1例えばマニアチスらの上記文献に記
載される標準方法を用いて、5au3AおよびS日p工
制限酵素の使用によりMusIL−4クローンから分離
した。
次に、 cDNAフラグメントの5′末端ヲpα3クロ
ーニングはフタ−に連結するためにリンキングオリゴヌ
クレオチl−″金製造した。オリゴヌクレオチド9の組
成は、以下の表1および第5図に示すように、Kpn工
接着5′末端とそれに続くα因子プロセッシング領域(
AAA−AGN) を含む。Hisをコードするコド
ンCAT はα因子プロセッシング部位の3′側に位
置して、成熟BSF’−1遺伝子の第1コドンとして役
立つ。
ーニングはフタ−に連結するためにリンキングオリゴヌ
クレオチl−″金製造した。オリゴヌクレオチド9の組
成は、以下の表1および第5図に示すように、Kpn工
接着5′末端とそれに続くα因子プロセッシング領域(
AAA−AGN) を含む。Hisをコードするコド
ンCAT はα因子プロセッシング部位の3′側に位
置して、成熟BSF’−1遺伝子の第1コドンとして役
立つ。
表1
に瑛I
CTTTG GAT AAA AGA CAT ATc
CACGGA TGcGAG AAA AATCAT
GGA AACCTA TTT TC;T GTA T
AG GTG ccr ACr!c’rc TTT T
TACACTTG AGA GA 0% AACTGT CTCTAG pyαfBsF−1−!ラスミド″ヲ作判するために、
マニアラスらの上記文献に記載されるような標準方法全
使用して、 NcoI平渭−Kpn I消化プラスミド
、 KpnI−8au3Aリンキングオリゴヌクレオチ
ドおよび5au3A−8spI MusIL−4cDN
A 7ラグメントヲ連結する。得られたpYαfBsF
’−1プラスミドはATCCに冨託番号53220とし
て寄託された。
CACGGA TGcGAG AAA AATCAT
GGA AACCTA TTT TC;T GTA T
AG GTG ccr ACr!c’rc TTT T
TACACTTG AGA GA 0% AACTGT CTCTAG pyαfBsF−1−!ラスミド″ヲ作判するために、
マニアラスらの上記文献に記載されるような標準方法全
使用して、 NcoI平渭−Kpn I消化プラスミド
、 KpnI−8au3Aリンキングオリゴヌクレオチ
ドおよび5au3A−8spI MusIL−4cDN
A 7ラグメントヲ連結する。得られたpYαfBsF
’−1プラスミドはATCCに冨託番号53220とし
て寄託された。
その他の標準組換えDNA技術が同じ発現ベクターを作
製するために使用でき、また上記の詳細な作製方法はp
YαfBsF−1ベクターへの挿入のためのBSF−1
cDNADNAフラグメントラめに使用しうる種々の技
法の例証的かつ非限定的な一例であることを理解すべき
である。さらに、MusIL−4cDNA フラグメ
ントは酵母宿主にょるBSF−1の高レベル発現のため
に他の適当なベクター内に挿入されるだろう。
製するために使用でき、また上記の詳細な作製方法はp
YαfBsF−1ベクターへの挿入のためのBSF−1
cDNADNAフラグメントラめに使用しうる種々の技
法の例証的かつ非限定的な一例であることを理解すべき
である。さらに、MusIL−4cDNA フラグメ
ントは酵母宿主にょるBSF−1の高レベル発現のため
に他の適当なベクター内に挿入されるだろう。
pyαfBsF−1発現プラスミド8は標準方法によル
Trp+形質転換細胞の選択のためにS、セレビシェの
酵母菌株79(α、シ上1−1、垣2−1)を形質転換
すべく使用された。形質転換に先立って、菌株79はY
EPD培地(1w/v%酵母エキス、2w/v%ペプト
ン、2W/V%グルコース)中で2×107細胞/at
の密度へ増殖させた。細胞i 1000X9.22℃で
5分間遠心することにより収穫し、得られた沈殿物を滅
菌蒸留水で洗った。
Trp+形質転換細胞の選択のためにS、セレビシェの
酵母菌株79(α、シ上1−1、垣2−1)を形質転換
すべく使用された。形質転換に先立って、菌株79はY
EPD培地(1w/v%酵母エキス、2w/v%ペプト
ン、2W/V%グルコース)中で2×107細胞/at
の密度へ増殖させた。細胞i 1000X9.22℃で
5分間遠心することにより収穫し、得られた沈殿物を滅
菌蒸留水で洗った。
その後酵母細胞はl/1o容量のSED (I M ソ
ルビトール、25 mM EDTA(pH8,0)
、および59mMジチオトレイトール)中に再懸濁して
30’Cで10分間インキュベートすることにより濃縮
した。この細胞−緩衝液混合物’i 300 X 9で
5分間遠心した。
ルビトール、25 mM EDTA(pH8,0)
、および59mMジチオトレイトール)中に再懸濁して
30’Cで10分間インキュベートすることにより濃縮
した。この細胞−緩衝液混合物’i 300 X 9で
5分間遠心した。
沈殿物’t ”/’to容量の1Mソルビトールで1回
洗い、1/1o容量の5CE(IMツルピトー/Iz、
0.1Mクエン酸ナトリウム(pH5,8)、0.OI
M EDTA) 中に再懸濁した。この溶液に細胞壁
を破壊するために10 害毒のグルスラーゼを加え
、その後この溶 く液を時々穏やかに攪拌しなから3
0’Cで(9)分間インキエバーションした。スフェロ
プラストの存在は、 (顕微鋼スライド゛上の5w/
v% SDS 1筒中KIO”μeの酵母細胞を希釈
して、400×位相差で1ゴー (スト“を観察する
ことによって検定した。その後、 〕細胞混合物全3
00 X 9 で3分間遠心した。得られた沈殿物は
1/1o容量の1Mソルビトールで2回洗い、次いでC
aS(1Mソルビトール、10mMCaCe2)で1回
洗った。
洗い、1/1o容量の5CE(IMツルピトー/Iz、
0.1Mクエン酸ナトリウム(pH5,8)、0.OI
M EDTA) 中に再懸濁した。この溶液に細胞壁
を破壊するために10 害毒のグルスラーゼを加え
、その後この溶 く液を時々穏やかに攪拌しなから3
0’Cで(9)分間インキエバーションした。スフェロ
プラストの存在は、 (顕微鋼スライド゛上の5w/
v% SDS 1筒中KIO”μeの酵母細胞を希釈
して、400×位相差で1ゴー (スト“を観察する
ことによって検定した。その後、 〕細胞混合物全3
00 X 9 で3分間遠心した。得られた沈殿物は
1/1o容量の1Mソルビトールで2回洗い、次いでC
aS(1Mソルビトール、10mMCaCe2)で1回
洗った。
その後、酵母スフェロプラストはペックス(Beggs
)の上記文献に記載の方法にょシ発現イクターで形質転
換した。沈殿スフェロプラストi1/2oo 容量のC
aS中に懸濁し、 1.5mA’−r−ッペ/ド1ル
ア管中に100μeアリコートずつ分割した。その後、
各アリコートに1〜10μ6 (0,5〜5μ9)のプ
。
)の上記文献に記載の方法にょシ発現イクターで形質転
換した。沈殿スフェロプラストi1/2oo 容量のC
aS中に懸濁し、 1.5mA’−r−ッペ/ド1ル
ア管中に100μeアリコートずつ分割した。その後、
各アリコートに1〜10μ6 (0,5〜5μ9)のプ
。
ラスミド”DNA1加えた。この混合物を室温で151
分間インキュイージョンし、次に1m/のPEG(20
%PEG4000、10mM Ca(J2.10mM
トリス−HCI (pH7,4) )を各アリコートに
加えてDNA)取込み全便した。室温で15分後、混合
物を350く9で5分間遠心した。得られた沈殿物’k
150μeりSO3(loz/ 02Mソルビトー
ル、6.7 trtl (7)1’EPD培地、0.1
3mA!のI M CaCl2.27111(7)■乙
トリプトファンおよび3.7 mlの水)中に再懸濁し
し。この混合物をI℃で20分間インキ二は−ショ/し
た。その後細胞全平板培養した。
分間インキュイージョンし、次に1m/のPEG(20
%PEG4000、10mM Ca(J2.10mM
トリス−HCI (pH7,4) )を各アリコートに
加えてDNA)取込み全便した。室温で15分後、混合
物を350く9で5分間遠心した。得られた沈殿物’k
150μeりSO3(loz/ 02Mソルビトー
ル、6.7 trtl (7)1’EPD培地、0.1
3mA!のI M CaCl2.27111(7)■乙
トリプトファンおよび3.7 mlの水)中に再懸濁し
し。この混合物をI℃で20分間インキ二は−ショ/し
た。その後細胞全平板培養した。
プロトプラス)/DNA混合物の平板培養に先tって、
選択平板ヲ37℃でプレインキュバーショ/した。18
.2 rtrlのソルビトール、2g寒天、0.6憂ジ
フコ酵母窒素塩基(アミノ酸不含)、2gグレコース、
0.1 ml!の1%アデニン、0.4 me(D 1
%ウラ/ルおよび必要に応じてアミノ酸類から成る溶融
7た上部寒天(45℃)3m/i形淘転換細胞の各アノ
コートに加え、管内害物を選択平板上に注いだ。
選択平板ヲ37℃でプレインキュバーショ/した。18
.2 rtrlのソルビトール、2g寒天、0.6憂ジ
フコ酵母窒素塩基(アミノ酸不含)、2gグレコース、
0.1 ml!の1%アデニン、0.4 me(D 1
%ウラ/ルおよび必要に応じてアミノ酸類から成る溶融
7た上部寒天(45℃)3m/i形淘転換細胞の各アノ
コートに加え、管内害物を選択平板上に注いだ。
二の平板ft30℃で2〜4日間インキュベーバーン7
た。Trpマイナス培地中に発生したコロニーは?rp
l遺伝子をもつプラスミド、すなわち形質転換されたも
のを含んでいた。
た。Trpマイナス培地中に発生したコロニーは?rp
l遺伝子をもつプラスミド、すなわち形質転換されたも
のを含んでいた。
バイオアッセイの前に、形質転換細胞を加〜閣w、lの
YEPD中30’Cで定常期になるまで増殖させた。
YEPD中30’Cで定常期になるまで増殖させた。
収穫時に、プロテアーゼ阻害剤のフェニルメチルスルホ
ニル(PMSF) およびペプスタチンAを加えて、
それぞれ最終濃度全1mMおよび10μMとした。その
後400 X 9 で遠心して細胞を除き、培地f
0.45ミクロンのセルロースアセテートフィルターに
ューヨーク、コーニング、コーニング・グラス・ワーク
ス)全通して濾過した。滅菌上清を4℃で保存した。B
SII’−1は実施例2および3に記載の方法と同じ精
製法を用いて上清から精製した。精製したタンパク質産
物はB細胞増殖検定(実施例A)により検定し、約I
X 10’単位/ミリリットルのBSF’−1活性を示
すことが判明した。
ニル(PMSF) およびペプスタチンAを加えて、
それぞれ最終濃度全1mMおよび10μMとした。その
後400 X 9 で遠心して細胞を除き、培地f
0.45ミクロンのセルロースアセテートフィルターに
ューヨーク、コーニング、コーニング・グラス・ワーク
ス)全通して濾過した。滅菌上清を4℃で保存した。B
SII’−1は実施例2および3に記載の方法と同じ精
製法を用いて上清から精製した。精製したタンパク質産
物はB細胞増殖検定(実施例A)により検定し、約I
X 10’単位/ミリリットルのBSF’−1活性を示
すことが判明した。
実施例11
ヌクレオチド番号67のRaa工制限酵素部位からヌク
レオチド番号440のRsa工部位までのMu日工L−
4クローンの部分が、BSF−1遺伝子についてヒトc
DNAライブラリー全スクリーニングするためのプロー
ブとして使用された。第4図に示すようにこのプローブ
は成熟ネズミBSF’−1遺伝子の全コード領域を含む
。こうして、それは他の動物種の相同BSF’−1遺伝
子とハイブリダイズするであろう。
レオチド番号440のRsa工部位までのMu日工L−
4クローンの部分が、BSF−1遺伝子についてヒトc
DNAライブラリー全スクリーニングするためのプロー
ブとして使用された。第4図に示すようにこのプローブ
は成熟ネズミBSF’−1遺伝子の全コード領域を含む
。こうして、それは他の動物種の相同BSF’−1遺伝
子とハイブリダイズするであろう。
ネズミcDNAヌクレオチドプローブは、マニアテスら
の上記文献108に記載される上記の標準方法を使用し
て二ックトランスレーンヨンにより放射性標識した。こ
の方法により、プローブは約5X 1108Cp/μg
DNAの比活性に標識された。スクリーニング法で使
用する前に、標識クローンは100℃の水中で10分間
沸騰させ、その後氷上で冷却することにより変性した。
の上記文献108に記載される上記の標準方法を使用し
て二ックトランスレーンヨンにより放射性標識した。こ
の方法により、プローブは約5X 1108Cp/μg
DNAの比活性に標識された。スクリーニング法で使
用する前に、標識クローンは100℃の水中で10分間
沸騰させ、その後氷上で冷却することにより変性した。
ヒトcDNAライブラリーはマイトジェン刺激ヒトT細
胞から抽出したポ’J A+mRNA から作製され
る。ヒト末梢血白血球は10v/v%FO8,50U/
II!jペニシリン、50μg/at ストレプトマイ
シン、300 /J g/ml新鮮L新鮮用タミン、1
%PHA(容量基準)およびIOμg /ml P M
D Aを補足したRPMニー 1640 で刺激す
る。培養の加時間後mRNA fヒトTmaから抽出し
、その後実施例5に記載の方法によりポリA mRNA
f抽出タンパク質から分離する。mRNAに対応す
る2本領cDNAのライブラリーは実施例6に記載の方
法を使用して作製される。その後、ヒトcDNAライブ
ラリーは実施例8に記載のサザンブロッテインダスクリ
ーニング法の使用により放射性標識ネズミcDNAプロ
ーブでスクリーニングし1次いでスクリーニングされた
クローンを実施例Fに記載の核酸配列決定法の使用によ
り同定す名〇 当分針で習熟した者には明らかであるように。
胞から抽出したポ’J A+mRNA から作製され
る。ヒト末梢血白血球は10v/v%FO8,50U/
II!jペニシリン、50μg/at ストレプトマイ
シン、300 /J g/ml新鮮L新鮮用タミン、1
%PHA(容量基準)およびIOμg /ml P M
D Aを補足したRPMニー 1640 で刺激す
る。培養の加時間後mRNA fヒトTmaから抽出し
、その後実施例5に記載の方法によりポリA mRNA
f抽出タンパク質から分離する。mRNAに対応す
る2本領cDNAのライブラリーは実施例6に記載の方
法を使用して作製される。その後、ヒトcDNAライブ
ラリーは実施例8に記載のサザンブロッテインダスクリ
ーニング法の使用により放射性標識ネズミcDNAプロ
ーブでスクリーニングし1次いでスクリーニングされた
クローンを実施例Fに記載の核酸配列決定法の使用によ
り同定す名〇 当分針で習熟した者には明らかであるように。
本発明はその精神または本質から逸脱することなく上記
の実施態様以外の他の形態で具体化されうる。従って、
本発明の上記の実施態様はすべての点において例証的で
あるとみなされ、限定的であると考えられるべきでない
。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲に説明される通
りであり、前述の実施例に限定されない。
の実施態様以外の他の形態で具体化されうる。従って、
本発明の上記の実施態様はすべての点において例証的で
あるとみなされ、限定的であると考えられるべきでない
。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲に説明される通
りであり、前述の実施例に限定されない。
本発明の実施態様の細部は添付の図面を参考にして説明
されるであろう。 第1図は高性能液体クロマトグラフィーでBSF’−1
を均質に精製した最終結果を示し、第1パネルは均質B
SF−1のBm胞バイオアッセイの結果であり、そして
第2パネルは均質BSF−1の5DS−PAGE分析の
結果である。(第2パネルにおいて、レーン1の出発物
質C3M) は前のHPLC法からの活性分画のプー
ルから成る。)第2図はIL−2依存性CTLL細胞お
よび因子依存性F’DC−P2細胞の増殖を刺激する精
?!! BSF’−1の能力を試験する増殖検定の結果
を示す。 第3図は本発明によって生産された均質BSF−1(ロ
)、組換えIL−2(Δ)および組換えIL−3(○)
が精製B細胞(・ξネルA)、因子依存性FDC−p2
細胞(・ξネルB)、工L−3依存性32D細胞(
・ξネルC)および工L−2依存性CTLL細胞(・ξ
ネルD)の増殖全刺激するそれらの能力について試験さ
れた増殖検定の結果を示す。 第4図は本発明によって単離された成熟BSF−1遺伝
子を含むMus工L−4cDNA p o−7ノヌクレ
オチト9配列および対応するアミノ酸配列を示し、ヌク
レオチドはクローン配列の最初から番号が付けられてお
り、アミノ酸はタン/ξり質の成熟NH2末端(すなわ
ち矢印で示したHis残基)からアミノ酸番号140の
Ser残基まで番号が付けられている。 第5図は酵母宿主細胞を形質転換して機能的BSF’−
1を発現させるべく使用されるpYαfBsF−l (
BSF−を遺伝子のコード領域が挿入されている)の作
製方法を示す模式図である。 第3図 図面の糸孔 第1図 今画番J (内容に変更なし) 第2図 58、!59 6061 62 6364 &566
67今画 トド Φ〜 零の ) ツn !n 酩 58 ?漬 本#! ?=B tL b % 冒豆e>
gz ←−(5(<ltn ←ト5ラ
ピ 貼 目互 紅 Ef 9: 皺、= 8ご 零−F 5F 5−!LIJ
tJ:J: L)Cり のの <ト<
−’c LII+L)* (5,(J、 0゜3
石 宜エ 1二 實= 璽=85訂 沓5鴎:
荘e 菖353 ←、 くコ のコ 0為 く・ Q−唾
む 56 にj 838ミ Sこ; ド: と、
= ミ2 ♂二 し2(:E u−u工 0(5
く← Φくo ト・ h e < )l ’−
〇CIIIト ←J:<nel−h@ Φ− ← ←L 4g< (5の 。−<<く
リ・ (s (h tJ+ )IIlb
ロf、 2 、> 尽: B guL)(Jコ
ug、u−ucu− く ヒ・ く勢 ト“O(III s−
。 L) LI−(5(Φ〉<り の〉く
のり Uw* L)3 <o uコQ
ト・ (5’k (−(J b−−・く υ−
)u (5の uL u−LJ ue
4> ue Ll−(5:IQ トー ロー
く納 ←ロ く−(5(1−1(!IL) (
(の)の(5’iX ”a呑 龜對 i多 料 溢苓
式 静h b L) #I L) 1−
Q−←コ トー く杭くの l−u I+
+ψ く工 0」トド く」巨茨 35 E
B どニ ミご しニ ョ5(# I−”
u ’ (5@l H@ ’;i ’>
3 ?(< )(L l+の くの
υ−←ト<<滅3 壽 蕾と 35 便’E、 E?
5 i3ご し二 −二 =; ?S ぽζ ;δ
: e 3 G と:A 詳ご ごζ 9品 ;;
;”5’Z 目N Q 171 ’eJ 3
聰(E 2 91aJ 2−1ヨ5 肥 菖S ご五
■ ii 市 UE3 5> Ej 蓼3;3
目;: 3; b手続補正書(方力 昭和63年 1月IcI日 特許庁長官 小 川 邦 夫 殿昭和62年特許
願第122396号 2、発明の名称 B細助諌り激因子 3、補正をする者 事件との関係 出 願 人
されるであろう。 第1図は高性能液体クロマトグラフィーでBSF’−1
を均質に精製した最終結果を示し、第1パネルは均質B
SF−1のBm胞バイオアッセイの結果であり、そして
第2パネルは均質BSF−1の5DS−PAGE分析の
結果である。(第2パネルにおいて、レーン1の出発物
質C3M) は前のHPLC法からの活性分画のプー
ルから成る。)第2図はIL−2依存性CTLL細胞お
よび因子依存性F’DC−P2細胞の増殖を刺激する精
?!! BSF’−1の能力を試験する増殖検定の結果
を示す。 第3図は本発明によって生産された均質BSF−1(ロ
)、組換えIL−2(Δ)および組換えIL−3(○)
が精製B細胞(・ξネルA)、因子依存性FDC−p2
細胞(・ξネルB)、工L−3依存性32D細胞(
・ξネルC)および工L−2依存性CTLL細胞(・ξ
ネルD)の増殖全刺激するそれらの能力について試験さ
れた増殖検定の結果を示す。 第4図は本発明によって単離された成熟BSF−1遺伝
子を含むMus工L−4cDNA p o−7ノヌクレ
オチト9配列および対応するアミノ酸配列を示し、ヌク
レオチドはクローン配列の最初から番号が付けられてお
り、アミノ酸はタン/ξり質の成熟NH2末端(すなわ
ち矢印で示したHis残基)からアミノ酸番号140の
Ser残基まで番号が付けられている。 第5図は酵母宿主細胞を形質転換して機能的BSF’−
1を発現させるべく使用されるpYαfBsF−l (
BSF−を遺伝子のコード領域が挿入されている)の作
製方法を示す模式図である。 第3図 図面の糸孔 第1図 今画番J (内容に変更なし) 第2図 58、!59 6061 62 6364 &566
67今画 トド Φ〜 零の ) ツn !n 酩 58 ?漬 本#! ?=B tL b % 冒豆e>
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目;: 3; b手続補正書(方力 昭和63年 1月IcI日 特許庁長官 小 川 邦 夫 殿昭和62年特許
願第122396号 2、発明の名称 B細助諌り激因子 3、補正をする者 事件との関係 出 願 人
Claims (11)
- (1)サブマイドジェン濃度の抗免疫グロブリンMの存
在下でT細胞不含精製B細胞の増殖を刺激する能力につ
いて検定したとき約3.28×10^5U/μgタンパ
ク質の比活性を示し、インターロイキン2依存性細胞の
増殖を促進する能力を有し、コロニー刺激因子依存性細
胞の増殖を促進する能力を有し、そしてまた約18.4
キロダルトンの分子量および次のアミノ末端アミノ酸配
列:His−Iie−His−Gly−Cys−Asp
−Lys−Asn−His−Leu−Valをもつこと
によって特徴づけられるネズミB細胞刺激因子。 - (2)水性培地中に懸濁されたタンパク質混合物からB
細胞刺激因子を精製する方法であって、(a)シリカゲ
ルに共有結合された有機リガンドを含む第1の逆相液体
クロマトグラフィーカラムにタンパク質混合物を装填し
、それによってB細胞刺激因子を第1カラムに保持させ
、その第1カラムをアセトニトリル勾配で溶離し、そし
てB細胞刺激因子活性を示す分画をプールすること;お
よび (b)第1の液体クロマトグラフィーカラムから溶離さ
れてプールされた分画を、シリカゲルに共有結合された
有機リガンドを含む第2の逆相液体クロマトグラフィー
カラムに通し、それによってB細胞刺激因子を第2カラ
ムに保持させ、その第2カラムを緩衝化N−プロパノー
ル勾配で溶離し、そしてB細胞刺激因子活性を示す分画
をプールすること; から成るB細胞刺激因子の精製方法。 - (3)ネズミB細胞刺激因子をコードする実質的に純粋
なDNA。 - (4)第4図に示すヌクレオチド番号77からヌクレオ
チド番号436までの核酸配列から成る、特許請求の範
囲第3項記載の実質的に純粋なDNA。 - (5)その発現を生じさせ得る第2DNA配列に遺伝子
操作的に連結された、特許請求の範囲第3項記載のDN
A配列。 - (6)特許請求の範囲第4項記載の核酸配列によってコ
ードされたポリペプチド。 - (7)B細胞刺激因子の生物学的活性に実質的に影響を
及ぼすことなく、1個またはそれ以上のアミノ酸が付加
、置換または欠失された、特許請求の範囲第6項記載の
ポリペプチド。 - (8)第4図に示す核酸配列のヌクレオチド77〜43
6から成るDNAフラグメントにハイブリダイズし得る
実質的に純粋なDNA。 - (9)ネズミ以外の動物種から誘導される、特許請求の
範囲第8項記載の実質的に純粋なDNA。 - (10)特許請求の範囲第9項記載のDNA配列を含む
組換えDNA発現ベクター。 - (11)特許請求の範囲第10項記載の発現ベクターに
よって形質転換された宿主。
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