CZ279427B6 - Způsob pěstování mikroorganismu - Google Patents

Abstract

Mikroorganismy čeledi Escherichia coli nebo Pseudomonas putida, které obsahují plasmid pBT 22a-1, DSM 3148P nebo pBT 306.16, DSM-3149P. Tyto mikroorganismy konstruktivně produkují kreatinamidinhydrolázu, ktkerá má průmyslové využití při stanovení kreatininu a dále je možno ji využít při diagnose ledvinových chorob. Řešení se rovněž týká rekombinované DNA, s výhodou ve formě svrchu uvedených plasmidů, které jsou uloženy do svrchu uvedených mikroorganismů. ŕ

Description

Mikroorganismus čeledi Escherichia coli nebo Pseudomonas putida a rekombinovaná DNA

Oblast techniky

Vynález se týká mikroorganismu čeledi Escherichia coli nebo Pseudomonas putida a rekombinované DNA.

Dosavadní stav techniky

Enzym kreatinamidinhydroláza EC 3,5,3.3 má průmyslové využití při stanovení .kreatininu. Tento enzym je mimo jiné možno využít při diagnóze onemocnění ledvin, při němž se v moči nachází množství kreatininu, které se podstatně liší od množství, které je možno prokázat v moči zdravých jedinců. Jsou také známy mikroorganismy, například z čeledi Pseudomonas, u nichž je možno indukcí při použití kreatinu vyvolat tvorbu kreatinamidinhydrolázy v množství, které je možno dále zpracovávat, dosažitelné výtěžky a náklad na izolaci takto získaného enzymu však stále ještě představuje limitující faktor pro průmyslové využití uvedeného enzymu.

Bylo by tedy zapotřebí nalézt mikroorganismy, při jejichž pěstování -by nedocházelo ke shora uvedeným nevýhodám a které by produkovaly požadovaný enzym kreatinamidinhydrolázu konstitutivně, to jest bez až dosud nutné indukce, čímž by také bylo možno dosáhnout podstatně vyšších výsledků než v případě použití až dosud známých mikroorganismů, které jsou schopné uvedený enzym vytvářet. Vynález si klade zacil vypěstovat při použití genetického inženýrství takový mikroorganismus, u něhož by genetická informace vedla ke zvýšené tvorbé shora uvedeného enzymu v mikroorganismu, který je možno snadno pěstovat a z něhož je také možno produkovaný enzym izolovat za přijatelných nákladů.

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří mikroorganismus čeledi Escherichia coli nebo Pseudomonas putida, které obsahují plasmid pBT 2a-l, DSM 3148P nebo pBT 306.16, ĎSM 3149P a konstruktivně produkuje kreatinamidinhydrolázu.

Podstatu vynálezu tvoří také rekombinovaná DNA, která obsahuje následující kódový řetězec baží pro bílkovinu, štěpící kreatin s řetězcem aminokyselin 1 až 403

1' MetGlnMetProLysThrLeuArglleArgAsnGlyAspLysValArgSerThrPheSer20

ATGCAAATGCCCAAGACGCTCCGCATCCGTAACGGCGACAAGGTTCGCTCCACCTTCTfC60 ******

AlaGlnGluTyrAlaAsnArgGlnAlaArgLeuArgAlaBisLeuAlaAlaGluAsnne40

GCCCAGGAATACGCCAATCGCCAAGCCAGGCTGCGCGCCCACCTGGCGGCGGAGAACATC120 t * * t ii

AspAlaAlallePheThrSerTyrHisAsnlleAsnTyrTyrSerAspPheLeuTyrCys60

121 GACGCCGCGATCTTCACCTCGTACCACAACATCAACTACTACTCCGACTTCCTCTACTGC180 * * * **

-1CZ 279427 B6

SerPheGlyArgProTyrAlaLeuValValThrHisAspAspVallleSerlleSerAla80

181 TCCTTCGGCCGCCCCTACGCGTTGGTGGTGACCCACGACGACGTCATCAGCATCAGCGCC2 4 0 * i i i ii

AsnlleAspGlyGlyGlnProTrpArgArgThrValGlyThrAspAsnlleValTyrThr100

41 AACATCGACGGCGGCCAGCCGTGGCGCCGCACCGTCGGCACCGACAACATCGTCTACACC3 0 0 * t i i ii ’ 101' AspTrpGlnArgAspAsnTyrPheAlaAlalleGlnGlnAlaLeuProLysAlaArgArg120

301 GACTGGCAGCGCGATAACTACTTCGCCGCCATCCAGCAGGCGTTGCCGAAGGCCCGCCGC360 i t i i ii

121 IleGlylleGluBisAspBisLeuAsnLeuGlnAsnArgAspLysLevAlaAlaArgTyr140

61 ATCGGCATCGAACATGACCACCTGAACCTGCAGAACCGCGACAAGCTGGCCGCGCGCTAT420 i i * * **

141 ProAspAlaGluLeuValAspValAlaAlaAlaCyšHeLArcEs-tArgMetlleLysSer160

421 CCGGACGCCGAGCTGGTGGACGTGGCCGCCGCCTGC.ATGCGŤATGCGCATGATCAAATCC480 * t i * ii

161 AlaGluGluHisValMetlleArgBisGlyAlaArglleAlaAspIleGlyGlyAlaAla180

81 GCCGAAGAGCACGTGATGATCCGCCACGGCGCGCGCATCGCCGACATCGGTGGTGCGGCG5 4 0 * i i i ii

181 ValValGluAlaLeuGlyAspGlnValProGluTvrGlyValAlaLeuBisAlaThrGln200

541 GTGGTCGAAGCCCTGGGCGACCAGGTACCGGAATACGAAGTGGCGCTGCATGCCACCCAG600 * i i i **

201. AlaMetValArgAlalleAlaAspThrPheGluAspValGluLeuMetAspThrTrpThr220

601 GCCATGGTCCGCGCCATTGCCGATACCTTCGAGGACGTGGAGCTGATGGATACCTGGACC660 i * i t t*

221 TrpPheGlnSerGlylleAsnThrAspGlyAlaHisAsnProValThrThrArgLysVal240

661 TGGTTCCAGTCCGGCATCAACACCGACGGCGCGCACAACCCGGTGACCACCCGCAAGGTG720 * t i i ti

241 AsnLysGlyAspneLeuSerLeuAsnCysPheProMetlleAláGlyTyrTyrThrAla260

721 AACAAGGGCGACATCCTCAGCCTCAACTGCTTCCCGATGATCGCCGGCTACTACACCGCG780 t i i i τi

261 LeuGluArgThrLeuPheLsuAspHisCysSsrAspAspHisLeuArgLeuTrpGlnVal2:0

81 TTGGAGCGCACCCTGTTCCTCGACCACTGCTCGGACGACCACCTGCGTCTGTGGCAGGTC8 4 0 ***** *

281 AsnValGluValHisGluAlaGlyLeuLysLeuIleLysProGlyAlaArgCysSerAsp300

41 AACGTCGAGGTGCATGAAGC C GGCCTGAAGCTGATCAAGCCCGGTGCGCGTTGCAGCGAT9 0 0 * * * * **

301 IleÁlaArgGluLeuAsnGluIlePheLeuLysHisAspValLeuGlnTyrArgThrPhe320

901 ATCGCCCGCGAGCTGAACGAGATCTTCCTCAAGCACGACGTGCTGCAGTACCGCACCTTC960 * . i i i ti

321 GlyTyrGlyHisSerPheGlyThrLeuSeiBisTyrTyrGlyArgGluAlaGlyLeuGlu340

61 GGCTACGGCCACTCCTTCGGCACGCTCAGCCACTACTÁCGGCCGCGAGGCCGGGTTGGAA1020 ***** *

-2CZ 279427 B6

341 LeuArgGluAspIleAspThrValLeuGluProGlyMetValValSerMetGluProMet360

1021 CTGCGCGAGGACATCGACACCGTGCTGGAGCCGGGCATGGTGGTGTCGATGGAGCCGATG1080 * * * * *i

61 11eMetLeuP roGluGlyLeuP roGlyAlaGlyGlyTyrArgGluH i sAs pIleLeuIle380

1081 ATCATGCTGCCGGAAGGCCTGCCGGGCGCCGGTGGCTATCGCG AGC AC GACATCCTGATC1140 * * i * **

381 ValAsnGluAsnGlyAlaGluAsnlleThrLysPheProTyrGlyProGluLysAsnlle. 400

1141 GTCAACGAGAACGGTGCCGAGAACATCACCAAGTTCCCCTACGGCCCGGAGAAAAACATC 1200

	i	*	*	i	i	*
401	IleArgLys					420
1201	ATCCGCAAATGA					1260
	*	i	*	*	i	*

nebo jeho ekvivalent, který je řetězcem pro stejný řetězec aminokyselin.

podle genetického kódu kódovým

2a-l

Tato řekombinovaná

DSM 3148P nebo pBT

DNA je s výhodou ve formě 306,16, DSM 3149P.

plasmidu pBT

Mikroorganismus s obsahem shora uvedeného plasmidu je schopen produkovat kreatinamidinhydrolázu v množství, které je rovno 50 % celkového množství bílkovin, které je shora uvedeným mikroorganismem vytvářeno.

Shora uvedené mikroorganismy a také odpovídající plasmidy lze získat podle zásad genetického inženýrství. Při získávání mikroorganismů, které konstitutivně vytvářejí kreatinamidinhydrolázu je tedy možno postupovat například tak, že se DNA z Pseudomonas putida

a) částečně štěpí enzymem EcoRi za vzniku fragmentu o 5,8 kilobazí, nebo se

b) štěpí enzymy Eco RI a Pvu II za vzniku fragmentu o 2,2 kilobazí, fragment, získaný způsobem a) nebo b) se potom klonuje při použití vektoru, rozštěpeného stejnou restrikční endonukleázou, získaným materiálem se transformuje vhodný kmen Escherichia coli nebo Pseudomonas putida.a izolují se kmeny, které konstitutivně vytvářejí kreatinamidinhydrolázu. Pod pojmem kilobaze se rozumí v průběhu přihlášky tisíc párů nukleotidových baží.

Informace pro expresi kreatinamidinyhdrolázy se nachází na fragmentu o délce 5,8 kilobazí a na podfragmentu o délce 2,2 kilobazí, které je možno získat štěpením působením enzymu Eco RI nebo společným působením enzymů Eco RI a Pvu II. Shora uvedené fragmenty se podrobí klonování známým způsobem při požití vektoru, který je rozštěpen toutéž restrikční endonukleázou tak, aby byly získány typy zakončení, které je možno vzájemně opět navázat. Je také možno postupovat tak, že se rozštěpí vektory, vhodné pro použití u čeledí Escherichia coli nebo Pseudomonas putida jinými restrikčními endonukleázami tak, že při vhodném uspořádání míst pro štěpení je zachována schopnost replikace pro vektor, doplněný některým ze shora uvedených fragmentů a uložený do

-3CZ 279427 B6 uvedeného místa po štěpení jinými endonukleázami i schopnost transformace shora uvedených čeledí mikroorganismů těmito vektory. Jako vektor se s výhodou užije plasmid pBR 322, transformovaný včleněním některého ze dvou shora uvedených fragmentů a zavedený do vhodného kmene Escherichia coli. Každý odborník může uvést celou řadu kmenů E. coli, které jsou vhodné pro transformaci plasmidem pBR 322 a jeho deriváty. Dalším výhodným vektorem pro toto použití je fág Charon 10. Plasmid pBR 322 a jeho deriváty se stejně jako další vhodné vektory dnes již běžně dodávají.

Méně výhodný je způsob, při němž se plasmid pBR 322 rozštěpí působením enzymů Eco RI a Pvu II, takto vzniklý fragment o 2,3 kilobazích se izoluje a spojí se s fragmentem o 2,2 kilobazích z P. putida po štěpení enzymy Eco RI a Pvu II za vzniku nového plasmidu, označovaného pBT 3-2, který se potom použije k transformaci vhodného kmene E. coli. Tímto způsobem se získá kmen E. coli K12 ED 8654 DSM 3144.

Kmeny E. coli, získané shora uvedeným způsobem transformací derivátem plasmidu, odvozeného od plasmidu pBR 322 je možno velmi snadno podrobit selekci na základě jejich resistence proti ampicilinu. Vzhledem k tomu, že získané kmeny jsou odolné proti ampicilinu a současně vytvářejí enzym kreatinamidinhydrolázu, nemohou netransformované buňky růst a mezi rostoucími buňkami se způsobem, který bude dále podrobněji popsán snadno najdou ty buňky, které produkují požadovaný enzym.

Zvláště dobré výsledky je možno způsobem podle vynálezu získat tak, že se na buňky, zvolené z vhodného kmene E. coli s obsahem plasmidu pBT 3-2 působí v období amplifikace plasmidu nitrosoguanidinem, potom se plasmid izoluje, znovu se transformují buňky E. coli, cyklus se popřípadě opakuje a z takto získaných klonů s vyjádřenou tvorbou kreatinamidinhydrolázy se izoluje plasmid pBT 2a-l, DSM 3148P, jehož způsob výroby je také popsán. Jak již bylo uvedeno shora, produkuji buňky Escherichia coli, transformované shora uvedeným plasmidem kreatinamidinhydrolázu v množství, které odpovídá 50 % celkového množství bílkovin, produkovaného těmito buňkami.

Vzniklé klony mikroorganismů je možno identifikovat jako kmeny, produkující vysoké množství kreatinamidinhydrolázy tak, že se tyto klony uvedou do styku s agarózovými plotnami, které obsahují kreatin, sarkosinoxidázu, peroxidázu a barevný indikátor pro průkaz peroxidu vodíku. Jednotlivé klony je v tomto systému možno identifikovat podle silného zbarvení, které odpovídá vysoké tvorbě enzymu. Jako indikátorový systém pro peroxid vodíku se s výhodou použije 4-aminoantipyrin v kombinaci s N-ethyl-N-(sulfoethyl) -3-methylalaninové soli, s výhodou ve formě draselné soli.

Podle vynálezu je také možno zkonstruovat plasmidy, které jsou vhodné nejen pro expresi v mikroorganismech E. coli, ale také v mikroorganismech P. putida. S výhodou se postupuje tak, že se z plasmidu pBT 2a-l získá štěpením restrikční endonukleázou Pvu I a Pvu II fragment o 2,8 kilobazí a tento fragment se naváže na další fragment o 10 kilobazích, získaný.z plasmidu pBT 306.1 štěpením enzymy Pvu I a Srna I. Tímto způsobem se získá plasmid pBT 306-16, DSM 3149 P, který vyvolává konstitutivní tvorbu

-4CZ 279427 B6 kreatinamidinhydrolázy jak u mikroorganismů E. coli, tak u mikroorganismů P. putida.

Je překvapující, že způsobem podle vynálezu je možno dosáhnout podstatného zvýšení tvorby enzymu. Již několikrát bylo sice oznámeno, že zvýšením počtu kopií určitého genu je možno dosáhnout zvýšené exprese tohoto genu. Z toho však nebylo možno předpokládat, že i při přenesení genů z čeledi Pseudomonas do čeledi E. coli bude pravděpodobně možno dosáhnout vyšší exprese genu. Ve skutečnosti byly podávány zprávy o tom, že při přenesení nových genových kombinací z čeledi Pseudomonas do E. coli došlo ke snížení exprese genu, jak bylo uvedeno například v publikacích B. Stanisisch a J. Ortiz, J. Gen. Microbiol. 1976. 94, str. 281 až 289, Nakazáwa a další, J. Bacteriol. 1978, 134, str. 270 až 277, Ribbons a další, Soč. Gen. Microbiol. Quart. 1978, 6, str. 24 až 25 a Franklin a další, Microbiological Degradation of Xenobiotics and Recalicitrant Compounds, Leisinger Cook, Hútter und Nuesch Hrsgb., 1981, 109 až 130. Skutečnost, že nebylo možno očekávat zlepšení uvedeného typu je možno doložit přehledem nejrůznějších několikastupňových syntéz, na jejichž konci se získá enzymaticky účinná bílkovina.

Informace pro vznik bílkoviny je uložena v desoxyribonukleové kyselině (DNA). Tato DNA se převádí působením RNA-polymerázy na mRNA. Takto synthetizovaná mRNA se v ribosomech převádí na bílkovinu, přičemž vždy tři nukleotidy (triplet nebo kodon) jsou podle uspořádání genetického kódu klíčem pro tvorbu jedné určité aminokyseliny

Řídicí oblasti na úrovni DNA určují, na kterém místě se začne řetězec DNA převádět na mRNA (sled promotoru) a také na kterém místě se syntéze mRNA zastaví (terminační sled).

Sledy pro začátek a pro ukončení se nacházejí také na úrovni syntézy bílkovin (translace). Obecně je možno uvést, že kodon ATG (který se převádí na f-methionin) znamená počátek bílkoviny a například kodony TAA nebo TAG znamenají terminační kodon pro ukončení translace.

Míra exprese poAypeptidového sledu závisí na celé řadě faktorů, mimo jiné i na kvalitě sledu promotoru, stálosti mRNA, sekundární a terciární struktury mRNA, kvalitě místa vazby na ribosom, odstup místa vazby na ribosom· od kodonu pro počátek translace (ATG), na sledu nukleotidů mezi místem vazby na ribosom a mezi kodonem pro počátek translace (ATG) a mezi signálem pro ukončení translace na úrovni transkripce i translace. Bez přesné znalosti primární struktury genu a struktury bílkoviny, pro niž je gen kódem není možno cíleně zasáhnout do Shora popsaných řídicích procesů exprese genu. Protože tyto přesné znalosti nebyly v daném případě k dispozici, nebylo možno předpokládat ani vyšší výtěžek syntézy při použití svrchu uvedených mikroorganismů a plasmidů, získaných způsobem podle vynálezu.

Při provádění způsobu podle vynálezu se jako kmenů Escherichia coli užije s výhodou E. coli K12, a to zejména:

E. coli K12, W 3350 (thi, galK, galT, rpsl, [P. Tiollais], DSM 3141) ,

-5CZ 279427 B6

E. coli K12, ED 8654 (trp R, hsd M⁺, hsd R , sup E, sup F, [K. Murray], DSM 2102),

E. coli K12, CSH 1 (thi, trp, lac z, rpsl [sbírka mikroorganismů Cold Spring Harborj, DSM 3142).

Z kmenů Pseudomonas putida je možno použít izoláty divokých kmenů i kmeny laboratorní. Zvláště dobrých výsledků je možno dosáhnout při použití Pseudomonas putida 2440, DSM 2106 (Gene 1981, 237 až 247).

Jako vektorové systémy pro expresi v E. coli se při provádění způsobu podle vynálezu s výhodou užívají genetickou manipulací získané deriváty běžně dodávaného plasmidu pBR 322 (Gene 1977, 95 až 113). Pro expresi v kmenech Pseudomonas se s výhodou užívají geneticky pozměněné deriváty plasmidu pRSF 1010 (Gene 1981, 237 až 247). Při použití shora uvedených restrikčních endonukleáze pro konstrukci geneticky pozměněných plasmidů podle vynálezu se získají úseky genu, které jsou kódem pro kreatinamidinhydrolázu s obsahují ještě systémy pro expresi vektoru, řídicí systém pro počátek translace v cílové buňce a gen, podle něhož je možno výsledné mikroorganismy snadno podrobit selekci, například gen pro odolnost proti antibiotikům.

Vynález bude dále popsán v souvislosti s připojenými výkresy, kde na obr. 1 je schematicky znázorněna konstrukce plasmidu pBT 3-2 při použití fragmentu o velikosti 2,2 kilobazí z DNA Pseudomonas putida a plasmidu pBR 322 jako výchozích materiálů pro tuto konstrukci, na obr. 2 je znázorněna konstrukce plasmidu pBT 306.1 z plasmidů RSF 1010 a pACYC 177 způsobem podle vynálezu, na obr. 3 je znázorněna konstrukce plasmidu pBT 306.16 z plasmidů pBT 306.1 a pBT 2a-l způsobem podle vynálezu, na obr. 4 je znázorněn výsledek nanesení buněčného extraktu na SDS gel, a to:

Sloupec 1: výchozí kmen Pseudomonas putida,

Sloupec 2: cílový využitelný kmen E. coli ED, který nese plasmid pBT 2a—1,

Sloupec 3: pro srovnání 15 mikrogramů čištěné kreatinázy,

Sloupec 4: využitelný kmen E. coli ' ED a na obr. 5 je znázorněn sled DNA, který je kódem pro enzym kreatinamidinhydrolázu a bílkovinný sled, který je výsledkem použití shora uvedeného sledu DNA.

Aby bylo možno nalézt pozitivní klony, to znamená klony, které konstitutivně produkují kreatinamidinhydrolázu je možno při provádění způsobu podle vynálezu užít zvláštní třídicí systém, jehož principem je imunologický test na enzym. Při provádění tohoto postupu se fixují na vhodný nosič, například na polyvinylovou fólii specifické protilátky proti kreatinamidinhydroláze, fólie se přiloží na rozrušené kolonie nebo také na plaky. Po promytí vodou se fólie inkubuje se stejnou specifickou protilátkou ve formě enzymatického konjugátu, například s peroxidázou. V případě, že je přítomen klon, produkující enzym, vzniká navrstvení antigenu-protilátky a enzymaticky značené protilátky.

Konjugát protilátky a peroxidázy poskytuje ve vhodném systému s obsahem barevného indikátoru zbarvení, například při použití

-6CZ 279427 B6 indikátorového systému s obsahem tetramethylbenzidinu, dioktylnatriumsulfosukcinátu a peroxidu vodíku v želatině zeleně zbarvené skvrny. Rozmezí stanovitelného množství při použiti tohoto systému je 10 až 100 pg antigenu bílkovinné povahy. Systém tohoto typu je možno vytvořit na základě poznatků, které jsou uvedeny v publikaci Testkombination Genexpression Boehringer Mannheim GmbH.

Vynález bude osvětlen následujícími příklady.

Příklad 1

A. Izolace DNA z chromosomů Pseudomonas putida

DNA z chromosomů kmene Pseudomonas putida DSM 2106 se po rozrušení buněk izoluje a po dvojí fenoliziaci a po vysrážení ethanolem se rozpustí na koncentraci 600 μg/ml (Cosloy a Oishi, Molec. Gen. Genet., 1973, 124, 1 až 10).

μg chromosomální DNA se částečně štěpí působením pěti jednotek restrikční endonukleázy Eco RI, E.C. 3.1.23.11 po dobu 30 minut a míra štěpení se sleduje na agarózovém gelu.

B. Izolace a čištění DNA z fágu lambda Charon 10

Ί Π bakterii kmene E. coli ED DSM 2102 se inkubuje O s 5 x 10 fágu lambda Charon 10 po dobu 20 minut při teplotě 37 °C a potom se směs nechá růst až do počátku lyse buněk při použití 500 ml živného prostředí s dostatečným množstvím živin. Izolace fágu a DNA se potom provádí přesně podle návodu, který je uveden v publikaci Maniatise a dalších, Molecular cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, 76 až 85.

^g DNA fágu Charon 10 se úplně rozštěpí působením restrikční endonukleázy Eco RI. Potom se společně inkubuje 1 μg částečně rozštěpené DNA z chromosomů Pseudomonas putida (odstavec A), 3 μg DNA fágu Charon 10, rozštěpené enzymem Eco RI a 40 jednotek enzymu T4 DNA ligázy. Uložení navázaných fragmentů DNA do přední a zadní části bílkoviny fágu lambda je možno provést in vitro. Výroba bílkovin, potřebných k tomuto účelu a uložení DNA je podrobně popsáno v publikaci Maniatis a.další, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory 1982, 256 až 291 (in vitro systémy pro DNA fágu lambda se obchodně dodávají — například Boehringer Mannheim, DNA-Packaging Kit). Přibližně 0,5 μg získaného produktu a DNA z Pseudomonas putida se inkubuje s 20 μΐ systému, získaného in vitro, po 60 minutách se přidá 0,5 ml pufru SM (Maniatis a další, Cold Spring Harbor Laboratory 1982, 443) a 1/200 objemu (2,5 μΐ) systému, získaného in vitro __ n s 200 μΐ přes noc pěstované kultury kmene ED (v 10 síranu hořečnatého) podobu 10 minut při teplotě 37 °C. Suspenze bakterií se potom smísí s 3 ml LB (Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory 1972, 433), 0,8 % agarózy a směs se vlije na plotny LB. Na 1 μg použité DNA sé 'získá přibližně 10⁵ plaků.

-7CZ 279427 B6

K identifikaci fágů, které obsahují gen pro kreatinázu se užije shora uvedeného imunologického testu na přítomnost enzymu. Indikátorový systém sestává z 6 mg/ml tetramethylbenzidinu, 20 mg/ml dioktylnatriumsulfosukcinátu a 0,01 % peroxidu vodíku v 6% želatině. Na 1 000 plaků bylo možno prokázat dva pozitivní signály.

C. Reklonování genu pro kreatinázu při použití E. coli.

Z pěti plaků, které byly prokázány jako pozitivní při shora uvedeném imunologickém testu byla izolována DNA tohoto fágu. Pět vzorků takto získané DNA bylo rozštěpeno působením restrikčního enzymu Eco RI a kromě různých pásů bylo možno ve všech pěti vzorcích DNA prokázat společný pás pro DNA o velikosti 5,8 kilobazí. Tento fragment byl charakterizován pomocí štěpení několika různými restrikčními endonukleázami, jak je znázorněno na obr. 1.

Z přibližně 5 μg tohoto fragmentu, získaného štěpením enzymem Eco RI se odštěpí působením enzymu Pvu II fragment o velikosti 2,2 kilobazí. Vzniklé fragmenty DNA se dělí na agarózovém gelu s nízkou teplotou tání a izoluje se fragment o 2,2 kilobazích Eco RI- Pvu II. Při izolaci uvedeného fragmentu DNA z agarózového gelu se postupuje tak, že se odpovídající pásy vyříznou, přenesou do reakční skleněné nádoby (Eppendorfovy zkumavky) a smísí s přibližně dvojnásobným množstvím vody. Potom se směs inkubuje tak dlouho při teplotě 65 °C, až dojde k rozpuštění agarózy (5 až 10 minut), vzorek se krátce protřepe a potom se energicky protřepe s polovičním objemem fenolu (neutralizovaného 10 mM Tris HC1 o pH 7,5 a 1 mM EDTA, TE). Jednotlivé fáze se od sebe oddělí odstředěním po dobu 10 minut při 15 000 g a horní vodná fáze se znovu protřepe s fenolem. Po opakovaném odstředění 10 minut při 15 000 g se horní fáze dvakrát protřepe vždy s 1 ml éteru, éter se odpaří při teplotě 65 °C a DNA se vysráží 1/10 objemu 3 M octanu sodného o pH 7,2 a 2,5násobným objemem ethanolu při teplotě -20 °C. Potom se DNA odstředí po dobu 10 minut při 15 .000 -g, suší;se ve vakuu a potom se smísí s 10 μΐ TE. Všechny další izolace jednotlivých fragmentů byly vždy prováděny podle tohoto postupu.

Přibližně 4 μg DNA z plasmidu pBR 322 se rozštěpí působením enzymů Eco RI a Pvu II a izoluje se fragment o velikosti 2,3 kilobazí. 0,2 μg tohoto.'fragmentu DNA z pBR 322 se. inkubuje přes noc s pěti jednotkami T4 DNA ligázy a s 0,5 μg fragmentu ze shora uvedeného fágu lambda o 2,2 kilobazích, získaného štěpením pomocí restrikčních enzymu Eco RI a Pvu II. Výsledný plasmid je označován jako plasmid pBT 3-2 a je v mikroorganismech E. coli kódem pro biologicky účinnou kreatinázu.

Příklad 2

DNA z plasmidu pBT 3-2, která je kódem pro kreatinázu se v průběhu amplifikační fáze dále zpracovává působením nitrosoguanidinu přesně podle návodu, uvedeného v publikaci Talmadge a Gilbert, Gene, 1980, 12, 235 až 241. Potom se DNA plasmidu po rozrušení buněk izoluje metodou s použitím CsCl-ethidiumbromidu (Maniatis a další, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, 1982, 250 až 251) a nanese se na prostředí s plným množstvím živin (LB)

-8CZ 279427 B6 s obsahem 20 μ^/τηΐ ampicillinu. Po inkubaci přes noc při teplotě 37 °C se kolonie přenášejí na plotny s obsahem prostředí LB, na něž byly předem uloženy kotouče nitrocelulózového filtračního papíru (Schleicher, Schúll BA 85). Plotny se inkubují při teplotě 37 C po dobu 12 až 18 hodin, potom se nitrocelulózový filtr s koloniemi přenese do skleněné Petriho misky průměru 20 cm s obsahem 1 ml směsi toluenu a chloroformu s obsahem 1:1. Inkubace trvá 20 minut při teplotě 37 °C. Nitrocelulózový filtr se potom uloží na agarózovou plotnu s obsahem indikátoru tak, aby došlo k přímému styku mezi buňkami a indikátorovou plotnou. Barevná reakce se objeví v závislosti na čase a na množství kreatinázy, synthetizované v jednotlivých klonech. Podle shora uvedeného schématu byl izolován klon ED, který obsahoval plasmid pBT 2a-l, DSM 314'3. Tento plasmid je kódem pro kreatinázu, která tvoří přibližně 50 % celkového množství bílkoviny, produkovaného buňkou. Tento způsob je schematicky znázorněn na přiloženém obr. 1.

Alternativním způsobem ke shora popsané NG-mutagenesi je použití cizorodého promotoru, například promotoru pro laktózu, a tím dosáhnout vyšší úrovně expresse kreatinázy. Promotor je možno získat z komerčně dodávaných plasmidů, například jako fragment DNA z plasmidů pUC. Při provádění tohoto způsobu se rozštěpí plasmid pBT 3-2 v místě štěpení enzymem EcoRI a potom se podrobí působení exonukleázy Bal 31 tak, aby bylo z každé strany odštěpeno přibližně 10 až 100 párů baží. Potom se do zkráceného plasmidů pBT 3-2 včlení promotor pro laktózu působením enzymu T₄~ligázy. Tato DNA se potom shora uvedeným způsobem podrobí mutagenese působením nitrosoguanidinu a potom se použije k transformaci kmene ED a jednotlivé takto získané klony se shora uvedeným způsobem zkoušejí na vysokou expresi genu.

Shora uvedená agarózová plotna s indikátorovým systémem představuje zkušební systém, jehož princip spočívá v tom, že se peroxid vodíku, vzniklý z kreatinu působením kreatinamidinhydrolázy a sarkosinoxidázy štěpí peroxidázou na 1/2 O₂ a vodu a kyslík reaguje s barevným indikátorovým systémem, například obsahujícím 4-aminoántipyrin (4-AAP) a N-ethyl-N-(sulfoethyl)-3-methylanilin ve formě draselné soli (EST). Vznikne modrofialové zabarvení, které je za přítomnosti přebytku enzymu sarkosinoxidázy a peroxidázy mírou množství kreatinamidinhydrolázy, synthetizované v koloniích.

Princip uvedeného stanovení je možno schematicky znázornit následujícím způsobem:

Kreatin + H₂O kreatinamidinhydroláza sarkosin + močovina

-----------------:------.>

sarkosin + O₂ + H₂O Sarc - OD glycin + formaldehyd + peroxid vodíku —>

H₂O₂ + 4-AAP + EST POD barvivo + 2 H₂O :>

-9CZ 279427 B6

Složení systému pro zjišťování účinnosti kreatinamidinhydrolázy

Složka

Koncentrace

1.	kreatin	10	mM
2.	NaN3	0,	5 mM
3 .	Tris HC1 (pH 7,8)	20	mM
4.	sarkosinoxidáza	5	jednotek
5.	peroxidáza	2,5	jednotek
6.	4-AAP	0,25	mg/ml
7.	EST	1,5	mg/ml

Všechny reakční složky se rozpustí a smísí se se stejným objemem agarózy s nízkou teplotou tání (2 %). 6 ml takto získaného materiálu se vlije do Petriho misky, plotny je možno skladovat ve tmě přibližně 2 týdny při teplotě 4 °C.

Příklad 3

Při klonování a expresi klonovaného sledu pro kreatinamidinhydrolázu v mikroorganismu Pseudomonas putida se používá plasmid RSF 1010 (Bagdasarian a další, Gene 1981, 16, 237 až 247). Plasmid RSF 1010 se linearizuje pomocí restrikčního enzymu Pvu II a potom se izoluje z plasmidu pACYC 177 (Chang a Cohen, J. Bacteriol. 1978, 134, 1141 až 1156) po štěpení enzymem Hae II fragment o 1,4 kilobazích. 0,2 ^g DNA plasmidu RSF 1010 se spojí s 1 μg fragmentu po štěpení enzymem Hae II za použití T4 ligázy, jako výsledný plasmid se získá plasmid pBT 306.1, znázorněný na obr. 2. Plasmid RSF 1010 a deriváty tohoto plasmidu mají široké použití (Gene 16, 1981, 237 až 247) a jsou například použitelné k amplifikaci jak v mikroorganismech E. coli, tak v čeledi Pseudomonas. Plasmid pBT 2a-l se rozštěpí enzymy Pvu I a Pvu II a izoluje se fragment o velikosti 2,8 kilobazí, plasmid pBT 306.1 se také rozštěpí a izoluje se fragment o velikosti 10 kilobazí. 0,5 ^g DNA vektoru se naváže na 0,5 μg fragmentu po štěpení enzymy Pvu I a Pvu II. Získaným materiálem se transformuje E. coli ED a klony, produkující kreatinázu se vyhledají použitím shora uvedených ploten s obsahem indikátoru. Z jednoho z pozitivních klonů se připraví shora uvedeným způsobem s použitím CsCl-ethidiumbromidu DNA plasmidu. Tento plasmid se označuje pBT 306.16, DSM 3149 P, jak je znázorněno na obr. 3.

Transformace DNA z plasmidu v Pseudomonas putida 2440 se provádí přesně podle metody, uvedené v publikaci Franklin a další, Microbiol. Degradation of Xenobiotics and Recalicitant Compounds, Leisinger, Cook, Hútter and Nuetsch, Hrgsb., 1981, 109 až 130. Při použití ploten s obsahem indikátoru se identifikují pozitivní klony. Tento postup je v případě Pseudomonas putida 2440 možný, přestože tento kmen obsahuje v chromosomech kod pro kreatinamidinhydrolázu, protože k expresi genu pro kreatinamidinhydroláz^u dochází konstitutivně. Je tedy možno v tomto případě rozlišovat mezi chromosomálním a plasmidovým kódem por kreatinamidinhydrolázu.

-10CZ 279427 B6

Příklad 4

Stanovení kreatinamidinhydrolázy se provádí sledováním reakce amoniových iontů, vzniklých reakcí s ureázou při použití běžně dodávaného reakčního činidla Harnstoff (Boehringer Mannheim, Best. Nr. 124 770).

Divoký kmen Pseudomonas putida 2440 se inkubuje při stanovení účinnosti kreatinamidinhydrolázy v 5 ml prostředí LB s obsahem 1 % kreatinu přes noc při teplotě 30 °C. Buňky se oddělí odstředěním a jednou se promyjí 50 mM fosfátového pufru o pH 7,5. Potom se buňky znovu smísí s původním objemem fosfátového pufru o koncentraci 50 mM při pH 7,5 a rozruší se působením ultrazvuku na dobu 4 x 30 sekund. Pěstování a rozrušení buněk, které obsahují plasmid, který je kódem pro kreatinamidinhydrolázu provádí stejně s tím rozdílem, že prostředí neobsahuje žádný kreatin pro indukci a že selekce na přítomnost plasmidu provádí přidáním ampicilinu (20 μg/ml pro plasmid pBT 3-2, pBT 2a-l) nebo streptomycinu (200 μg pro plasmid pBT 306.16). Kultury se pěstují v případě Pseudomonas putida při teplotě 30 °C, v případě E. coli při teplotě 37 °C.

Kreatinamidinhydroláza v Pseudomonas putida a v E. coli

Kmen/plasmid

Účinnost jednotky/1

Pěstování

1.	Pseudomonas	putida	2440	1	- kreatin
2.	Pseudomonas	putida	2440		250	+	kreatin
3 .	Pseudomonas	putida	2440/
	pBT 306.16			1	800	-	kreatin
4.	E. coli ED				-	+	kreatin
5.	E. coli ED/pBT 3-2			30	-	kreatin
6.	E. coli ED/pBT 2a-l		2	800	-	kreatin

Údaje prokazují, že při klonování sledu, který je kódem pro kreatinamidinhydrolázu

1. bakterie E. coli získávají novou schopnost synthetizovat kreatinamidinhydrolázu, přičemž

2. tato exprese probíhá na rozdíl od výchozího kmene Pseudomonas putida jak pro E. coli, tak pro Pseudomonas putida konstitutivně .

Navíc je možno při mutagenezi působením DNA, která je kódem pro kreatinamidinhydrolázu dosáhnout zvláště vysoké exprese. Jde například až o 1 OOOnásobné zvýšení účinnosti/litr ve srovnání s výchozím kmenem Pseudomonas a až ó 2 SOOnásobné zvýšení v případě E. coli.

V E. coli ED/pBT 2a-l DSM 3143 je účinnost 500 jednotek/g biomasy (vlhké), specifická účinnost je 4,5 jednotek/mh bílkoviny. Protože specifická účinnost v případě vysoce čištěné bílkoviny je 9 jednotek/mg, je zřejmé, že u E. coli tvoří kreatinamidinhydroláza 50 % rozpustných bílkovin. Při analýze surového extrak-11CZ 279427 B6 tu na SDS-gelu způsobem podle publikace Laemmli, Nátuře, 1970, 227, 680 až 685 je možno prokázat, že kreatinamidinhydroláza tvoři hlavní pásy rozpustné bílkovinné frakce, jak je zřejmé z obr. 4, sloupec 2.

Příklad 5

Pro kultivaci ve fermentoru byly užity tři kmeny Escherichia coli, a to E. coli W 3350, E. coli ED 8654 a E. coli CSH 1. K transformaci se užije plasmidu pBT 2a-l. Po čištění jednotlivých kolonií se pěstuje předběžná kultura v živném prostředí DYT (Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor, 1972, 433) s obsahem 20 μ9^1 ampicilinu přes noc při teplotě 37 °C. Fermentační prostředí (DYT) se potom naočkuje předběžnou kulturou (1 % očkovacího materiálu) a bez selekce na přítomnost plasmidu se kultura nechá růst 20 až 30 hodin při teplotě 37 °C. Po 25 hodinách pěstování je účinnost kreatinamidinhydrolázy přibližně 600 jednotek/gram vlhké biomasy, tj. přibližně 4,5 jednotek/mg bílkoviny.

V případě fermentace Pseudomonas putida se užije plasmid pBT 306.16 k transformaci kompetentních buněk kmene Pseudomonas putida 2440 shora uvedeným způsobem, čímž se získá kmen pseudomonas putida DSM 3147.

Po čištění jednotlivých kolonií se pěstuje v prostředí DYT přes noc při teplotě 30 °C předběžná kultura, prostředí obsahuje 200 μg/ml streptomycinu. Potom se touto kulturou naočkuje fermentační prostředí (DYT) při použití 1 % očkovacího materiálu a kultura se nechá růst při teplotě 30 C 20 až 30 hodin. Účinnost po 25 hodinách je přibližně 220 jednotek/g vlhké biomasy, tj. přibližně 1,8 jednotek/mg bílkoviny.

Claims (4)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Mikroorganismus čeledi E. coli nebo Pseudomonas putida, obsahující plasmid pBT 2a-l, DSM 3148P nebo pBT 306.16. DSM 3149P a konstruktivně produkující kreatinamidinhydrolázu.
2. 2. Rekombinovaná DNA, obsahující následující kódový řetězec baží pro bílkovinu, štěpící kreatin s řetězcem aminokyselin 1 až 403,. .

   MetGlnMetProLysThrLeuArglleArgAsnGlyAspLysValArgSerThrPheSer ATGCAAATGCCCAAGACGCTCCGCATCCGTAACGGCGACAAGGTTCGCTCCACCTTCTCC

   AlaGlnGluTyrAlaAsnArgGlnAlaArgLeuArgAlaHisLeuAlaAlaGluAsnile

   GCCCAGGAATACGCCAATCGCCAAGCCAGGCTGCGCGCCCACCTGGCGGCGGAGAACATC

   AspAlaAlallePheThrSerTyrHisAsnlleAsnTyrTyrSerAspPheLeuTyrCys GACGCCGCGATCTTCACCTCGTACCACAACATCAACTACTACTCCGACTTCCTCTACTGC

   SerPheGlyArgProTyrAlaLeuValValThrHisAspAspVallleSerlleSerAla TCCTTCGGCCGCCCCTACGCGTTGGTGGTGACCCACGACGACGTCATCAGCATCAGCGCC

   AsnlleAspGlyGlyGlnProTrpArgArgThrValGlyThrAspAsnlleValTyrThr AACATCGACGGCGGCCAGCCGTGGCGCCGCACCGTCGGCACCGACAACATCGTCTACACC

   AspTrpGlnArgAspAsnTyrPheAlaAlalleGlnGlnAlaLeuProLysAlaArgArg GACTGGCAGCGCGATAACTACTTCGCCGCCATCCAGCAGGCGTTGCCGAAGGCCCGCCGC

   IleGlylleGluHisAspHisLeuAsnLeuGlnAsnArgAspLysLevAlaAlaArgTyr ATCGGCATCGAACATGACCACCTGAACCTGCAGAACCGCGACAAGCTGGCCGCGCGCTAT

   ProAspAlaGluLeuValAspValAlaAlaAlaCysMetArgMetArgMetlleLysSer CCGGACGCCGAGCTGGTGGACGTGGCCGCCGCCTGCATGCGTATGCGCATGATCAAATCC

   AlaGluGluHisValMetlleArgHisGlyAlaArglleAlaAspIleGlyGlyAlaAla

   GCCGAAGAGCACGTGATGATCCGCCACGGCGCGCGCATCGCCGACATCGGTGGTGCGGCG

   ValValGluAlaLeuGlyAspGlnVálProGluTvrGlyValAlaLeuHisAlaThrGln

   GTGGTCGAAGCCCTGGGCGACCAGGTACCGGAATACGAAGTGGCGCTGCATGCCACCCAG

   AlaMetValArgAlalleAlaAspThrPheGluAspValGluLeuMetAspThrTrpThr GCCATGGTCCGCGCCATTGCCGATACCTTCGAGGACGTGGAGCTGATGGATACCTGGACC

   TrpPheGlnSerGlylleAsnThrAspGlyAlaHisAsnProValThrThrArgLysVal TGGTTCCAGTCCGGCATCAACACCGACGGCGCGCACAACCCGGTGACCACCCGCAAGGTG

   AsnLysGlyAspIleLeuSerLeuAsnCysPheProMetlleAlaGlyTyrTyrThrAla

   AACAAGGGCGACATCCTCAGCCTCAACTGCTTCCCGATGATCGCCGGCTACTACACCGCG

   LeuGluArgThrLeuPheLeuAspHisCysSerAspAspHisLeuArgLeuTrpGlnVal TTGGAGCGCACCCTGTTCCTCGACCACTGCTCGGACGACCACCTGCGTCTGTGGCAGGTC

   AsnValGluValHisGluAlaGlyLeuLysLeuIleLysProGlyAlaArgCysSerAsp AACGTCGAGGTGCATGAAGCCGGCCTGAAGCTGATCAAGCCCGGTGCGCGTTGCAGCGAT

   -13CZ 279427 B6

   IleAlaArgGluLeuAsnGluIlePheLeuLysHisAspValLeuGlnTyrArgThrPhe . ATCGCCCGCGAGCTGAACGAGATCTTCCTCAAGCACGACGTGCTGCAGTACCGCACCTTC

   GlyTyrGlyHisSerPheGlyThrLeuSerHisTyrTyrGlyArgGluAlaGlyLeuGlu

   GGCTACGGCCACTCCTTCGGCACGCTCAGCCACTACTACGGCCGCGAGGCCGGGTTGGAA

   LeuArgGluAspIleAspThrValLeuGluProGlyMetValValSerMetGluProMet

   CTGCGCGAGGACATCGACACCGTGCTGGAGCCGGGCATGGTGGTGTCGATGGAGCCGATG

   IleMetLeuProGluGlyLeuProGlyAlaGlyGlyTyrArgGluHisAspIleLeuIle

   ATCATGCTGCCGGAAGGCCTGCCGGGCGCCGGTGGCTATCGCGAGCACGACATCCTGATC

   ValAsnGluAsnGlyAlaGluAsnlleThrLysPheProTyrGlyProGluLysAsnlle

   GTCAACGAGAACGGTGCCGAGAACATCACCAAGTTCCCCTACGGCCCGGAGAAAAACATC

   IleArgLys

   ATCCGCAAATGA nebo jeho ekvivalent, který je podle genetického kódu kódovým řetězcem pro stejný řetězec aminokyselin.
3. 3. Rekombinovaná DNA podle nároku 2 ve formě plasmidu pBT 2a-l, DSM 3148P.
4. 4. Rekombinovaná DNA podle nároku 2 ve formě plasmidu pBT 306.16, DSM 3149P.