JPS61128895A - Production of useful substance using coenzyme recovery reaction - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To produce a useful substance efficiently by the use of a small amount of expensive NAD(P), by carrying out an enzymatic reduction reaction in the presence of L-malic acid and malic dehydrogenase by the use of NAD(P)H and a dehydrogenase or a reductase. CONSTITUTION:An enzymatic reduction reaction using NADH or HADPH and a dehydrogenase and a reductase is carried out in the presence of L-malic acid and malic dehydrogenase(decarboxylation reaction type). An enzyme used for a reduction reaction of NAD(P) may be an enzyme which is treated with L-malic acid in the presence of NAD(P) to give NAD(P)H, pyruvic acid and CO2, and malic dehydrogenase derived from any origin may be used. USE:For producing various amino acids, lactic acid, tetrahydrofolic acid, alkaloid, carnitine, 1-ketochenodeoxycholic acid, etc.

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は補酵素再生反応を利用した有用物質の製造方法
に関する。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION [Industrial Field of Application] The present invention relates to a method for producing useful substances using a coenzyme regeneration reaction.

〔従来の技術〕[Conventional technology]

従来酵素反応を利用した有用物質製造法としては、プロ
テアーゼ、アミラーゼ等の加水分解酵素を利用した方法
が大部分であった。しかしながら、それらの方法で実施
可能な分野には限があり、多方面での酵素反応を利用し
た有用物質生産を検討する場合には加水分解酵素以外の
酵素を利用する必要があることは当然である。Most conventional methods for producing useful substances using enzymatic reactions have been methods using hydrolytic enzymes such as protease and amylase. However, there are limits to the fields in which these methods can be implemented, and when considering the production of useful substances using enzyme reactions in a variety of fields, it is natural that enzymes other than hydrolytic enzymes need to be used. be.

脱水素酵素反応の生成物にはステロイド化合物、アルカ
ロイド、アミノ酸類、有機酸類等の有用な化合物が多く
、有用物質の生産には種々の脱水素酵素を利用する可能
性が考えられる。The products of dehydrogenase reactions include many useful compounds such as steroid compounds, alkaloids, amino acids, and organic acids, and it is thought that various dehydrogenases may be used to produce useful substances.

当然のことであるが、脱水素酵素を用いて物質１モルを
還元するには通常１モルのＮ’ＡＤ　（Ｐ）Ｈが１モル
のＮＡＤ（Ｐ）に酸化される。ＮＡＤ（ＰＩＨは高価で
あるためこのままでは産業的に利用価値を持たない場答
が多い６通常は、主反応とは別に、反応液中に別の脱水
素酵素舎添加して、同時に副反応としてＮＡＤ（Ｐ）か
らｒｑ′ＡＤ（ｐ）Ｈへの還元反応をおこなわせる場合
が多い。As a matter of course, in order to reduce one mole of a substance using a dehydrogenase, normally one mole of N'AD (P)H is oxidized to one mole of NAD(P). Because NAD (PIH) is expensive, there are many cases where it has no industrial utility value as it is 6 Usually, separate from the main reaction, another dehydrogenase is added to the reaction solution, and at the same time as a side reaction. In many cases, a reduction reaction from NAD(P) to rq'AD(p)H is carried out.

例えば乳酸脱水素酵素（以後ＴＪＤＨと略する）によっ
て乳酸からピルビン酸を生成させると共にＮＡ、ＤをＮ
ＡＤＩ（に還元し、同時に反応液中にアンモニウム塩と
アラニン脱水素酵素（以後Ａ１ａＤＨ）を共存させるこ
とでＬ−アラニンを生産させる試みが報告されている〔
バイオキミカ・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉ
ｍ、　Ｂｉｏ−ｐｈｙｓ、　Ａｃ’ｔａ、）３７０巻、
３２９頁（１９７４年）参照〕。For example, pyruvic acid is produced from lactic acid by lactate dehydrogenase (hereinafter abbreviated as TJDH), and NA and D are
An attempt has been reported to produce L-alanine by reducing ADI (to
Biochimica Biophysica Acta (Biochi
m, Bio-phys, Ac'ta,) 370 volumes,
See page 329 (1974)].

このような反応を長時間実施するためには、ＮＡＤ（Ｐ
）およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈが共に安定なｐＨ領域で反応を
行う必要がある。ＮＡＤ（Ｐ）はアルカリ領域で不安定
であり、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈは酸性領域で不安定であるので
実際に実施可能なｐＨ領域は６〜８と考えられている。In order to carry out such a reaction for a long time, NAD(P
) and NAD(P)H are both stable in the pH range. Since NAD(P) is unstable in an alkaline region and NAD(P)H is unstable in an acidic region, the practical pH range is thought to be 6 to 8.

しかしながらＬＤＨの触媒する酵素反応り一乳酸＋ＮＡ
Ｄ＋；コピルピン酸十ＮＡＤＨ＋Ｈ＋功化学平衡係数は
中性領域ではＫｅ、ｑ、　＝　２．８　ＸＩ　Ｑ７１２
（２５°Ｃ）と著しく乳酸生成に傾いているため、　Ｎ
Ａ、Ｄ（Ｈ）の安定領域でＬ−アラニンの効果的な生産
を実施するのはなかなか困難であった。However, the enzymatic reaction catalyzed by LDH - lactic acid + NA
D+: Copyrupic acid 10 NADH + H+ Chemical equilibrium coefficient is Ke, q, = 2.8 XI Q712 in the neutral region
(25°C), which favors lactic acid production.
It has been difficult to effectively produce L-alanine in the stability region of A and D(H).

ＮＡＤのＮＡＤＨへの還元方法としては、他にアルコー
ル脱水素酵素（Ａ’ＤＨと略す）、グルコース６−りん
酸脱水素酵素（”’ａ６ｐＤＨと略す）をもちいる方法
があるが、これらの酵素もＬＤＨと同様な゛理由で中性
領域での酵素反応には利用し難い欠点を有している。中
性領域でＮＡＤの還元反応に応用可能な酵素として最近
良く利用される酵素にギ酸脱水素酵素（ＦＤＨと略す）
がある。ＦＤＨは次式 ％式％ の反応を触媒し、生成した。　ｏ　ｔ’が反応系外にｍ
５いために反応が中性領域でも良く進行するものと考え
られている。しかしながら、基質のギ酸が人体に有毒で
腐蝕性を有する点から工業的規模での応用は困難と考え
られた。Other methods for reducing NAD to NADH include methods using alcohol dehydrogenase (abbreviated as A'DH) and glucose 6-phosphate dehydrogenase (abbreviated as 'a6pDH), but these enzymes For the same reason as LDH, it has the disadvantage that it is difficult to use for enzymatic reactions in the neutral range. elementary enzyme (abbreviated as FDH)
There is. FDH was produced by catalyzing the reaction of the following formula. o t' is outside the reaction system
It is believed that the reaction proceeds well even in the neutral region because of the However, because the substrate, formic acid, is toxic and corrosive to the human body, it was considered difficult to apply it on an industrial scale.

他方ＮＡＤＩ’の再生循環反応を利用する有用物質生産
法としては植物アルカロイドの転換反応への応用が知ら
れている〔アナリテイカル・バイオ　ケ　ミ　ス　ト　
リ　−（Ａｎａｌｙｔｉｏａｌ　　Ｂｉｏｃｈθｍ１ｓ
ｔｒｙ　　）１１６巻、４６２頁、（１９８１年）〕即
ち、組織培養した植物細胞のカテナミン・レダクターゼ
（、０ａｔｂθｎａｍｉ４θｒｅｄｕｃｔａｓｅ　）を
用いてアルカロイドの還元反応を行う場合にイソクエン
酸とインクエン酸脱水素酵素を共存させると七によって
ＮＡＤＰの再生循環使用が報告今れている。On the other hand, as a method for producing useful substances that utilizes the regenerative circulation reaction of NADI', application to the conversion reaction of plant alkaloids is known [Analytical Biochemist]
Re-(Analytioal Biochθm1s
Try) Vol. 116, p. 462 (1981)] That is, when performing an alkaloid reduction reaction using catenamine reductase (atbθnami4θreductase) from tissue-cultured plant cells, isocitrate and incitrate dehydrogenase are allowed to coexist. The regenerative and cyclical use of NADP has been reported by and seven researchers.

しかしながらこの場合には、基質の一つとして使用する
イソクエン酸が非常に高価であることが問題である。However, in this case, the problem is that isocitric acid used as one of the substrates is very expensive.

ＮＡＤＰＨ’の再生方法としては、他に０６１’ＤＨ，
グルタミン噛脱水素酵素を用いる方法が知られているが
、これらの酵素もＬＤＨの場合と同様に、中性ｐＨ域で
は平衡がＮ−ＡＤＰ　ＮＥ成力方向傾いているため、上
記目的には有効ではない。Other methods for regenerating NADPH' include 061'DH,
A method using glutamine dehydrogenase is known, but as in the case of LDH, the equilibrium of these enzymes is tilted toward N-ADP NE formation in the neutral pH range, so they are not effective for the above purpose. isn't it.

〔発明が解決しようとする問題点〕[Problem that the invention seeks to solve]

１％ｌ　　＋、　’準−？イ４−表しよＩ−箋マａ　ｒ
ｙ　／Ｔｌｌ　　甫ル任蕩ば中えＮＡＤ（Ｐ）およびＮ
ＡＤ（１？ｌＨが共に安定な中性付近のｐＨ領域で実施
するためにはＮ　ＡＤ　（Ｐ）の還元反応を中性付近の
ｐＨ領域で効果的に進行させ得るシステムを完成させる
ことが必須と考えられた。ＦＤＨを用いた場合には中性
付近のｐＨでの反応が可能であるがギ酸の有毒性が障害
になると考えられた。なお、ＮＡＤ　（Ｐ）　Ｈと種々
の脱水素酵素によるＮＡＤ　（Ｐ）生成方向への反応は
通常中性ｐＨで効果的に進行することは良く知られた現
象である。1%l +, 'semi-? I4-Represent I-Notebook a r
y/Tll NAD (P) and N
In order to carry out the reduction reaction of NAD (P) in a pH region around neutrality where both AD(1?lH) are stable, it is essential to complete a system that can effectively proceed the reduction reaction of NAD(P) in a pH region around neutrality. When FDH was used, the reaction was possible at a pH around neutrality, but the toxicity of formic acid was thought to be an obstacle. It is a well-known phenomenon that the reaction toward the production of NAD (P) normally proceeds effectively at neutral pH.

他方、本発明者らは、既にりんご酸脱水素酵素（脱炭酸
反応型）（以下ＭＡＤＨと略記する）を用いる効果的な
ＭＡＤ（Ｐ）からのＮＡＤ（Ｐ）Ｈの製造法を開発して
きた（特願昭５９−６０１００号、特願昭５９−８９９
８２号、特願昭５９−１９７０８０号、特願昭５９−！
９７０８１号）。これらの方法においてはＭＡＤ（Ｐ）
、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの共に安定なる中性付近のｐＨ域にお
いて、効果的にＮＡＤ、（Ｐ）の還元が可能であること
が確かめられている。On the other hand, the present inventors have already developed an effective method for producing NAD(P)H from MAD(P) using malate dehydrogenase (decarboxylation type) (hereinafter abbreviated as MADH). (Patent Application No. 1983-60100, Patent Application No. 59-899
No. 82, Special Application No. 197080, Special Application No. 1970-!
No. 97081). In these methods MAD(P)
It has been confirmed that it is possible to effectively reduce NAD and (P) in a pH range around neutrality where both NAD and (P)H are stable.

本発明の目的は、本発明者らが見い出したＮＡＤ（Ｐ）
の再生還元方法と種々の脱水素酵素反応を組み合わせる
ことによる、ＮＡＤ　（Ｐ）再生循瑣反応を利−用した
有用物質製造法を提供することにある。The object of the present invention is to obtain NAD(P) discovered by the present inventors.
The object of the present invention is to provide a method for producing a useful substance using a NAD (P) regeneration cycle reaction by combining a regeneration reduction method with various dehydrogenase reactions.

〔問題点を解決するための手段〕[Means for solving problems]

本発明を概説すれば、本発明は補酵素再生反応を利用し
た有用物質製造方法に関する発明であって、ＮＡＤＨま
たはＮＡＤＰＩ（と脱水素酵素または眉元酵素とを用い
酵素的還元反応によって物質を生産する方法において、
Ｌ−りんご酸とＭＡＤＩ（との存在下で反応を行うこと
を特徴とする。To summarize the present invention, the present invention relates to a method for producing a useful substance using a coenzyme regeneration reaction. In the method of
It is characterized in that the reaction is carried out in the presence of L-malic acid and MADI.

本発明の上記方法によれば、高価なＮＡ、Ｄ　（Ｐｉを
少量使用することで効率良く有用物質の生産を達成する
ことが可能である６゜また、反応はＭＡＤ（Ｐ）および
ＮＡＤ（ＰＩ　Ｈの共に安定なｐ）Ｉ領域で実施可能な
ために、反応中の補酵素の分解は殆んど見られず、反応
後回収することで繰り、返し使用することも可能である
、このように本発明方法は非常に有効な工業的物質生産
方法を提供するもので−ある。According to the above method of the present invention, it is possible to efficiently produce useful substances by using a small amount of expensive NA, D (Pi). Because it can be carried out in the stable p)I region of H, there is almost no decomposition of the coenzyme during the reaction, and it can be used repeatedly by recovering it after the reaction. The method of the present invention provides a highly effective industrial method for producing substances.

不発１男に使用するＬ−りんご酸は安価な原料であるフ
マール酸よりフマラーゼの作用によって容易に生産する
ことが可能である。The L-malic acid used for the misfired first son can be more easily produced by the action of fumarase than fumaric acid, which is a cheap raw material.

次に本発明を更に詳しく説明する。Next, the present invention will be explained in more detail.

本発明のＮＡＤ（Ｐ）の還元反応に使用する酵素はＮＡ
Ｄ（Ｐ）存在下にＬ−りんご酸に作用してＮＡＤ（ＰＨ
１（を生産すると共にピルビン酸および炭酸ガスを生成
する酵素であれば、いずれの起源の、りんご酸脱水素酵
素（脱炭酸反応型）でも良い。The enzyme used in the reduction reaction of NAD(P) of the present invention is NA
In the presence of D(P), it acts on L-malic acid to form NAD(PH
Malate dehydrogenase (decarboxylation reaction type) of any origin may be used as long as it produces pyruvic acid and carbon dioxide while producing pyruvic acid and carbon dioxide gas.

−上記酵素としては酵素番号ＰｎＣ１，１，１，、，３
８に属しＨＡＤを特異的に補酵素とする酵素７、酵素番
号ＥＯ１，，１，１，３９に属しＮＡＤまたはＮＡ、Ｄ
Ｐｌを補酵素とする酵素および、酵素番号Ｅ、ｔ１．ｌ
ｄ、ｉ、　−４０に属しＮＡＤＰ・を特異的に補酵素と
する酵素が挙げられる。本発明方法においては上記の３
種類の酵素のうち、いずれの酵素でも使用することがで
きるが酵素の性質、および補酵素の要求性を考慮して各
々の場合に最適き考えられるＭＥを使用すれば良い。-The above enzymes have enzyme numbers PnC1, 1, 1, , 3
Enzyme 7, which belongs to the enzyme number EO1, 1, 1, 39 and which specifically uses HAD as a coenzyme, NAD or NA, D
Enzymes with Pl as a coenzyme, enzyme numbers E, t1. l
Examples include enzymes that belong to the d, i, and -40 groups and specifically use NADP as a coenzyme. In the method of the present invention, the above 3
Although any of the various types of enzymes can be used, it is sufficient to consider the properties of the enzyme and the requirements for coenzymes and to use the ME that can be considered optimal in each case.

上記三種のＭＡＤＨによるＮＡＤ（Ｐｉの還元反応、の
条件については本発明者らの既に特許出願し、た特許出
願明細書に詳しく記載されている（特願昭５９−６０１
００号、特願昭５９−８９９８２号、特願昭５９−１９
７０８１号）。The conditions for the reduction reaction of NAD (Pi reduction reaction) using the three types of MADH mentioned above are described in detail in the patent application specification filed by the present inventors (Japanese Patent Application No. 59-601).
No. 00, Japanese Patent Application No. 59-89982, Japanese Patent Application No. 59-1989
No. 7081).

上述した如く本発明にはＥＯ１，，１，１，３ｇおよび
ＲｉＯ１，１，１，４０のＭＡＤＨも使用可能であるが
ＩＯ１，１，１，３９のＭＡＤＨはＮＡ：ｏ、ＮＡＤ：
ｐ＋を共に補酵素とし得る点でＮＡＤ関午脱水素酵素お
よびＮＡＤＰ。As mentioned above, MADH of EO1,,1,1,3g and RiO1,1,1,40 can also be used in the present invention, but MADH of IO1,1,1,39 is NA:o, NAD:
NAD dehydrogenase and NADP in that both p+ can be used as coenzymes.

関与脱水素酵素の関与する酵素反応に共に使用できる点
で効率的である。It is efficient in that it can be used together with enzymatic reactions involving participating dehydrogenases.

本発明者らはアクロモバクタ−・バルブラス（Ａｏｈｒ
ｏｍｏｂａａｔｅｒ　ｐａｒｖｕｌｕｓ）にこの型のＭ
入ＤＨ生産能を見い出した（特願昭５９−１９７０８０
号）ので本発明の説明にはこの酵素を用いた実験で説明
するが本発明はこれに限定されない。The present inventors have discovered that Achromobacter bulbulas (Aohr)
This type of M
Discovered the ability to produce input DH (patent application 197080-1980
Therefore, the present invention will be explained using experiments using this enzyme, but the present invention is not limited thereto.

ＭＡＤＨの調製方法は特願昭５９−１９７０８０して使
用した。すなわち洗浄菌体を非イオン界面活性剤−例え
ばトライトンＸ−１００（ローム・アンド・ハース社製
）を０．１％共存、させて−晩凍結保存することにより
細胞の透過性を向上させ、菌体を直接酵素標品として用
いることも可能である。The method for preparing MADH was disclosed in Japanese Patent Application No. 59-197080. That is, by freezing and preserving the washed bacterial cells overnight in the coexistence of 0.1% nonionic surfactant such as Triton X-100 (manufactured by Rohm and Haas), cell permeability is improved and the bacterial It is also possible to directly use the body as an enzyme preparation.

更に菌体は力？ゲナン、アルギン酸ソーダ等でビーズ状
に固定化することにより固定化菌体として反応に利用す
るこ吉も可能である。Moreover, is the bacterial body a force? It is also possible to use Kokichi in the reaction as immobilized bacterial cells by immobilizing them in the form of beads with genane, sodium alginate, etc.

反応に使用するりんご酸はＬ一体またはＩ）Ｌ一体が使
用出来る。The malic acid used in the reaction can be L monolithic acid or I)L monolithic acid.

なお、アンモニウム源としては各種アンモニウム塩類や
水酸化アンモニウム等が使用出来る。Note that various ammonium salts, ammonium hydroxide, etc. can be used as the ammonium source.

酵素反応は常圧条件下でも可能であるが、減圧条件で実
施した場合にはＲＩＩＡＤ　Ｈ反応の結果生成する炭酸
ガスがほぼ完全に反応系外に除去できるので反応を効率
的に良く行うことが出来る場合が多い。The enzymatic reaction is possible under normal pressure conditions, but when carried out under reduced pressure conditions, the carbon dioxide gas produced as a result of the RIIAD H reaction can be almost completely removed from the reaction system, making it possible to carry out the reaction efficiently. In many cases it is possible.

反応温度は実際に使用する基質の安定性を考慮して設定
するが、通常は２０〜４０”Ｃ１好ましくは２５〜３０
’Ｃで行う。The reaction temperature is set taking into consideration the stability of the substrate actually used, but is usually 20-40" C1, preferably 25-30"
' Do it in C.

反応ｐＨは６〜９、特にｐＨ，−７〜８が好ましい。The reaction pH is preferably 6 to 9, particularly preferably -7 to 8.

反応時間は目的物質の生産が最大に達するまで行うが通
常数時間から数日間である。The reaction time is usually several hours to several days, although the reaction time is continued until the production of the target substance reaches its maximum.

Ｌ−りんご酸および製造目的物質の原料の濃度は製造目
的物質および使用する脱水素酵素または還元酵素の種類
により最適条件を決定する。The optimum concentration of L-malic acid and the raw material for the substance to be manufactured is determined depending on the substance to be manufactured and the type of dehydrogenase or reductase used.

本発明により製造される有用物質はＮＡＤＨまたはＮＡ
ＤＰＨ；再生反応を利用した、脱水素酵素または還元酵
素反応生成物であれぽいか々る物質でも良いが、具体例
としては各種アミノ酸、乳酸、テトラヒドロ葉酸、アル
カロイド、カルニチン、１２−ケトケノデオキシコール
酸等が挙げられる。The useful substance produced by the present invention is NADH or NA
DPH: Any substance such as a dehydrogenase or reductase reaction product using a regeneration reaction may be used, but specific examples include various amino acids, lactic acid, tetrahydrofolic acid, alkaloids, carnitine, 12-ketochenodeoxycholic acid, etc. can be mentioned.

次に試験例により本発明の反応条件を詳細に検討した結
果を示す。Next, the results of a detailed study of the reaction conditions of the present invention using test examples will be shown.

試験例　Ｉ Ｌ−りんご酸からＤＬ−アーラニンの生産Ｌ−りんご酸
はＮＡＤ共存下ＭＡＤＨによってピルビン酸、炭酸ガス
およびＮＡＤＨに転換し、ピルビン酸はＮＡＤＨ共存下
ＡｌａＤＨによってＬ−アラニンに転換すると共にＮＡ
Ｄを生産する。Ｌ−アラニンはアラニンラセマーゼ（以
後ＡＲと略す）の作用でＤＩ・−アラニンとなる。ＭＡ
ＤＨ粗酵素液にはアクロモバクタ−・パルブラスエＦＯ
−１３１８２の超音波破砕液を、ＡｌａＤＨ粗酵素液に
はコリネバクテリウム０フラツカムフアシエンス（ａｏ
ｒＶｎθｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｌａｃａｕｍｆａｃｉｅ
ｎｓ）　ＡＨＵ　−１６２２の超音波破砕液を適当に処
理して使用する。Test Example I Production of DL-arlanine from L-malic acid L-malic acid is converted to pyruvic acid, carbon dioxide and NADH by MADH in the presence of NAD, and pyruvic acid is converted to L-alanine by AlaDH in the presence of NADH, and NA
Produce D. L-alanine becomes DI·-alanine by the action of alanine racemase (hereinafter abbreviated as AR). M.A.
Achromobacter parvulusae FO was added to the DH crude enzyme solution.
-13182 ultrasonic disruption solution, and the AlaDH crude enzyme solution was Corynebacterium 0 fructum faciens (ao
rVnθbacteriumflacaumfacie
ns) Appropriately process the ultrasonic disruption solution of AHU-1622 and use it.

培養および酵素の調製は上記の二菌株を用いて以下のよ
うに行う。ＤＬ−りんご酸１　ｆ’／ｄｌ、ｕｇｓｏ４
　＠　７　Ｈ＊Ｏ０，０３ｆ　／　ｄｅ、　＜えん酸０
．３ｙ７，１１、ＫＲＨＰＯ４１，５？　／　ｄｌ！　
、　　Ｎａ（ＮＨ，）ＨＰＯ４０、５３ｆ　／　ｄｌ　
５ＮａＯＨＯ，６ｆ　／ｄｉ　、酵母エキス０．１ｆ／
ｄ１１ヘプ）　７１　？　／ｌｉｔ　（ｐＴ４７．０）
よりなる栄養培地５００ｍ１を２を容三角フラスコに入
れ、１２０”Ｃで１５分間殺菌する。上記培地に前記菌
株を接種し、３０゛Ｃで２４時間振ｆ・培養する。培養
終了液を遠心分離して菌体を得、これを洗浄後、１０　
ｍＭ　２−メルカプトエタノール（以後２−　ＭＥと略
記する）、２　ｍＭのエチレンジアミン四酢醗二ナトリ
ウム（以後ＫＤＴＡ　−２　Ｎａと略記する）を含むｐ
Ｈ７，’４の４０ｍＭりん酸緩衝液５００ｍ１中に懸濁
させ、５°Ｃ以下で１゜分間９　Ｋｌ（ｚの超音波破砕
機〔久保田製作所（株）〕で菌体破砕する。破砕液を遠
心分離した上清を粗酵素液とした。ＡＲ活性は両菌株の
粗酵素液に含有されていた。Cultivation and enzyme preparation are performed using the two strains described above as follows. DL-malic acid 1 f'/dl, ugso4
@7 H*O0,03f/de, <Citric acid 0
．． 3y7,11, KRHPO41,5? / dl!
, Na(NH,)HPO40,53f/dl
5NaOHO, 6f/di, yeast extract 0.1f/di
d11 hep) 71? /lit (pT47.0)
Put 500 ml of a nutrient medium consisting of 2 into an Erlenmeyer flask and sterilize it at 120"C for 15 minutes. Inoculate the above-mentioned strain into the above medium and shake and culture at 30°C for 24 hours. Centrifuge the cultured solution. After washing the cells, 10
p containing mM 2-mercaptoethanol (hereinafter abbreviated as 2-ME) and 2 mM ethylenediaminetetraacetic acid disodium (hereinafter abbreviated as KDTA-2Na).
Suspend in 500ml of 40mM phosphate buffer H7,'4 and disrupt the bacterial cells at 5°C or below for 1° using a 9Kl (z) ultrasonic disruptor [Kubota Seisakusho Co., Ltd.]. The centrifuged supernatant was used as a crude enzyme solution. AR activity was contained in the crude enzyme solution of both strains.

Ｌ−りんご酸はトリカルボン酸サイクル（ＴＯＡサイク
ル）の中間代謝物であるためＴＯＡサイクルに関与する
酵素、即ちりんご酸脱水素酵素（［０１，１，１，３７
）およびフマラーゼ＜　Ｅａ　４．２．１．２：の作用
を受は副反応が起こる恐れがある。Since L-malic acid is an intermediate metabolite of the tricarboxylic acid cycle (TOA cycle), it is an enzyme involved in the TOA cycle, namely malate dehydrogenase ([01,1,1,37
) and fumarase < Ea 4.2.1.2: Side reactions may occur.

りんご酸とオキサロ酢酸の平衡は中性ｐＨ領域ではりん
ご酸生成に充分類いているためりんご酸脱水素酵素（１
１００１，１，１，３７）の影暢は殆んど受けない。し
かしながら、フマラーゼの作用によって、Ｌ−りんご酸
が一部７アール酸となり、次いでアスパルターゼの作用
でＬ−アスパラギン酸となる現象が見られた。The equilibrium between malic acid and oxaloacetate is sufficient for malic acid production in the neutral pH region, so malate dehydrogenase (1
1001, 1, 1, 37) has almost no impact. However, a phenomenon was observed in which part of L-malic acid was converted to 7-alic acid by the action of fumarase, and then converted to L-aspartic acid by the action of aspartase.

よって両菌体由来の粗酵素液中のフマラーゼを熱失活さ
せ得る条件を検討した。Therefore, conditions under which the fumarase in the crude enzyme solution derived from both bacterial cells could be thermally inactivated were investigated.

第１表はアクロモバクタ−・パルブラスエＦＯ−１３１
８２、およびコリネバクテリウム・フラツカムファシエ
ンスＡＨＴＪ　−１６２２の超音波破砕液を５０℃加熱
した場合の残存フマラーゼを調べた結果である。Table 1 shows Achromobacter parvulusae FO-131.
82 and Corynebacterium fruccumfaciens AHTJ-1622 were examined for residual fumarase when the ultrasonicated solution was heated to 50°C.

第　　１　　表 加熱処理によるフマラーゼ活性の除去 数値は残存活性（％ｌ 第１表から明らかなようにコリネバクテリウム・フラツ
カムファシエンスおよびアクロモバクタ−・バルブラス
の粗酵素液中のフマラーゼ活性は５０℃の加熱でそれぞ
れ１０詔よび６゜分の処理で完全に除去することが出来
た。上記処理によって粗酵素液中のＭＡＤＨおよびＡｌ
ａＤＨ（ま共に全く安定であった。Table 1 Removal of fumarase activity by heat treatment The numerical value is the residual activity (%l). It was possible to completely remove MADH and Al in the crude enzyme solution by heating for 10 minutes and 6 degrees, respectively.
aDH (both were completely stable).

このように処理をした酵素液、各１　ｍｌ　（ＭＡＤＨ
活性は２・Ｕｌ　ｍｌ　、　ＡｌａＤＨ活性は２・Ｕ／
ｍｌを含む）を反応基質溶液ＢｒＢｉ（Ｌ・−りんど酸
１５０■、ＮＡＤ　Ｉ　Ｗ、ＮＨ４０１１００１１？、
ＭｇＯ］４２　Ｑを５０ｍＭ　　Ｈ１！！ＰＩＣ８緩衝
液８　ｍｌ中に溶解してｐＨ７，５に調整したもの）に
添加して３０°Ｃ下で反応をおこなった。1 ml each of the enzyme solution treated in this way (MADH
The activity is 2.U ml, and the AlaDH activity is 2.U/ml.
ml) was added to the reaction substrate solution BrBi (L-phosphoric acid 150 μl, NADI W, NH40110011?,
MgO]42Q at 50mM H1! ! The mixture was dissolved in 8 ml of PIC8 buffer and adjusted to pH 7.5) and reacted at 30°C.

なお、Ｕは国際単位であり１．Ｕｌは１分間に１マイク
ロモルの基質に作用する酵素量である。In addition, U is an international unit and 1. Ul is the amount of enzyme that acts on 1 micromole of substrate per minute.

反応液は経時的に１ｆｉｔをｎ−ブタノール：酢酸：水
＝３：１：１の溶媒にてペーパークロマトグラフィーを
行い、ニンヒドリン発色にて検出をおこなった。反応３
０時間にてＬ−りんご酸は殆んど全部アラニンに転換さ
れた。なお定量はアミノ酸ｉ動分析計を使用した。アス
パラギン酸は全く生成されていない。One fit of the reaction solution was subjected to paper chromatography over time using a solvent of n-butanol:acetic acid:water=3:1:1, and detection was performed using ninhydrin coloring. reaction 3
Almost all L-malic acid was converted to alanine at 0 hours. Note that an amino acid i dynamic analyzer was used for quantification. Aspartic acid is not produced at all.

次に生成したアラニンをＧ工Ｔｏ（２，，３，４１６−
テトラ−０−アセチルーβ−Ｄ−グルコピラノシルイソ
チオチアネート）に作用させてＧ工ＴＯ−アラニンを生
成させた（二村典行、高滓科学ニュース、Ｖｏｌ、２５
、屋５（１９８４））。Next, the generated alanine is converted into G-To(2,,3,416-
G-TO-alanine was produced by reacting with tetra-0-acetyl-β-D-glucopyranosyl isothiothianate (Noriyuki Futamura, Takashi Kagaku News, Vol. 25).
, Ya 5 (1984)).

ＨＰＴＪＯ−クロマトグラフィーによって、Ｄ−、Ｌ−
アラニンの比率を測定した結果Ｄ：Ｌ比は５５：４５で
あった。By HPTJO-chromatography, D-, L-
As a result of measuring the ratio of alanine, the D:L ratio was 55:45.

試験例　２ Ｌ−りんご酸からＬ−アラニンの生産 試験例１において、ＡｌａＤＨによりピルビン酸からの
不斉還元的に生成したＬ−アラニンは共存するＡＲによ
りＤ’Ｌ−アラニンに変換される。Test Example 2 Production of L-alanine from L-malic acid In Test Example 1, L-alanine produced by AlaDH through asymmetric reduction from pyruvic acid is converted to D'L-alanine by coexisting AR.

故に何らかの処理によってＡＲ活性を除去することでＬ
−アラニンのみを効果的に生産できるものと推定した。Therefore, by removing AR activity through some treatment, L
- It was estimated that only alanine could be effectively produced.

先スアクロモバクター・パルブラスエＦＯ−１８１８２
の粗酵素液中のアラニンラセマーゼの種々のカルボニル
試薬による失活条件について検討した。Acromobacter parvulusae FO-18182
We investigated the conditions for inactivating alanine racemase in crude enzyme solution using various carbonyl reagents.

・ＡＲは活性中心にピリドキサールりん酸をもつＢ６酵
素であり、種々のカルボニル試薬と特異的に反応して活
性を消失することが知られている。・AR is a B6 enzyme with pyridoxal phosphate in its active center, and is known to specifically react with various carbonyl reagents to eliminate its activity.

粗酵素液Ｃ４０ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ７，５）に２−
　Ｍ’ｌ　１０ｍＭ％ＥＤＴＡ　−２Ｎａを２　ｍＭ金
含有せたもの〕に２〜１０ｍＭになるように種々のカル
ボニル試薬を添加して３０″Ｃで１時間処理したのち、
残存するラセマーゼ活性を調べた。その結果を第２表に
示す。Crude enzyme solution C 40mM phosphate buffer (pH 7,5) with 2-
Various carbonyl reagents were added to 2 to 10 mM in M'l 10mM% EDTA-2Na containing 2mM gold, and treated at 30"C for 1 hour.
Residual racemase activity was examined. The results are shown in Table 2.

第　　２　　表 第２表より明らかな如く調べた範囲ではフェニルヒドラ
ジンが最も効果的であった。Table 2 As is clear from Table 2, phenylhydrazine was the most effective within the range investigated.

次に最も効果的であったフェニルヒドラジンを用いて処
理ｐＨおよび処理温度を変えて検討をおこなった。その
結果を第３表に示す。Next, studies were conducted using phenylhydrazine, which was the most effective, while changing the treatment pH and treatment temperature. The results are shown in Table 3.

第３表 第３表より明らかなように５９ｍＭフェニルヒドラジン
でｐＨ６，０，４０’０．　１時間処理によってＡＲ活
性は処理前の０．０３８−％量に軽減させることが出来
た。As is clear from Table 3, 59mM phenylhydrazine was used at pH 6,0,40'0. After treatment for 1 hour, AR activity could be reduced to 0.038-% of the amount before treatment.

上記処理によってアクロモバクタ−・バルブラスのＭＡ
ＤＨ活性は全く影響を受けず処理前と同じ活性を示した
。By the above treatment, MA of Achromobacter bulbulas
DH activity was not affected at all and showed the same activity as before treatment.

次いでＡ１ａＤＨ生産菌であるコリネバクテリウム・フ
ラツカムファシエンスの！酵素ｉ中ノＡＲ除去法を検討
した。粗酵素液［４０ｍ・Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ７，５
）に２−　Ｍｉｌｌｉ　ｌ　ＯｍＭ、　ＥＤＴＡ−２Ｎ
ａを２ｍＭ含有させたもの〕に２〜１０ｍＭになるよう
に種々のカルボニル試薬を添加して３０°Ｃで１時間処
理したのち残存するＡＲ活性を調べた。Next, Corynebacterium fratsucumfaciens, which is an A1aDH producing bacterium! A method for removing AR in Enzyme I was investigated. Crude enzyme solution [40mM phosphate buffer (pH 7,5
) to 2-Milli OmM, EDTA-2N
Various carbonyl reagents were added to the solution containing 2mM of A to give a concentration of 2 to 10mM, and the remaining AR activity was examined after treatment at 30°C for 1 hour.

その結果を第４表に示す。The results are shown in Table 4.

第　　４　　表 第４表より明らかな如く調べた範囲ではフェニルヒドラ
ジンが鰻も効果的であった。Table 4 As is clear from Table 4, phenylhydrazine was also effective for eel within the range investigated.

次に最も効果的であったフェニルヒドラジンを用いて処
理ｐＨおよび処理温度を変えて検討をおこなった。その
結果を第５表゛に示す。Next, studies were conducted using phenylhydrazine, which was the most effective, while changing the treatment pH and treatment temperature. The results are shown in Table 5.

第５表 第５表より明らかなように５０ｍＭフェニルヒト）ジン
でｐＨ６，０，４０°Ｃ１１、時間処理によってＡＲ活
性は処理前の０．２４％に軽減させることが出来た。As is clear from Table 5, the AR activity could be reduced to 0.24% of the pre-treatment level by treatment with 50mM phenylhuman)dine at pH 6.0, 40°C, 11 hours.

一上記処理によってコリネバクテリウム−フラッカムフ
ァシエンスのＡ１ａＤＨ活性は全く影響を受けず処理前
と同じ活性値を示した。1. The A1aDH activity of Corynebacterium flaccum faciens was not affected at all by the above treatment and showed the same activity value as before the treatment.

以ヒの如くしてフマラーゼ活性およびＡＲ活性を蔭去し
たＭＥｉ粗酵素液およびＡ１ａＤＨ粗酵素液を用いてＬ
−りんご酸からＤＬ−アラニンの生産をおこなった。Using MEi crude enzyme solution and A1aDH crude enzyme solution in which fumarase activity and AR activity have been removed as described below, L.
- DL-alanine was produced from malic acid.

両酵素液各１．　ｍｌ　（ＭＡＤＨ活性は２　’　Ｕ　
／　ｍｌ　、　Ａｌ　ａＤＨ活性は２　Ｕ　／　ｍｌを
含む）を反応基質溶液８　ｍｌ　（Ｌ−１’）ンご醸１
５　Ｑ　ｍｆＳ、　ＷＡＤ　ｌ　ｌｑ、　　ＮＨ４０１
１００■、Ｍｇ０１２．２．　”？を５　Ｑ　ｍＭ　Ｈ
１１＋ＰＫＳ緩衝液８ｍｌ中に溶解させてｐＨを７，５
に調整したもの）に添加して３０°Ｃで反応をおこなっ
た。1 each of both enzyme solutions. ml (MADH activity is 2'U
/ml, Al aDH activity contains 2 U/ml) was added to 8 ml (L-1') of the reaction substrate solution.
5 Q mfS, WAD l lq, NH401
100■, Mg012.2. “?5 Q mM H
11+PKS buffer to pH 7.5.
The reaction was carried out at 30°C.

反応液は経時的に１μｔをペーパークロマトグラフィー
をおこないアラニンの生成を調べた。The reaction solution was subjected to paper chromatography of 1 μt over time to examine the production of alanine.

定量はアミノ酸自動分析計およびＨＰＬＯにておこなっ
た。生成したアラニンはＧ工ＴＯ−アラニンに変えたの
ちＨＰＬＯでＤＬ分析をおこなった。４０時間の反応で
転換率９５％でアラニンが生成した。Quantification was performed using an automatic amino acid analyzer and HPLO. The produced alanine was converted into G-TO-alanine, and then subjected to DL analysis using HPLO. Alanine was produced at a conversion rate of 95% after 40 hours of reaction.

Ｄ：Ｌの比率は３：９７であった。反応液から常法によ
りイオン交換樹脂にてアラニンを吸脱着・させたのち、
結晶化によって光学純度１０’０％のＬ−アラニンを得
た。Ｌ−りんご酸からのモル収率は７０％であった。The D:L ratio was 3:97. After adsorbing and desorbing alanine from the reaction solution using an ion exchange resin using a conventional method,
L-alanine with an optical purity of 10'0% was obtained by crystallization. The molar yield from L-malic acid was 70%.

〔実施例〕〔Example〕

次に本発明を実施側方具体的に説明するが、本発明はこ
れら実施例に限定されない。Next, the present invention will be specifically explained in terms of implementation, but the present invention is not limited to these Examples.

実施例、１：Ｌ−りんご酸からＤＬ−アラニンの生産 概要は試験例１と同様におこなった。ＭＡＤＨ生産菌は
アクロモ？くフタ−・バルブラスエＦＯ−１３１８２を
、ＡｌａＴ）Ｈ生産菌はコリネバクテリウム拳フラツカ
ムファシエンスＡＨＵ　−１６２２を使用する。フマラ
ーゼ活性を除去するために、アクロモバクタ−・コリネ
バクテリウムの粗酵素液を５０℃でそれぞれ６０分、１
５分加熱処理した。　　　　　　　゛ 両酵素液各５　ｍｌ　（ＭＡＤＨ活性は２　Ｕ　／　ｍ
ｌ　、　　Ａ１ａＤＨ活性は２　Ｕ’／’ｒｎｌを含む
）を反応基質溶゛液９Ｑｒｕｌ（Ｌ−りんご酸１．５１
Ｓ’、ＮＡＤ　１０　”？、Ｍｇ０１．２２００　ｍＦ
！を蒸留水に溶解し、アンモニア水でｐＨ７，５に調整
したもの）に添加して３０°Ｃで反応をおこなった。Example 1: Production of DL-alanine from L-malic acid The general outline was the same as in Test Example 1. Is Acromo the MADH producing bacterium? Corynebacterium fratus cumfaciens AHU-1622 is used as the AlaT)H producing bacterium. To remove fumarase activity, the crude enzyme solution of Achromobacter Corynebacterium was incubated at 50°C for 60 minutes for 1 hour.
Heat treatment was performed for 5 minutes. 5 ml each of both enzyme solutions (MADH activity is 2 U/m
1, A1aDH activity contains 2 U'/'rnl) and 9 Qrul of reaction substrate solution (L-malic acid 1.51
S', NAD 10"?, Mg01.2200 mF
! (dissolved in distilled water and adjusted to pH 7.5 with aqueous ammonia) and reacted at 30°C.

反応液は経時的に１メｔをペーパークロマトグラフィー
をおこないアラニンの生成度を調べた。。The reaction solution was subjected to paper chromatography of 1 MET over time to examine the degree of production of alanine. .

定量はアミノ酸自動分析計およびＨ−ｐＬｏにておこな
った。生成したアラニンはＧＩＴＯ−アラニンにしてＤ
二り比をＨＰＬＯにて測定した。Quantification was performed using an amino acid automatic analyzer and H-pLo. The generated alanine is converted to GITO-alanine and D
The two ratios were measured by HPLO.

反応５時間でほぼ１００％の転換率でアラニンが生成し
た。反応終了後硫酸で反応液をｐＨ５，；０に調製して
蛋白質等の不純物を沈殿させる。ついて穿ンモニア水で
ｐＨ６，０に調整したのち、ロータリーエバポレーター
で濃縮することでアラニンを結晶化させた。得られたア
ラニンのＤ：Ｌの比はＨＰＬＯで調べた結果５６：４４
であった。Alanine was produced with almost 100% conversion in 5 hours of reaction. After the reaction is completed, the reaction solution is adjusted to pH 5.0 with sulfuric acid to precipitate impurities such as proteins. After adjusting the pH to 6.0 with aqueous ammonia, alanine was crystallized by concentrating with a rotary evaporator. The D:L ratio of the obtained alanine was 56:44 as determined by HPLO.
Met.

Ｌ−りんご酸からの最終的なモル回収率は８０％であっ
た。The final molar recovery from L-malic acid was 80%.

実施例　２：Ｌ−りんご酸からＬ−アラニンの生産 実施例１と同様にア、クロモバクター・パルブラスエＦ
Ｏ−１３１８２、コリネバクテリウム・フラツカムファ
シエンスＡＨＴＪ　−１６，２２を培養して、フマラー
ゼ活性を除去したＭＡＤＩ（粗酵素液を調製した。Example 2: Production of L-alanine from L-malic acid In the same manner as in Example 1, A. Chromobacter parvulusae F.
O-13182 and Corynebacterium fruccumfaciens AHTJ-16,22 were cultured to prepare MADI (crude enzyme solution) from which fumarase activity was removed.

更にＡＲ活性を除去するために、両組酵素液をｐＨ６に
調整したのち、試験例２の結果に従い、フェニルヒドラ
ジンを５０ｍＭになるように添加したのちアクロモバク
タ−およびコリネバクテリウムの粗酵素液をそれぞれ５
０’Ｃおよび４０°Ｃで１時間加熱処理した。以上の操
作ではＭＡＤＨおよびＡｌａＤＨ活性は全く影響を受け
ない。In order to further remove AR activity, both sets of enzyme solutions were adjusted to pH 6, phenylhydrazine was added to 50mM according to the results of Test Example 2, and the crude enzyme solutions of Achromobacter and Corynebacterium were respectively added. 5
Heat treatment was performed at 0'C and 40C for 1 hour. MADH and AlaDH activities are not affected at all by the above operations.

このようにして調製した粗酵素液者５ｍｌ（Ｍｚ活性は
２　Ｕ　／　１１ｅ、八ｌａ　ＤＨ活性は２．Ｕ／ａｄ
を含む）を実施例１と同じ反応基質溶液９Ｑｒｎｌに添
加して３０°Ｃで反応させた。分析操作は実施例１七同
様に実施した。反応５時間でほぼ１００％の転換率でア
ラニンが生成した。反応終了液を硫酸でｐＨ５に調整・
して蛋白質等の不純物を沈殿させる。ついでアンモニア
水を添加してｐＨ６，０に調整したのち、ロータリーエ
バポレーターで濃縮してアラニンを結晶化させた。、得
られたアラニンをＧＩＴＯ−アラニンとしてＨＰＬＯで
分析したところＤ：Ｌの比は３：９７であった。Ｌ−り
んご酸からのモル収率は９０％であった。5 ml of the crude enzyme solution prepared in this way (Mz activity: 2 U/11e, 8 la DH activity: 2.U/ad
) was added to 9Qrnl of the same reaction substrate solution as in Example 1 and reacted at 30°C. Analytical operations were carried out in the same manner as in Example 17. Alanine was produced with almost 100% conversion in 5 hours of reaction. Adjust the reaction completed solution to pH 5 with sulfuric acid.
to precipitate impurities such as proteins. Next, aqueous ammonia was added to adjust the pH to 6.0, and the mixture was concentrated using a rotary evaporator to crystallize alanine. When the obtained alanine was analyzed by HPLO as GITO-alanine, the D:L ratio was 3:97. The molar yield from L-malic acid was 90%.

得られた結晶を集め再結晶をした結％Ｌ−アラ＝７９９
．５％のアラニン結晶が得られた。モル収率は８０％で
あった。The obtained crystals were collected and recrystallized to yield % L-Ara = 799.
．． 5% alanine crystals were obtained. The molar yield was 80%.

実施例　３：α−ケトイソカプロン階からのＬ−ロイシ
ンの生産 α−ケトイソカプロン酸からのロイシン脱水素酵素（Ｌ
ｅｕＤｌ（と略記する）にょるＬ−ロイシンの生産を実
施した。Example 3: Production of L-leucine from α-ketoisocaproic acid Leucine dehydrogenase (L
L-leucine was produced using euDl (abbreviated as euDl).

実施例１と同様の操作でアクロモバクタ−・パルブラス
エＦＯ−１３１８２由来のＭＡＤＨ粗酵素液（フマラー
ゼ活性除去済み）を調製した。A MADH crude enzyme solution (fumarase activity removed) derived from Achromobacter parvulusae FO-13182 was prepared in the same manner as in Example 1.

ロイシン脱水素酵素はバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｎ
、↓ｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ　）由来の精製酵素（東洋
紡績（株）販売）を使用した。　　　− 両酵素液各５　ｍｌ　（ＭＡＤＨ活性は２　Ｕ　７　ｍ
ｌ−ＬｅｕＤＨ活性は２　Ｕ　／ｍｌを含む）を反応基
質溶液９０ｒｎｌ（Ｌ−りんご酸１．！Ｍ’、α−ケト
イソカプロン酸１．２１、ＮＡＤ　ｌ　Ｏη、Ｍｇ０１
ｔ　２０　ｏ”Ｑ　ヲ蒸留水に溶解し、アンモニア水で
ｐ、Ｈ７，５に調整したもの）に添加して３０“Ｃで反
応をおこなった。Leucine dehydrogenase is produced by Bacillus subtilis (Bacn
, ↓us 5ubtilis) (sold by Toyobo Co., Ltd.) was used. - 5 ml each of both enzyme solutions (MADH activity is 2 U 7 m
l-LeuDH activity (containing 2 U/ml) was added to 90 rnl of the reaction substrate solution (L-malic acid 1.!M', α-ketoisocaproic acid 1.21, NAD l Oη, Mg01
The solution was dissolved in distilled water and adjusted to pH and H7.5 with aqueous ammonia), and the reaction was carried out at 30"C.

反応液は経時的にペーパークロマトグラフィーをおこな
いロイシンの生成度を調べた。定量はアミノ酸自動分析
計およびＨＰＬＯでおこなった。The reaction solution was subjected to paper chromatography over time to examine the degree of leucine production. Quantification was performed using an amino acid automatic analyzer and HPLO.

生成したロイシンは（）ＩＴＯ−ロイシンにしてＤＬ比
率をＨＰＴＪＯにて測定した。The produced leucine was converted into ()ITO-leucine and the DL ratio was measured using HPTJO.

反応６時間でほぼ１００％のモル転換率でロイシンが生
成した。硫酸で反応液をｐＨ５，０に調整して蛋白質等
の不純物を沈殿させる。ついで硫酸を更に添加してｐＨ
６，０としたのち濃縮してロイシンを結晶化さ・せた。Leucine was produced at nearly 100% molar conversion in 6 hours of reaction. The reaction solution is adjusted to pH 5.0 with sulfuric acid to precipitate impurities such as proteins. Then add more sulfuric acid to adjust the pH.
After adjusting the concentration to 6.0, it was concentrated to crystallize leucine.

得られたロイシンは１００％Ｌ型ロイシンであった。The obtained leucine was 100% L-type leucine.

結晶ロイシンは純一度９５％であり、Ｌ　＋、りんご酸
からのモル収率は７５％であった。The crystalline leucine was 95% pure and the molar yield from L+, malic acid was 75%.

実施例　４ニジヒドロ葉酸（以後ＤＨＦと略記する）か
らテトラヒドロ葉酸の製造 テトラヒドロ葉酸（以後ＴＨＰと略記する）のホルミル
体〔５−ホルミル−ＴＨＥ’、別名ロイコボリン（Ｌｅ
ｕｃｏｖｏｒｉｎ）　”］はアミノプテリン、アメトプ
テリン等の制癌剤使用時に併用される医薬である。Example 4 Production of tetrahydrofolic acid from dihydrofolic acid (hereinafter abbreviated as DHF) [5-formyl-THE', also known as leucovorin (Le
ucovorin) is a drug used in combination with anticancer drugs such as aminopterin and amethopterin.

ＴＨＦは葉酸（以後’ＦＡと略記する）からＤＨＦを経
て還元反応により生産される。THF is produced from folic acid (hereinafter abbreviated as 'FA) through DHF through a reduction reaction.

ＤＨＦからＴＨＦへの還元は亜ニチオン酸ナトリウム白
金触媒等を用いる化学的還元法でも生産可能であるが、
その場合には異性体が出来るため生理活性なジヒドロ葉
階レダクターゼ（以後ＤＨＦＲと略記する、ｗａ　１．
５．ｔ、３　）’を用いる酵素的還元法で得られたＴＨ
１ｔ’の半分である。Reduction of DHF to THF can also be produced by a chemical reduction method using a sodium dithionite platinum catalyst, etc.
In that case, isomers are produced, so physiologically active dihydrophthalmyl reductase (hereinafter abbreviated as DHFR) wa 1.
5. TH obtained by enzymatic reduction method using t,3)'
It is half of 1t'.

本発明者らはＭＡＤＨのＮｋＤＰ、再生循環利用システ
ムをＤＨＦからのＴＨＦへの不斉還元への応用に使用し
た。The present inventors used the NkDP of MADH, a recycling and recycling system for application to the asymmetric reduction of DHF to THF.

ＤＨＦはメソッド・イン轡エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈ
ｏ＋ｉｉｎ　ｗｎｚ、）Ｖｏｌ、　１８　Ｂ　、　　１
９７１年７２６頁）の方法に準じてＦＡから調製した。DHF is a method-based enzyme
o+iin wnz,) Vol, 18 B, 1
It was prepared from FA according to the method of 971, p. 726).

Ｆ！Ｕち、ＦＡｌｆを２０　ｍｌのｌ’Ｗ　　ＮａＯＨ
溶液に溶解し、それに亜鉛末２１を添加し、３０分攪拌
する。亜鉛末を濾過で除いたのち、１８０ｍＡ’の５％
アスコルビン酸ナトリウム溶液（ｐＨ６）を添加して氷
冷する。２ＮＨＯ１溶液を添加してｐＨを２．８に下げ
て、′ＤＨＦを沈殿させる。沈殿物は０．０　Ｉ　ＮＨ
Ｏ１溶液で２回洗浄したのち、アセトン洗浄、エーテル
洗浄をおこなう。以上の操作で線間８５％のＩ）Ｈ？が
約９０％の収率で得られた。・更にＤＨＦの精製はＤＩ
ＩｉＡ−セルロースカラムを用いておこなった。上記の
ようにして得られた粗ＤＨＦを１００ｍ１の１％２−Ｍ
Ｅ溶液に懸濁したのちｌＮＮａＯＨを滴下して溶解させ
、それを試料とする１６０ｆのＤＩ！！ＡＦｉ−セルロ
ースを０．ｌＮＮａＯＨ溶液に懸濁させたのち、４０＋
ｍ直径のカラムに詰めた。F! Add 20 ml of FAlf to l'W NaOH
Dissolve in the solution, add zinc dust 21 to it and stir for 30 minutes. After removing zinc dust by filtration, 5% of 180 mA'
Add sodium ascorbate solution (pH 6) and cool on ice. 2N HO1 solution is added to lower the pH to 2.8 to precipitate 'DHF. The precipitate is 0.0 INH
After washing twice with O1 solution, acetone washing and ether washing are performed. With the above operations, the line spacing is 85% I)H? was obtained with a yield of about 90%.・Furthermore, DHF purification is done by DI.
It was carried out using an IiA-cellulose column. 100 ml of 1% 2-M crude DHF obtained as above was added to
After suspending in E solution, add IN NaOH dropwise to dissolve it, and use it as a sample for 160f DI! ! AFi-cellulose at 0. After suspending in 1N NaOH solution, 40+
packed into a column with a diameter of m.

溶出液が無色になるまで０．　ｌＮＮａＯＨ溶液で洗浄
したのち、無イオン水、次いで１％２−’ｙｗ溶液で充
分平衡化させた。このように調製したカラムに試料を添
加し、ついでＮＨ、ＯＨ濃変をグラジエンに上げてＤＨ
Ｆを溶出させた。混合槽には１％２−ＭＥ溶液を５００
　ｍｌ入れ、補給槽には１．５Ｎ　　ＮＨ４ＯＨ溶液（
１％２−ＭＥを含む）を入れ凹型のグラジェントで溶出
させた。溶出流の２８０ｎｍでの吸収を記録して最大吸
収部位を集める。0 until the eluate becomes colorless. After washing with 1N NaOH solution, it was fully equilibrated with deionized water and then with 1% 2-'yw solution. The sample was added to the column prepared in this way, and then the NH and OH concentration was increased to the gradient and DH
F was eluted. In the mixing tank, add 500 ml of 1% 2-ME solution.
ml, and 1.5N NH4OH solution (
(containing 1% 2-ME) was added and eluted using a concave gradient. Record the absorption of the elution stream at 280 nm and collect the site of maximum absorption.

回収液とＨＯ１溶液でｐＨ２，８に調製してＤＨＩＰを
沈殿させた。沈殿物は０．　ｏ　Ｉ　Ｎ　　ＨＯＩ溶液
で２回洗浄したのち、アセトン、エーテルで各２回洗浄
した。この操作でほぼ純粋なりＨＩＰが得られた。The pH was adjusted to 2.8 using the recovered solution and HO1 solution to precipitate DHIP. Precipitate is 0. After washing twice with o I N HOI solution, it was washed twice each with acetone and ether. Almost pure HIP was obtained by this operation.

回収率は最初から計算して約５０％であった。The recovery rate calculated from the beginning was about 50%.

ＤＨＦは鶏肝臓よりメソッド・イン・エンザイモロジ−
Ｖｏ１．’、■、３６４頁（１９６３年）の方法に従っ
て酸沈殿、有機溶媒沈殿、硫安分画等によって精製した
。DHF is obtained from chicken liver using Method in Enzymology.
Vol1. Purification was carried out by acid precipitation, organic solvent precipitation, ammonium sulfate fractionation, etc. according to the method of ', ■, p. 364 (1963).

ＤＨＦからＴＨＦへの転換反応は５０ｍ１三角フラスコ
中で次のようにしておこなった。The conversion reaction from DHF to THF was carried out in a 50 ml Erlenmeyer flask as follows.

即ち実施例１の如くして調製したアクロモバクタ−・バ
ルブラスのＭＡＤＨ酵素液５　ｍｌ　（ＭＡＤＨを２　
Ｕ　／　ｍｌ含む）、鶏肝臓由来のＤＨＰＲ酵素液５　
ｍｌ（ＤＨＦ’Ｒを２　ｕ　／　ｍｌを含む）を反応基
質溶液１゜−Ｉ−ｒ−１／１１どａｌｂ　？１−　ｅ　
Ａ　＋ｈｗｔｖｗ　？　ｎ　ｅ　ｅｌｌ／ｌ　　％１．
　Ｍ＋をＩＯＷ％ＮＡＤＰ　１を１０η、更に２−ＭＫ
ＩＯ／Ｉ／！。That is, 5 ml of Achromobacter bulbulas MADH enzyme solution prepared as in Example 1 (2 ml of MADH
U/ml), DHPR enzyme solution derived from chicken liver 5
ml (containing 2 u/ml of DHF'R) to the reaction substrate solution 1°-I-r-1/11 which alb? 1-e
A+hwtvw? n e ell/l %1.
M+ to IOW%NADP 1 to 10η, then 2-MK
IO/I/! .

をｌＱｍＭりん酸緩衝液に溶かしてｐＨを７．０に合わ
せたもの〕に添加して３０°Ｃで３ｈｒ反応させた。反
応の進行は、反応液の一部を５％クエン酸−ＮＨ，ＯＨ
−イソアミルアルコール（ｐＨ８，０）を展開溶媒とす
るペーパークロマトグラフィーで経時的に分析した。３
時間反応後２−　ＭＥを０，２Ｍになるように添加した
のちＤ］１Ｃ１−セルロースカラムによりＴＨＥの分離
精製をおこなった。８？のＤＦｉ　Ａｍ−セルロース粉
末をＱ、ｌ　Ｎ　　ＮａＯＨ溶液に懸濁したのち、２０
膿直径のカラムに流し込む。溶出液が無色になるまでＱ
、ｌ　Ｎ’　ＮａＯＨ溶液を流したのち、無イオン水で
洗浄する。次いで１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６，０）をｐＨ
が平衡に達するまで流す。溶出液ｐＨが６．０に達した
のち１％２−ＭＫ溶液でカラムを充分平衡化させる。was dissolved in 1QmM phosphate buffer and the pH was adjusted to 7.0] and reacted at 30°C for 3 hours. To progress the reaction, a portion of the reaction solution was mixed with 5% citric acid-NH,OH.
- Analyzed over time by paper chromatography using isoamyl alcohol (pH 8,0) as a developing solvent. 3
After the reaction for a period of time, 2-ME was added to give a concentration of 0.2M, and then THE was separated and purified using a D]1C1-cellulose column. 8? After suspending DFi Am-cellulose powder in Q, lN NaOH solution, 20
Pour into a column of pus diameter. Q until the eluate becomes colorless
, l N' After flowing the NaOH solution, it is washed with deionized water. Then, 1M acetate buffer (pH 6,0) was adjusted to pH
Flow until equilibrium is reached. After the eluate pH reaches 6.0, the column is sufficiently equilibrated with a 1% 2-MK solution.

このようにして準備したカラムに反応液を上部より流し
込む。溶出は５００ｄの１％２−　Ｍｌ！！溶液を混合
槽に０．７５Ｎ酢酸溶液（１％２−　Ｍｉｎ含有）を補
給槽に入れてグラジェント溶出゛をおこなう。溶出分画
流は２８５ｎｍの波長で吸収を検出していく。最大吸収
を示す両分を回収し、凍結乾燥をする。粉末を無水エー
テルで２回洗浄してＴＨＩＦ標品とする。The reaction solution is poured into the column prepared in this way from the top. Elution was 1% 2-Ml at 500d! ! The solution was placed in a mixing tank, and a 0.75N acetic acid solution (containing 1% 2-Min) was added to a supply tank to perform gradient elution. Absorption of the elution fraction flow is detected at a wavelength of 285 nm. Both fractions showing maximum absorption are collected and freeze-dried. The powder is washed twice with anhydrous ether to prepare the THIF standard.

ＴＨＦ標品の純度検定は５％クエン酸−ＮＨ４０Ｈ−イ
ソアミルアルコール（ｐＨ８，０）を展開溶媒としてペ
ーパークロマトグラフィーでおこない、デンシトメータ
ーで定量した。The purity of the THF sample was tested by paper chromatography using 5% citric acid-NH40H-isoamyl alcohol (pH 8.0) as a developing solvent, and the purity was determined using a densitometer.

その結果、上記の得られたＴＨＥ’の純度は８５％、収
量は約８０％であった。ＤＫＩ−セルロースの再クロマ
トグラフィーをおこなうことで更に高純度（９６％）の
ＴＨＦを得ることも可能である。As a result, the purity of the obtained THE' was 85%, and the yield was about 80%. It is also possible to obtain THF with even higher purity (96%) by rechromatography of DKI-cellulose.

〔発明の効果〕〔Effect of the invention〕

以上詳細に説明したとおり、本発明によって、りんご酸
脱水素酵素（脱炭酸反応型）を用いる補酵素再生循環反
応を利用した種々の有用物質の工業的生産法を確立する
ことができた。本発明は従来法と比較して効率的な補酵
素再生循環システムを開発した点で効果を有する。As explained in detail above, according to the present invention, it has been possible to establish an industrial production method for various useful substances using a coenzyme regeneration circulation reaction using malic acid dehydrogenase (decarboxylation type). The present invention is effective in that it has developed a coenzyme regeneration circulation system that is more efficient than conventional methods.

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨと脱水素酵素または還元
酵素とを用い酵素的還元反応によつて有用物質を生産す
る方法において、Ｌ−りんご酸とりんご酸脱水素酵素（
脱炭酸反応型）との存在下で上記反応を行うことを特徴
とする有用物質の製造方法。 ２、アンモニア源存在下、アラニン脱水素酵素を作用せ
しめＬ−アラニンを製造する特許請求の範囲第１項記載
の方法。 ３、アンモニア源およびα−ケトイソカプロン酸存在下
、ロイシン脱水素酵素を作用せしめＬ−ロイシンを製造
する特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４、ジヒドロ葉酸存在下、ジヒドロ葉酸還元酵素を作用
せしめテトラヒドロ葉酸を製造する特許請求の範囲第１
項記載の方法。[Claims] 1. A method for producing a useful substance by an enzymatic reduction reaction using NADH or NADPH and a dehydrogenase or a reductase, in which L-malic acid and malate dehydrogenase (
A method for producing a useful substance, characterized in that the above reaction is carried out in the presence of a decarboxylated substance (decarboxylation reaction type). 2. The method according to claim 1, wherein L-alanine is produced by activating alanine dehydrogenase in the presence of an ammonia source. 3. The method according to claim 1, wherein L-leucine is produced by activating leucine dehydrogenase in the presence of an ammonia source and α-ketoisocaproic acid. 4. Claim 1 of producing tetrahydrofolate by activating dihydrofolate reductase in the presence of dihydrofolate
The method described in section.