SU1351974A1 - Method of obtaining fluorine-derivatives of 1-tyrosine - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к биотехнологии , а именно к ферментативному синтезу фторпроизводных Ь-тирозина, примен емых в медицине в качестве фармакологически активных веществ. Целью изобретени   вл етс  удешевление процесса и повышение безопасности технологии очистки целевого продукта. Способ заключаетс  в том, что готов т биокатализатор, представл ющий собой про вл ющие тирозин -феноллиазную активность клетки Citrobacter inter- medius , включенные в 7-12%-ный крио- гель поливинилового спирта, а получение фторпроизводных L-тирозина ведут непрерывно в реакторе проточного типа , из полученного на выходе из реактора раствора целевой продукт выдел ют упариванием в вакууме с последующей очисткой известными методами ионообменной хроматографии и перекристаллизации . (Л со ел ;о -vj 4The invention relates to biotechnology, in particular to the enzymatic synthesis of fluorine derivatives of L-tyrosine, used in medicine as pharmacologically active substances. The aim of the invention is to reduce the cost of the process and increase the safety of the purification technology of the target product. The method consists in preparing a biocatalyst, which represents the tyrosine -phenollyase activity of Citrobacter intermedius cells, included in 7-12% polyvinyl alcohol cryogel, and the production of fluorine derivatives of L-tyrosine is carried out continuously in the reactor The flow type, from the solution obtained at the outlet of the reactor, the target product is isolated by evaporation in vacuum, followed by purification using known methods of ion-exchange chromatography and recrystallization. (L came out; o -vj 4

Description

Изобретение относитс  к биотехнологии , а именно к ферментативному синтезу фторпроизводйых оптически активной D(-aминoкиcлoты-L-тирозина, которые могут быть использованы в медицине в качестве фармакологически активных веществ.The invention relates to biotechnology, in particular to the enzymatic synthesis of fluorine-produced optically active D (α-L-tyrosine amino acids, which can be used in medicine as pharmacologically active substances.

Цель изобретени  - удешеёление процесса получени  и повышение степени его безопасности.The purpose of the invention is to reduce the cost of obtaining and increase its safety.

Способ получени  фтор-производньк L-тирозина включает следующие этапы.The method for preparing the L-tyrosine fluoride derivative includes the following steps.

Получение биокатализатора, т.е. иммобилизацию клеток-i Citrobacter in- termedius в криогель на основе поливинилового спирта (две). Данна  опе- раци  осуществл етс  по общей схеме так называемого криоконструиро- вани  и заключаетс  в смешении водного раствора ЛВС с суспензией клетрк и дальнейшем замораживании порций полученной смеси при (-10)- (-30) С в течение 12-24 ч, последующем оттаивании полученных частиц и .их промывке от неиммобилизовавшейс  части клеток.Preparation of the biocatalyst, i.e. immobilization of Citrobacter intermedius-i cells into a polyvinyl alcohol cryogel (two). This operation is carried out according to the general scheme of the so-called cryoconstruc- tion and consists in mixing an aqueous solution of LAN with cell suspension and further freezing portions of the resulting mixture at (-10) - (-30) C for 12-24 h, followed by thawing particles obtained and their washing from the non-immobilized part of the cells.

Биосинтез фторпроизводных L-тирозина с помощью биокатализатора в реакторе проточного типа при пропускании через него раствора субстратов, содержащего, г/л: О или лс-фтор-фе- нол 2; пируват кали  (натри ) 10; ацетат аммони  15; пиридоксальфосфат 0,025; рН раствора субстратов 8,0- 8,3.Biosynthesis of fluorine derivatives of L-tyrosine using a biocatalyst in a flow-type reactor by passing through it a solution of substrates containing, g / l: O or hp-fluor-phenol 2; potassium pyruvate (sodium) 10; ammonium acetate 15; pyridoxal phosphate 0.025; The pH of the substrate solution is 8.0– 8.3.

Выделение целевого продукта (2- илн З-фтор-Ь-тирозина) из раствора, получаемого после проточного реактора с иммобилизованными клетками. Операци  выделени  вклюхгает упаривание летучей части раствора при пониженном давлении, перерастворение остатка в воде и выделение аминокислоты на ионообменной колонке со смолой КУ-2 (в Н -фор ме) из смеси с другими веществами реакционной массы. После элюировани  целевого продукта водным аммиаком, упаривани  элюата, егоIsolation of the desired product (2-yl 3-fluoro-b-tyrosine) from the solution obtained after the flow reactor with immobilized cells. The isolation operation involves evaporation of the volatile portion of the solution under reduced pressure, reconstitution of the residue in water and isolation of the amino acid on an ion exchange column with KU-2 resin (in H-form) from the mixture with other substances of the reaction mass. After elution of the desired product with aqueous ammonia, evaporation of the eluate, its

растворени  в кислой среде фторпроиз- 50 зина данным способомdissolving in acidic medium fluorine proizin- 50

водное Lj -тирозюта осаждаетс  добавле- Пример 1. 5г влажной биомаснием двууглекислого натри  и перекристаллизовываетс  из воды.the aqueous Lj-tyroside is precipitated by adding Example 1. 5g with a moist biomass of sodium bicarbonate and recrystallized from water.

Выбор конкретных параметров пред- лат аемого способа получени  фтор- производных L -тирозина обусловлен следующими моментами.The choice of specific parameters of the proposed method of obtaining fluorine derivatives of L-tyrosine is due to the following points.

Концентраци  раствора ПВС в суспензии с клетками, предназначеннойThe concentration of the PVA solution in the cell suspension

сы клеток Citrobacter intermedius, содержащей 23tl единиц тирозин-фенол- лиазы, суспендируют в 70 г водного gg раствора ПВС, содержащего 7,5 г полимера; после тщательного перемешивани  полученную суспензию замораживают при -20 с порци ми по 0,2-0,3 мл (врем  замораживани  18 ч). После отsyro cells of Citrobacter intermedius containing 23tl units of tyrosine phenol lyase are suspended in 70 g of aqueous gg PVA solution containing 7.5 g of polymer; after thorough mixing, the resulting suspension is frozen at -20 with portions of 0.2-0.3 ml (freezing time 18 h). After from

5five

дл  получени  биокатализатора, составл ет от 7 до 12%. При меньшей, чем 7%, концентрации полимера наблюдаетс  некоторое вымывание включенных в криогель клеток, что нежелательно (снижаетс  активность биокатализатора ) . При концентрации ПВС вьш1е 12% наблюдаетс  также снижение активности , но из-за ди(|)фузионных затруднений в концентрированном геле (дл  14%-ного гел  - около 69% от активности биокатализатора в случае 12%- ного криогел ).to obtain a biocatalyst, it is from 7 to 12%. At less than 7% of the polymer concentration, some leaching of the cells included in the cryogel is observed, which is undesirable (the activity of the biocatalyst decreases). When the concentration of PVA is above 12%, a decrease in activity is also observed, but due to di (|) fusional difficulties in a concentrated gel (for a 14% gel it is about 69% of the activity of the biocatalyst in the case of a 12% cryogel).

Режимы замораживани  (температура и врем ) завис т от концентрации ПВС в исходной смеси, объема замораживани  порции вещества, имеющегос  холодильного оборудовани . Предлагаемые режимы выбраны на основании экспериментов , и предусматривают температуру криогенной обработки от -Ю до -30 С и ее врем  от 12 до 24 ч. Состав раствора и концентрации 5 веществ, необходимых дл  биосинтеза, фторпроизводных L-тирозина иммо- билизованньтми клетками Citrobacter intermedius, также найдены экспериментально , а использование орто- или мета-изомеров фтор-фенола дает возможность получать соответственно 3-фтор- или 2-фтор-тирозин.Modes of freezing (temperature and time) depend on the concentration of PVA in the initial mixture, the volume of freezing of a portion of the substance, available refrigeration equipment. The proposed modes are selected on the basis of experiments, and provide for the temperature of cryogenic treatment from –U to –30 ° C and its time from 12 to 24 hours. The composition of the solution and the concentration of 5 substances necessary for the biosynthesis of L-tyrosine fluorine derivatives with immobilized Citrobacter intermedius cells, also found experimentally, and the use of ortho or meta-isomers of fluoro-phenol makes it possible to obtain, respectively, 3-fluoro or 2-fluoro-tyrosine.

Дл  выделени  целевого продукта предлагаетс  схема без использовани  органическ1-гх растворителей: раствор.To isolate the target product, a scheme is proposed without using organic solvents: solution.

00

00

5five

получаемый на выходе из проточногоobtained at the outlet of the flow

реактора с иммобилизованными клетками , упаривают при пониженном давлении (например, с помощью роторногоreactor with immobilized cells, evaporated under reduced pressure (for example, using a rotary

испарител ), остаток перераствор ютevaporator), the residue is redissolved

в воде и нанос т на колонку с катионообменной смолой в H -форме (например , смола КУ-2); далее аминокислотуin water and applied to a column with a cation-exchange resin in the H-form (for example, resin KU-2); further amino acid

элюируют водным аммиаком и упариваютeluted with aqueous ammonia and evaporated

элюат досуха. После переосаждени the eluate is dry. After redeposition

и перекристаллизации получают очищен- ньй целевой продукт.and recrystallization, purified product is obtained.

.Ниже привод тс  конкретные примеры получени  фторпроизводных I-тиро-.Below are specific examples of the preparation of fluoro derivatives of I-thyro.

Пример 1. 5г влажной биомассы клеток Citrobacter intermedius, содержащей 23tl единиц тирозин-фенол- лиазы, суспендируют в 70 г водного gg раствора ПВС, содержащего 7,5 г полимера; после тщательного перемешивани  полученную суспензию замораживают при -20 с порци ми по 0,2-0,3 мл (врем  замораживани  18 ч). После отраствора ПВС, содержащего 6 г полимера; после тщательного перемешивани  порции полученной суспензии объемом 0,3-0,4 мл замораживают при Example 1. 5g of wet biomass of Citrobacter intermedius cells containing 23tl units of tyrosine phenol lyase are suspended in 70 g of aqueous gg of PVA solution containing 7.5 g of polymer; after thorough mixing, the resulting suspension is frozen at -20 with portions of 0.2-0.3 ml (freezing time 18 h). After the PVA solution, containing 6 g of polymer; after thoroughly stirring, a portion of the obtained suspension with a volume of 0.3-0.4 ml is frozen at

таивани  частицы 10%-ного по ПВС криогел  промывают стерильной водой и загружают в проточный реактор, куда затем подают раствор субстратов,soaking the 10% PVA cryogel particle is washed with sterile water and loaded into a flow reactor, where the substrate solution is then fed,

содержащий, г/л: о-фтор-фенол 2; пи- в течение 12 ч. После оттаива- руват кали  10; ацетат аммони  15 и пири- ни  частицы 12%-ного по ПВС. криогел  доксальфосфат 0,025 (рН раствора 8,2), промывают стерильной водой и загру- Раствор субстратов подают непрерывно со жают в проточный реактор, куда затем- скоростью 45 мл/ч, собира  элюат в сбор- ю подают раствор субстратов такого же ник. За 10 дней непрерывной эксплуа- состава, что и в примере 1, имеющегоcontaining, g / l: o-fluoro-phenol 2; pi- for 12 hours. After thawing potassium 10; ammonium acetate 15 and pyrienium particles of 12% PVA. Cryogel doxalphosphate 0.025 (pH of the solution is 8.2), washed with sterile water and loading. The substrate solution is fed continuously into the flow reactor, where then a solution of the substrates of the same name is collected at a rate of 45 ml / h. For 10 days of continuous operation, as in example 1, having

рН 8,3. Раствор субстратов подают со скоростью 40 мл/час, собира  элюат в сборник. За 1.0 дней непрерывной ра- . 15 боты накоплено 9,6 л элюата, который -. обрабатывают, как в примере 1. Получено 23 г 3-фтор-Ь-тирозина, константы вещества аналогичны примеру 1. Предлагаемый способ получени pH 8.3. The substrate solution is fed at a rate of 40 ml / hour, collecting the eluate in the collection. For 1.0 days of continuous ra-. 15 bots accumulated 9.6 liters of eluate, which is -. treated as in example 1. Received 23 g of 3-fluoro-b-tyrosine, the substance constants are the same as example 1. The proposed method of obtaining

тации накоплено 10,8 л элюата, который упаривают при 55-60 С и пониженном давлении (16 мм рт.ст.). Остаток перераствор ют в воде, нанос т на колонку (1 л) с ионообменной смолой КУ-2 (Н -форма) и промывают колонку водой до нейтральной реакции. Аминокислоту элюируют 5%-ным водным аммиаком , элюат упаривают досуха. Остаток 20 фторпроизводных- -тирозина-дает воз-The accumulation of 10.8 liters of eluate is accumulated, which is evaporated at 55-60 ° C and reduced pressure (16 mm Hg). The residue was redissolved in water, applied to a column (1 l) with KU-2 ion-exchange resin (H-form), and the column was washed with water until neutral. The amino acid is eluted with 5% aqueous ammonia, the eluate is evaporated to dryness. The remainder of the 20 fluorine derivatives-tyrosine gives the

раствор ют в 1М НС1, а затем осаждают целевой продукт прибавлением бикарбоната натри . Выпавший осадок отдел ют , промывают холодной водой и перекристаллизовывают из дистиллирован- 25 вани  целых клеток Citrobacter interной воды. Получают 25 г З-фтор-1-ти- medius взамен дорогому очищенномуis dissolved in 1M HC1, and then the desired product is precipitated by the addition of sodium bicarbonate. The precipitated precipitate is separated, washed with cold water and recrystallized from the distillation of 25 whole Citrobacter interconnecting water cells. 25 g of 3-fluoro-1-ti-medius are obtained instead of expensive purified

ферменту - тирозинфенол-лиазе. Кроме того, данный способ увеличивает продолжительность функционировани  биоНС1 ).30 катализатора, что позвол ет длитель-the enzyme tyrosine phenol-lyase. In addition, this method increases the lifetime of the bioNS1) .30 catalyst, which allows for a longer

Пример2. 5 г влажной биомас- нов врем  непрерывно получать целе ,сы клеток Citrobacter intermedius,Example2. 5 g of wet biomass can continuously be obtained by cella, Citrobacter intermedius cells,

розина (Найдено, %: С 54,26; Н 5,07; N 7,09. Вычислено, %: С 54,27; Н 5,06; N 7,03; -8,5(с 4,1 МRosina (Found,%: C 54.26; H 5.07; N 7.09. Calculated,%: C 54.27; H 5.06; N 7.03; -8.5 (with 4.1 M

содержащих 215 едршиц тирозин-фенол- лиазы, суспендируют в 95 г водногоcontaining 215 edschitz tyrosine phenol lyase, suspended in 95 g of aqueous

вой продукт. Так, например, даже через 2 мес. иммобилизованные в крио- гель ПВС клетки продолжают работать раствора ПВС, содержащего 7 г поли- и катализировать синтез фторпроизвод- мера; после тщательного перемешива- ных L-тирозина.howl product. For example, even after 2 months. the cells immobilized in the PVO cryogel continue to work with the PVA solution containing 7 g of poly- and catalyze the synthesis of the fluoroproproducer; after thoroughly mixing L-tyrosine.

ни  порции полученной суспензии объ- Использование проточных реакто- емом 0,1-0,2 мл замораживают при в течение 24 ч. После оттаивани  частицы 7%-ного по ПЕС криогел  промьщают стерильной водой и загружают в проточный реактор,-куда затем подают раствор субстра-тов, содержащий , г/л: ос-фтор-фенол 2; пируватNo portion of the resulting suspension is used. Using a flow-through reactor, 0.1-0.2 ml is frozen at 24 hours. After thawing, the particles of the 7% PES cryogel are rinsed with sterile water and loaded into the flow reactor; substrates containing, g / l: is-fluoro-phenol 2; pyruvate

ров (.известной конструкции) и непре- рывных режимов работы биокатализато- 40 Р улучшает технологичность процесса получени  фторпроизводных L-тирозина, Предлагаема  схема выделени  це- левого продукта повьш1ает безопасностьof the known construction and continuous operation modes of the biocatalysis-40 P improves the manufacturability of the process for the preparation of fluorine derivatives of L-tyrosine. The proposed scheme for the isolation of the target product increases the safety

процесса, так как позвол ет отказать- натри  10; ацетат аммони  15 и пири- g с  от использовани  органических доксальфосфат 0,025 (рН раствора 8,0). .растворителей - вс  очистка проводитс  в водкой среде. .process, since it allows you to refuse sodium 10; ammonium acetate 15 and pyri-g from the use of organic doxalphosphate 0.025 (pH 8.0). Solvents - all cleaning is carried out in a vodka medium. .

Claims (1)

Формула изобретени Invention Formula Раствор субстратов подают непрерывно со скоростью 50 мл/ч, собира  элюат в сборнике. За 10 дней непрерывной эксплуатации накоплено 12,0 л элюата, g Способ получени  фторпроизводных который обрабатывают, как в приме- L-тирозина, предусматривающий приго- ре 1. Получают 18 г 2-фтор-1-тирозина товление субстрата из фтор4«нолов, (Найдено, %: С 5.4,34; Н 5,16; N 6,90. пирувата и аммиака, смешение их с Вычислено %г С 54,7; Н 5,06; N биокатализатором, обладающим тиро- 7,03); . D -1.,40 (с 4, Ш НС1). зин-фенол-лиазной активностью, провеПримерЗ . 5г влажной био- дение реакции синтеза в оптимальных массы клеток Citrobacter intermedius, дл  нее услови х с последующим содержащих 250 единиц тирозинфенол- лением и очисткой целевого продукта.The substrate solution is fed continuously at a rate of 50 ml / h, collecting the eluate in the collection. For 10 days of continuous operation, 12.0 l of eluate was accumulated, g. A method for producing fluorine derivatives, which is treated as in the example of L-tyrosine, involving preparation 1. 18 g of 2-fluoro-1-tyrosine production of a substrate is obtained. (Found,%: C 5.4.34; H 5.16; N 6.90. Pyruvate and ammonia, mixing them with Calculated% g C 54.7; H 5.06; N with a biocatalyst having a tiro- 7.03) ; . D -1., 40 (c 4, W HC1). Zin-phenol-lyase activity, Proprimer3. 5g of wet biodynamic synthesis reaction in the optimal mass of Citrobacter intermedius cells, conditions for it followed by containing 250 units of tyrosine phenolation and purification of the target product. лиазы, суспендируют в 45 г водногоlyase suspended in 45 g of water 1351974 1351974 раствора ПВС, содержащего 6 г полимера; после тщательного перемешивани  порции полученной суспензии объ , в,PVA solution containing 6 g of polymer; after thoroughly mixing a portion of the resulting suspension, емом 0,3-0,4 мл замораживают приThis 0.3-0.4 ml is frozen at в течение 12 ч. После оттаи ни  частицы 12%-ного по ПВС. криог промывают стерильной водой и загр жают в проточный реактор, куда за подают раствор субстратов такого состава, что и в примере 1, имеющ within 12 hours. After thawing, no particles of 12% PVA. The cryog is washed with sterile water and loaded into a flow reactor, to which a solution of substrates of such composition as in example 1 is fed; можность синтезировать целевой продукт в одну стадию и с абсолютной : нантиоселективностью; удешевл ет процесс получени  за счет использо Использование проточных реакто- the ability to synthesize the target product in one stage and with absolute: nanoselectivity; reduces the cost of production due to the use of flow reactors ров (.известной конструкции) и непре- рывных режимов работы биокатализато- 40 Р улучшает технологичность процесса получени  фторпроизводных L-тирозина, Предлагаема  схема выделени  це- левого продукта повьш1ает безопасностьof the known construction and continuous operation modes of the biocatalysis-40 P improves the manufacturability of the process for the preparation of fluorine derivatives of L-tyrosine. The proposed scheme for the isolation of the target product increases the safety Формула изобретени Invention Formula Способ получени  фторпроизводных L-тирозина, предусматривающий приго- товление субстрата из фтор4«нолов, пирувата и аммиака, смешение их с биокатализатором, обладающим тиро- зин-фенол-лиазной активностью, провеотличающийс  тем, что. A method for producing fluorine derivatives of L-tyrosine, which involves the preparation of a substrate of fluorine-4-nols, pyruvate and ammonia, mixing them with a biocatalyst having tyrosine-phenol-lyase activity, which is distinguished by the fact that. б135197Абb135197Ab с целью удешевлени  процесса полу- medius, включенные в 7-12%-ный крио- чени  и повьшени  степени его без- гель поливинилового спирта, а про- опасности, в качестве биокатализатора цесс синтеза ведут непрерывно в реак- используют клетки Citrobacter inter- торе проточного типа.in order to reduce the cost of the semi-medius process, included in the 7-12% cryogenesis and increase its degree of doping free of polyvinyl alcohol, and, as a biocatalyst, the synthesis process is continuously carried out in the reaction of the cells of the Citrobacter interporter flow type.