CN110225920A

CN110225920A - 具有细胞渗透性和骨组织再生能力的双功能新颖肽及其用途

Info

Publication number: CN110225920A
Application number: CN201780081086.7A
Authority: CN
Inventors: 朴玧贞; 郑钟平; 李周娟; 朴柱哲
Original assignee: Seoul National University Industry Foundation; Nano Intelligent Biomedical Engineering Corp Co Ltd
Current assignee: Seoul National University Industry Foundation; Nano Intelligent Biomedical Engineering Corp Co Ltd
Priority date: 2016-12-27
Filing date: 2017-12-27
Publication date: 2019-09-10
Anticipated expiration: 2037-12-27
Also published as: WO2018124749A1; EP3564255A4; KR101944517B1; US20190382446A1; US10836795B2; KR20180076043A; EP3564255A1; CN110225920B

Abstract

本发明涉及一种新颖肽，所述肽来源于顶盖蛋白7蛋白并且具有细胞渗透性和骨组织再生能力两者；并且涉及所述肽的用途。根据本发明的肽具有优异的骨组织再生能力，并且因此可用于治疗需要骨再生的疾病，诸如骨质疏松。特别地，由于还具有细胞渗透性，所述肽不需要附着独立肽或添加另一种制剂以用于其细胞渗透，并且因此可方便地应用于需要各种手术再生治疗的矫形术等。

Description

具有细胞渗透性和骨组织再生能力的双功能新颖肽及其用途

【技术领域】

本发明涉及新颖双功能肽及其用途，所述新颖双功能肽具有细胞渗透性和骨组织再生能力两者；并且更特别地涉及来源于具有细胞渗透性和骨组织再生能力两者的顶盖蛋白(copine)7蛋白的新颖肽及其作为骨植入材料等的用途。

【背景技术】

人组织分为硬组织(诸如骨)和软组织，诸如皮肤、粘膜和牙髓。胶原原纤维(I型胶原原纤维)已知在确定硬组织的结构方面起到主要作用。与骨质丢失相关联的代表性疾病为骨质疏松，并且肿瘤等可导致对硬组织的损害。

在矫形手术和整形手术的领域中，利用各种类型的骨移植材料和屏障膜，已进行引导的骨再生、自体移植、同种异体移植等以在肿瘤治疗之后恢复丢失的骨组织并修复骨缺陷。然而，这些治疗不能诱导充分再生效果。最近，已研究利用各种类型的生长因子和蛋白质的骨再生方法。然而，虽然骨形态发生蛋白-2(其为通常用于矫形手术的骨再生的蛋白质)具有优异骨再生性能，但已报道具有引起骨组织之外的组织中的骨形成的副作用并且最终导致患者死亡，并且具有引起癌症的另外副作用。此外，用于骨再生的大多数药物基于骨吸收抑制的机制。甲状旁腺激素(PTH)(其为用作基于骨再生机制的药物的唯一药物)不便之处在于其当用作药物时需要每日注射，因为其为具有数分钟或更短的极短半衰期的蛋白质。

同时，近来已证明，顶盖蛋白7蛋白在牙髓干细胞(DPSC)分化成成牙质细胞中起作用(Oh,Hyun-jung等人Biomaterials 37(2015)217；Lee,Ji-Hyun等人,Biomaterials32.36(2011):9696-9706)。然而，因为蛋白质在体内具有极短半衰期(如同其他蛋白质)并且由总计633个氨基酸构成，所以需要基因重组的复杂过程以制备蛋白质。这成为蛋白质作为药物大量合成的障碍。

因此，由于对解决如上文所描述的现有技术的问题的巨大努力，本发明人已鉴定，顶盖蛋白7蛋白的特定肽的序列具有改善骨再生的细胞渗透性和功能。基于此发现，完成本发明。

【发明内容】

【技术问题】

因此，已根据上述问题而做出本发明，并且本发明的一个目标是提供具有细胞渗透性和骨组织再生能力的双功能的新颖肽。

本发明的另一个目标是提供用于骨组织再生治疗的新颖药物组合物。

本发明的另一个目标是提供新颖生物材料。

【技术方案】

根据本发明，上述及其他目标可通过提供SEQ ID NO:4的氨基酸序列所表示的肽来实现。

根据本发明的另一个方面，提供了用于骨组织再生治疗的新颖药物组合物，所述新颖药物组合物包含作为活性成分的所述肽。

根据本公开文本的另一个方面，提供了包含所述肽的生物材料。

根据本发明的另一个方面，提供了所述肽、所述药物组合物或所述生物材料对于骨组织再生治疗的用途。

根据本发明的另一个方面，提供了骨组织再生治疗方法，所述方法包括将所述肽、所述药物组合物或所述生物材料给予或移植至需要骨组织再生治疗的患者。

【附图说明】

从以下详细描述结合附图将更清楚地理解本发明的上述及其他目标、特征及其他优点，其中：

图1示出了由SEQ ID NO:1-6所示的氨基酸序列所表示的肽在顶盖蛋白7蛋白上的位置；

图2示出了HPLC和质量分析的结果，以鉴定由SEQ ID NO:1-6所示的氨基酸序列所表示的肽的固相化学合成的结果；

图3示出了MTT测定的结果，以评估由SEQ ID NO:1-6所示的氨基酸序列所表示的肽的细胞毒性；

图4示出了共焦显微镜观察的结果，以评估由SEQ ID NO:1-6所示的氨基酸序列所表示的肽的细胞渗透性；

图5示出了共焦显微镜观察的结果(a)和定量分析的结果(b)，以评估由SEQ IDNO:4所示的氨基酸序列所表示的肽和顶盖蛋白7蛋白的细胞渗透性；

图6示出了共焦显微镜观察的结果(a)和骨钙蛋白的表达水平的量化的结果(b)，以比较由SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列所表示的肽和顶盖蛋白7蛋白之间的骨分化能力；和

图7a示出了在将含有由SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列所表示的肽或顶盖蛋白7蛋白的骨移植材料移植至兔子的颅骨中之后的骨组织再生效果的鉴定的结果，并且图7b示出了在将含有由SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列所表示的肽或顶盖蛋白7蛋白的骨移植材料移植至兔子的颅骨中之后的骨组织再生效果的组织形态测量的结果。

[具体实施方式]

除非另外定义，本文所用的全部技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员所理解的意义相同的意义。通常，本文所用的命名法在本领域中为公知的并且为通常使用的。

顶盖蛋白7蛋白已知由两个C2结构域和一个vWMA结构域组成，其中C2结构域参与利用胞外基质膜通过胞吞作用的胞内进入，并且通过结合至两个或三个钙离子(Ca²⁺)而有助于蛋白质的磷酸化和蛋白质的结构稳定性两者(Nalefski,Eric A.和JosephJ.Falke.Protein Science 5.12(1996):2375-239；Perestenko,Pavel等人,FEBS journal282.19 2015):3722-3736)。同时，vWMA结构域已知参与胞外基质蛋白质和整联蛋白受体的细胞粘着并且调控胞内蛋白质之间的信号转导和相互作用(Springer,TimothyA.Structure 14.11(2006):1611-1616)。最近，已报道，顶盖蛋白7蛋白促进胞内标志物(牙本质涎磷蛋白(DSP))的表达[Oh,Hyun-Jung等人Biomaterials 37(2015):208-217；Lee,Ji-Hyun等人Biomaterials 32.36(2011):9696-9706)]。此外，本发明人先前鉴定，顶盖蛋白7蛋白增加TAZ和Smad(其为胞内骨分化标志物)的表达。

在研究结果的结论中，本发明人已假设顶盖蛋白7蛋白通过胞内蛋白质之间的相互作用可诱导骨分化，已发现顶盖蛋白7蛋白中具有胞内渗透能力的结构域，已设计由SEQID NO:1-6的氨基酸序列所表示的六种肽，并且已通过比较这些肽的毒性、细胞渗透性和骨再生能力而获得具有最佳效果的肽。

因此，在一个方面，本发明涉及由SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列所表示的肽。

所述肽可具有细胞渗透性和骨组织再生能力的双功能。

在本发明中，所述肽优选地利用肽合成仪通过化学合成来制备，因为相比于顶盖蛋白7蛋白的制备，所述肽可通过基因重组技术以较大量来制备，但本发明不限于此。同时，所述肽可用D型氨基酸及其他化学物质进行修饰以增加在人体内的稳定性或以维持活性结构。

同时，本发明人已通过体外实验鉴定，所述肽促进骨缺陷部分存在的干细胞分化成骨组织，并且使组织再生能力最大化而无细胞毒性。

因此，在一个方面，本发明涉及用于骨组织再生治疗的新颖药物组合物，所述新型药物组合物包含作为活性成分的肽。

如本文所用，术语“治疗”是指用于通过将含有作为活性成分的肽的药物组合物给予至需要骨再生的患者(例如，骨质疏松患者)以促进骨再生而治疗骨疾病的任何动作。

在本发明中，所述组合物可配制为选自口服制剂、注射制剂或局部植凝胶制剂中的一者，但本发明不限于此；并且利用本领域中公知的任何方法可制备成合适制剂(JosephPrice Remington,Remington's Pharmaceutical Science；第17版，MackPublishingCompany,EastonPA)。

在本发明中，局部植入凝胶制剂可包括：i)选自聚乳酸乙醇酸、泊洛沙姆和丙二醇的合成聚合物；或ii)选自胶原蛋白、海藻酸、海藻酸丙二醇酯、硫酸软骨素和壳聚糖的天然聚合物，但不限于此。其中海藻酸为生物兼容性和无毒性天然多糖，其为已证明对于各种应用(诸如药物递送***、细胞植入载体和创伤疗法)安全的已知生物兼容性材料。

在本发明的实施方案中，为将所述肽并入凝胶基材中，所述肽可通过将所述肽与海藻酸溶液混合来制备。所述肽还可添加至肽-海藻酸共轭溶液，所述共轭溶液通过利用交联剂在肽和海藻酸之间形成酯键来制备。

在本发明的一个实施方案中，用于制备局部植入的凝胶制剂的海藻酸的浓度优选地为5％至10％(w/v)，并且更优选地为6％至8％。海藻酸可溶解于三聚磷酸盐溶液中，然后可向其添加硫酸钙以提供钙离子和磷酸根离子，这些离子为骨再生所必需的无机离子。三聚磷酸盐的浓度优选地为1％至10％(w/v)，更优选地为4％至6％。硫酸钙优选地以1mg/mL至20mg/mL的浓度，并且更优选地以2mg/mL至10mg/mL的浓度来添加。

所述组合物优选地以1mg至60mg/1kg需治疗受试者体重的剂量来给予，但本发明不限于此。剂量可根据各种因素而改变，包括体重、年龄、性别、患者的健康状况和饮食、给予时间、给予方法、***率，和疾病的严重度。剂量可由本领域的技术人员考虑到这些因素来确定。

在本发明中，优选地，所述肽以mg的单位用于组合物。本发明肽所来源的顶盖蛋白7蛋白易于被胞内酶降解并且因此在人体中为不稳定的，因为其具有数十kDa的尺寸；不可能通过合成来大量生产，因为其通常合成为重组蛋白质；并且以ug的单位来使用，因为其具有引起身体的免疫反应的副作用。然而，在本发明中，据发现，甚至当以mg的单位使用时，所述肽不具有细胞毒性，大量生产为可能的并且不存在供应肽的困难，因为所述肽可通过胞外合成(诸如化学合成)来获得。特别地，在上文所描述的肽的情况下，当比较20mg和40mg的剂量时，据发现，骨再生能力以20mg的剂量得以最大化。

在本发明中，组合物还可包含至少一种辅助剂，所述至少一种辅助剂选自赋形剂、缓冲剂、抗微生物抗菌剂、表面活性剂、抗氧化剂、张力调节剂、防腐剂、增稠剂和粘度改性剂，但本发明不限于此。每种成分可选自本领域常用的原材料，可合适地被修饰，并且可在本领域可接受的范围内给予。

在本发明中，组合物可作为单独的治疗剂给予或与另一治疗剂组合地给予，并且可与常规治疗剂依序或同时给予。此外，组合物可单独地或与另一骨移植(植入)材料组合地使用。骨移植材料可包括骨矿物质粉末及其多孔块、合成羟磷灰石粉末及其多孔块、磷酸三钙粉末及其多孔块、磷酸一钙粉末及其多孔块等等。

最后，本发明人确认，含有所述肽的骨移植材料至兔子的颅骨缺陷部分的移植得到在兔子的颅骨缺陷部分周围再生新骨的显著效果。

因此，在另一个方面，本发明涉及含有肽的生物材料。

在本发明中，可使用作为本领域所用的骨移植材料和聚合物支架的任何类型和形式的生物材料。优选地，生物材料为用于骨移植的生物材料，所述生物材料含有骨矿物质粉末(来源于自体骨、牛骨或猪骨)及其多孔块、合成羟磷灰石粉末及其多孔块、磷酸三钙粉末及其多孔块、磷酸一钙粉末及其多孔块，或作为主要成分的硅二氧化物(二氧化硅)；骨填充移植材料，所述骨填充移植材料含有作为主要成分的二氧化硅和聚合物的混合物；生物兼容性聚合物，所述生物兼容性材料含有壳聚糖、作为主要成分的细小颗粒、钛；等等。此外，聚合物支架优选地为含有壳聚糖的多孔支架、作为主要成分的生物兼容性聚合物、钛的三维多孔支架等等。此外，优选的是，将用于骨移植的生物材料和支架的表面修饰成使得活性肽可易于粘着。

在本发明中，生物材料优选地选自天然聚合物、骨矿物质和合成聚合物，但不限于此。

在本发明中，所述天然聚合物优选地选自胶原蛋白、海藻酸、丙二醇、海藻酸、硫酸软骨素和壳聚糖，但不限于此。

在本发明中，骨矿物质可优选地i)来源于动物或ii)为化学合成的，但不限于此。

在本发明中，化学合成的骨矿物质优选地为羟磷灰石，但不限于此。

在本发明中，所述合成聚合物优选选自聚乳酸乙醇酸、泊洛沙姆和丙二醇，但不限于此。

在本发明中，生物材料优选地用于骨移植，但不限于此。

在另一个方面，本发明涉及肽、药物组合物或生物材料对于骨组织再生治疗的用途。

在另一个方面，本发明涉及骨组织再生治疗的方法，所述方法包括将肽、药物组合物或生物材料给予或移植至需要骨组织再生治疗的患者。

因为用于骨再生治疗的方法中的药物组合物和给予方法已在上文描述，所以将省略其重复描述以避免过于复杂，并且用于骨再生治疗的通用方法可通过本领域的技术人员的适当实施或修改来利用。

同时，对其给予药物组合物或可对其移植生物材料的受试者可为任何动物，包括人；并且可为例如动物，诸如狗、大鼠或小鼠。

实施例

在下文中，将参考实施例更详细地说明本发明。然而，对于本领域技术人员将显而易见的是，这些实施例仅提供用于说明本发明，并且不应理解为限制本发明的范围。

实施例1：具有细胞渗透和骨组织再生能力两者的双功能肽的设计

六种肽侯选物(其预计具有细胞渗透性和骨再生能力的双功能)选自顶盖蛋白7蛋白的氨基酸序列。六种肽的氨基酸序列以下表1的SEQ ID NO:1-6示出，并且其在顶盖蛋白7蛋白上的位置示于图1中。如下表1所示，SEQ ID NO:1、2、4和5所示的肽各自由10个氨基酸组成；SEQ ID NO:3所示的肽包括具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸的肽和具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸的肽(这两种肽彼此连接)，并且因此由20个氨基酸组成；SEQ ID NO:6所示的肽包括具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸的肽和具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸的肽(这两种肽彼此连接)，并且因此由20个氨基酸组成。

[表1]

SEQ ID NO:1-6所示的肽的氨基酸序列

实施例2：肽的合成

SEQ ID NO:1-6所示的肽利用合成仪通过Fmoc固相化学合成方法从C末端进行合成。与作为封闭基团的fmoc-(9-芴基烷氧基羰基)共轭的Rink树脂(0.075mmol/g，100至200目，1％的DVB交联)用于合成。将50mg的Rink酰胺MBHA树脂添加至合成仪中，所述树脂用DMF进行溶胀，并且20％的哌啶/DMF溶液用于移除Fmoc-基团。将5、10和15当量的0.5M的氨基酸溶液(溶剂：DMF)、1.0M的DIPEA(溶剂：DMF&NMP)和0.5M的HBTU(溶剂：DMF)在氮气氛围下反应一小时至两小时。每当脱保护步骤和偶联步骤完成时，反应溶液用DMF和甲醇洗涤两次。在最后氨基酸偶联之后，Fmoc基团通过脱保护来移除。

通过茚三酮测试方法来确认合成。在确认Fmoc基团移除之后，试剂K裂解混合物以20ml/1g的树脂来添加，摇晃3个小时，然后过滤以分离其中溶解有树脂和肽的混合物。将冷醚添加至过滤溶液以使裂解混合物中的肽沉淀，并且所述肽通过离心进行分离。在以醚洗涤数次并离心之后，试剂K裂解混合物完全移除。获得粗制肽，溶解于蒸馏水中，并且利用液相色谱法进行纯化。将纯化的肽冻干。纯化的肽的分子量利用质谱法来确定。图2示出了关于通过上文所描述的方法合成的SEQ ID NO:1-6的肽的HPLC和质量分析的结果。

实施例3：合成的肽的体外细胞毒性的评估

进行细胞存活力测试以评估上文实施例2所合成的SEQ ID NO:1-6所示的肽的细胞毒性。为此，将牙髓干细胞以9x 10³个细胞/孔的密度接种至Dulbecco’s ModifiedEagle's Medium(Gibco,USA)的96孔聚苯乙烯板的每个孔中，所述板补充有10％的FBS(胎牛血清)和1％的抗菌/抗真菌溶液(Thermo Fisher Scientific,USA)；然后培养24小时。每个孔以各个浓度(50μM,100μM,200μM,400μM,500μM,800μM,1000μM和2000μM)的SEQ ID NO:1-6所示的肽进行处理。在24小时(1天)、48小时(2天)和72小时(3天)之后，进行MTT测定以确认肽的细胞毒性。对于MTT测定，培养基在用肽处理之后24小时、48小时、72小时移除，并且每个孔然后用180μl的DMEM培养基和20μl的MTT溶液的混合物进行处理，然后进一步培养1小时。一小时后，移除混合溶液，每个孔用200μl的二甲基亚砜(DMSO)进行处理，然后将混合溶液转移至新96孔板中，并且测量其细胞毒性。三次实验的所有数值表示为平均值±标准偏差(SD)，并且测量数值示于图3中。

因此，据确认，SEQ ID NO:5所示的肽和SEQ ID NO:6所示的肽为胞内毒性的，并且SEQ ID NO:1-4所示的肽不具有细胞毒性，即使将它们均培养3天。

实施例4：合成的肽的细胞渗透性的确认

为确认实施例2所合成的SEQ ID NO:1-6所示的肽的细胞渗透性，将异硫氰酸荧光素(FITC)附着至每个肽的N末端。将牙髓干细胞以3x 10⁴个细胞的密度接种至4孔室中，并且在DMEM培养基中培养24小时以用于细胞稳定。24小时之后，将细胞用各个浓度(50μM,100μM,200μM,500μM,1000μM)的经FITC标记的肽处理30分钟。细胞用100ng/ml的顶盖蛋白7蛋白处理30分钟，以与所述肽比较其细胞渗透性。然后，为比较这些肽或蛋白质的胞内渗透行为，每个孔用4％的多聚甲醛进行处理，固定于室温下10分钟，用0.5％的Triton-X 100进行处理，并且在室温下培养15分钟。然后，将细胞用含有3％的牛血清白蛋白(BSA)的缓冲溶液(PBS)封闭30分钟。在顶盖蛋白7蛋白的情况下，将CPNE7一抗以1:100的比率在含有1％的牛血清白蛋白的缓冲溶液(PBS)中稀释并且在4℃下反应16小时。将异硫氰酸荧光素(FITC)共轭的二抗以1:200的比率稀释并且在室温下反应1小时。最后，核染色染料(Hoechst 33342，蓝色)在室温下处理10分钟并且用缓冲溶液(PBS)洗涤，并且其荧光强度利用共焦扫描显微镜(IX 70,Olympus Co,Tokyo,Japan)进行测量以确定表达程度。所有数值表示为在三个不同区域所测量的荧光强度的平均值±SD，并且与对照组(未处理，NT)相比较(*P<0.05)。

因此，如图4所示，发现SEQ ID NO:1所示的肽甚至在最高浓度(1000uM)下不具有荧光表达，并且因此不具有细胞渗透能力。另一方面，发现SEQ ID NO:2所示的肽甚至在1000uM下具有弱荧光，但不具有强荧光。然而，SEQ ID NO:4所示的肽甚至当在100μM下处理时具有荧光，这意味着所述肽具有最佳细胞渗透效率。接下来，发现SEQ ID NO:3所示的肽和SEQ ID NO:6所示的肽依序具有相对优异的细胞渗透效率。

同时，当利用共焦显微镜将SEQ ID NO:4所示的肽的细胞渗透能力与顶盖蛋白7蛋白的细胞渗透能力相比较时，发现SEQ ID NO:4所示的肽相比于顶盖蛋白7蛋白具有更好细胞渗透性。作为荧光强度的量化的结果，SEQ ID NO:4所示的肽表现出相比于顶盖蛋白7蛋白的强荧光强度，这表明SEQ ID NO:4所示的肽相比于所述肽所来源的顶盖蛋白7蛋白表现出改善的细胞渗透性(图5)。

实施例5：SEQ ID NO:4所示的肽和顶盖蛋白7蛋白之间的骨分化能力的比较

为确认SEQ ID NO:4所示的肽(在实施例4中所述肽确定具有最佳细胞渗透功能)和顶盖蛋白7蛋白的骨分化能力，评估牙髓干细胞(DPSC)中骨钙蛋白的表达差异。

为此，将1x 10⁵个DPSC在24孔板中悬浮于50μl的培养基(Dulbecco's ModifiedEagle's Medium,Gibco,USA)，所述培养基补充有10％的FBS(胎牛血清)和1％的抗菌抗真菌溶液(Thermo Fisher Scientific,USA)。将细胞培养24小时然后分别用浓度为200μM和500μM的SEQ ID NO:4所示的肽和浓度为100ng/ml的顶盖蛋白7蛋白进行处理，同时用分化基础培养基(成骨)(Lonza,USA)替换培养基18天，所述分化基础培养基补充有补充剂(hMSCOsteogenic SingleQuots,Lonza,USA)。然后，骨钙蛋白的表达水平利用免疫荧光(IF)技术进行比较。为此，将细胞用4％的多聚甲醛进行处理，固定于室温下10分钟，用0.5％的Triton-X 100进行处理，并且在室温下培养15分钟。然后，将细胞用含有3％的牛血清白蛋白(BSA)的缓冲溶液(PBS)封闭30分钟。将骨钙蛋白的一抗以1:100的比率在含有1％的牛血清白蛋白的缓冲溶液(PBS)中稀释并且在4℃下反应16小时。将异硫氰酸荧光素(FITC)共轭的二抗以1:200的比率稀释并且在室温下反应1小时。最后，将细胞用核染色染料(Hoechst33342，蓝色)在室温下处理10分钟并用缓冲溶液(PBS)洗涤，并且骨钙蛋白的表达水平用共焦扫描显微镜(IX 70,Olympus Co,Tokyo,Japan)来确定。所有数值表示为在三个不同区域所测量的荧光强度的平均值±SD，并且与对照组(未处理，NT)相比较(*P<0.05)。

因此，如图6所示，当骨钙蛋白的表达程度作为荧光强度用共焦显微镜确定时，相比于用100mg/ml的肽处理的组，用200μM和500μM的SEQ ID NO:4所示的肽处理的组具有相对更强荧光强度。因此，发现SEQ ID NO:4所示的肽在骨分化能力方面优于顶盖蛋白7蛋白。

实施例6：兔子的SEQ ID NO:4所示的肽和顶盖蛋白7蛋白的骨再生能力的评估

将20mg和40mg的SEQ ID NO:4所示的肽溶解于100μL的纯化水中，并且将溶液添加至0.1g的骨移植材料，使之在4℃下静置24小时并冻干。顶盖蛋白7蛋白以与上文相同的方式用作对照组，并且以100μg和200μg的量并入0.1g的骨移植材料。直径为8mm的缺陷部分形成于新西兰白兔(家兔)的颅骨中，并且每个缺陷部分植入0.1g的骨移植材料。骨膜和皮肤双重缝合。所述动物在移植后3周处死，将样本固定在***溶液中并包埋于组织中以获得厚度为20μm的样本。所制备样本以碱性品红和甲苯胺蓝进行染色以制备未脱钙样品。所述样品以光学显微镜进行成像并且进行组织学分析。在三个不同样品中所有数值表示为所测量的区域的平均值±SD(标准偏差)并且与顶盖蛋白7蛋白相比较(*P<0.05)。

因此，如图7a所示，相比于含有顶盖蛋白7蛋白的骨移植材料，含有SEQ ID NO:4所示的肽的骨移植材料具有再生新骨的优异效果(基于颅骨缺陷部分)。另外，如图7b所示，当进行组织形态分析时，发现SEQ ID NO:4所示的肽相比于顶盖蛋白7蛋白具有显著更广的骨再生区域。这些结果表明，SEQ ID NO:4所示的肽相比于顶盖蛋白7蛋白具有优异骨再生效果。

尽管本发明已参考具体配置进行详细地描述，但是本领域的技术人员将理解，所述描述出于说明性目的提供为优选实施方式，并且不应理解为限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围由附属权利要求及其等同物限定。

【工业适用性】

根据本发明的肽由于优异骨再生能力而用于需要骨再生的疾病的治疗，诸如骨质疏松；并且由于其固有细胞渗透能力而无需附着额外肽或添加其他试剂以用于肽的细胞渗透；由于其固有细胞渗透能力而在短时间内促进细胞迁移、增殖和分化；并且最终证实了有效骨再生效果。因此，有利地，根据本发明的肽可容易地应用于各种手术再生治疗，包括矫形手术，并且可缩短治疗周期。

【序列表自由文本】

附有电子文件。

序列表

<110> 首尔大学校产学协力团

纳米智能生物医学工程有限公司

<120> 具有细胞渗透性和骨组织再生能力的双功能新颖肽及其用途

<130> PF-B2214

<140> PCT/KR2017/015588

<141> 2017-12-27

<150> KR 10-2016-0180121

<151> 2016-12-27

<160> 6

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有细胞渗透性和骨组织再生能力的双功能候选肽

<400> 1

Ser Thr Thr Phe Glu Glu Met Gln Lys Ala

1 5 10

<210> 2

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有细胞渗透性和骨组织再生能力的双功能候选肽

<400> 2

Phe Glu Glu Gly Gln Ala Gln Trp Asp Cys

1 5 10

<210> 3

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有细胞渗透性和骨组织再生能力的双功能候选肽

<400> 3

Phe Glu Glu Gly Gln Ala Gln Trp Asp Cys Val Asn Pro Lys Tyr Lys

1 5 10 15

Gln Lys Arg Arg

20

<210> 4

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有细胞渗透性和骨组织再生能力的双功能肽

<400> 4

Val Asn Pro Lys Tyr Lys Gln Lys Arg Arg

1 5 10

<210> 5

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有细胞渗透性和骨组织再生能力的双功能候选肽

<400> 5

Ser Tyr Lys Asn Ser Gly Val Val Val Leu

1 5 10

<210> 6

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有细胞渗透性和骨组织再生能力的双功能候选肽

<400> 6

Val Asn Pro Lys Tyr Lys Gln Lys Arg Arg Ser Tyr Lys Asn Ser Gly

1 5 10 15

Val Val Val Leu

20

Claims

1.一种由SEQ ID NO:4的氨基酸序列表示的肽。

2.权利要求1的肽，其中所述肽具有细胞渗透性和骨组织再生能力的双功能。

3.一种用于骨组织再生治疗的药物组合物，其包含作为活性成分的权利要求1的肽。

4.权利要求3的组合物，其中所述组合物配制为选自以下中的一种：口服制剂、注射制剂和局部植入凝胶制剂。

5.权利要求4的组合物，其中所述局部植入凝胶制剂包含：

i)选自聚乳酸乙醇酸、泊洛沙姆和丙二醇的合成聚合物；或

ii)选自胶原蛋白、海藻酸、海藻酸丙二醇酯、硫酸软骨素和壳聚糖的天然聚合物。

6.权利要求3的组合物，其中所述组合物以1mg至60mg/1kg需治疗受试者体重的剂量来给予。

7.一种生物材料，其包含权利要求1的肽。

8.权利要求7的生物材料，其中所述生物材料选自天然聚合物、骨矿物质和合成聚合物。

9.权利要求8的生物材料，其中所述天然聚合物选自胶原蛋白、海藻酸、丙二醇、硫酸软骨素和壳聚糖。

10.权利要求8的生物材料，其中所述骨矿物质i)来源于动物或ii)为化学合成的。

11.权利要求10的生物材料，其中所述化学合成的骨矿物质为羟磷灰石。

12.权利要求8的生物材料，其中所述合成聚合物选自聚乳酸乙醇酸、泊洛沙姆和丙二醇。

13.权利要求7的生物材料，其中所述生物材料用于骨移植。