JPS61191675A - 巨大分子物質 - Google Patents
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- JPS61191675A JPS61191675A JP60290918A JP29091885A JPS61191675A JP S61191675 A JPS61191675 A JP S61191675A JP 60290918 A JP60290918 A JP 60290918A JP 29091885 A JP29091885 A JP 29091885A JP S61191675 A JPS61191675 A JP S61191675A
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
- C12N11/06—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier attached to the carrier via a bridging agent
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D213/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
- C07D213/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
- C07D213/04—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
- C07D213/60—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
- C07D213/62—Oxygen or sulfur atoms
- C07D213/70—Sulfur atoms
- C07D213/71—Sulfur atoms to which a second hetero atom is attached
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- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54353—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals with ligand attached to the carrier via a chemical coupling agent
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は新規なピリジン化合物に関する。本発明による
新規な化合物は二官能性カップリング剤およびチオール
化剤として特に有用である。
新規な化合物は二官能性カップリング剤およびチオール
化剤として特に有用である。
そのうちの少くとも一方が蛋白質またはポリペプチドか
らなる2種の物質の接合体(コンジュゲート)の製造に
おいて接合体の各成分を共有結合でカップリングさせる
ために二官能性剤を使用することは知られておシ、通常
は接合分子中のアミノ基が接合反応のために使用されて
いる。これに関するよく知られた剤はグルタルジアルデ
ヒドである。しかしながら、蛋白質またはポリペプチド
は1個以上のアミノ基を含有しておシ、他方接合体の第
24分を構成する物質もまた1個以上のアミノ基を含有
している。
らなる2種の物質の接合体(コンジュゲート)の製造に
おいて接合体の各成分を共有結合でカップリングさせる
ために二官能性剤を使用することは知られておシ、通常
は接合分子中のアミノ基が接合反応のために使用されて
いる。これに関するよく知られた剤はグルタルジアルデ
ヒドである。しかしながら、蛋白質またはポリペプチド
は1個以上のアミノ基を含有しておシ、他方接合体の第
24分を構成する物質もまた1個以上のアミノ基を含有
している。
グルタルジアルデヒドおよび接合分子中のアミノ基を用
いる他の二官能性剤をカップリングさせる場合には、所
定組成の接合体(たとえば各成分の単一分子のみを含有
す2二分子接合体)を生成するため、さらにまた蛋白質
またはポリペプチド中に分子内交叉結合をもたらすかま
たは同一種類の成分の2個の分子または分子の一方ある
いは両方の種類の3個またはそれ以上の分子を有する接
合体の生成をもたらしそしである場合にはまた接合体と
ほぼ同じ大きさであシうる凝集体を生成するようなカッ
プリング剤の重合(たとえばグルタルジアルデヒドが使
用される場合)をもたらす副反応も得られる。すなわち
、もつとも不均質な生成物混合物が得られるのである。
いる他の二官能性剤をカップリングさせる場合には、所
定組成の接合体(たとえば各成分の単一分子のみを含有
す2二分子接合体)を生成するため、さらにまた蛋白質
またはポリペプチド中に分子内交叉結合をもたらすかま
たは同一種類の成分の2個の分子または分子の一方ある
いは両方の種類の3個またはそれ以上の分子を有する接
合体の生成をもたらしそしである場合にはまた接合体と
ほぼ同じ大きさであシうる凝集体を生成するようなカッ
プリング剤の重合(たとえばグルタルジアルデヒドが使
用される場合)をもたらす副反応も得られる。すなわち
、もつとも不均質な生成物混合物が得られるのである。
特定の反応条件を使用しそして反応混合物をたとえばア
フイニテイクロマトグラフイーおよびゲルP遍のような
種類の分離方法で精製することによシはじめて充分な単
一性および純度を有する接合体を得ることが可能である
が、しかしこれらの分離方法は多くの労力を要ししかも
かなシ時間がかかる。しかも、収量はしばしば非常に低
い。
フイニテイクロマトグラフイーおよびゲルP遍のような
種類の分離方法で精製することによシはじめて充分な単
一性および純度を有する接合体を得ることが可能である
が、しかしこれらの分離方法は多くの労力を要ししかも
かなシ時間がかかる。しかも、収量はしばしば非常に低
い。
本発明にしたがえば、既知の剤の場合におけるような副
反応を起すことなしに穏和な条件下で比較的単一性の二
分子性またはオリゴマー性のホモおよびヘテロの両液合
体を製造するための二官能性剤として使用できる新しい
群の化合物が発見された。この新規なカップリング剤を
使用する場合にはよシ高い収量で所望の接合体が得られ
る。
反応を起すことなしに穏和な条件下で比較的単一性の二
分子性またはオリゴマー性のホモおよびヘテロの両液合
体を製造するための二官能性剤として使用できる新しい
群の化合物が発見された。この新規なカップリング剤を
使用する場合にはよシ高い収量で所望の接合体が得られ
る。
また、新規な化合物はアミノ基含有物質をチオール化す
るためのチオール化剤としても使用されうる。これはア
ミン基を含有しそして水性液体中に可溶性である巨大分
子状物質特にアミン基を含有するバイオポリマーおよび
それの誘導体主として蛋白質、ポリペプチドおよびポリ
サンカライドまたはアミノ基を含有するそれらの誘導体
て関して特に好ましい。
るためのチオール化剤としても使用されうる。これはア
ミン基を含有しそして水性液体中に可溶性である巨大分
子状物質特にアミン基を含有するバイオポリマーおよび
それの誘導体主として蛋白質、ポリペプチドおよびポリ
サンカライドまたはアミノ基を含有するそれらの誘導体
て関して特に好ましい。
本発明による化合物は、式
%式%(
〔式中、R1は2−ピリジル、5−ニトロ−2−ピリジ
ルまたは4−ピリジルであシ、Aは1〜10個好ましく
は1〜6個の炭素原子を有する炭化水素残基でありモし
て2は基 (式中nは2tたは3であシ、R1は前記R1と同じ定
義を有しそしてそれに等しくそしてR2はメチルまたは
エチルである)であるかまたは最後に述べた基の酸付加
塩である〕を有する点に特徴がある。
ルまたは4−ピリジルであシ、Aは1〜10個好ましく
は1〜6個の炭素原子を有する炭化水素残基でありモし
て2は基 (式中nは2tたは3であシ、R1は前記R1と同じ定
義を有しそしてそれに等しくそしてR2はメチルまたは
エチルである)であるかまたは最後に述べた基の酸付加
塩である〕を有する点に特徴がある。
炭化水素残基Aは脂肪族残基であるのが好ましいが、ま
た芳香族残基であってもよい。Aはたとえば直鎖状また
は分枝鎖状のアルキレン残基たとえば−(CB2)m−
C式中mは整数1〜10好ましくは1〜6である)たと
えば−(!H2−(!H2−である。
た芳香族残基であってもよい。Aはたとえば直鎖状また
は分枝鎖状のアルキレン残基たとえば−(CB2)m−
C式中mは整数1〜10好ましくは1〜6である)たと
えば−(!H2−(!H2−である。
式1で表わされる化合物は多数の異なる方法によシ製造
されうる。現在好適とされている方法は以下のとおシで
ある。
されうる。現在好適とされている方法は以下のとおシで
ある。
式!において2が基
である化合物は、縮合剤の存在下で式
%式%()
(式中R1およびAは共に前述の定義を有する)で表わ
されるジスルフィドをnが2である場合のN−ヒドロキ
シスクシンイミド(またはnが3である化合物を所望す
る場合にはnが3である類縁化合物)と反応させること
によシ製造される。
されるジスルフィドをnが2である場合のN−ヒドロキ
シスクシンイミド(またはnが3である化合物を所望す
る場合にはnが3である類縁化合物)と反応させること
によシ製造される。
この反応は10〜30℃の温度で有機溶媒中において行
われる。適当な溶媒の例としてはたとえばメチレンクロ
ライド、エチレンアセテートおよびジオキサンがあげら
れる。反応時間は反応成分および反応温度の選択によシ
変わる。
われる。適当な溶媒の例としてはたとえばメチレンクロ
ライド、エチレンアセテートおよびジオキサンがあげら
れる。反応時間は反応成分および反応温度の選択によシ
変わる。
使用される縮合剤はエステル化反応で一般的な剤たとえ
ば・N、N−ジシクロへキシルカルボジイミドであるこ
とができる。
ば・N、N−ジシクロへキシルカルボジイミドであるこ
とができる。
弐■で表わされる出発化合物は1式
%式%)
で表わされるメルカプトアルキルカルボン酸ヲ式
%式%)
(式中人およびR1は前述の定義を有する)で表わされ
るジピリジルジスルフィドと反応させこことによ#)製
造されうる。
るジピリジルジスルフィドと反応させこことによ#)製
造されうる。
この反応は10〜30℃の温度で有機溶媒中において行
われる。適当な溶媒の例としてはたとえばエタノール、
酢酸エチルおよびジオキサンがあげられる。反応時間は
反応成分および反応温度の選択により変化する。
われる。適当な溶媒の例としてはたとえばエタノール、
酢酸エチルおよびジオキサンがあげられる。反応時間は
反応成分および反応温度の選択により変化する。
式「において2が基
−C−8−R1
である化合物は、前記式[のジスルフィドを対応するチ
オピリドンと有機溶媒中において縮合剤の存在下で最初
は低温たとえば一20℃で約1〜2時間ついで周囲温度
(約+20℃)で反応させることによシ製造される。こ
こでの適当な溶媒はたとえばメチレンクロライド、酢酸
エチルおよびジオキサンである。使用する縮合剤はN。
オピリドンと有機溶媒中において縮合剤の存在下で最初
は低温たとえば一20℃で約1〜2時間ついで周囲温度
(約+20℃)で反応させることによシ製造される。こ
こでの適当な溶媒はたとえばメチレンクロライド、酢酸
エチルおよびジオキサンである。使用する縮合剤はN。
N−ジシクロへキシルカルボジイミドであるのが好まし
い。
い。
使用される出発物質は式Iで表わされる化合物を式■で
表わされる化合物と反応させることによシ得られる混合
物であるのが好ましい。
表わされる化合物と反応させることによシ得られる混合
物であるのが好ましい。
E
式1において2が基−C−0−R2である化合物は、有
機溶媒中において式 %式% (式中R2およびAは前述の定義を有する)で表わされ
るチオールイミデートを弐R1−8−8−R1(式中R
1は前述の定義を有する)で表わされるピリジルジスル
フィドと反応させることによシ製造される。溶媒はたと
えば約10%の氷酢酸を含有するメタノールであること
ができる。
機溶媒中において式 %式% (式中R2およびAは前述の定義を有する)で表わされ
るチオールイミデートを弐R1−8−8−R1(式中R
1は前述の定義を有する)で表わされるピリジルジスル
フィドと反応させることによシ製造される。溶媒はたと
えば約10%の氷酢酸を含有するメタノールであること
ができる。
本発明による化合物を二官能性カップリング剤として使
用する場合には次の方法が適用される。例示のために本
発明にしたがってN−スクシンイミジル−3−(2−ピ
リジルジチオ)−プロピオネート のたすけをかシてカップリングさせるために2種の物質
〔各々が少くとも1個のアミン基を反応に提供しうるも
のであり(念とえば蛋白質およびペプチド)、一般的に
B1−NH2およびB2−IJH2として示す〕が選択
された。
用する場合には次の方法が適用される。例示のために本
発明にしたがってN−スクシンイミジル−3−(2−ピ
リジルジチオ)−プロピオネート のたすけをかシてカップリングさせるために2種の物質
〔各々が少くとも1個のアミン基を反応に提供しうるも
のであり(念とえば蛋白質およびペプチド)、一般的に
B1−NH2およびB2−IJH2として示す〕が選択
された。
これらの物質は最初にそれぞれ以下のように補助剤と反
応する。
応する。
訃よび
これら生成物の一方たとえば工程b)からの生成物はつ
いで次式にしたがって酸媒体中でたとえばジチオトレイ
トール(I)TT)で還元される・■ ついでこうして得られたチオールは次式にしたがってこ
の場合には工程a)からのジスルフィドと反応する。
いで次式にしたがって酸媒体中でたとえばジチオトレイ
トール(I)TT)で還元される・■ ついでこうして得られたチオールは次式にしたがってこ
の場合には工程a)からのジスルフィドと反応する。
工程a)およびb)は通常20〜25℃の温度で5〜8
のpHを有しそして1〜10容量係のメタールまたはエ
タノールを含有する水溶液中において実施される。
のpHを有しそして1〜10容量係のメタールまたはエ
タノールを含有する水溶液中において実施される。
工程C)は通常20〜25℃の温度でpH3〜5におけ
る水性媒体中(Cおいて実施されうる。変性された分子
B2が本来的なジスルフィド結合を有していない場合に
は還元(よまた別の遷元剤を用いそしてより高いpH値
たとえばpHs〜a5までで実施されうる。
る水性媒体中(Cおいて実施されうる。変性された分子
B2が本来的なジスルフィド結合を有していない場合に
は還元(よまた別の遷元剤を用いそしてより高いpH値
たとえばpHs〜a5までで実施されうる。
工程d)は通常20〜25℃でpH4〜8における水性
媒体中で実施される。
媒体中で実施される。
前記物質の一方がすでに反応に関与しうる反応性チオー
ル基(たとえば脂肪族チオール基)を有する場合には前
記工程のb)およびC)は省略できる。
ル基(たとえば脂肪族チオール基)を有する場合には前
記工程のb)およびC)は省略できる。
二分子へテロ接合体が所望される場合には2種の物質は
およそモノ置換よシ以上に置換されるべきではない。所
望ならば2分子よシも大きい接合体は2種物質を1分子
当た91個よシ多い置換基で置換することによシ裏遺さ
れうる。
およそモノ置換よシ以上に置換されるべきではない。所
望ならば2分子よシも大きい接合体は2種物質を1分子
当た91個よシ多い置換基で置換することによシ裏遺さ
れうる。
ここでは当然これら物質が反応にあずかる相当する数の
7ミノ基を含有するということが必要である。オリゴ接
合体(たとえばトリ接合体およびテトラ接合体)の合成
においてはこれら物質の一つは一般におよそモノ置換以
上に置換されるべきではない。まな、前述と同じ方法で
ホモ接4すなわちB1=B2)を製造することも可能で
ある。
7ミノ基を含有するということが必要である。オリゴ接
合体(たとえばトリ接合体およびテトラ接合体)の合成
においてはこれら物質の一つは一般におよそモノ置換以
上に置換されるべきではない。まな、前述と同じ方法で
ホモ接4すなわちB1=B2)を製造することも可能で
ある。
本発明の化合物のチオール化剤としての有用性は前記工
程のb)およびC)から明らかである。
程のb)およびC)から明らかである。
これに関しては導入されるチオール基がピリジルジスル
フィド形態で閉塞されているということが特に好ましい
。このようにして導入されたチオール基とその物質(た
とえばその物質がジスルフィド橋を含有する蛋白質また
はポリペプチドである場合)中に存在するジスルフィド
橋との望ましくないチオールジスルフィド交換反応が変
性工程の間そして変性物質たとえば変性蛋白質を貯蔵す
る場合に避けられる。物質(たとえば蛋白質)中に導入
されたR1− S −8−基をチオール基(H8−)に
変換し九い場合には、これは同時に物質中に存在しうる
本来のジスルフィド橋を還元することなしに選択還元に
よシ実施されうる。これはR1−8−8−基とたとえば
蛋白質中の本来の脂肪族ジスルフィド橋との間の化学反
応性の相異によシ可能である。
フィド形態で閉塞されているということが特に好ましい
。このようにして導入されたチオール基とその物質(た
とえばその物質がジスルフィド橋を含有する蛋白質また
はポリペプチドである場合)中に存在するジスルフィド
橋との望ましくないチオールジスルフィド交換反応が変
性工程の間そして変性物質たとえば変性蛋白質を貯蔵す
る場合に避けられる。物質(たとえば蛋白質)中に導入
されたR1− S −8−基をチオール基(H8−)に
変換し九い場合には、これは同時に物質中に存在しうる
本来のジスルフィド橋を還元することなしに選択還元に
よシ実施されうる。これはR1−8−8−基とたとえば
蛋白質中の本来の脂肪族ジスルフィド橋との間の化学反
応性の相異によシ可能である。
すなわち本発明はまた水性液体中に溶解する変性巨大分
子状物質、特にアミノ基を含有するバイオポリマー(b
iopolyner )およびそれの誘導体、好ましく
はアミノ基を含有する蛋白質、ポリペプチドおよびポリ
サッカライドまたはそれらの誘導体をも包含する。これ
らの変性巨大分子状物質はその中の1個またはそれ以上
のアミノ基(−MH2)が式−MH−C−A−8−3−
11(式中人およびR1は共に前述の定義を有しそして
Xは0またはMH1好ましくは0である>”’e *
”−ra hた点に特徴がある。これらの基は式 −NH−c−CH2−ca2−5−8−R’ C式中R
1は前述の定義を有する)で表わされる基から選択され
るのが好ましく、2−ピリジルが好ましい。
子状物質、特にアミノ基を含有するバイオポリマー(b
iopolyner )およびそれの誘導体、好ましく
はアミノ基を含有する蛋白質、ポリペプチドおよびポリ
サッカライドまたはそれらの誘導体をも包含する。これ
らの変性巨大分子状物質はその中の1個またはそれ以上
のアミノ基(−MH2)が式−MH−C−A−8−3−
11(式中人およびR1は共に前述の定義を有しそして
Xは0またはMH1好ましくは0である>”’e *
”−ra hた点に特徴がある。これらの基は式 −NH−c−CH2−ca2−5−8−R’ C式中R
1は前述の定義を有する)で表わされる基から選択され
るのが好ましく、2−ピリジルが好ましい。
工程C)およびd)によるチオールジスルフィド交換反
応は、式1で表わされる化合物中の基R1が還元的に分
裂されて化合物R1−8Rになることができついでこれ
が対応する化合物HR1=Sに互変異性されることを必
要とする。2−ピリジル基および4−ピリジル基によシ
みたされる外に、その条件はまたチオールジオン互変異
性が破壊されないような位置でかかる型の置換基で置換
される対応する基によってもみたされる。
応は、式1で表わされる化合物中の基R1が還元的に分
裂されて化合物R1−8Rになることができついでこれ
が対応する化合物HR1=Sに互変異性されることを必
要とする。2−ピリジル基および4−ピリジル基によシ
みたされる外に、その条件はまたチオールジオン互変異
性が破壊されないような位置でかかる型の置換基で置換
される対応する基によってもみたされる。
5−ニトロ−2−ピリジルがこの置換ピリジル基に属す
ることが見出された。
ることが見出された。
次に本発明による化合物の製法およびこれら化合物の使
用を説明する多くの実施例でさらに本発明を説明する◎ 実施例1 N−スクシンイミジル−3(2−ピリジルジ
チオ)プロピオネート 1.9P(a6ミリモル)の2,2−ジピリジルジスル
フィドを10−の酢酸エチル中に溶解した。10−の酢
酸エチル中における0、95’(a6ミリモル)の3−
メルカプトグロピオン酸溶液を攪拌しながら同時に0.
1 m (2滴)のボロントリフルオライドエーテラー
トを反応混合物に加えながら15分間に滴加した。つい
で振盪させながら室温で20時間保持し、反応混合物を
蒸発させ(B11chi Rotavaporによる。
用を説明する多くの実施例でさらに本発明を説明する◎ 実施例1 N−スクシンイミジル−3(2−ピリジルジ
チオ)プロピオネート 1.9P(a6ミリモル)の2,2−ジピリジルジスル
フィドを10−の酢酸エチル中に溶解した。10−の酢
酸エチル中における0、95’(a6ミリモル)の3−
メルカプトグロピオン酸溶液を攪拌しながら同時に0.
1 m (2滴)のボロントリフルオライドエーテラー
トを反応混合物に加えながら15分間に滴加した。つい
で振盪させながら室温で20時間保持し、反応混合物を
蒸発させ(B11chi Rotavaporによる。
<40℃)そして固体の黄色残留物を10I11tの冷
酢酸エチル(+4℃)でスラリーにしついで濾過した。
酢酸エチル(+4℃)でスラリーにしついで濾過した。
こうして約90%の2−チオピリドン(h点124〜1
26℃、文献値128〜130℃)が回収された。2−
カルボキシエチル(2−ピリジル)ジスルフィドの収率
は約60チであった。1トNMRδ(CDC43) 2
.7 3.3 (4H,m、−CH2CH2)、S、
−(!OOH)。
26℃、文献値128〜130℃)が回収された。2−
カルボキシエチル(2−ピリジル)ジスルフィドの収率
は約60チであった。1トNMRδ(CDC43) 2
.7 3.3 (4H,m、−CH2CH2)、S、
−(!OOH)。
ついで0.681i’(5ミリモル)のN−ヒドロキシ
スクシンイミドを溶液に加え、その後10rrLtの乾
燥酢酸エチル中に溶解されたt03y−(5ミリモル)
のジシクロへキシルカルボジイミドを室温で振盪させな
がら15分間で滴加した。反応を室温で5時間振盪下で
継続させ、ついで反芯温合物を+4°Cに冷却しそして
沈殿したジシクロへキシルカルボジイミドをF遍した。
スクシンイミドを溶液に加え、その後10rrLtの乾
燥酢酸エチル中に溶解されたt03y−(5ミリモル)
のジシクロへキシルカルボジイミドを室温で振盪させな
がら15分間で滴加した。反応を室温で5時間振盪下で
継続させ、ついで反芯温合物を+4°Cに冷却しそして
沈殿したジシクロへキシルカルボジイミドをF遍した。
わずかに黄色の溶液を蒸発させそして油状物をエタノー
ル中に溶解しついで一20℃で晶出させた。
ル中に溶解しついで一20℃で晶出させた。
収率は45%であった。融点は7&5〜815℃であっ
た。
た。
C12H12N204S2としての元素分析は次のとお
シである。
シである。
計算値: c 46.14、H3,83、Na97、S
2Q、53%実測値: c 46.19、H3,88
、N B96、s 20.02%3j2 (4H,s
広い、−cH2−ca2 )、6.90−B82 (4
H1実施例22−チオピリジル−3−(2−ピリジルジ
チオ)プロピオネート 1、9 P C& 6ミリモル)の2,2−ジピリジル
ジスルフィドを65dの酢酸エチル中に溶解した。10
−の酢酸エチル中における0、95’(a6ミリそル)
の3−メルカプトプロピオン酸の溶液を振盪させながら
15分間で滴加し、同時に0l−(2滴)のポロントリ
フルオライドエーテラートを反応混合物に加えた。室温
で20時間放置後溶液を一20℃に冷却した。その後1
.037(5ミリモル)のジシクロへキシルカルボジイ
ミドを15−の酢酸エチル中に溶解し、これを溶液に強
く攪拌しながら15分間滴刺した。
2Q、53%実測値: c 46.19、H3,88
、N B96、s 20.02%3j2 (4H,s
広い、−cH2−ca2 )、6.90−B82 (4
H1実施例22−チオピリジル−3−(2−ピリジルジ
チオ)プロピオネート 1、9 P C& 6ミリモル)の2,2−ジピリジル
ジスルフィドを65dの酢酸エチル中に溶解した。10
−の酢酸エチル中における0、95’(a6ミリそル)
の3−メルカプトプロピオン酸の溶液を振盪させながら
15分間で滴加し、同時に0l−(2滴)のポロントリ
フルオライドエーテラートを反応混合物に加えた。室温
で20時間放置後溶液を一20℃に冷却した。その後1
.037(5ミリモル)のジシクロへキシルカルボジイ
ミドを15−の酢酸エチル中に溶解し、これを溶液に強
く攪拌しながら15分間滴刺した。
反応を1時間−20℃で継続させついで室温(約20℃
)で−夜続けさせた。生成するジシクロへキシルカルバ
ミドをF去し、溶液を蒸発させk (B11chi R
otavaporによる、〈40℃)0ついで10−の
冷酢酸エチル(+4”Cりを加え、混合物を再び一過し
てそれによシすべてのジシクロヘキシルカルバミドを除
去できた。生成物は1.52であった。純度は約90%
であった。
)で−夜続けさせた。生成するジシクロへキシルカルバ
ミドをF去し、溶液を蒸発させk (B11chi R
otavaporによる、〈40℃)0ついで10−の
冷酢酸エチル(+4”Cりを加え、混合物を再び一過し
てそれによシすべてのジシクロヘキシルカルバミドを除
去できた。生成物は1.52であった。純度は約90%
であった。
IH−NMR,δ(CD(!t3) 3.15 (4H
,e広い、−ca2−c′H2)、実施例3 メチル−
4(2−ピリジルジテオ)ブチルイミデート 20■(0,12ミリモル)のメチル−4−メルカプト
ブチルイミデート塩酸塩、26η(0,12ミリモル)
の2,2′−ジピリジルジスルフィドおよび0.57!
の氷酢酸を5−のメタノール中に溶解した。反応をIH
−NMRで行ないそしてすべてのイミデートが反応した
時に(約12時間)混合物を蒸発乾固させた。IH−N
MR(CD50D)を用いて反応混合物を分析したとこ
ろメチル−4−メルカプトブチルイミデートに基づいて
約20チの収率を示した。
,e広い、−ca2−c′H2)、実施例3 メチル−
4(2−ピリジルジテオ)ブチルイミデート 20■(0,12ミリモル)のメチル−4−メルカプト
ブチルイミデート塩酸塩、26η(0,12ミリモル)
の2,2′−ジピリジルジスルフィドおよび0.57!
の氷酢酸を5−のメタノール中に溶解した。反応をIH
−NMRで行ないそしてすべてのイミデートが反応した
時に(約12時間)混合物を蒸発乾固させた。IH−N
MR(CD50D)を用いて反応混合物を分析したとこ
ろメチル−4−メルカプトブチルイミデートに基づいて
約20チの収率を示した。
実施例4 N−スクシンイミジル−2(2−ピリジルジ
チオ)プロピオネート この化合物は3−メルカプトプロピオン酸が2−メルカ
プトプロピオン酸にff1iキ換えられる以外は実施例
1に記載のN−スクシンイミジル−3(2−ピリジルジ
チオ)プロピオネートと同じ方法で製造された。さらに
、合成は約1A。
チオ)プロピオネート この化合物は3−メルカプトプロピオン酸が2−メルカ
プトプロピオン酸にff1iキ換えられる以外は実施例
1に記載のN−スクシンイミジル−3(2−ピリジルジ
チオ)プロピオネートと同じ方法で製造された。さらに
、合成は約1A。
スケールで実施された。生成物はI H−NMRで分析
された。
された。
実施例5 N−スクシンイミジル−3(4−ピリジルジ
チオ)プロピオネート この化合物は2,2′−ジピリジルジスルフィドカ4.
4’−ジピリジルジスルフィドによシ置き換えられる以
外は実施例1に記載のN−スクシンイミジル−3(2−
ピリジルジチオ)−プロピオネートと同じ方法で製造さ
れた。さらに合成は’Aoスケールで実施された。生成
物は1)!−NMRで分析された。
チオ)プロピオネート この化合物は2,2′−ジピリジルジスルフィドカ4.
4’−ジピリジルジスルフィドによシ置き換えられる以
外は実施例1に記載のN−スクシンイミジル−3(2−
ピリジルジチオ)−プロピオネートと同じ方法で製造さ
れた。さらに合成は’Aoスケールで実施された。生成
物は1)!−NMRで分析された。
実施例6 N−スクシンイミジル−3(5−二トロー2
−ピリジルジチオ)プロピ オネート この化合物は2,2′−ジピリジルジスルフィドがビス
(5−ニトロ−2−ピリジル)ジスルフィドによシ置き
換えられる以外は実施例1に記載のN−スクシンイミジ
ル、−3(2−ピリジルジチオ)プロピオネートと同じ
方法で製造された。さらに合成は’Aoスケールで実施
された。
−ピリジルジチオ)プロピ オネート この化合物は2,2′−ジピリジルジスルフィドがビス
(5−ニトロ−2−ピリジル)ジスルフィドによシ置き
換えられる以外は実施例1に記載のN−スクシンイミジ
ル、−3(2−ピリジルジチオ)プロピオネートと同じ
方法で製造された。さらに合成は’Aoスケールで実施
された。
生成物はI H−NMRで分析された。
実施例7 α−アミラーゼのチオール化5■のα−アミ
ラーゼ1pH7,5のα5rntの0.1Mυん酸ナト
リウムバッファー中に溶解し、これに75μtf)N−
スクシンイミジル−3(2−ピリジルジチオ)プロピオ
ネ−)(99,5%ztoH中における34mM )を
加え念。混合物を激しく振盪させた後反応を+23℃で
40分間継続させた。反応混合物をセファデックスG−
25(発鈴商標)(Pharmacia Fine C
hemica’ls AB社裂、エビクロロヒドリンで
交叉結合され之デキストランのビーズ)上でゲル濾過し
た(使用した媒体はpH7,5の0.5 M りん酸ナ
トリウムバッファーであった)。ついでこうして得られ
たα−アミラーゼ−ピリジルジスルフィド誘導体はゲル
濾過から得られた物質(1,5m/)に50μtの50
mMジチオトレイトール(dithiothreito
l)を加えることによシ還元された。還元は+23″C
で20分間継続させた。過剰のジチオトレイトールおよ
び他の低分子量取分はセファデックスG−25上〒のゲ
ル濾過により除去された(使用媒体は0.3 MIJa
(:tであつ7IC)。このようなチオール化されたα
−アミラーゼは0.75モルSH1モル蛋白質を含有す
ることが見出された・実施例8 ヒツジ−抗つサギーエ
gG抗体−α−アミラーゼ接合体の製法 a)チオール化α−アミラーゼ チオール化α−アミラーゼは前記実施例7にしたがって
製造された。
ラーゼ1pH7,5のα5rntの0.1Mυん酸ナト
リウムバッファー中に溶解し、これに75μtf)N−
スクシンイミジル−3(2−ピリジルジチオ)プロピオ
ネ−)(99,5%ztoH中における34mM )を
加え念。混合物を激しく振盪させた後反応を+23℃で
40分間継続させた。反応混合物をセファデックスG−
25(発鈴商標)(Pharmacia Fine C
hemica’ls AB社裂、エビクロロヒドリンで
交叉結合され之デキストランのビーズ)上でゲル濾過し
た(使用した媒体はpH7,5の0.5 M りん酸ナ
トリウムバッファーであった)。ついでこうして得られ
たα−アミラーゼ−ピリジルジスルフィド誘導体はゲル
濾過から得られた物質(1,5m/)に50μtの50
mMジチオトレイトール(dithiothreito
l)を加えることによシ還元された。還元は+23″C
で20分間継続させた。過剰のジチオトレイトールおよ
び他の低分子量取分はセファデックスG−25上〒のゲ
ル濾過により除去された(使用媒体は0.3 MIJa
(:tであつ7IC)。このようなチオール化されたα
−アミラーゼは0.75モルSH1モル蛋白質を含有す
ることが見出された・実施例8 ヒツジ−抗つサギーエ
gG抗体−α−アミラーゼ接合体の製法 a)チオール化α−アミラーゼ チオール化α−アミラーゼは前記実施例7にしたがって
製造された。
111)2−ピリジルジスルフィド基を含有するとツジ
ー抗うビットーーG−抗体 1.2■のヒツジ−抗つサギーIgG−抗体(免疫吸着
精製によシヒッジの超免疫血清から調製された)をpH
7,5のα5−の0.1ytりん酸ナトリウムバッファ
ー中に溶解し、これに15μtのN−スクシンイミジル
−3−(2−ピリジルジチオ)−プロピオネ−)(Et
OH中における5、9mM)を加えた。溶液を激しく振
盪させた後反応を+23℃で40分間行なわしめた。過
剰の試薬および他の望ましくない低分子成分をセファデ
ックスG−25上でのゲルー過によシ除去した(媒体は
α3 M NaC2)。
ー抗うビットーーG−抗体 1.2■のヒツジ−抗つサギーIgG−抗体(免疫吸着
精製によシヒッジの超免疫血清から調製された)をpH
7,5のα5−の0.1ytりん酸ナトリウムバッファ
ー中に溶解し、これに15μtのN−スクシンイミジル
−3−(2−ピリジルジチオ)−プロピオネ−)(Et
OH中における5、9mM)を加えた。溶液を激しく振
盪させた後反応を+23℃で40分間行なわしめた。過
剰の試薬および他の望ましくない低分子成分をセファデ
ックスG−25上でのゲルー過によシ除去した(媒体は
α3 M NaC2)。
こうして変性されたヒツジ−抗つサギーエgG−抗体は
蛋白質1モル当九シ2モルの2−ピリジルジスルフィド
基を含有していることが見出された。
蛋白質1モル当九シ2モルの2−ピリジルジスルフィド
基を含有していることが見出された。
C)ヒツジ−抗つサギーエEG−抗体−α−アミラーゼ
接合体 1−のfl S MNaCt中1c オける1゜21q
のヒツジ−抗つサギーエgG−抗体−2−ビリジルジス
ル、フィト(17ナノモルの2−ピリジルジスルフィド
基を含有する8ミリモルの蛋白り(前記b)からのもの
)を2−のCL3MNaC2中における5■のチオール
化α−アミラーゼ(75−)/モMシん酸Naバッファ
ーを加えそして+4℃で18時間反応を行なわしめた。
接合体 1−のfl S MNaCt中1c オける1゜21q
のヒツジ−抗つサギーエgG−抗体−2−ビリジルジス
ル、フィト(17ナノモルの2−ピリジルジスルフィド
基を含有する8ミリモルの蛋白り(前記b)からのもの
)を2−のCL3MNaC2中における5■のチオール
化α−アミラーゼ(75−)/モMシん酸Naバッファ
ーを加えそして+4℃で18時間反応を行なわしめた。
反応混合物をセファデックスa −200上でゲルテ過
しついで各フラクションを分析したところ使用抗体の8
0%が接合されたことを示した。
しついで各フラクションを分析したところ使用抗体の8
0%が接合されたことを示した。
こうして虫取された接合体は実質的に2分子であった。
また少量の3分子および4分子の物質も観察できた。接
合体は酵素作用および免疫作用の両方を示した。接合体
を含有する各フラクションを一緒にしそして290μ?
(接合抗体)/mtに濃縮しついで+4°Cで0.3
M NaC2中に保存した。
合体は酵素作用および免疫作用の両方を示した。接合体
を含有する各フラクションを一緒にしそして290μ?
(接合抗体)/mtに濃縮しついで+4°Cで0.3
M NaC2中に保存した。
実施例92−ピリジルジスルフィド基を含有するアルカ
リ性りん酸分解酵素 一4Wqのアルカリ性シん酸分解酵素(ホスファターゼ
)(子牛の腸からのもの、BoehringerMan
nheim AG社製品)をpH15である2dの0.
1mりん散ナトリウムバッファー中に溶解し、これに1
50μtのN−スクシンイミジル−3(2−ピリジルジ
チオ)プロピオネ−)(99,5%エタノール中におけ
る1、7ミリモル)を加えた。
リ性りん酸分解酵素 一4Wqのアルカリ性シん酸分解酵素(ホスファターゼ
)(子牛の腸からのもの、BoehringerMan
nheim AG社製品)をpH15である2dの0.
1mりん散ナトリウムバッファー中に溶解し、これに1
50μtのN−スクシンイミジル−3(2−ピリジルジ
チオ)プロピオネ−)(99,5%エタノール中におけ
る1、7ミリモル)を加えた。
反応混合物を激しく振盪させた後+23°0で40分間
反応を継続させた。ついで反応混合物をセファデックス
G−25上でゲルテ過した(使用媒体は前述と同じシん
酸塩バッファーであった。
反応を継続させた。ついで反応混合物をセファデックス
G−25上でゲルテ過した(使用媒体は前述と同じシん
酸塩バッファーであった。
こうして変性されたアルカリ性りん酸分解酵素は蛋白質
1モル当たり1モルのピリジルジスルフィド構造を含有
した。
1モル当たり1モルのピリジルジスルフィド構造を含有
した。
実施例10 ヒツジ−抗つサギーIgG−抗体のチオー
ル化 2.5■のヒツジ−抗つサギーエgG−抗体(Na2S
O4沈殿によりヒツジの血清から製造された)をpH1
5である0、5−の0.1Mシん酸Naバッファー中に
溶解し、これに40μtのN−スクシンイミジh−3−
(2−ピリジルジチオ)プロピオネ−)(99,5%エ
タノール中における1、7ミリそル)を加えた。混合物
を激しく振盪させた後生23℃で40分間反応を継続さ
せた。過剰の反応成分および他の望ましくない低分子量
成分をセファデックスG−25上でのゲル濾過により除
去した(使用媒体はpH5である11M酢酸ナトリウム
であった)。ついでこうして得られたヒツジ−抗つサギ
ーエgG−抗体−ピリジルジスルフィド誘導体は50μ
tの50ミリモルジチオトレイトールをゲルー過からの
ボイド物質(約1.5−)に加えることによシ還元され
た。この還元は+23℃で30分間続けられた。過剰の
ジチオトレイトールおよび他の低分子量成分はセファデ
ックスG−25上でのゲル濾過によシ除去された(使用
媒体は0.3 MNaC2であった)。こうしてチオー
ル化されたヒツジ−抗つサギーエgG−抗体は蛋白質1
モル当たり2モルのSHを含有していた。
ル化 2.5■のヒツジ−抗つサギーエgG−抗体(Na2S
O4沈殿によりヒツジの血清から製造された)をpH1
5である0、5−の0.1Mシん酸Naバッファー中に
溶解し、これに40μtのN−スクシンイミジh−3−
(2−ピリジルジチオ)プロピオネ−)(99,5%エ
タノール中における1、7ミリそル)を加えた。混合物
を激しく振盪させた後生23℃で40分間反応を継続さ
せた。過剰の反応成分および他の望ましくない低分子量
成分をセファデックスG−25上でのゲル濾過により除
去した(使用媒体はpH5である11M酢酸ナトリウム
であった)。ついでこうして得られたヒツジ−抗つサギ
ーエgG−抗体−ピリジルジスルフィド誘導体は50μ
tの50ミリモルジチオトレイトールをゲルー過からの
ボイド物質(約1.5−)に加えることによシ還元され
た。この還元は+23℃で30分間続けられた。過剰の
ジチオトレイトールおよび他の低分子量成分はセファデ
ックスG−25上でのゲル濾過によシ除去された(使用
媒体は0.3 MNaC2であった)。こうしてチオー
ル化されたヒツジ−抗つサギーエgG−抗体は蛋白質1
モル当たり2モルのSHを含有していた。
実施例112−ピリジルジスルフィド基含有アルブミン
pH7,5である1−のQ、I M!Jん酸ナトリウム
バッファー中における8■の人の血清アルブミンを12
μtのN−スクシンイミジル−3(2−ピリジルジチオ
)プロピオネ−)(99,5%エタノール中40ミリモ
ル)と混合させた。+23℃で40分間反応させた後反
応混合物をセファデックスG−25カラム上でゲル濾過
した(使用媒体は前記と同じシん酸塩バッファーであっ
た)。
バッファー中における8■の人の血清アルブミンを12
μtのN−スクシンイミジル−3(2−ピリジルジチオ
)プロピオネ−)(99,5%エタノール中40ミリモ
ル)と混合させた。+23℃で40分間反応させた後反
応混合物をセファデックスG−25カラム上でゲル濾過
した(使用媒体は前記と同じシん酸塩バッファーであっ
た)。
このボイド物質的2−はアルブミン−2−ピリジルジス
ルフィド籾導体を含有してい念。誘導体の還元後に単離
された2−チオピリドンの量を分光光度計で測定したと
ころ置換割合は2.5モルチオール1モルアルブミンで
あった。
ルフィド籾導体を含有してい念。誘導体の還元後に単離
された2−チオピリドンの量を分光光度計で測定したと
ころ置換割合は2.5モルチオール1モルアルブミンで
あった。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1)その中の1個またはそれ以上のアミノ基(−NH_
2)が式 ▲数式、化学式、表等があります▼ (式中、R^1は2−ピリジル、5−ニトロ−2−ピリ
ジルまたは4−ピリジルであり、Aは1〜6個の炭素原
子を有する炭化水素残基でありそしてXはOまたはNH
である) で表わされる基に変換されている変性アミノ基を含有す
る水性液体中に可溶性の巨大分子物質。 2)その物質がプロテインまたはポリペプチドまたはそ
れの誘導体である前記第1項による変性巨大分子状物質
。 3)その中の1個またはそれ以上のアミノ基が式 ▲数式、化学式、表等があります▼ (式中R^1は前述の定義を有する)で表わされる基に
変換されている前記第1項または第2項による変性巨大
分子物質。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SE7702462A SE430062B (sv) | 1977-03-04 | 1977-03-04 | Kopplings- eller tioleringsreagens |
SE7702462-8 | 1977-03-04 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS61191675A true JPS61191675A (ja) | 1986-08-26 |
JPS624368B2 JPS624368B2 (ja) | 1987-01-30 |
Family
ID=20330623
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2406678A Granted JPS53130674A (en) | 1977-03-04 | 1978-03-04 | Novel pyridine compound |
JP60290918A Granted JPS61191675A (ja) | 1977-03-04 | 1985-12-25 | 巨大分子物質 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2406678A Granted JPS53130674A (en) | 1977-03-04 | 1978-03-04 | Novel pyridine compound |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4149003A (ja) |
JP (2) | JPS53130674A (ja) |
DE (1) | DE2808523A1 (ja) |
FR (1) | FR2382450A1 (ja) |
GB (1) | GB1597756A (ja) |
SE (1) | SE430062B (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2006500364A (ja) * | 2002-08-16 | 2006-01-05 | イムノージェン インコーポレーテッド | 高い反応性と溶解度を有する架橋剤および小分子薬物の標的化送達用コンジュゲートの調製におけるそれらの使用 |
Families Citing this family (49)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2430943A1 (fr) * | 1978-07-13 | 1980-02-08 | Toyo Jozo Kk | Nouveaux derives disulfures |
SE446184B (sv) * | 1979-01-12 | 1986-08-18 | Toyo Jozo Kk | Polyfunktionell disulfidforening anvendbar som tverbindande medel |
SE8003732L (sv) * | 1980-05-19 | 1981-11-20 | Pharmacia Diagnostics Ab | Sett vid bestemningsmetoder involverande biospecifika affinitetsreaktioner |
US4563304A (en) * | 1981-02-27 | 1986-01-07 | Pharmacia Fine Chemicals Ab | Pyridine compounds modifying proteins, polypeptides or polysaccharides |
SE8102194L (sv) * | 1981-04-06 | 1982-10-07 | Pharmacia Ab | Terapeutiskt aktiv organisk forening och farmaceutisk beredning innehallande denna |
SE8102193L (sv) * | 1981-04-06 | 1982-10-07 | Pharmacia Ab | Terapeutiskt aktiv organisk forening och dess anvendning |
US4433059A (en) * | 1981-09-08 | 1984-02-21 | Ortho Diagnostic Systems Inc. | Double antibody conjugate |
FR2522269A1 (fr) * | 1982-02-26 | 1983-09-02 | Pasteur Institut | Agents antitumoraux, tels que la daunorubicine, a efficacite amelioree, leur obtention et procede pour augmenter l'efficacite des agents antitumoraux |
FR2523445A1 (fr) * | 1982-03-17 | 1983-09-23 | Sanofi Sa | Nouveaux conjugues associant, par liaison covalente, une enzyme et un anticorps, et associations medicamenteuses utilisant lesdits conjugues |
US4614712A (en) * | 1983-02-25 | 1986-09-30 | The Upjohn Company | Immunoassays with luciferase labeled ligands or receptors |
SE8302758L (sv) * | 1983-05-17 | 1984-11-18 | Pharmacia Ab | Sett for uppspjelkning av disulfidbindningar och derigenom erhallen forening |
GB8334499D0 (en) * | 1983-12-24 | 1984-02-01 | Beecham Group Plc | Derivatives |
ATE107031T1 (de) * | 1984-12-03 | 1994-06-15 | Hoechst Celanese Corp | Verfahren zur bestimmung eines liganden. |
US4797491A (en) * | 1986-03-17 | 1989-01-10 | Cetus Corporation | Compound 1-(3-(2-pyridyldithio)propionamido)-12-(5-hydrazidoglutaramido)-4,9-dioxadodecane |
US4880935A (en) * | 1986-07-11 | 1989-11-14 | Icrf (Patents) Limited | Heterobifunctional linking agents derived from N-succinimido-dithio-alpha methyl-methylene-benzoates |
JPS6391563A (ja) * | 1986-10-07 | 1988-04-22 | Nitsusui Seiyaku Kk | 細菌由来蛋白特異抗原の検査法 |
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