JPS6116016B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は免疫学的凝集反応による凝集パターン
の判定方法に関するものであり、特に血球粒子の
凝集パターンから各種の血液型の判定や抗体、抗
原の検出を行なう粒子凝集パターン判定方法に関
するものである。

例えば、血液型の判定方法として、特公昭51―
16798号公報には、底面がワインカツプ状に彎曲
した反応容器を用い、この容器に遠心分離して得
られる被検血球の２〜５％の浮遊液と特定の抗血
清とを定量分注し、両者を撹拌した後、静置し、
次に遠沈を行ない、沈澱した血球を振りほどくよ
うに反応容器を激しく振動させた後、比較的ゆつ
くりと振動させて凝集成分を容器底面の中心部に
集めるようにして凝集パターンを形成し、これを
測光検出する方法が提案されている。すなわち、
凝集結合した粒子は迅速に容器の中央に集められ
るのに対し、結合していない粒子は溶液中に再び
分散し、容器中心部に集まらない現象を利用した
ものである。この血液型判定方法においては、遠
沈した後反応容器を激しく振つて沈澱した血球を
容器底面から分離させるものであるため、凝集結
合力の強いABO式血液型の判定に利用されてい
る。

しかし、RH式血液型を判定する場合とか、各
種の不規則抗体、抗原やHBs抗原等を検出する場
合のように結合力の弱い免疫学的凝集反応の場合
には、上述したような判定方法は利用できない。

すなわち、凝集結合力が弱いと、反応容器を振
動させることにより一旦結合した血球等の粒子が
分離してしまい、反応容器の中心部に集まらない
からである。そこで、HBs抗原の検出測定には、
円錐形の底面を有する反応容器を多数個設けたマ
イクロプレートを用いる方法が採られている。こ
の方法は、例えば10×12穴のマイクロプレートを
使用し、以下に示す手法でHBs抗原を検出測定す
るものである。

(1) Ｒ―PHA用緩衝液をマイクロプレートの各
穴に１滴（0.025ml）ずつ加える。

(2) 検体をダイリユーターに採り倍々希釈を２系
列ずつ10管まで行なう。

(3) 検体の希釈列の第１列にＲ―PHA緩衝液
を、第２列にＲ―PHA inhibition溶液をそれぞ
れ１滴（0.025ml）ずつ加える。

(4) マイクロミキサーで10秒間十分に振盪後、37
℃１時間インキユベートする。

(5) Ｒ―PHA cellを１滴（１％浮遊液0.025ml）
各穴に加える。

(6) マイクロミキサーで10秒間十分に振盪し、Ｒ
―PHA cellを均一に浮遊させる。

(7) 室温で振動を避け１時間静置後、凝集パター
ンを検出する。

かかる検出方法によれば、反応容器は検出直前
には振動を受けず十分静置されるから、沈降した
凝集体が分離されることはなく、比較的凝集結合
力の弱い免疫学的凝集反応による凝集パターンを
得ることができる。

一方、本願人は特願昭54―53370号において、
凝集結合力の強い自然抗体による血液型はもとよ
り凝集結合力の極めて弱い不規則抗体による血液
型をも十分に判定できる血液型判定方法を提案し
た。かかる血液型判定方法は、例えば底面が円錐
形の反応容器を用い、この反応容器に血液型を判
定すべき血液の血球粒子と標準抗血清試薬とをを
収容して撹拌し、比較的短い時間（約30分間）静
置した後に凝集パターンを検出して血液型を判定
するものである。この方法では、被検血球粒子が
抗血清試薬と反応する場合には沈降した血球粒子
が凝集するにつれ円錐形底面に雪のように薄く堆
積して一様堆積パターンを形成るが血球と抗血清
試薬とが反応しない場合には血球粒子は凝集せ
ず、離散したまま沈降し、円錐形底面に到達する
とその斜面を転がり落ち、円錐底面の中央に集合
して集積パターンを形成する。したがつて、円錐
底面にできる抗血清試薬との反応の有無による沈
降血球粒子のパターンの相違を光学的に検出する
ことにより、血液型を判定することができる。

上述した各種の凝集パターン判定方法において
は、反応容器の底部に形成される凝集パターンを
いかにして検出するから問題である。例えばワイ
ンカツプ状の反応容器を用いる特公昭51―16798
号公報に記載された方法では、反応液を透過する
光量を検出する混濁度測定方法を採用している。
すなわち、反応液中を光束が通過するときに、液
面から底面に到る液中に浮遊している血球粒子に
より吸収の度合が変化し、これを光電的に測定す
るようになつている。前記公報の第３３図に示さ
れている実施例ではワインカツプ状の反応容器の
上方から光を入射させ、反応容器の下方に、中心
開口およびこれを囲む環状開口を有するマスクを
配置し、中心開口を通つた光を第１の受光素子に
入射させ、環状開口を通つた光をレンズを介して
第２の受光素子に入射させるように構成してい
る。したがつて、反応容器中の反応液の中央部を
通り、第１の受光素子に入射した光の光量は反応
液の中央部の混濁度を表わすものとなり、反応液
の周辺部を通り、第２の受光素子に入射した光の
光量は反応液の周辺部の混濁度を表わすものとな
る。したがつて、反応液の中心部を通る光の光量
が基準値よりも減少すると共に周辺部を通る光の
光量が基準値よりも増大すれば、これを「凝集」
と判断し、中心部および周辺部を通る光の光量が
基準値に対して変化していなければ、「非凝集」
と判断することができる。このような凝集パター
ンの検出判定法は、反応容器の底部中央に形成さ
れる凝集塊から中央部測光用開口までの距離が凝
集パターンの横方向の広がりに比べて小さい場合
には問題はないと考えられるが、凝集塊から中央
開口までの距離が長くなると、反応液の周辺部に
入射した光が粒子により散乱され、中央開口を通
つて第１受光素子に入射したり、この逆に中央部
に入射した光が粒子により散乱され、環状開口を
通つて第２受光素子に入射する光量が多くなり、
正確な測光ができなくなる欠点がある。すなわ
ち、反応容器の径が底部の厚みに比較して大き
く、物理的配置の関係上、開口をあけたマスクを
反応容器のの底部に十分近接して配置することが
できない場合や、容器底部から照明し、容器上方
で受光する必要があるため、マスクを反応液に十
分近付けて配置することができない場合には、反
応液中の粒子による散乱光が測光精度を低下さ
せ、正確な判定が不可能となる。このような欠点
を除くためには、混濁度の差を大きくするために
反応容器を大きくすることが考えられるが、この
場合にはサンプル量が多くなり、微量サンプルの
分析ができなくなる。また、検出光学系が相当複
雑であり、特に反応容器が大きいときは問題がな
いが、サンプル量を減らすために小さい反応容器
を用いる必要があるときは、検出光学系を小形に
することが因難であり、製造、調整が難かしくな
る。

さらに上述した沈降粒子により反応容器底面に
形成される凝集パターンを検出判定る場合には、
上述し混濁度測定方法を採用したのでは測定精度
が上がらず、正確な判定はできない。特にこのよ
うに沈降する粒子により反応容器底面に形成され
る一様堆積パターンおよび集積パターンを自動的
に検出判定する場合には、相当精度の高い検出装
置が必要である。特に反応容器の底面に形成され
る凝集パターンは必らずしも明瞭には形成され
ず、一様堆積パターンと集積パターンとの中間の
状態のパターンも形成されることもあり、このよ
うな中間パターンをも含めて、凝集パターンを正
確に読取つて判定する必要もある。さらに、凝集
パターンを光電的に検出する際には、個々の反応
容器の底面に形成された傷、底面に付着したご
み、個々の反応容器の透過率のバラツキ、個々の
反応液の濃度のバラツキ、光源の変動、光源の照
明むら等の種々の要因が混入し、これらはバツク
グランドノイズとなる。このようなバツクグラン
ドノイズのため、正確な判定が因難になることが
ある。また、このようなバツクグランドノイズに
よる影響を軽減するのには、凝集パターンを明瞭
に形成する必要があるが、このためには静置時間
を十分に長くとる必要があり、処理能率が低下す
ると共に試料の量を多くする必要があり、超微量
の分析は因難となる。

本発明の目的は、上述した従来の種々の欠点を
除去し、上述したバツクグランドノイズによる影
響を除去し、反応容器の底面に形成される凝集パ
ターンを正確に検出して判定することができ、し
かも容易かつ安価に実施することができると共に
微量の試料の判定結果を迅速に得ることができる
粒子凝集パターンの判定方法を提供しようとする
ものである。

本発明は、底面の少く共一部を傾斜面とした反
応容器に収容した反応溶液中の粒子が沈降して底
面に形成される粒子凝集パターンを光電的に検出
判定するに当たり、容器底面を一様に照明し、こ
の底面の像を結像レンズにより受光装置の受光面
に結像させるようにし、前記反応容器面に凝集パ
ターンが形成される以前に底面の像を受光装置に
より検出し、その出力をバツクグランドノイズと
して記憶しておき、次に凝集パターンの形成途中
または形成後に底面の像を受光装置により検出
し、その出力から前記記憶しておいたバツクグラ
ンドノイズを減算し、この減算出力を処理して凝
集パタンの判定を行なうことを特徴とするもので
ある。

以下図面を参照して本発明を詳細に説明する。

第１図は本発明による粒子凝集パターン判定方
法を実施する装置の一例の構成を示す線図であ
る。光源ランプ１の光をコリメータレンズ２によ
り平行光束とし、拡散板３を介して反応容器４に
一様に入射させる。反応容器４の底面を円錐形と
する。粒子凝集反応による免疫学的分析を行なう
に当つては、例えば反応容器４に、例えば試料血
液の血球浮遊液を所定量分注し、次に抗血清試薬
を所定量分注し、撹拌後、ほぼ静置状態として血
球粒子を沈降させ、容器底面に形成される凝集パ
ターンを検出して判定を行なう必要がある。

第２図は反応容器４の底面の拡大図であり、円
錐状の底面に粒子が結合凝集して一様に堆積した
状態を示してある。このような一様堆積パターン
は、例えばABO式の血液型判定を行なう場合
に、Ａ型の試料血液の血球浮遊液にＡ型の抗血清
試薬を加えて自然沈降させたときに得られるもの
である。すなわちこの場合には静置により沈降し
た血球粒子は底面において互いに結合し、傾斜面
を転がり落ちることが少ないので、底面にほぼ一
様に堆積される。この一様堆積パターンを詳細に
観察すると、中央の最下部５Ａには相当厚く堆積
しているのに対し、周辺部５Ｃではそれに比べて
やや薄く堆積しており、それらの間の中間部５Ｂ
ではほぼ連続的に厚さが変化している。

本発明では、このように反応容器４の底面４Ａ
に形成される凝集パターンを焦点深度の深い結像
レンズ６により受光装置７上に結像して検出する
ものであるが、本例ではその中心部５Ａと周辺部
５Ｃとの明るさの相違に基いて検出するものと
し、そのために第３図に示すように受光装置７に
は中心部に配置した第１の受光素子７Ａと、周辺
部の配置した第２の受光素子７Ｂとを設ける。こ
れら受光素子７Ａおよび７Ｂの出力をそれぞれ増
幅器８Ａおよび８Ｂで増幅した後、A/D変換器９
でデイジタル量に変換し、これをメモリ１０内に
記憶する。本発明では上述した検出は、反応容器
４内に試料と試薬とを分注した直後、すなわち底
面４Ａに凝集パターンが形成される以前に行な
い、その時に受光装置７から得られる出力をメモ
リ１０内に記憶する。このように凝集パターン形
成以前に検出した出力は、反応容器４の底部にで
きた傷、付着したゴミ、透過率のバラツキ、反応
液の濃度のバラツキ、光源１の変動、照明むら等
の要因を表わすものであり、これをバツクグラン
ドノイズと称する。このようなバツクグランドノ
イズが存在するため、凝集パターンの検出は正確
に行なわれないと共に凝集パターンが完全に形成
されるまで検出を待たなければならず、処理能力
が低くなる欠点がある。

本発明においては、このような欠点を除くため
に、第１図に示すように、光源ランプ１ コリメ
ータレンズ２、拡散板３、結像レンズ６および受
光装置７と全く同じ構造および特性を有する光源
ランプ１′、コリメータレンズ２′、拡散板３′、
結像レンズ６′および受光装置７′を設ける。反応
容器４は矢印Ａで示すように第１の測光位置から
第２の測光位置まで移動させる。第２の受光装置
７′の２つの出力をそれぞれ増幅器８A′および８
B′を経て第１および第２の差動増幅器１１Ａおよ
び１１Ｂの一方の入力端子に供給する。これら差
動増幅器の他方の入力端子にはアドレス指定回路
１２により指定された位置に記憶されているデイ
ジタル量を読み出し、これをD/A変換器１３でア
ナログ量に変換した信号を供給する。このアナロ
グ信号は上述したように中心部および周辺部にお
けるバツクグランドノイズを表わすものである。
第１および第２の差動増幅器１１Ａおよび１１Ｂ
において、第２受光装置７′の出力からこのバツ
クグランドノイズ成分は除去され、したがつて真
に凝集パターンを表わす信号だけが出力される。
これら出力を第３の差動増幅器１４に供給して、
凝集パターンの中心部と周辺部との差を求める。
さらにこの差出力を第４の差動増幅器１５の一方
の入力端子に供給し、他方の入力端子には基準電
圧源１６から所定の値に調整した基準電圧を印加
する。第２図に就き上述したように一様堆積パタ
ーンにおいては中心部５Ａと周辺部５Ｂとの明る
さの差は少なく、したがつて第３差動増幅器１４
から供給される差出力は基準値よりも小さく、第
４差動増幅器１５の出力は、例えば０ボルトであ
る。これに対し、凝集結合反応が起こらず、沈降
した粒子が反応容器底面を転がつて中央部に集積
する集積パターンでは周辺部の明るさは中央部の
明るさに比べて明るいので、第３差動増幅器１４
からの差出力は基準値よりも大きくなり、第４差
動増幅器１５の出力は、例えば＋15Vと大きくな
る。このようにして第４差動増幅器１５から得ら
れる出力を判定表示回路１７に供給することによ
り、反応容器底面４Ａに形成される凝集パターン
を判定し、その結果をプリントアウトしたり、表
示したりすることができる。

上述したように本発明においては、凝集結合反
応が進行る以前にバツクグランンドノイズを予じ
め検出し、これを記憶しておき、凝集結合が進
み、凝集パターンが形成される途中または形成後
に検出した信号からの前記のバツクグランドノイ
ズを除去した後の信号を処理して凝集パターンの
判定を行なうようにしたため、バツクグランドノ
イズに影響されない正確な判定が行なえると共
に、凝集パターンが完全に形成される以前におい
ても判定が可能であるから、処理能率が著しく向
上することになる。また、試料および試薬も微量
で足りる利点がある。

本発明は上述した例にのみ限定されるものでは
なく、幾多の変形、変更が可能である。例えば上
述した例では測光部を２個所設けたが、勿論１個
所だけで設け、これにより被検液を２回測光する
こともできる。この場合には、第１および第２の
測光部のバラツキの影響は全くなくなる。また、
上述した例では測光を２回行なつたが、それ以上
の回数測光することもできる。からに信号処理回
路の構成についても種々の変形例が考えられる。
例えば第１図に示す例では第３差動増幅器１４の
出力を１個の基準値と比較したが、異なるレベル
の複数の基準値と比較することもできる。さらに
上述した例ではメモリ１０をデイジタルメモリと
し、第１の受光装置７の出力をA/D変換器９でデ
イジタル量とした後記憶したが、アナログメモリ
を用いることもでき、この場合にはA/D変換器９
およびD/A変換器１３を省くことができる。

第４図は信号処理回路の他の例を示すものであ
り、第１図に示したものと同じ部分には同じ符号
を付して示す。本例では第１の受光装置７の出力
の差を予じめ記憶しておき、これを第２の受光装
置７′の出力の差から減算するものである。この
ために第１受光装置７の第１および第２の受光素
子７Ａおよび７Ｂからの出力をそれぞれ増幅器８
Ａおよび８Ｂで増幅した後、第１差動増幅器２０
に供給し、これらの差を求める。この差をA/D変
換器９でデイジタル量に変換してデイジタルメモ
リ１０に記憶する。一方第２受光装置７′の第１
および第２の受光素子７A′および７B′からの出
力をそれぞれ増幅器８A′および８B′で増幅した
後第２差動増幅器２１に供給し、これらの差を求
め、これを第３差動増幅器２２の一方の入力端子
に供給する。このとき、他方の入力端子にはアド
レス指定回路１２で指定されるメモリ１０のアド
レス位置から読出した差信号を供給し、これら両
差信号の差を求める。この第３差動増幅器２２の
差出力を第１図と同様に第４差動増幅器１５にお
いて基準電圧源１６からの基準値と比較し、その
比較結果を判定・表示回路１７に供給する。

さらに上述した例では円錐形の底面を有する反
応容器を用いたが、片流れ屋根形、切妻屋根形、
ピラミツド形などの種々の形状の底面を有する反
応容器を用いることもできる。

また受光装置の構成も種々の変形が可能であ
り、例えば第５図Ａに示すように第１および第２
の受光素子３０Ａおよび３０Ｂを中心部と周辺部
に配置したり、第５図Ｂに示すように多数の受光
素子３１Ａ〜３１Ｊを分布させて配置したり、第
５図Ｃに示すようにCCDのようなリニア固体撮
像装置３２を直径方向に配列したり、第５図Ｄに
示すように３つの受光素子３３Ａ〜３３Ｃを同心
円状に配列することもできる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の粒子凝集パターン判定方法を
実施する装置の一例の構成を示す線図、第２図は
同じくその反応容器およびその底面に形成される
凝集パターンを示す図、第３図は受光装置一例の
構成を示す平面図、第４図は本発明方法を実施す
る装置の変形例を示す線図、第５図Ａ，Ｂ，Ｃお
よびＤは受光装置の変形例を示す平面図である。 １，１′…光源ランプ、２，２′…コリメータレ
ンズ、３，３′…拡散板、４…反応容器、６，
６′…結像レンズ、７，７′…受光装置、１０…メ
モリ、１１Ａ，１１Ｂ，１４，１５，２０，２
１，２２…差動増幅器、１６…基準電圧源、１７
…判定表示回路。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 底面の少く共一部を傾斜面とした反応容器に
   収容した反応溶液中の粒子が沈降して底面に形成
   される粒子凝集パターンを光電的に検出判定する
   に当たり、容器底面を一様に照明し、この底面の
   像を結像レンズにより受光装置の受光面に結像さ
   せるようにし、前記反応容器底面に凝集パターン
   が形成される以前に底面の像を受光装置により検
   出し、その出力をバツクグランドノイズとして記
   憶しておき、次に凝集パターンの形成途中または
   形成後に底面の像を受光装置により検出し、その
   出力から前記記憶しておいたバツクグランドノイ
   ズを減算し、この減算出力を処理して凝集パター
   ンの判定を行なうことを特徴とする粒子凝集パタ
   ーン判定方法。