JPS61162170A - 構成性クレアチンアミジノヒドロラーゼを形成する微生物及びその製法 - Google Patents
構成性クレアチンアミジノヒドロラーゼを形成する微生物及びその製法Info
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- JPS61162170A JPS61162170A JP60292383A JP29238385A JPS61162170A JP S61162170 A JPS61162170 A JP S61162170A JP 60292383 A JP60292383 A JP 60292383A JP 29238385 A JP29238385 A JP 29238385A JP S61162170 A JPS61162170 A JP S61162170A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は構成性クレアチンアミジノヒドロラーゼを形成
する微生物又はプラスミド並びにその製法に関する。
する微生物又はプラスミド並びにその製法に関する。
従来の技術
酵素クレアチンアミジノ−ヒドロラーゼ（ＩＣ３，５，
３，３）は、クレアチニン測定のために工業的に使用さ
れている。従って、これは、特に血清中又は尿中のクレ
アチニン含量が、健康な組織に現れる値 とは異る値で
現われる腎臓疾患の診断のための臨床分析で使用される
。
３，３）は、クレアチニン測定のために工業的に使用さ
れている。従って、これは、特に血清中又は尿中のクレ
アチニン含量が、健康な組織に現れる値 とは異る値で
現われる腎臓疾患の診断のための臨床分析で使用される
。
例えばクーレアチンによる誘導下に１後処理に耐える量
でクレアチンアミジノ−ヒドロラーゼを製造することが
できる微生物例えばシュードモナス属菌が公知であるが
、この酵素の取得可能な収率及び単離の経費は、なおこ
の酵素の工業的使用のためには制限要因となっている。
でクレアチンアミジノ−ヒドロラーゼを製造することが
できる微生物例えばシュードモナス属菌が公知であるが
、この酵素の取得可能な収率及び単離の経費は、なおこ
の酵素の工業的使用のためには制限要因となっている。
発明が解決しようとする問題点
従って、この欠点を有せず、殊に、クレアチンアミジノ
ヒドロラーゼを構成的に形成する即ちこのために誘導を
必要とすることなしに、かつこの際に従来公知のクレア
チンアミジノ−ヒドロラーゼ形成体よりも著るしく良好
な収率を示す微生物が必要である。更に、本発明の目的
は、遺伝子工学的方法で、良好に培養でき、それから酵
素を経費的に好適に単離することのできる宿主微生物中
に、所定酵素の合成能力に関する遺伝子情報が存在する
ような微生物を製造することである。
ヒドロラーゼを構成的に形成する即ちこのために誘導を
必要とすることなしに、かつこの際に従来公知のクレア
チンアミジノ−ヒドロラーゼ形成体よりも著るしく良好
な収率を示す微生物が必要である。更に、本発明の目的
は、遺伝子工学的方法で、良好に培養でき、それから酵
素を経費的に好適に単離することのできる宿主微生物中
に、所定酵素の合成能力に関する遺伝子情報が存在する
ような微生物を製造することである。
問題点を解決する手段
本発明によればこの課題は解決される。従って、本発明
の目的は、構成性クレアチンアミジノヒドロラーゼを形
成する特徴を有するＥ・コリー又はシェードモナス・プ
チダに属する微生物である。Ｅ・コリーに属する微生物
に関して、この酵素の誘導性形成も従来は認められて〜
・なかった。シェードそナス・プチダにおいては、クレ
アチンアミジノ−ヒドロラーゼの形成に関する情報が存
在するが、この酵素は誘導下にのみ、かつ、かなり低い
活性で形成される。
の目的は、構成性クレアチンアミジノヒドロラーゼを形
成する特徴を有するＥ・コリー又はシェードモナス・プ
チダに属する微生物である。Ｅ・コリーに属する微生物
に関して、この酵素の誘導性形成も従来は認められて〜
・なかった。シェードそナス・プチダにおいては、クレ
アチンアミジノ−ヒドロラーゼの形成に関する情報が存
在するが、この酵素は誘導下にのみ、かつ、かなり低い
活性で形成される。
本発明によるＥ・コリーに属する有利な微生物は、シラ
スミｋＷ ｐＢＴ ２ ａ −１ｔ″有する。この種の
微生物は、蛋白質のその全合成能力の５０チまでをクレ
アチンアミジノヒドロラーゼの形成のために調達するこ
とができる。
スミｋＷ ｐＢＴ ２ ａ −１ｔ″有する。この種の
微生物は、蛋白質のその全合成能力の５０チまでをクレ
アチンアミジノヒドロラーゼの形成のために調達するこ
とができる。
本発明によるも５１つの有利な微生物は、プラスミド−
ｐＢＴ ５０６．１６ を有するＥ−コリー又はシュー
ドモナス・プチダに属する微生物である。この種の微生
物は、同様に非常に高い合成能力を有する構成性クレア
チンアミジノヒドロラーゼ形成体である。
ｐＢＴ ５０６．１６ を有するＥ−コリー又はシュー
ドモナス・プチダに属する微生物である。この種の微生
物は、同様に非常に高い合成能力を有する構成性クレア
チンアミジノヒドロラーゼ形成体である。
本発明のもう１つの目的は、プラスミドｐＢＴ２ａ−１
ＣＤ８Ｍ３１４８Ｆ）及びｐＢＩｉ１３０６．１６（Ｄ
ＢＭ ５１４９ ｐ ）である。最初に記載のプラスミ
ドは特に高い合成能力をＥ・コリー属の微生物に与え、
第２番目に記載のプラスミｒは、Ｅ・コリー内でもシュ
ードモナス・プチダ内でも所望酵素の高い表現を与える
利点を有する。
ＣＤ８Ｍ３１４８Ｆ）及びｐＢＩｉ１３０６．１６（Ｄ
ＢＭ ５１４９ ｐ ）である。最初に記載のプラスミ
ドは特に高い合成能力をＥ・コリー属の微生物に与え、
第２番目に記載のプラスミｒは、Ｅ・コリー内でもシュ
ードモナス・プチダ内でも所望酵素の高い表現を与える
利点を有する。
前記のように、本発明による微生物もしくはプラスミド
は、遺伝子工学的方法で得ることができる。従って、本
発明による構成性クレアチンアミジノヒドロラーゼを形
成する前記種馬の微生物の製法は、シェードモナス・プ
チダからのＤＮＡを ａ）ＥｃｏＲｌで制限的に消化させて５．１３Ｋｂ−断
片を得るか又は ｂ）ＫｃｏＲｌ及びＰｖｕＩＩで切断して２．２に１１
１−断片を得、 ａ）又はｂ）で得た断片をその又は同じ制限エンドヌク
レアーゼで切断されたベクターにクローン化し、これを
選択したベクターにとって好適なＥ・コリー又はＰ・プ
チダ株中に移し、構成性クレアチンアミジノヒドロラー
ゼを形成するクローンを単離することよりなる。ここで
Ｋｌ）は、「キロ塩基対」即ち１０００ヌクレオチド塩
基対である。
は、遺伝子工学的方法で得ることができる。従って、本
発明による構成性クレアチンアミジノヒドロラーゼを形
成する前記種馬の微生物の製法は、シェードモナス・プ
チダからのＤＮＡを ａ）ＥｃｏＲｌで制限的に消化させて５．１３Ｋｂ−断
片を得るか又は ｂ）ＫｃｏＲｌ及びＰｖｕＩＩで切断して２．２に１１
１−断片を得、 ａ）又はｂ）で得た断片をその又は同じ制限エンドヌク
レアーゼで切断されたベクターにクローン化し、これを
選択したベクターにとって好適なＥ・コリー又はＰ・プ
チダ株中に移し、構成性クレアチンアミジノヒドロラー
ゼを形成するクローンを単離することよりなる。ここで
Ｋｌ）は、「キロ塩基対」即ち１０００ヌクレオチド塩
基対である。
クレアチンアミジノ−ヒドロラーゼの表現のための情報
は、５−８ ｘｂ−断片もしくはその２．２Ｋｍ）のサ
ブ７ラグメント（これは前記方法で、制限エンドヌクレ
アーゼ’Ｅｃｏ Ｒｌ単独で又はＰｖｕ ｎと一緒にな
つ九Ｂｃｏ Ｒｌで切り出される）上に存在する。それ
ぞれの７ラグメントは、遺伝子工学に公知の方法により
、適合末端を得るために同じ制限エンｒヌクレアーゼで
切断されたベクターにクローン化される。有利でない場
合にも、Ｅ・コリー又はシュードモナス・プチダに好適
なベクターを、その切断位置でシュードモナス・プチダ
からの１個又は前記のＤＮＡ −断片で補修されたベク
ターの修復能力及びその形質転換性が宿主菌株内で保持
されるように配置されている他の制限エンドヌクレアー
ゼで切断することもできる。ベクターとして、有利にプ
ラスミドｐＢＲ３２２を使用し、これは双方のシュード
モナス・プチダＤＮＡフラグメ／トの１個のＥ・コリー
枕内への挿入により形質転換する。商業にとって、プラ
スミドｐＢＲ５２２及びその誘導体で非常に良好に形質
転換できる多くのＥ・コリー株は公知である。他の有利
なベクター（ファージ・シャロン（Ｐｈａｇｅ ｃｈａ
ｒｏｎ ）１０、ｐＢＲ３２２並ひにその誘導体は同様
である）はベクター市場で入手される。
は、５−８ ｘｂ−断片もしくはその２．２Ｋｍ）のサ
ブ７ラグメント（これは前記方法で、制限エンドヌクレ
アーゼ’Ｅｃｏ Ｒｌ単独で又はＰｖｕ ｎと一緒にな
つ九Ｂｃｏ Ｒｌで切り出される）上に存在する。それ
ぞれの７ラグメントは、遺伝子工学に公知の方法により
、適合末端を得るために同じ制限エンｒヌクレアーゼで
切断されたベクターにクローン化される。有利でない場
合にも、Ｅ・コリー又はシュードモナス・プチダに好適
なベクターを、その切断位置でシュードモナス・プチダ
からの１個又は前記のＤＮＡ −断片で補修されたベク
ターの修復能力及びその形質転換性が宿主菌株内で保持
されるように配置されている他の制限エンドヌクレアー
ゼで切断することもできる。ベクターとして、有利にプ
ラスミドｐＢＲ３２２を使用し、これは双方のシュード
モナス・プチダＤＮＡフラグメ／トの１個のＥ・コリー
枕内への挿入により形質転換する。商業にとって、プラ
スミドｐＢＲ５２２及びその誘導体で非常に良好に形質
転換できる多くのＥ・コリー株は公知である。他の有利
なベクター（ファージ・シャロン（Ｐｈａｇｅ ｃｈａ
ｒｏｎ ）１０、ｐＢＲ３２２並ひにその誘導体は同様
である）はベクター市場で入手される。
ｐＢＲ３’ｌ ２ をＫｃｏ Ｒ１及びＰｖｕ ｌで切
断し、この際に生じる２、３ Ｋｂ−フラグメントを単
離し、Ｐ・プチダからの２．２Ｋｂ Ｋｃｏ Ｒｌ −
Ｐｖｕ １フラグメントと連結させｐＢＴ ３−２と称
される新規プラスミドを形成させ、これをｍ・コリー中
に移す方法がより有利である。こうしてＥ・コリーＫｌ
２ｇｎ８６５４（ＤｓＭ３１４４）が得られる。
断し、この際に生じる２、３ Ｋｂ−フラグメントを単
離し、Ｐ・プチダからの２．２Ｋｂ Ｋｃｏ Ｒｌ −
Ｐｖｕ １フラグメントと連結させｐＢＴ ３−２と称
される新規プラスミドを形成させ、これをｍ・コリー中
に移す方法がより有利である。こうしてＥ・コリーＫｌ
２ｇｎ８６５４（ＤｓＭ３１４４）が得られる。
前記方法でｐＢＲ５２２からの誘導体で形質転換された
Ｅ・コリー株は、そのアンピシリン耐性に基づき、非常
に良好に選択できる。これらはアンピシリン耐性であり
、かつクレアチンアミジノヒドロラーゼ形成体であるの
で、形質転換されなかった細胞は生長させることはでき
ず、生長した細胞の下で、所望の酵素を形成するものは
後に詳述する方法で容易に取り出すことができる。
Ｅ・コリー株は、そのアンピシリン耐性に基づき、非常
に良好に選択できる。これらはアンピシリン耐性であり
、かつクレアチンアミジノヒドロラーゼ形成体であるの
で、形質転換されなかった細胞は生長させることはでき
ず、生長した細胞の下で、所望の酵素を形成するものは
後に詳述する方法で容易に取り出すことができる。
本発明により、ｐＢＴ３−２を有する形質転換されたＥ
・コリー細胞をプラスミＹの増幅の時点にニトロソグア
ニジンで処理し、その後、このプラスミドをこれから単
離し、改めてＥ・コリー細胞中に移し、このサイクルを
場合により繰り返し、この際に得られる特に優れたクレ
アチンアミジノーヒドロラーゼ活性を有する微生
゛物クローンから、同様に本発明の目的物であるノラ
スミ′ドｐＢＴ ２ ａ −１（ＤＢＭ ３１４８ Ｐ
）を得る際に、特に良好な結果が得られる。前記のよ
うに、プラスミドを有するＥ・コリー細胞は、全蛋白質
形成に対して５０％までのクレアチンアミジノヒＦロラ
ーゼを生産する。
・コリー細胞をプラスミＹの増幅の時点にニトロソグア
ニジンで処理し、その後、このプラスミドをこれから単
離し、改めてＥ・コリー細胞中に移し、このサイクルを
場合により繰り返し、この際に得られる特に優れたクレ
アチンアミジノーヒドロラーゼ活性を有する微生
゛物クローンから、同様に本発明の目的物であるノラ
スミ′ドｐＢＴ ２ ａ −１（ＤＢＭ ３１４８ Ｐ
）を得る際に、特に良好な結果が得られる。前記のよ
うに、プラスミドを有するＥ・コリー細胞は、全蛋白質
形成に対して５０％までのクレアチンアミジノヒＦロラ
ーゼを生産する。
クレアチンアミジノーヒｒロラーゼの特に高い活性を有
する生じた微生物クローｙを同定することのできるスク
リーニング系が得られ、この際、この種のクローンを、
クレアチン、サルコシンオキシダーゼ、ペルオキシダー
ゼ及びＨ，Ｏ，−呈色指示薬を溶解含有するアガロース
プレートと接触させる。次いで、強い酵素形成に相応す
る最も強い呈色を示すクローンを増殖のために選択する
。Ｈ３Ｏ２−呈色指示薬系としては、４−アミノアンチ
ピリンをＮ−エチル−Ｎ−（スルホエチル）−３−メチ
ルアニリン塩有利にカリウム塩と組合せて使用するのが
有利である。
する生じた微生物クローｙを同定することのできるスク
リーニング系が得られ、この際、この種のクローンを、
クレアチン、サルコシンオキシダーゼ、ペルオキシダー
ゼ及びＨ，Ｏ，−呈色指示薬を溶解含有するアガロース
プレートと接触させる。次いで、強い酵素形成に相応す
る最も強い呈色を示すクローンを増殖のために選択する
。Ｈ３Ｏ２−呈色指示薬系としては、４−アミノアンチ
ピリンをＮ−エチル−Ｎ−（スルホエチル）−３−メチ
ルアニリン塩有利にカリウム塩と組合せて使用するのが
有利である。
本発明の方法では、Ｅ・コリー中での酵素の表現だけで
なく、Ｐ・プチダ中でも好適であるプラスミドも製造で
きる。このために、ｐＢ’Ｉ’２ａ−１から制限エンド
ヌクレアーゼｐｖｕ ｌ及びｐｖｕ ｕ を用いる切断
により２．８に１）−フラグメントを得、これ金、他の
、ｐＢ’Ｉ’ ３０６．１からＰｖｕ Ｉ及びＳｍａＩ
ｔ用いる切断により得られる１ＱＫ１：＋−フラグメン
トと結紮するのが有利である。こうして、プラスミドｐ
Ｂ’ｒ ３０６．１６（ｐｓＭ３１４９Ｐ）が得られ、
これは、Ｅ・コリー中でもＰ−プチダ中でも構成性クレ
アチンアミジノ−ヒドロラーゼ形成作用をする。
なく、Ｐ・プチダ中でも好適であるプラスミドも製造で
きる。このために、ｐＢ’Ｉ’２ａ−１から制限エンド
ヌクレアーゼｐｖｕ ｌ及びｐｖｕ ｕ を用いる切断
により２．８に１）−フラグメントを得、これ金、他の
、ｐＢ’Ｉ’ ３０６．１からＰｖｕ Ｉ及びＳｍａＩ
ｔ用いる切断により得られる１ＱＫ１：＋−フラグメン
トと結紮するのが有利である。こうして、プラスミドｐ
Ｂ’ｒ ３０６．１６（ｐｓＭ３１４９Ｐ）が得られ、
これは、Ｅ・コリー中でもＰ−プチダ中でも構成性クレ
アチンアミジノ−ヒドロラーゼ形成作用をする。
本発明により、酵素形成の著るしい増加が達成されるこ
とは意想外である。即ち、特定遺伝子のコぜ一数を高め
ることによるＤＮＡ組換え法を使用することにより高め
られた遺伝子表現が得られることは既に多く報告された
。しかしながら、これから、シュードモナスからの遺伝
子をＥ・コリー中に移すことによりＷ１実に遺伝子表現
を高めることに由来することはできない。
とは意想外である。即ち、特定遺伝子のコぜ一数を高め
ることによるＤＮＡ組換え法を使用することにより高め
られた遺伝子表現が得られることは既に多く報告された
。しかしながら、これから、シュードモナスからの遺伝
子をＥ・コリー中に移すことによりＷ１実に遺伝子表現
を高めることに由来することはできない。
実際に、ＤＮＡ−組換えによりシュードモナスからＥ・
コリー中に移された遺伝子の多くに関して、遺伝子表現
の減少すら報告されている〔例えばスタニシツシュ（８
ｔａｎｉｓｉｓｃｈ ）及びオルテイツ（０ｒｔｉｚ
）による。ジャーナル・オプ・ジェネラル・マイクロビ
オロジイ（Ｊ、Ｇｅｎ。
コリー中に移された遺伝子の多くに関して、遺伝子表現
の減少すら報告されている〔例えばスタニシツシュ（８
ｔａｎｉｓｉｓｃｈ ）及びオルテイツ（０ｒｔｉｚ
）による。ジャーナル・オプ・ジェネラル・マイクロビ
オロジイ（Ｊ、Ｇｅｎ。
ＭｉＣｒｏｂｉｏｌ、 ） １ ９７６．９４．２
８１〜２８９、ナカデワ（Ｎａｋａｚａｖａ ）等によ
るＪ、バクテリオロジイ（Ｊ、 Ｂａｃｔ、ｏｒｉｏｌ
、 ） １９７８． １３４．２７０〜２７７、リボン
（Ｒｌｂｂｏｎｓ ）等によるツク・ゲン・マイクロピ
オロ、 （８ｏｃ、 Ｇｅ瓜Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、
Ｑｕａｒｔ、 ） １９７８．６．２４〜２５．７
ランクリン（Ｆｒａｎｋｌｉｎ ）等によるマイクロビ
オール・デグラデーション・オデ・キセノビオティクス
・アンド・レカリシトラント・コンパウンダ（Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ Ｄｅｇｒａ（ｌａｔ＋１ｏｎｏｆ Ｘｅｎ
ｏｂｉｏｔｉｃｓ ａｎｄ Ｒｅｃａｌｉｃｉｔｒａｎ
ｔ Ｃｏｍｐｏｕｎｌｇ。
８１〜２８９、ナカデワ（Ｎａｋａｚａｖａ ）等によ
るＪ、バクテリオロジイ（Ｊ、 Ｂａｃｔ、ｏｒｉｏｌ
、 ） １９７８． １３４．２７０〜２７７、リボン
（Ｒｌｂｂｏｎｓ ）等によるツク・ゲン・マイクロピ
オロ、 （８ｏｃ、 Ｇｅ瓜Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、
Ｑｕａｒｔ、 ） １９７８．６．２４〜２５．７
ランクリン（Ｆｒａｎｋｌｉｎ ）等によるマイクロビ
オール・デグラデーション・オデ・キセノビオティクス
・アンド・レカリシトラント・コンパウンダ（Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ Ｄｅｇｒａ（ｌａｔ＋１ｏｎｏｆ Ｘｅｎ
ｏｂｉｏｔｉｃｓ ａｎｄ Ｒｅｃａｌｉｃｉｔｒａｎ
ｔ Ｃｏｍｐｏｕｎｌｇ。
ＬｅｉＳｉｎｇｅｒ Ｃｏｏｋ、 Ｈｉｔｔ＋ｅｒ ｕ
ｎｌ Ｎｅｕｅｓｃｈ Ｈｒｓｇｂ、）１９８１．１０
９〜１３０頁参照〕。最終的に酵素活性蛋白質を形成す
るまで進行すべき種々の生物学的合成工程を考察すると
、この種の改良は予期できないことが判る。
ｎｌ Ｎｅｕｅｓｃｈ Ｈｒｓｇｂ、）１９８１．１０
９〜１３０頁参照〕。最終的に酵素活性蛋白質を形成す
るまで進行すべき種々の生物学的合成工程を考察すると
、この種の改良は予期できないことが判る。
蛋白質に関する情報は、デツキシリボン核酸（ＤＮＡ）
内に含有されている。このＤＮＡは、ＤＮＡ−依存ＲＮ
Ａ−ポリメラーゼによりｍＲＮＡ （メツセンジャーＲ
ＮＡ ）にｓｔｉ訳され机このように合成されたｍＲＮ
Ａは蛋白質内のりざソームの所で翻訳され、この際、そ
れぞれ３個の核酸（トリプレット又はコドン）は、遺伝
子コドンの法則に従って特定のアミノ醗の形成を決定す
る。
内に含有されている。このＤＮＡは、ＤＮＡ−依存ＲＮ
Ａ−ポリメラーゼによりｍＲＮＡ （メツセンジャーＲ
ＮＡ ）にｓｔｉ訳され机このように合成されたｍＲＮ
Ａは蛋白質内のりざソームの所で翻訳され、この際、そ
れぞれ３個の核酸（トリプレット又はコドン）は、遺伝
子コドンの法則に従って特定のアミノ醗の形成を決定す
る。
ＤＮＡ一平面上の制御範囲は、どの位置でＤＮＡの１本
の鎖がｍＲＮＡに翻訳されるか（プロモーター配列）も
しくはどの位置でｍＲＮＡの合成が停止されるか（末端
配列）を決める。
の鎖がｍＲＮＡに翻訳されるか（プロモーター配列）も
しくはどの位置でｍＲＮＡの合成が停止されるか（末端
配列）を決める。
同様に蛋白質合成（翻訳）の平面上の停止及び開始配列
は、公知である。この際、一般に、ＡＴＧ （これはで
−メチオニンに翻訳される）は、蛋白質の開始を、かつ
例えばＴＡＡ又はＴＡ（）は翻訳の終りを決定する。
は、公知である。この際、一般に、ＡＴＧ （これはで
−メチオニンに翻訳される）は、蛋白質の開始を、かつ
例えばＴＡＡ又はＴＡ（）は翻訳の終りを決定する。
ポリペプチド配列の表現の程度は、多くのファクターに
依存し、例えば特にプロモーター配列の品質、ｍＲＮＡ
−安定性、ｍＲＮＡの２次及び３次構造、′りがノーム
結合位置の品質、開始コドン（ＡＴ（））からのりがソ
ーム結合位置の距離、リポソーム結合位置と開始コドン
（ＡＴＧ）との間のヌクレオチド配列及び転写及び翻訳
面に対する有効停止信号の存在に依存する。遺伝子及び
これによりコーＹされた蛋白質の１次構造の正調な知識
なしに、前記の遺伝子表現の調節工程を把握することは
できない。本発明以前この正確な知識は存在しなかつ九
ので、本発明による微生物及びプラスミドの改良された
合成能力は予期できなかった。
依存し、例えば特にプロモーター配列の品質、ｍＲＮＡ
−安定性、ｍＲＮＡの２次及び３次構造、′りがノーム
結合位置の品質、開始コドン（ＡＴ（））からのりがソ
ーム結合位置の距離、リポソーム結合位置と開始コドン
（ＡＴＧ）との間のヌクレオチド配列及び転写及び翻訳
面に対する有効停止信号の存在に依存する。遺伝子及び
これによりコーＹされた蛋白質の１次構造の正調な知識
なしに、前記の遺伝子表現の調節工程を把握することは
できない。本発明以前この正確な知識は存在しなかつ九
ので、本発明による微生物及びプラスミドの改良された
合成能力は予期できなかった。
本発明の範囲では、Ｅ・コリーとして、Ｅ・コＩＪ−に
１２−株の有利な誘導体を使用する。
１２−株の有利な誘導体を使用する。
そのうち、特に、例えば次のものが有効に使用された：
Ｅ・コリーｘ１２、ｗ３３５０［ｐ・チオライス（Ｔｈ
１ｏｌｌａｉｓ ）のｔ、ｈ１．ｇａｌｋ、 ｇａｌＴ
。
１ｏｌｌａｉｓ ）のｔ、ｈ１．ｇａｌｋ、 ｇａｌＴ
。
ｒｐｓｌ、］（Ｄ８Ｍ３１４１）
Ｅ・コリーに１２、ＥＤ ８６５４ （Ｋ・ムレイ（Ｍ
ｕｒｒａｙ ）のｔ＋ｒｐ Ｒ、ｈｅｏＬ Ｍ” 、ｋ
ｈａ６ Ｒ−。
ｕｒｒａｙ ）のｔ＋ｒｐ Ｒ、ｈｅｏＬ Ｍ” 、ｋ
ｈａ６ Ｒ−。
ｓｕｐ Ｗ １ｓｕｐ Ｆ ］ （Ｄ８Ｍ ２１ ０２
）Ｅ・コリーに１２、Ｃ！ＳＲ（コールド・スプリン
ク、ハーバースタムデンムルング （ＣＯＩｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｔａｍｍｓ
ａｍｍｌｕｎｇ）からのｔｈ１．ｔｒｎ、 ｌａｃ Ｚ
、 ｒｔｔｓｌ １（ＤＥＩＭ ３１ ４２ ） シュードモナス・７ａ／チダ杵の宿主細胞として、野生
型単離物も実験塞株も使用できる。シュードモナス・プ
チダ２４４０（ｎｓＭ２１０６）（ｒン（Ｇｅｎ）１９
８１．２３７〜２４７参照〕を用いて特に良好な結果が
得られた。
）Ｅ・コリーに１２、Ｃ！ＳＲ（コールド・スプリン
ク、ハーバースタムデンムルング （ＣＯＩｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｔａｍｍｓ
ａｍｍｌｕｎｇ）からのｔｈ１．ｔｒｎ、 ｌａｃ Ｚ
、 ｒｔｔｓｌ １（ＤＥＩＭ ３１ ４２ ） シュードモナス・７ａ／チダ杵の宿主細胞として、野生
型単離物も実験塞株も使用できる。シュードモナス・プ
チダ２４４０（ｎｓＭ２１０６）（ｒン（Ｇｅｎ）１９
８１．２３７〜２４７参照〕を用いて特に良好な結果が
得られた。
Ｅ・コリー中での表現のためのベクター系として、本発
明によれば、前記のように、有利に市販のプラスミドｐ
ＢＲ５２２の遺伝学的に操作された誘導体〔デ：／（Ｇ
ｅｎｅ） １９７７．９５〜１１３参照〕を使用するの
が有利である、シュードモナス株中の表現のために、プ
ラスミドｐＲ８７１０１０の遺伝学的に変換された誘導
体〔デン（Ｇｅｎｅ） 、１９８１．２３７〜２４７参
照〕を使用するのが有利である。本発明の遺伝学的に変
換されたプラスミドの形成の几めの前記の制限エンドヌ
クレアーゼの使用の際に、クレアチンアミジノヒドロラ
ーゼをコードする遺伝子断片が得られ、これは、表現−
ベクター系及び宿主細胞中のぺＸター系の増加されたコ
ぎ一数に作用する調節源並びにその生成物を容易に選択
することのできる（例えば抗生物質耐性）遺伝子を有す
る。
明によれば、前記のように、有利に市販のプラスミドｐ
ＢＲ５２２の遺伝学的に操作された誘導体〔デ：／（Ｇ
ｅｎｅ） １９７７．９５〜１１３参照〕を使用するの
が有利である、シュードモナス株中の表現のために、プ
ラスミドｐＲ８７１０１０の遺伝学的に変換された誘導
体〔デン（Ｇｅｎｅ） 、１９８１．２３７〜２４７参
照〕を使用するのが有利である。本発明の遺伝学的に変
換されたプラスミドの形成の几めの前記の制限エンドヌ
クレアーゼの使用の際に、クレアチンアミジノヒドロラ
ーゼをコードする遺伝子断片が得られ、これは、表現−
ベクター系及び宿主細胞中のぺＸター系の増加されたコ
ぎ一数に作用する調節源並びにその生成物を容易に選択
することのできる（例えば抗生物質耐性）遺伝子を有す
る。
次忙本発明を添付図面及び実施例につき詳述する。
第１図は、シュードモナス・プチダＤＮＡからの２．２
Ｋｂ−フラグメント及びプラスミドｐＢＲ３２２を出発
物質として用いたプラスミドｐＢＴ３−２の製造経過を
略示した図であり、第２図は、プラスミドＲＳＦ １０
１０及びｐＡＣ！ＹＣ１７７からの本発明によるプラス
ミドｐＢＴ ３０６−１の製造工程を示す図であり、第
３図は、ｐＢＴ ３０６・１及びｐＢＴ ２ ａ −１
からの本発明によるプラスミドｐＢＴ ３０６．１６の
形成工場を示す図であり、第４図は第１片：出発株シュ
ードモナス・プチダ、第２片＝ｆラスミドｐＢＴ ２
ａ −１を有する一Ｅ・コリー野生株ＫＤ １第４片：
宿主株ＥＤ及び第３片：比較用精製クレアチナーゼ１５
μｇの細胞エキスを付与したＳＤ８デルを示す図である
。
Ｋｂ−フラグメント及びプラスミドｐＢＲ３２２を出発
物質として用いたプラスミドｐＢＴ３−２の製造経過を
略示した図であり、第２図は、プラスミドＲＳＦ １０
１０及びｐＡＣ！ＹＣ１７７からの本発明によるプラス
ミドｐＢＴ ３０６−１の製造工程を示す図であり、第
３図は、ｐＢＴ ３０６・１及びｐＢＴ ２ ａ −１
からの本発明によるプラスミドｐＢＴ ３０６．１６の
形成工場を示す図であり、第４図は第１片：出発株シュ
ードモナス・プチダ、第２片＝ｆラスミドｐＢＴ ２
ａ −１を有する一Ｅ・コリー野生株ＫＤ １第４片：
宿主株ＥＤ及び第３片：比較用精製クレアチナーゼ１５
μｇの細胞エキスを付与したＳＤ８デルを示す図である
。
次表は酵素クレアチンアミジノヒドロラーゼをコーＶす
るＤＮＡ配列及びこのＤＮＡ配列から生じる蛋白質配列
を示している。
るＤＮＡ配列及びこのＤＮＡ配列から生じる蛋白質配列
を示している。
：ｘ： 養
衿賛 藁 藁悼
賛 藁藁
藁 藁陽性クローン即ち、
構成性クレアチンアミジノヒドロラーゼを形成する微生
物クローンを見つけるために、本発明によれば、酵素免
疫テストの原理により操作するスクリーニング系を使用
することができる。この際、クレアチンアミジノヒドロ
ラーゼに対する特異抗体を適当な担体例えばポリビニル
−シートに固定させ、このシートを溶解されたコロニイ
及びプラーク上にのせる。Ｒ２０で洗浄の後に、このシ
ートを酵素接合物（例えばペルオキシダーゼとの）の形
の同じ特異抗体と共にインキエベートする。この酵素を
生産しうるクローンを存在させると、抗体−抗原及び酵
素標識された抗体からのサンドインチが生じる。
衿賛 藁 藁悼
賛 藁藁
藁 藁陽性クローン即ち、
構成性クレアチンアミジノヒドロラーゼを形成する微生
物クローンを見つけるために、本発明によれば、酵素免
疫テストの原理により操作するスクリーニング系を使用
することができる。この際、クレアチンアミジノヒドロ
ラーゼに対する特異抗体を適当な担体例えばポリビニル
−シートに固定させ、このシートを溶解されたコロニイ
及びプラーク上にのせる。Ｒ２０で洗浄の後に、このシ
ートを酵素接合物（例えばペルオキシダーゼとの）の形
の同じ特異抗体と共にインキエベートする。この酵素を
生産しうるクローンを存在させると、抗体−抗原及び酵
素標識された抗体からのサンドインチが生じる。
抗体−ペルオキシダーゼ−接合物は適当な呈色指示楽系
で呈色し、例えばゼラチン中のテトラメチルベンジジン
、ジオクテルナトリクムスルホスクシネート及びＨ２Ｏ
２からの指示薬系において、緑色斑点を示す。この系は
、蛋白質抗原１０ｐｇ〜ｉ ｏ ｏ ｐｇの検出限界を
示す。この株の酵素免疫テストの製造及び適当な抗体の
調製は、ベーリンガー６マンハイム社（Ｂｏｅｈｒｉｎ
ｇｅｒＭａｎｎｂｓｉｍ ＧｍｂＨ）のテストコンビナ
チオン・ｒンエクスゾレツション（Ｔｅｓｔｋｏｍｂｉ
ｎａｔｉｏｎＧｅｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ）に関する
指示により実施することができる。
で呈色し、例えばゼラチン中のテトラメチルベンジジン
、ジオクテルナトリクムスルホスクシネート及びＨ２Ｏ
２からの指示薬系において、緑色斑点を示す。この系は
、蛋白質抗原１０ｐｇ〜ｉ ｏ ｏ ｐｇの検出限界を
示す。この株の酵素免疫テストの製造及び適当な抗体の
調製は、ベーリンガー６マンハイム社（Ｂｏｅｈｒｉｎ
ｇｅｒＭａｎｎｂｓｉｍ ＧｍｂＨ）のテストコンビナ
チオン・ｒンエクスゾレツション（Ｔｅｓｔｋｏｍｂｉ
ｎａｔｉｏｎＧｅｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ）に関する
指示により実施することができる。
実施例
次に実施例につき本発明を詳述する。
染色体ＤＮＡを、細胞の溶解及びガラス棒上へのＤＮＡ
の巻き付ｄ （ＡｕｆｗｉＯｋｅｌｎ ）によシ単離し
、２回のフェノール処理（ｐｈｅｎｏｌｉｓｉｅｒｕｎ
ｇ）及びエタノール沈殿の後に、６００μＩ／ｍｌの濃
度で溶解させる（コスロイ（０ｏｓｌｏｙ ）及びオー
イシ（０１ｓｈｉ ）によるモレク、ｒン、ダネ）
（ＭＯ１＋３Ｃ，Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ、
） １ ９７３ 、 １２４．１〜１０ｊｊ
参照〕。
の巻き付ｄ （ＡｕｆｗｉＯｋｅｌｎ ）によシ単離し
、２回のフェノール処理（ｐｈｅｎｏｌｉｓｉｅｒｕｎ
ｇ）及びエタノール沈殿の後に、６００μＩ／ｍｌの濃
度で溶解させる（コスロイ（０ｏｓｌｏｙ ）及びオー
イシ（０１ｓｈｉ ）によるモレク、ｒン、ダネ）
（ＭＯ１＋３Ｃ，Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ、
） １ ９７３ 、 １２４．１〜１０ｊｊ
参照〕。
染色体ＤＮＡ １０μｙを］ＣｃｏＲｌ （Ｈ２Ｏ，３
，１−２３、１１） ５単位で制限的に６０分間分解さ
せ、アガロースデル中で消化の程度を分析様Ｅ・コリー
ＫＤ（Ｄ８Ｍ２１０２）の細菌１０１０をλファージシ
ャロン１０５Ｘ１０’と共に３７℃で２０分間インキエ
ベートし、引続き、このバクテリアの溶解が開始するま
で完全培地５００ｄ中で生長させる。ファージ−及びＤ
ＮＡ−単離の工程は、正確には、マニアチス（Ｍａｎｉ
ａｔｉｓ ）等による文献モレキュラーｅクローニング
（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ；Ｏｏｉ Ｓ
ｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ）
ｉ ９３ ’ｌ、７６〜８５頁の処方に従がい行なった
。
，１−２３、１１） ５単位で制限的に６０分間分解さ
せ、アガロースデル中で消化の程度を分析様Ｅ・コリー
ＫＤ（Ｄ８Ｍ２１０２）の細菌１０１０をλファージシ
ャロン１０５Ｘ１０’と共に３７℃で２０分間インキエ
ベートし、引続き、このバクテリアの溶解が開始するま
で完全培地５００ｄ中で生長させる。ファージ−及びＤ
ＮＡ−単離の工程は、正確には、マニアチス（Ｍａｎｉ
ａｔｉｓ ）等による文献モレキュラーｅクローニング
（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ；Ｏｏｉ Ｓ
ｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ）
ｉ ９３ ’ｌ、７６〜８５頁の処方に従がい行なった
。
シャロン１Ｑ ＤＮＡ １０Ｍｇを完全にＫｃｏ Ｒ１
に で切断する。Ａ）によるｘｃｏ Ｒｌで制限ｎガーゼの
４０単位ｔ＼へζζ曳−八へ賑鵞弧（私と共にインキエ
ベートする。このファージλの頭部−及び尾部蛋白質で
連結されたＤＮＡ−〕２グメントの包装（Ｖｓｒｐａｃ
ｋｅｎ ）を試験管内で行なう。包装に必要な蛋白質の
製造並びＫ ＤＮＡの包装は、”ｖ＝アチス（Ｍａｎｉ
ａｔｉｓ）等によるそレキエラー・クローニング （Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ ＯＩＯｎｉｎｇｓ ０ｏｌ（Ｌ
Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ
） １９８２．２５６〜２９１に記載の方法で行なう（
λＤＮＡ粒子に関する試験管内包装系は、市場で例えば
ペーリンガー・マンハイムのＤＮＡ−パッケージング・
キット（ＤＮＡ −ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｋｉ！ ）で
ある）。連結されたλ及びシュードモナス・プチダＤＮ
Ａ約ｏ、ｓ ＩＩを、試験管内包装バッチ２０μノと共
にインキエベートし、６０分後に、８Ｍ緩衝液０．５
ｍ （マニアチスによるモレキュラー・クローニング１
９８２．４４６）を添加し、この包装パッチのＶｚｏｏ
ｔ （２，５ｐｉ ） ｔ、株ＫＤの昼夜培養物（１
０−２Ｍ（ｆｉ酸マグネシウム中）２００１Ｌｌと共に
３７℃で１０分間インキエベートする。この細ｌ１１患
濁液を引続きＬＢ（ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ ）のエクス
ペリメンツ・イン・モレキュラー・デネテイクス （１［ｉｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏ１ｅｃｕｌ
ａｒ Ｇｅｎ１ｉｌｔｉＱｓ＋Ｃｏ１ｄ Ｅｌｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌｏｂｏｒａｔｏｒｙ ） １９７
２．４３６参照〕アガロース（０，８％）３ｄと混合し
、Ｔ、＋Ｂプレート上に注ぐ。使用ＤＮＡ １μｇ当シ
、７アージプラーク（プラーク）約１０５が得られる。
に で切断する。Ａ）によるｘｃｏ Ｒｌで制限ｎガーゼの
４０単位ｔ＼へζζ曳−八へ賑鵞弧（私と共にインキエ
ベートする。このファージλの頭部−及び尾部蛋白質で
連結されたＤＮＡ−〕２グメントの包装（Ｖｓｒｐａｃ
ｋｅｎ ）を試験管内で行なう。包装に必要な蛋白質の
製造並びＫ ＤＮＡの包装は、”ｖ＝アチス（Ｍａｎｉ
ａｔｉｓ）等によるそレキエラー・クローニング （Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ ＯＩＯｎｉｎｇｓ ０ｏｌ（Ｌ
Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ
） １９８２．２５６〜２９１に記載の方法で行なう（
λＤＮＡ粒子に関する試験管内包装系は、市場で例えば
ペーリンガー・マンハイムのＤＮＡ−パッケージング・
キット（ＤＮＡ −ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｋｉ！ ）で
ある）。連結されたλ及びシュードモナス・プチダＤＮ
Ａ約ｏ、ｓ ＩＩを、試験管内包装バッチ２０μノと共
にインキエベートし、６０分後に、８Ｍ緩衝液０．５
ｍ （マニアチスによるモレキュラー・クローニング１
９８２．４４６）を添加し、この包装パッチのＶｚｏｏ
ｔ （２，５ｐｉ ） ｔ、株ＫＤの昼夜培養物（１
０−２Ｍ（ｆｉ酸マグネシウム中）２００１Ｌｌと共に
３７℃で１０分間インキエベートする。この細ｌ１１患
濁液を引続きＬＢ（ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ ）のエクス
ペリメンツ・イン・モレキュラー・デネテイクス （１［ｉｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏ１ｅｃｕｌ
ａｒ Ｇｅｎ１ｉｌｔｉＱｓ＋Ｃｏ１ｄ Ｅｌｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌｏｂｏｒａｔｏｒｙ ） １９７
２．４３６参照〕アガロース（０，８％）３ｄと混合し
、Ｔ、＋Ｂプレート上に注ぐ。使用ＤＮＡ １μｇ当シ
、７アージプラーク（プラーク）約１０５が得られる。
クレアチナーゼをコードする遺伝子を有するファージの
同定のために、先に記載の酵素−免疫テストを使用する
。この指示薬系は、６チゼラチン中のテトラメチルベン
ジジン６ｗ／ＩＩｔｌ、ジオクチルナトリウムスルホテ
クシネート２０ ’９７１１４”Ｉｋ ’Ｃｊ ＨｚＯ
＋ ０．０１９によシ成る。１０００プラーク当り２個
の陽性信号が測定される。
同定のために、先に記載の酵素−免疫テストを使用する
。この指示薬系は、６チゼラチン中のテトラメチルベン
ジジン６ｗ／ＩＩｔｌ、ジオクチルナトリウムスルホテ
クシネート２０ ’９７１１４”Ｉｋ ’Ｃｊ ＨｚＯ
＋ ０．０１９によシ成る。１０００プラーク当り２個
の陽性信号が測定される。
ａ） Ｚ・コリー中のクレアチナーゼ−遺伝子の再ク
ローニング 酵素免役テストで陽性のプラーク５個から前記のように
して、ファージ−ＤＮＡ を調製した。
ローニング 酵素免役テストで陽性のプラーク５個から前記のように
して、ファージ−ＤＮＡ を調製した。
Ｚｏｏ Ｒｌを用いる５個の種々のＤＮＡの切断は、禎
々異なるバンド（］３Ｂｎｄ ）と並んで５．８Ｋｂの
すべての５個の７アージＤＮＡにおける共通のＤＮＡ−
パンＰが示された。この５．Ｂｘｂの大きさのフラグメ
ントは種々の制限ヌクレアーゼで特性付けられた（第１
図参照）。
々異なるバンド（］３Ｂｎｄ ）と並んで５．８Ｋｂの
すべての５個の７アージＤＮＡにおける共通のＤＮＡ−
パンＰが示された。この５．Ｂｘｂの大きさのフラグメ
ントは種々の制限ヌクレアーゼで特性付けられた（第１
図参照）。
このＥｃｏ Ｒｌフラグメント約５μｇからｐｖｕ■の
使用下に２．２ Ｋｂ ７ラグメントを切断した。生じ
るＤＮＡフジグメントは、低融点アガロースダル中でそ
の大きさに応じて分離され、２．２ ＫｂＩＣｃＯＲ１
−ＰＹｕ Ｉ ７ラグメントが単離される。低融点アガ
ロースデルからのＤＮＡ −フラグメントの単離は、相
応するバンドを切出し、試験管（エツペンドルフ管）内
に移し、約２倍量の水を加えることによシ行なう。引続
き、６５℃で、アガロースが融解するまで（５〜１０分
）インキエベートシ、試料を短時間振動し、半量の７エ
ノール（１０ｍＭＴｘｘｓ −Ｈａｔ 、Ｐ）１７．５
及び１ｍＭ ＦｉＤＴＡ 、 ＴＫで中和）と共に倣し
く振動する。この相を１５０００ｇで１０分間遠心する
ことによシ分離させ、上の水相を改めてフェノールで振
出する。
使用下に２．２ Ｋｂ ７ラグメントを切断した。生じ
るＤＮＡフジグメントは、低融点アガロースダル中でそ
の大きさに応じて分離され、２．２ ＫｂＩＣｃＯＲ１
−ＰＹｕ Ｉ ７ラグメントが単離される。低融点アガ
ロースデルからのＤＮＡ −フラグメントの単離は、相
応するバンドを切出し、試験管（エツペンドルフ管）内
に移し、約２倍量の水を加えることによシ行なう。引続
き、６５℃で、アガロースが融解するまで（５〜１０分
）インキエベートシ、試料を短時間振動し、半量の７エ
ノール（１０ｍＭＴｘｘｓ −Ｈａｔ 、Ｐ）１７．５
及び１ｍＭ ＦｉＤＴＡ 、 ＴＫで中和）と共に倣し
く振動する。この相を１５０００ｇで１０分間遠心する
ことによシ分離させ、上の水相を改めてフェノールで振
出する。
１５０００！ｉで１０分間の遠心の後に、上相をエーテ
ル各１−で２回振出し、エーテルを６５℃で蒸発させ、
ＤＮＡを、３Ｍ酢酸ナトリウＡ （ｐＨ７−２） ’Ａ
ｏ量及びエタノール２．５倍量で一２０℃で沈殿させる
。ＤＮＡをｉ ｓｏ ｏ。
ル各１−で２回振出し、エーテルを６５℃で蒸発させ、
ＤＮＡを、３Ｍ酢酸ナトリウＡ （ｐＨ７−２） ’Ａ
ｏ量及びエタノール２．５倍量で一２０℃で沈殿させる
。ＤＮＡをｉ ｓｏ ｏ。
ｇで１０分間の遠心によシ沈殿させ、真空中で乾燥させ
、ＴＩＩ！１０μｌ中に入れる。他のすべての７ラグメ
ント単離はこの工程で行なう。
、ＴＩＩ！１０μｌ中に入れる。他のすべての７ラグメ
ント単離はこの工程で行なう。
１）ＢＲ３２２ＤＮＡ約４ μｇ ｔ Ｅ（！ＯＲ１及
びＰｖｕ■で切断し、２．３に１）７ラグメントを単離
させる。この１）ＢＲ３２２７ラグメント０．２μｇを
Ｔ４ＤＮＡＩＪガーセ゛５単位の使用下に、前記λファ
ージからの２．２ ｘｂ ＦＸｃｏ Ｒ１−ｐｖｕｌ１
７ラグメント０．５μｇと共にインキエベートする。生
じるプラスミドｄｐＢＴ３−２なる名称を有し、Ｉｌ１
．コリー中で生物学的活性のクレアチナーゼをコードす
る。
びＰｖｕ■で切断し、２．３に１）７ラグメントを単離
させる。この１）ＢＲ３２２７ラグメント０．２μｇを
Ｔ４ＤＮＡＩＪガーセ゛５単位の使用下に、前記λファ
ージからの２．２ ｘｂ ＦＸｃｏ Ｒ１−ｐｖｕｌ１
７ラグメント０．５μｇと共にインキエベートする。生
じるプラスミドｄｐＢＴ３−２なる名称を有し、Ｉｌ１
．コリー中で生物学的活性のクレアチナーゼをコードす
る。
例 ２
プラスミドｐＢＴ ３−２からのクレアチナーゼをコー
ドするＤＮＡを、タルマジェ（Ｔａｌｍａｄｇｅ ）及
びイルパー） （Ｇ１１ｂｅｒｔ ）の方法〔デン（Ｇ
ｏｎｅ ） １９８０．１２．２５５〜２４１参照〕で
、増幅相の間にニトロソグアニジンで処理する。引続き
、！ラスミドーＤＮＡを細胞の溶解の後に０ｓＯｊ−エ
チジウムゾロミド法で単離する〔マニアチス等によるモ
レキュラー・クローニング（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｏｒ
ｏｎｉｎｇ ； Ｃｏ１ｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ
） １９８２．８８−９４参照〕５株Ｅ。
ドするＤＮＡを、タルマジェ（Ｔａｌｍａｄｇｅ ）及
びイルパー） （Ｇ１１ｂｅｒｔ ）の方法〔デン（Ｇ
ｏｎｅ ） １９８０．１２．２５５〜２４１参照〕で
、増幅相の間にニトロソグアニジンで処理する。引続き
、！ラスミドーＤＮＡを細胞の溶解の後に０ｓＯｊ−エ
チジウムゾロミド法で単離する〔マニアチス等によるモ
レキュラー・クローニング（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｏｒ
ｏｎｉｎｇ ； Ｃｏ１ｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ
） １９８２．８８−９４参照〕５株Ｅ。
コリーＦｉＤ８６５４の好適な細胞をプラスミドＤＮＡ
で形質転換しくマエアチス等によるモレキュラー・クロ
ーニング、１９８２．２５０〜２５１＃ｆｆ１）、７／
ピＶ ９ ｙ ２０ μｓ／ｍヲ含有する完全培地プレ
ー） （ＸＪＢ）上に塗抹する。
で形質転換しくマエアチス等によるモレキュラー・クロ
ーニング、１９８２．２５０〜２５１＃ｆｆ１）、７／
ピＶ ９ ｙ ２０ μｓ／ｍヲ含有する完全培地プレ
ー） （ＸＪＢ）上に塗抹する。
３７℃で１夜インキユベートの後、コロニーを、予めニ
トロセルロース濾紙〔シュライヒア（８ａｈｌｅｉｃｈ
ｅｒ ）、シェル（ｓｃｈＭｌｌ） ＢＡ ８５）が載
せられているＬＢプレート上で熱処理する。
トロセルロース濾紙〔シュライヒア（８ａｈｌｅｉｃｈ
ｅｒ ）、シェル（ｓｃｈＭｌｌ） ＢＡ ８５）が載
せられているＬＢプレート上で熱処理する。
このプレートを６７°Ｃで１２〜１８時間培養の後、ニ
ドロースセルロース濾紙ヲコロニート共にＪｌｌシ出し
、クロロホルム／トルオ−／Ｌ／（１：１）１ｄが加え
られたガラスペトリシャーレ（φ２０ｃＩＩＬ）中に移
す。６７°０で２０分間インキエペートする。引続き、
ニトロセルロース濾紙を指示薬−アガロースプレート上
に、細胞と指示薬プレートとの間に直接接触が生じるよ
うに置く。
ドロースセルロース濾紙ヲコロニート共にＪｌｌシ出し
、クロロホルム／トルオ−／Ｌ／（１：１）１ｄが加え
られたガラスペトリシャーレ（φ２０ｃＩＩＬ）中に移
す。６７°０で２０分間インキエペートする。引続き、
ニトロセルロース濾紙を指示薬−アガロースプレート上
に、細胞と指示薬プレートとの間に直接接触が生じるよ
うに置く。
呈色反応は時間と個々のクローン中で合成されたクレア
チナーゼの量との関係で得られる。前記活性スクリーニ
ングから、プラスミドｐＢＴ２ａ−１（ＤＳＭ ３１４
３）を有するクローンＨＤが単離される。このプラスミ
ドは、細胞の可溶性蛋白質の約５０ｓを構成するクレア
チナーゼをコードする。この方法は第１図に図示されて
いる。
チナーゼの量との関係で得られる。前記活性スクリーニ
ングから、プラスミドｐＢＴ２ａ−１（ＤＳＭ ３１４
３）を有するクローンＨＤが単離される。このプラスミ
ドは、細胞の可溶性蛋白質の約５０ｓを構成するクレア
チナーゼをコードする。この方法は第１図に図示されて
いる。
ここに記載の直接ＮＧ−突然変異生成に対して択一的に
、異種プロモーター例えばラクトースプロモーター（こ
れは例えば市場で入手しうるプラスミド例えばｐＵｏ−
プラスミドから、ＤＮＡ−フラグメントとして単離され
うる）の導入によっても、このクレアチナーゼの表現増
加が得られる。このために、プラスミドｐＢＴ３−２を
ｚｃｏ ＲＩ−位置で開裂させ、エキソヌクレアーゼＢ
ａｌ ５１で各々の側から約１０〜１００ＢＦが除かれ
るように処理する５次いで、ラクトース−プロモーター
を、酵素Ｔ４−リガーゼを用いて、末端の連結下に、短
縮されたプラスミドｐＢＴ ３−２中に導入連結させる
。このＤＮＡを、次いで前記のようにニトロソ−グアニ
ジンで突然変異させ、引続き株ＦｉＤの形質転換のため
に使用し、クローンを前記のプレートスクリーニングで
遺伝子表現に関して試験する。
、異種プロモーター例えばラクトースプロモーター（こ
れは例えば市場で入手しうるプラスミド例えばｐＵｏ−
プラスミドから、ＤＮＡ−フラグメントとして単離され
うる）の導入によっても、このクレアチナーゼの表現増
加が得られる。このために、プラスミドｐＢＴ３−２を
ｚｃｏ ＲＩ−位置で開裂させ、エキソヌクレアーゼＢ
ａｌ ５１で各々の側から約１０〜１００ＢＦが除かれ
るように処理する５次いで、ラクトース−プロモーター
を、酵素Ｔ４−リガーゼを用いて、末端の連結下に、短
縮されたプラスミドｐＢＴ ３−２中に導入連結させる
。このＤＮＡを、次いで前記のようにニトロソ−グアニ
ジンで突然変異させ、引続き株ＦｉＤの形質転換のため
に使用し、クローンを前記のプレートスクリーニングで
遺伝子表現に関して試験する。
前記の指示薬−アガロースプレートは、クレアチンから
の酵素クレアチンアミジノ−ヒドロラーゼ及ヒサルプキ
シンオキシダーゼによシ生シタＨ２０□を、ペルオキシ
ダーゼ（ＰＯＤ ） ヲ介してｌ／２０２とＨ２Ｏに分
解し、この酸素を、例えば４−アミノアンチピリン（４
−ＡＡＰ ）及びＮ−エチル−Ｎ−（スルホエチル）−
３−メチルアニリン、Ｋ−塩（Ｅ日Ｔ）からの呈色指示
薬系と反応させる。酵素サルコシンオキシダーゼ及びペ
ルオキシダーゼの過剰の際に、コロニー中に合成された
クレアチンアミジノヒドロラーゼに関する尺度を表わす
青−紫色が生じる。
の酵素クレアチンアミジノ−ヒドロラーゼ及ヒサルプキ
シンオキシダーゼによシ生シタＨ２０□を、ペルオキシ
ダーゼ（ＰＯＤ ） ヲ介してｌ／２０２とＨ２Ｏに分
解し、この酸素を、例えば４−アミノアンチピリン（４
−ＡＡＰ ）及びＮ−エチル−Ｎ−（スルホエチル）−
３−メチルアニリン、Ｋ−塩（Ｅ日Ｔ）からの呈色指示
薬系と反応させる。酵素サルコシンオキシダーゼ及びペ
ルオキシダーゼの過剰の際に、コロニー中に合成された
クレアチンアミジノヒドロラーゼに関する尺度を表わす
青−紫色が生じる。
＋Ｈ２Ｏ２
Ｈ２Ｏ２＋４− ＡＡＰ−に８Ｔ−ご把９色素＋２ Ｈ
２０クレアチンアミジノ−ヒドロラーゼ活性スクリーニ
ング系の組成 １クレアチン 最終濃度 １ＱｍＭ２ Ｎ
ａＮ３ ／’ Ｑ、５ ｍＭ
６トリス（Ｔｒｉｓ）Ｈｏｌ（ｐｔｔ７．８） １
２０ ｍＭ４サルコシンオキシダーゼ
１ ５Ｕ／ａ１５ペルオキシダーゼ
＃ ２．５ Ｕ／ａｃ１６４−ＡＡＰ
＃ ０．２５ダ／ｄ７１１ｉＳ
Ｔ ＃ １．５ダ／
−１〜７に記載の試薬を溶かし、同量の低融点アガロー
ス（２％）と混合する。６ｄをペトリシャーレ中に注ぎ
、プレートは４℃で約２週間暗所に貯蔵することができ
る。
２０クレアチンアミジノ−ヒドロラーゼ活性スクリーニ
ング系の組成 １クレアチン 最終濃度 １ＱｍＭ２ Ｎ
ａＮ３ ／’ Ｑ、５ ｍＭ
６トリス（Ｔｒｉｓ）Ｈｏｌ（ｐｔｔ７．８） １
２０ ｍＭ４サルコシンオキシダーゼ
１ ５Ｕ／ａ１５ペルオキシダーゼ
＃ ２．５ Ｕ／ａｃ１６４−ＡＡＰ
＃ ０．２５ダ／ｄ７１１ｉＳ
Ｔ ＃ １．５ダ／
−１〜７に記載の試薬を溶かし、同量の低融点アガロー
ス（２％）と混合する。６ｄをペトリシャーレ中に注ぎ
、プレートは４℃で約２週間暗所に貯蔵することができ
る。
例 ６
クローン化及びシュードモナス・プチダ中のクローン化
されたクレアチンアミジノ−ヒドロラーゼの表現のため
に、プラスミドＲｓｐ１０１０〔バグダサリアン（Ｂａ
ｇｄａｓａｒｉａｎ ）等によるｒン（Ｇｅｎｅ） １
９８１．１６．２３７〜２４７参照〕を使用する。ＲＥ
ＩＦｌｏｌｏをＰｖｕ ｌで直巌化し、プラスミドｐＡ
ＯＹＯ１７７（チャン（ｃｈａｎｇ）及ヒコーエン（ｃ
ｏｈｅｎ ） ＫよるＪ、バクテリオロジイ（Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ、 ） １９７８．１６４．１１４１〜１１
５６参照〕からＨａｅ ｌ［切断により１．４Ｋｂフラ
グメントを単離した。ＲＳＦ １０１０ ＤＮＡ ０．
２μｇ ｆ： Ｔ、 ／ｖガーゼの使用下にＨａｅ Ｉ
Ｉ ７ラグメント１μｇと連結させると生じるプラスミ
ドはｐＢＴ５０６．１である（第２図）。ＲＳＦ １０
１０及びこのプラスミドの９４体は、広い宿主範囲によ
夛優れておｋ（？ン（Ｇａｎｅ） １６ （１９８１）
、２３７〜２４７参照〕、例えば、シュードモナス属菌
内でもＥ・コリー内でも増幅するのに好適である。プラ
スミドｐＢＴ ２ａ −１をｐｖｕ Ｉ及びＰｖｕ ｌ
で切断し、２．８ Ｋ′ｂ７９グメントを単離させ、１
）ＢＴ ３６０−１をｐｖｕ Ｉ及びｓｍａ Ｉで切断
し、１０Ｋｂフ２グメントを単離させた。ベクターＤＮ
Ａ Ｏ−５μｇ ｔ” Ｐｖｕ Ｉ −Ｐｖｕ ＩＩ
７ラグメント０．５μｇと連結させる。Ｅ・コリーＫＤ
を形質転換させ、クレアチナーゼをコードするクローン
を前記プレート−活性スクリーニング系を用いて同定す
る。陽性クローンから前記０ｓＯｊ −エチジウムゾロ
ミド法によシブラスミドＤＮＡを調製する。このプラス
ミドは、ｐＢＴ ３０６．１６（ＤＳＭ ３１４９ Ｆ
）なる名称を有する（第３図）。
されたクレアチンアミジノ−ヒドロラーゼの表現のため
に、プラスミドＲｓｐ１０１０〔バグダサリアン（Ｂａ
ｇｄａｓａｒｉａｎ ）等によるｒン（Ｇｅｎｅ） １
９８１．１６．２３７〜２４７参照〕を使用する。ＲＥ
ＩＦｌｏｌｏをＰｖｕ ｌで直巌化し、プラスミドｐＡ
ＯＹＯ１７７（チャン（ｃｈａｎｇ）及ヒコーエン（ｃ
ｏｈｅｎ ） ＫよるＪ、バクテリオロジイ（Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ、 ） １９７８．１６４．１１４１〜１１
５６参照〕からＨａｅ ｌ［切断により１．４Ｋｂフラ
グメントを単離した。ＲＳＦ １０１０ ＤＮＡ ０．
２μｇ ｆ： Ｔ、 ／ｖガーゼの使用下にＨａｅ Ｉ
Ｉ ７ラグメント１μｇと連結させると生じるプラスミ
ドはｐＢＴ５０６．１である（第２図）。ＲＳＦ １０
１０及びこのプラスミドの９４体は、広い宿主範囲によ
夛優れておｋ（？ン（Ｇａｎｅ） １６ （１９８１）
、２３７〜２４７参照〕、例えば、シュードモナス属菌
内でもＥ・コリー内でも増幅するのに好適である。プラ
スミドｐＢＴ ２ａ −１をｐｖｕ Ｉ及びＰｖｕ ｌ
で切断し、２．８ Ｋ′ｂ７９グメントを単離させ、１
）ＢＴ ３６０−１をｐｖｕ Ｉ及びｓｍａ Ｉで切断
し、１０Ｋｂフ２グメントを単離させた。ベクターＤＮ
Ａ Ｏ−５μｇ ｔ” Ｐｖｕ Ｉ −Ｐｖｕ ＩＩ
７ラグメント０．５μｇと連結させる。Ｅ・コリーＫＤ
を形質転換させ、クレアチナーゼをコードするクローン
を前記プレート−活性スクリーニング系を用いて同定す
る。陽性クローンから前記０ｓＯｊ −エチジウムゾロ
ミド法によシブラスミドＤＮＡを調製する。このプラス
ミドは、ｐＢＴ ３０６．１６（ＤＳＭ ３１４９ Ｆ
）なる名称を有する（第３図）。
シュードモナス・プチダ２４４０中のグラスミドＤＮＡ
の形質転換は、正確には、フランクリン（Ｆｒａｎｋｌ
ｉｎ ）の方法Ｉマイフロピオール・デグラデーション
・オシ・キセノビオティクス・アンド・レカリシト２ン
ト・コンパウンダ（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｄｅｇｒａｄ
ａｔｉｏｎ ｏｆ Ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃｓａｎｄ Ｒ
ｅｃａｌｉａｉｔｒａｎｔ Ｏｏｍｐｏｕｎｄｓ、Ｔ、
＋ｅｉ８１ｎｇ８ｒ９０００に、 −ＨｖＬｔｔｅｒ
ｕｎｄ Ｎｅｕｓｃｈ、 ） １ ９８１．１０９〜
１６０参照〕によプ行なう。このゾレート活性スクリー
ニングを用いて、陽性クローンを同定した。このことは
、シュードモナス・プチダ２４４０ （この株は染色体
コードされたクレアチンアミジノヒドロ２−ゼを含有す
る）で、プラスミドコードされたクレアチンアミジノ−
ヒトａ５−ゼの表現を構成的に行なうので、可能である
。この識別特性によシ、染色体コードされたクレアチン
アミジノヒドロラーゼとプラスミドコードされたクレア
チンアミジノヒドロラーゼとの間での区別ができる。
の形質転換は、正確には、フランクリン（Ｆｒａｎｋｌ
ｉｎ ）の方法Ｉマイフロピオール・デグラデーション
・オシ・キセノビオティクス・アンド・レカリシト２ン
ト・コンパウンダ（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｄｅｇｒａｄ
ａｔｉｏｎ ｏｆ Ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃｓａｎｄ Ｒ
ｅｃａｌｉａｉｔｒａｎｔ Ｏｏｍｐｏｕｎｄｓ、Ｔ、
＋ｅｉ８１ｎｇ８ｒ９０００に、 −ＨｖＬｔｔｅｒ
ｕｎｄ Ｎｅｕｓｃｈ、 ） １ ９８１．１０９〜
１６０参照〕によプ行なう。このゾレート活性スクリー
ニングを用いて、陽性クローンを同定した。このことは
、シュードモナス・プチダ２４４０ （この株は染色体
コードされたクレアチンアミジノヒドロ２−ゼを含有す
る）で、プラスミドコードされたクレアチンアミジノ−
ヒトａ５−ゼの表現を構成的に行なうので、可能である
。この識別特性によシ、染色体コードされたクレアチン
アミジノヒドロラーゼとプラスミドコードされたクレア
チンアミジノヒドロラーゼとの間での区別ができる。
例 ４
クレアチンアミジノ−ヒドロラーゼ活性の測定は、ウレ
アーゼを用いる反応で生じるアンモニウムイオンを、テ
スト組成物［ハルンストツ７ （Ｈａｒｎｓｔｏｆｆ
） （ベーリンガーｓ−ｒンノ１イムＢｅｇｔ、 Ｎｒ
ｓ １２４７７０ ）Ｊを用いて検出するととによシ行
なう。
アーゼを用いる反応で生じるアンモニウムイオンを、テ
スト組成物［ハルンストツ７ （Ｈａｒｎｓｔｏｆｆ
） （ベーリンガーｓ−ｒンノ１イムＢｅｇｔ、 Ｎｒ
ｓ １２４７７０ ）Ｊを用いて検出するととによシ行
なう。
野生型シェードそナス・プチダ２４４０をクレアチンア
ミジノ−ヒドロラーゼ活性の測定のためにクレアチン１
ｅｓを含有するＬＢ培地（５ｄ）中で６０℃で１夜イン
キエペートする。細胞を遠心によシ収得し、５０ ｍＭ
燐酸塩緩衝液（ｐＨ７，５）中で１回洗浄する。細胞を
当初量で、燐酸塩緩衝液（５０ｍＭ、ｐ）１７゜５）中
に入れ、超音波処理（４Ｘ３０秒）によりｍ解させる。
ミジノ−ヒドロラーゼ活性の測定のためにクレアチン１
ｅｓを含有するＬＢ培地（５ｄ）中で６０℃で１夜イン
キエペートする。細胞を遠心によシ収得し、５０ ｍＭ
燐酸塩緩衝液（ｐＨ７，５）中で１回洗浄する。細胞を
当初量で、燐酸塩緩衝液（５０ｍＭ、ｐ）１７゜５）中
に入れ、超音波処理（４Ｘ３０秒）によりｍ解させる。
クレアチンアミジノヒドロラーゼコードプラスミドを有
する細胞の培養及び溶解は、前記と同様の方法であるが
、培地に誘導用のクレアチ／を含有せず、アンピシリン
（グラスミドｐＢＴ３−２、ｐＢＴ ２ａ −１に対し
て２０μｇ ／ ｘｌ ）もしくはストレプトマイシン
（プラスミドｐＢＴ３０６−１６に対して２００μｇ
／ ｍ ）の添加によりグラスミドを選択するようにし
て、行なう。培養物の生長は、シュードモナス・プチダ
に関しては６０°Ｃで、Ｅ・コリーに関しては６７°Ｇ
で行なう。
する細胞の培養及び溶解は、前記と同様の方法であるが
、培地に誘導用のクレアチ／を含有せず、アンピシリン
（グラスミドｐＢＴ３−２、ｐＢＴ ２ａ −１に対し
て２０μｇ ／ ｘｌ ）もしくはストレプトマイシン
（プラスミドｐＢＴ３０６−１６に対して２００μｇ
／ ｍ ）の添加によりグラスミドを選択するようにし
て、行なう。培養物の生長は、シュードモナス・プチダ
に関しては６０°Ｃで、Ｅ・コリーに関しては６７°Ｇ
で行なう。
・ソ１−−−二斗フ、Ｊキ／Ｂパ穿、−ｔ １１−山の
クレアチンアミジノヒドロラーゼ ２） Ｉ ２５０
＋クレアチン４）Ｉｎ・コリー ＩＤ
士クレアチンこのデータは、ク
レアチンアミジノ−ヒドロラーゼのクローン化により、
１）Ｅ・コリー細菌は新特性ｆ：有するクレアチンアミ
ジノ−ヒドロラーゼを合成し、２）この表現（出発株シ
ュードモナス・プチダとは逆に）は、Ｅ・コリーに関し
ても、シュードモナス・プチダに関しても構成的に行な
われることを示している。更に１クレアチンアミジノ−
ヒドロラーゼコード性ＤＮＡの突然変異生成により、特
に高い表現を得ることができることが判る（誘導されな
かった出発法に比べたリットル当りの活性の増大、シュ
ードモナスでは力価１８００、Ｉｌｔ・コリーでは力価
２８００ ）。
クレアチンアミジノヒドロラーゼ ２） Ｉ ２５０
＋クレアチン４）Ｉｎ・コリー ＩＤ
士クレアチンこのデータは、ク
レアチンアミジノ−ヒドロラーゼのクローン化により、
１）Ｅ・コリー細菌は新特性ｆ：有するクレアチンアミ
ジノ−ヒドロラーゼを合成し、２）この表現（出発株シ
ュードモナス・プチダとは逆に）は、Ｅ・コリーに関し
ても、シュードモナス・プチダに関しても構成的に行な
われることを示している。更に１クレアチンアミジノ−
ヒドロラーゼコード性ＤＮＡの突然変異生成により、特
に高い表現を得ることができることが判る（誘導されな
かった出発法に比べたリットル当りの活性の増大、シュ
ードモナスでは力価１８００、Ｉｌｔ・コリーでは力価
２８００ ）。
ｇ、＝ｒリーＥＤ／Ｔ）ＢＴ ２ ａ −１ＣＤ８Ｍ！
１４３）中で、活性は５００単位／ビオマス（湿）１１
１もしくは特異活性は４．５ ｕ ／蛋白質ダである。
１４３）中で、活性は５００単位／ビオマス（湿）１１
１もしくは特異活性は４．５ ｕ ／蛋白質ダである。
高度精製された蛋白質の特異活性は、９ｕ／ａ９である
ので、Ｅ・コリー中のクレアチンアミゾノヒＰロラーゼ
は、可溶性蛋白質の５０係になる。８０８−デルでの粗
製エキスの分析結果〔レムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ ）によ
るナトウア（Ｎａｚｕｒｅ ）１９７０．２２７．６８
０〜６８５参照〕は、クレアチンアミジノ−ヒドロラー
ゼは可溶性蛋白５［フラクションの主要バンドであるこ
とを示している（第４図、第２片）。
ので、Ｅ・コリー中のクレアチンアミゾノヒＰロラーゼ
は、可溶性蛋白質の５０係になる。８０８−デルでの粗
製エキスの分析結果〔レムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ ）によ
るナトウア（Ｎａｚｕｒｅ ）１９７０．２２７．６８
０〜６８５参照〕は、クレアチンアミジノ−ヒドロラー
ゼは可溶性蛋白５［フラクションの主要バンドであるこ
とを示している（第４図、第２片）。
例 ５
醗酵装置中での培養のために、３種の種々のＥ−コリー
宿主系即ちＥ・コリーＷ３３５０、Ｅ・コリーＫＤ ８
６５４もしくはＥ−コリー０８Ｈ１を使用した。プラス
ミドｐＢＴ ２ ａ −１ｋ適当な細胞中に移す。個々
のコロニー上での浄化の後に、アンピシリン２０μｇ／
−を含有するＤＹ’ｌ’培地〔ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ
）のエクスベリメント・イン・モレキユラー・ダネテイ
クス（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏ１ｅｃｕｌ
ａｒ Ｇｅｎｅｔｔｃｓ、 Ｃｏｌ（ＩＳｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ ） 、１９７２．４３６参照〕中の前培
養物を３７℃で１夜培養する。この醗酵培地（ＤＹＴ
）に前培養物を接種しくイノキュラ上１％）、選択せず
にプラスミド保持物（Ｐｌａｇｍｉｄｅｒｈａｌｔ ）
上で３７℃で２０〜５０秒間生長させる。クレアチンア
ミジノ−ヒドロラーゼ活性は、２５時間後に約６００
ｕ／湿物質Ｉもしくは４．５ｕ／蛋白質ダである。
宿主系即ちＥ・コリーＷ３３５０、Ｅ・コリーＫＤ ８
６５４もしくはＥ−コリー０８Ｈ１を使用した。プラス
ミドｐＢＴ ２ ａ −１ｋ適当な細胞中に移す。個々
のコロニー上での浄化の後に、アンピシリン２０μｇ／
−を含有するＤＹ’ｌ’培地〔ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ
）のエクスベリメント・イン・モレキユラー・ダネテイ
クス（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏ１ｅｃｕｌ
ａｒ Ｇｅｎｅｔｔｃｓ、 Ｃｏｌ（ＩＳｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ ） 、１９７２．４３６参照〕中の前培
養物を３７℃で１夜培養する。この醗酵培地（ＤＹＴ
）に前培養物を接種しくイノキュラ上１％）、選択せず
にプラスミド保持物（Ｐｌａｇｍｉｄｅｒｈａｌｔ ）
上で３７℃で２０〜５０秒間生長させる。クレアチンア
ミジノ−ヒドロラーゼ活性は、２５時間後に約６００
ｕ／湿物質Ｉもしくは４．５ｕ／蛋白質ダである。
シュードモナス・プチダの培養のために、プラスミドｐ
ＢＴ５０６．１６を株２４４０の適当な細胞中に移すと
、ＰＳゾプチ（ＤＳＭ ３１４７ ）が得られる。
ＢＴ５０６．１６を株２４４０の適当な細胞中に移すと
、ＰＳゾプチ（ＤＳＭ ３１４７ ）が得られる。
個々のコロニーの浄化の後に、ストレプトマイシン２０
０μｇ／−を含有するＤ費培地中の培養物を３０℃で１
夜インキエペートする。培養培地（ＤＹ’Ｉ’）に接種
しくイノキエラム１％）、培養物１に３０℃で２０〜３
０時間放置生長させる。２５時間後の活性は約２２０ｕ
／湿物質Ｉもしくは１．８ｕ／蛋白質ダである。
０μｇ／−を含有するＤ費培地中の培養物を３０℃で１
夜インキエペートする。培養培地（ＤＹ’Ｉ’）に接種
しくイノキエラム１％）、培養物１に３０℃で２０〜３
０時間放置生長させる。２５時間後の活性は約２２０ｕ
／湿物質Ｉもしくは１．８ｕ／蛋白質ダである。
第１図はシュードモナス・プチダＤＮＡからの２．２
Ｋｂ −フラグメント及びプラスミドｐＢＲ３２２を出
発物質として用いたプラスミドｐＢＴ ５−２の製造経
過を示す図であり、第２図は、グラスミドＲＳＦ １０
１０及びＰＡＣＹＣ１７７からのプラスミドｐＢＴ ５
０６．１の製造経過を示す図であり、８１４３図はｐＢ
Ｔ ３０６．１及びｐＢＴ ２ ａ −１からの本発明
によるプラスミドｐＢＴ ５０６．１６の形成経過を示
す図であり、第４図は、出発味シュードモナス・プチダ
（１）ｆラスミドｐＢＴ ２０−１からの細胞エキス（
４）及び比較用の精製クレアチナーゼ（３）を付与した
８０８グルを示す図である。 る。 １Ｅｃｏ Ｒ１ Ｆｉｇ、２ Ｆｉｇ、３ 写１頁の続き ■Ｉｎｔ、ＣＩ、’ 識別記号 庁内整
理番号）発 明 者 クラウス・ボーカンプ ドイ
ツ連邦共和国トウシュトラーセ １５
Ｋｂ −フラグメント及びプラスミドｐＢＲ３２２を出
発物質として用いたプラスミドｐＢＴ ５−２の製造経
過を示す図であり、第２図は、グラスミドＲＳＦ １０
１０及びＰＡＣＹＣ１７７からのプラスミドｐＢＴ ５
０６．１の製造経過を示す図であり、８１４３図はｐＢ
Ｔ ３０６．１及びｐＢＴ ２ ａ −１からの本発明
によるプラスミドｐＢＴ ５０６．１６の形成経過を示
す図であり、第４図は、出発味シュードモナス・プチダ
（１）ｆラスミドｐＢＴ ２０−１からの細胞エキス（
４）及び比較用の精製クレアチナーゼ（３）を付与した
８０８グルを示す図である。 る。 １Ｅｃｏ Ｒ１ Ｆｉｇ、２ Ｆｉｇ、３ 写１頁の続き ■Ｉｎｔ、ＣＩ、’ 識別記号 庁内整
理番号）発 明 者 クラウス・ボーカンプ ドイ
ツ連邦共和国トウシュトラーセ １５
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、構成性クレアチンアミジノヒドロラーゼを形成する
Ｅ・コリー又はシユードモナス・プチダに属する微生物
。 ２、プラスミドｐＢＴ２ａ−１（ＤＳＭ３１４８Ｐ）を
含有する、特許請求の範囲第１項記載のＥ・コリーに属
する微生物。 ３、プラスミドｐＢＴ３０６．１６（ＤＳＭ３１４９ｐ
）を有する、特許請求の範囲第１項記載の微生物。 ４、所定のアミノ酸配列１〜４０３のクレアチン分解性
蛋白質に関してコードするアミノ酸配列１〜１２１２： 【アミノ酸配列があります】 又は遺伝子コードで同じアミノ酸配列に関してコードす
るその均等物を有することを特徴とする組換えＤＮＡ。 ５、プラスミドｐＢＴ２ａ−１（ＤＳＭ３１４８Ｐ）の
形の、特許請求の範囲第４項記載の組換えＤＮＡ。 ６、プラスミドｐＢＴ３０６．１６（ＤＳＭ３１４９Ｐ
）の形の、特許請求の範囲第４項記載の組換えＤＮＡ。 ７、構成性クレアチンアミジノヒドロラーゼを形成する
Ｅ・コリー又はシユードモナス・プチダに属する微生物
を製造するために、シユードモナス・プチダからのＤＮ
Ａを ａ）ＥｃｏＲ I で制限的に消化させて５．８Ｋｂ−フ
ラグメントを得、 ｂ）ＥｃｏＲ I 及びＰｖｕIIを用いて切断して２．２
Ｋｂ−フラグメントを得、 ａ）又はｂ）で得たフラグメントをこの又は同じ制限エ
ンドヌクレアーゼで切断されたベクターにクローン化し
、これをこの選択されたベクターに好適なＥ・コリー又
はＰ・プチダ株内に移し、この構成性クレアチンアミジ
ノヒドロラーゼを形成するクローンを単離することを特
徴とする、Ｅ・コリー又はシユードモナス・プチダに属
する微生物の製法。 ８、プラスミドｐＢＲ３２２をＥｃｏＲ I で切断し、
この切断位置に５．８Ｋ−フラグメントを挿入し、得ら
れたプラスミドをＥ・コリー内に移す、特許請求の範囲
第７項記載の方法。 ９、ｐＢＲ３２２をＥｃｏＲ I 及びＰｖｕIIで切断し
、２．３Ｋｂ−フラグメントを単離し、Ｐ・プチダから
の２．２ＫｂＥｃｏＲ I −ＰｖｕIIフラグメントと連
結してプラスミドｐＢＴ３−２を形成させ、これをＥ・
コリー内に移す、特許請求の範囲第７項記載の方法。 １０、形質転換されたＥ・コリーをアンピシリン耐性に
関して選択する、特許請求の範囲第７項から第９項まで
のいずれか１項に記載の方法。 １１、ｐＢＴ３−２を有し、形質転換されたＥ・コリー
細胞を、プラスミドの増幅時点にニトロソグアニジンで
処理し、その後、これからプラスミドを単離し、改めて
Ｅ・コリー細胞内に移し、場合により、このサイクルを
繰り返し、特に優れたクレアチンアミジノヒドロラーゼ
活性を有するクローンから、プラスミドｐＢＴ２ａ−１
を取得する特許請求の範囲第９項又は第１０項記載の方
法。 １２、プラスミドＲＳＦ１０１０をＰｖｕIIで切断し、
こうして得た切断位置に、プラスミドＰＡＣＹＣ１７７
からＨａｅIIで切出された１．４Ｋｂ−ＤＮＡ−フラグ
メントと結紮させ、この際、プラスミドｐＢＴ３０６．
１を得、これをＰｖｕ I 及びＳｍａ I で切断し、生じ
る１０Ｋｂ−断片を、ｐＢＴ２ａ−１のＰｖｕ I 及び
ＰｖｕIIでの切断により得られた２．８Ｋｂ−断片と結
紮させ、プラスミドｐＢＴ３０６．１６を得る、特許請
求の範囲第１１項記載の方法。 １３、形質転換された菌株の形成クローンを、クレアチ
ン、サルコシンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ及びＨ
＿２Ｏ＿２−呈色系を溶解含有するアガロースプレート
と接触させ、強い呈色を起こさせるクローンを選択する
、特許請求の範囲第７項から第１２項までのいずれか１
項に記載の方法。 １４、Ｈ＿２Ｏ＿２−呈色指示系として４−アミノアン
チピリンをＮ−エチル−Ｎ−（スルホエチル）−３−メ
チルアニリン塩と組合せて使用する、特許請求の範囲第
１３項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19853500184 DE3500184A1 (de) | 1985-01-04 | 1985-01-04 | Mikroorganismus und plasmid fuer konstitutive creatinamidinohydrolase-bildung sowie verfahren zur herstellung derselben |
| DE3500184.4 | 1985-01-04 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5189871A Division JPH07102140B2 (ja) | 1985-01-04 | 1993-07-30 | 組換えｄｎａ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61162170A true JPS61162170A (ja) | 1986-07-22 |
| JPH062050B2 JPH062050B2 (ja) | 1994-01-12 |
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