JPS6084299A - ヒト神経成長因子の遺伝子組換えによる調製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

本発明シまポリペプチドホルモン、ヒト神経成長因子（
ＮＧＦ）、組換え技術を用いたその調製法、およびそれ
を含有する組成物に関する。 本発明の背景 Ａ、神経我長因子 分子量〜１３０，０００の多成分系蛋白質がマウスの唾
液腺から分離された。この蛋白質は特（（雄マウスの唾
液腺に豊富に存在しており、通常神経成長因子（Ｎｅｒ
ｖｅ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　）と呼ばれている
。 この蛋白質が演じる主要な神経活性ば、感覚レセプター
（受容体）から脳へインパルスを伝える神経細胞、感覚
ニューロンの大きさおよび循環系、腺、平滑筋およびそ
の他の麗官の機能的活ｔｌ調節している自律神経系を構
成している２種の内の１つ、交感神経ニューロンの大き
さを増大させる能力を有する点にある。 マウスの唾液腺から、中Ｂ　ｐＨで抽出して得られるＮ
ＧＰＨ７８ＮＯＦとして知られており、α、βおよびβ
サブユニットと呼ばれる３つのサブユニットで構成され
ている。７８　ＮＧＦの全体としての神経活性は、非共
有結合性の力で互いに結合している２個の同一の１１８
アミノ酸ベグチドのダイマーであるβサブユニット４よ
ってもたらされる。このザブユニットは２．５ＳＮＧＦ
とも呼ばれる。βサブユニットは生物活性ヲ持っていな
い、しかし、とのβサブユニットはアルギニンニステロ
ペプチダーゼである。ＮＧＦの合成ニおける初期の遺伝
子産物は、βサブユニットで開裂されるプレプロ−ＮＧ
Ｆポリペプチドである。このｒサブユニットｎ、マウス
に於いて傷の治療を促進させることがわかった。 最近、第３のＮＧＦ成分（分子量〜１１６，０００）が
マウスの唾液腺から分離され、プラスミノーゲシ活注化
剤としての性質を有することが報告された。即ち、この
成分はグラスミノーゲンをプラスミンに変換するので、
血餅の溶解に利用し得ること全示唆し７ている（欧州特
許出願７’８３００６５６２（公開番号０００２１３９
Ａ１）参照：発明の名称、１−神経成長因子およびその
調製法」、出願日、１９７８年１１月２２日、公開、１
９７９年５月３０日）。 既述した様に、ＮＧＦの神経活性はβサブユニット（以
下、βＮＯＦと言う）によってもたらされる。これは、
中枢性アドレナリン作用性ニューロンの切断された軸索
の再生性再発芽を顕著に促進し、損傷を受けた軸索の修
復に有用な性質を持っていることがわかった。 Ｂ１組換えｉ）　Ｎ　Ａ技術 組換えＩ）　Ｎ　Ａ技術は、一応戎熟期に達したと言え
る、分子生物学者は、各種のＤＮＡ配列に６る程度容易
に組換え、形質転換された微生物および細胞培養株中で
多量の外来性蛋白質産物を生産し得る新しいＤＮＡ体を
つくることができる。一般。 的な手技手法は、各種のＤＮＡの平滑末端あるいは粘着
末端フラグメントにインビトロで結合させ、特定の生物
に形質転換するのに有用な強力な発現ベクターを調製し
、所望の外来性産物を効率的に合収させることである。 しかし、産物によっては、それを生産する方法は依然と
して回りくどいものであり、常に成功を予見し得る程に
は、この科学は進歩していない。事実、基礎的な実験に
基づくことなく、成功すると予想する者は、著しい実施
不能の危険をおかしてそ゛うするのである・主要な要素
、即ち複製起源、１種またはそれ以上の表現型選択特性
、発現プロモーター、外来性遺伝子の挿入および残留ベ
クターの］）　Ｎ　Ａ組換えは、通常宿主細胞の外で行
なう。得られた組換え複製可能発現ベクター捷たはプラ
スミドを形質転換によって細胞に導入し、その形質転換
体を増殖させることによって多量の組換えビヒクルを得
る・暗号化されているＤＮＡ情報の転写および翻訳を支
配している部分に関して適切な位置にこの遺伝子が挿入
された場合は、この得られた発現ベクターは、挿入され
た遺伝子が暗号化しているポリペプチド配列を生産する
のに有用である、この過程は発現と呼ばれる、要すれば
宿主細胞全溶解させ、他の蛋白質から分離精製して生産
物を回収することができる。 実際には、組換えＤＮＡ技術を使って全て外来性のペプ
チドを発現させることができ（いわゆる直接発現）、る
るいはまた、ホモローガス（同種の）ポリペプチドのア
ミノ酸配列の一部と融合したヘテロローガス（異種の）
ポリペプチドを発現させると々もできる。後者の場合、
目的とする生物活性産物は、細胞外環境で開裂されるま
で、融合したホモローガス／ヘテロローガスポリペプチ
ド内で不活性化されていることがある。 同様に、遺伝および細胞生理を研究するための細胞培養
寸たは組織培養の技術も非常に進歩している。単離した
正常細胞から、続々と継代（移植）して調製した耐久セ
ルラインを保持する手技手法を使用することができる。 研究に使用するには、この様なセルライシｌ−Ｊ：ｔｉ
、体培地中の固形担体上に保持するか、あるいは支持栄
養物を含んでいる懸濁液中で発育させて保持する。大量
生産のためのスケールアップには機械的な問題があるた
けである。 同様に、生物工学に於いて、蛋白質の生化学は有用な、
実ｒよ必要な補助字間である。所望の蛋白質を生産する
細胞に、何百という他の蛋白質、細胞代謝の内性産物を
も生産する。これらの夾雑蛋白質は、所望の蛋白質から
分離しておかないと、他の化合物と同様、所望の蛋白質
による治療過程でヒトや動物に投与されると毒性を現わ
すことがある。従って、当面の特定の系に適した分離法
を計画し、所望の用途に使用できる均質な安全な生産物
を得るのに蛋白質生化学の技術が必要となってくる。蛋
白質生化学はまた、所望の生産物の同定に、そしてそれ
を特定化して、細胞が確実に、変化したり変異すること
なく、忠実にそれ全生産したことを確かめるのにも必要
である。この科学分野は更に、バイオアッセイや安定性
試験全計画したり、臨床試験やマーケティングを行なう
前にやらなけれはならないその他の手続きにも関係して
いる。 本発明の要約 本発明は、従来、抽出技術や合１戎によって、実質的に
純粋な形で単離されたことのないヒトＮＧＦのβザブユ
ニットを提供するものである。本発明者らは、意外にも
、融合したホモローガス蛋白質（自己蛋白質）ｆ：含ん
でいない成熟（ｍａｔｕｒｅ）ポリペプチドの形で、β
−ＮＧＦをＥ、ｃｏｌｉ　（大腸菌）でヘテロローガス
蛋白質（外来性蛋白質）として発現させ得ることを見い
出した（これは、外来性蛋白質として認識する細胞酵素
から保護する必要があるかも知れないものである）。本
発明音ら砿１．ＮＯＦのβザブユニットは、Ｅ、ｃｏｌ
ｉ中で成熟蛋白質として直接発現される最も小さな蛋白
質である七イ言じている。 本発明に係るβ−ＮＯＦは、神経障害の治療またはそれ
に関連するその他の有用な目的に使用することができる
。天然に分泌されるヒトβ−ＮＯＦと同じであり、しか
も１１市乳動物由来の他の蛋白質を含んでいないので、
ヒト以外の動物由来のペプチドポルモジをヒトの病気の
治療に使う場合と違って、本発明のβ−Ｎ　Ｃ，ｌｉが
治療中に免疫原性反応をひき起すということはない。更
に、組織抽出物として得たβ−Ｎ　Ｇ　ｌ”に附随して
おり、それを含む組成物に望ましくない生物活性を示′
ｔｆｌｆｆｌ乳動物起源の他の蛋白質全実質的・疋含ん
でいないのが本発明のβ−ＮＧＦであり、これは外来性
蛋白質として得られるからである。 更に本発明は、このポリペプチドを発現し得る形で暗号
化している遺伝子配列を含んでいる複製可能なりＮＡ発
現ベクターを提供するものである。 更にまた本発明は、この様なベクターで形質転換された
微生物株またはセルラインの様な組換え宿主細胞、およ
びそれらの培養物を提供するものである。さらに本発明
は、得られたこのポリペプチドを含有している非経口投
与用の組成物を提供するものである。 従って、本発明の目的は、他の哺乳動物蛋白質を実質的
に含んでいないヒトβ−Ｎ　Ｇ　Ｆを得ることＫあり、
もう一つの目的は、天然資源から抽出によって得るこ々
ができる量より多量のヒトβ−ＮＧＦを得ることにある
・ 図面の説明 第１図はマウスＮＧＦのβサブユニットのアミノ酸配列
、それを暗号化している遺伝子配列、およびその遺伝子
の特定の断片（セグメント）の相補ＤＮＡ＠を示してい
る。 第２図は、β−ＮＧＦｍｌ（ＮＡの断片を含んでいるク
ローンのノーザンプロット分析を示してぃる。 第３図（１、マウスＮＧＦ遺伝子の部分的制限地図、お
よび本発明によって組み立てられたプラスミドのヌクレ
オチド配列とマウスＮＧＦ遺伝子のヌクレオチド配列と
のお゛およその一致を示している。 第４図は、組換えファージλｈＮ８の物理的地図および
ヒトゲノムを囲っている領域を示している。 第５図はヒトβＮＯＦ染色体遺伝子のヌクレオチド配列
を示している。 第６図は、ヒトおよびマウスのプレグローβＮＯＦ遺伝
子のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の比較を示し
ている、 第７図は、ヒトβＮ　ＯＦの発現のために組み立てられ
た遺伝子を示している。 ｇＩＪ８図は、ヒトβＮＧＦｆ：発現するための、Ｅ。 ｃｏｌｉ　’に形質転換するためのプラスミドｐｈ　Ｎ
　Ｇ　Ｆｔｒｐ　ｌの組み立て工程の一部を示している
。 詳細な説明 Ａ、宿主細胞の培養およびベクター ＤＮＡ配列を、それを発現することのできる他の配列に
有効に結合した場合、そのＩ）　Ｎ　Ａ配列を発現する
こ七ができるベクターを発現ベクターと言う。常にはっ
きりと記載することはしないが、この発現ベクターは、
エビソームとして、あるいは染色体ＤＮＡの組込み部分
として、宿主生物中で複製できるものでなければならな
い。言う捷でもなく、複製能を持たないものは有効に使
用できない。結局、発現ベクターとは機能的な定義であ
り、この用語は特定の配列に用いられるだけでなく、そ
の用語には、そこに含まれる特定のＤＮＡ暗号を発現す
ることができる全ゆるＤＮＡ配列が含まれている。一般
に、組換えＤＮＡ技術で用いられる発現ベクターはグラ
スミドの形であることが多い。このプラスミドは、環状
の２本鎖ＤＮＡループであって、そのベクターの形では
、染色体に結合していないものを言う。プラスミドは、
ベクターの最も普通に用いられる形であるので、本明細
書に於いては、プラスミドとベクターを交換可能な用語
として用いる。しかし本発明に於いては、同じ機能金有
する、当技術分野で知られている、あるいは今後知られ
得る他の形の発現ベクターも含捷れると解釈すべきであ
る。 本明細書に於いて組換え宿主細胞とけ、組換えＤＮＡ技
術を用いて組み立てられたベクターで形質転換された細
胞を意味する。 本明細書に記載した方法およびベクターは、広範囲の真
核性および原核性の生物の宿主細胞に使用することがで
きる。 勿論、一般的に、本発明に有用なベクターを組み立てる
に際し、Ｄ　Ｎ　Ａ配列をクローニングするのに原核生
物が好ましい。特にＥ、　ｃｏｌｉ　Ｋ　１２株２９４
（ＡＴＣＣ／ｌ６３１４４６）が特に好ましい。 使用し得るその他の微生物株として、Ｅ、　ｃｏｌｉ　
Ｂ、Ｅ、　Ｃａ１コ、　Ｘ　１７７６　（ＡＴＴＣ／Ｉ
６３１５３７　）などのＥ、’　ｃｏｌｉ株が含捷れる
。これらは限定する意味で挙げたのではなく、単なる例
示に過ぎないことは言う丑でもない。　・ 原核生物は発現にも使用することができる。上記ノ菌株
の他、Ｅ、　Ｃ０１ｉ　Ｗ３１１０　（Ｆ−＋λ−２原
栄養性、ＡＴＴＣ４２７３２５）　、Ｂａｃｉｌｌｕｓ
　５ｕｂｔｉｌｕｓの様な大腸菌類、Ｓａｌｍｏｎｅｌ
ｌａ　ｔｙｐｈｍｕｒｉｕ＋ｎやＳｅｒｒａｔｉａｍａ
ｒｃｅｓａｎｓ　の様な腸内細菌群および各種のシュー
ドモナス種を使用することができる。 一般に、これらの宿主に関しては、その宿主細胞と適合
し得る種由来のレプリコンおよび調節配列を含んでいる
プラスミドベクターが使用される。 このベクターはもともと、形質転換細胞に表現形質（表
現型）の選択性を付与することのできる標識化配列と共
に複製部位を持っている。例えば、Ｅ、　ｃｏｌｉ　（
１’ｉ、Ｅ、　ｃｏｌｉ種由来のｐｎｉｔ３．２２を使
ッテ形質転換される（　１３０１ｉＶａｒら、Ｇｅｎｅ
　２　：　９５（１９７７））。ｐ’ＢＲ３２２はアシ
ビンリシおよびテトラサイクリン耐性のための遺伝子を
含んでおり、従って、これは形質転換細胞を同定するだ
めの簡単な手段となる。このｐＢＲ３２２プラスミドや
その他の微生物グラスミドは、その微生物がそれ自身の
蛋白質を発現するのに使用することのできるプロモータ
ーを含んでいなければならず、あるいは含む様に改良さ
れなくてはならない。 組換えＤＮＡの組み立てに通常用いられるプロモーター
にはβ−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクト
ースプロモーター系（Ｃｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ　２
７５　：　６１５　（１９７８）　；　Ｉｔａｋｕｒａ
ら、　５ｃｉｅｎｃｅ　１９８　：　１０５６　（１９
７７）　；（３ｏｅｄｄｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ　２８１
’　：　５４４　（１９７９））およびトリプトファン
（ｔｒｐ）プロモーター系（０ｏｅｄｄｅｌら、　Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　＆ｓ、　８　：　４０５７（
１９８０）　；　ＥＩ’０Ａｐｐｌ　Ｐｕｂｌ　４００
３６７７６）がある、これらが最も普通に用いられてい
るが、その他の微生物プロモーターも発見され、使用さ
れており、それらのヌクレオチド配列は詳８ａに発表さ
れているので、当業者であれば、それらをプラスミドベ
クターに機能的に結合させることができる（　５ｉｅｂ
ｅｎｌｉｓｔら、　Ｃｅ１１２０　：２６９（１９８０
））。 原核生物の他、酵母培養株の様な真核性微生物も使用す
ることができる。８ａｃｃｂａｒｏｎｙｃｅｓ　ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅえばプラスミドＹ几ｐ　７　（Ｓｔｉｎ
ｃｈｃｏｍｂら、Ｎａｔｕｒｅ２．８２　：　３９　（
１９７９）　；　Ｋｉｎｇｅｍａｎ　ｆｉ　Ｇｅｎｅ７
：　Ｉ　４　１　（１９７９）　；　Ｔｓｃｈｅｍｐｅ
ｒ　ら、Ｇｅｎｅ　１　０：　１５７（１９８０））が
よく用いられる。このプラスミドは、トリプトファンを
生産する能力を欠いている酵母の突然変異株、例えばＡ
ＴＣＣ／ｆ６４４０７６またｔｒｙ　Ｐ　Ｅ　Ｐ　４−
’　１　（Ｊｏｎｅｓ、　ａｅｎｅｔｉｃｓ８５：１２
（１９７７））にとって選択マーカーとなるｔｒｐ　］
遺伝子をもともと含んでいる。酵母宿主細胞ゲノムの特
徴としてのｔｒｐ　ｌ損傷が存在することは、トリプト
ファンの非存在下に発育させることによって形質転換体
を検出する有効な環境を提供することになる。 酵母ベクター中の適切な促進（ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ　）
配列ニハ、３−ホスホグリセレートキナーゼ（Ｉｌｉｔ
Ｚｅｍａｎ　ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５５　：
　２０７３（１９８０））または他の解糖酵素（Ｈｅｓ
ｓら、Ｊ。 Ａａｖ、　Ｅｎｚｙｍｅｌ（ｅｇ、７　：　１４９　（
１９６８）　；１（ｏ　１１ａ　ｎａら、　Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ　１　７　：　４９００　（１９７８）
）、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホス
フェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベー
トデカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グル
コース−６−ホスフニートイソメラーゼ、３−ホスホグ
リセレートムターゼ、ピルベートキナーゼ、ト１ノオー
スホスフエートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメ
ラーゼおよびグルコキナーゼなどのフ゛ロモーター〃（
含まれる。好適な発現グラスミドヲ組み立てるに際し、
これらの遺伝子の終了（ｔｅｒｍｊ、ｎａｔｉｏｎ　）
西上列もまた、発現ベクターに、発現しようとするへ上
列の３′ニ結合さ−せてｍＲＮＡのポリアゾ＝ルイヒお
よび終了を提供する。発育条件によってコントロールさ
れる、もう１つの転写における有オリ性を持った他のプ
ロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチ
トクロームＣ１酸性ホスフアターゼ、窒素の代謝に関与
する分解酵素、」二言己のグリセルアルデヒド−３−ホ
スフェ−トチヒドロゲナーゼ、およびマルトースおよび
ガラクトースオｌＪ用に関与する酵素（Ｈ’、ａｌｌａ
ｎｄ、前記）などのり゛ロモーター領域である。酵母に
適合するプロモーター、複製起源および終了配列を含ん
でいる全てのプラスミドベクターが適している。 微生物の他、多細胞生物由来の細胞培養も宿主として使
用することがゼきる。原則として、を椎動物および無を
椎動物のいずれの細胞培養も使用できる。しかし、を椎
動物・細胞が最も興味があり、を椎動物細胞の培養増殖
（組織培養）が最近では常套手段となって来た（Ｔｉｓ
ｓｕｅ　０ｕｌｔｕｒｅ、　ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅＢ
Ｂ、　ＫｒｕｅｅおよびＰａｔｔｅｒｓｏｎ、　ｅｄｉ
ｔｏｒｓ（１９７３））。この様な有用な宿主細胞系の
例は、Ｖ　Ｅ　ＢＤおよびＨ８ｉ、ａ細胞、チ、ヤイユ
ーズ、７、ムスター卵巣（Ｃｉ−Ｉ　Ｏ’　）細胞系、
Ｗ２Ｂ５、Ｂ　ｆ（ｉ（、Ｃ０８−７およびＭ　］）　
ＣＫ細胞系などである。この様な細胞の発現ベクターは
、通常、（要すれば）複製起源、発現しようとする遺伝
子の前に位置するプロモーター、必要なリポソーム結合
部位、ＲＮＡ組み継ぎ（スプライス）部位、ポリアデニ
ル化部位、転写終了配列などを含んでいる。本明細書で
は、好ましい態様を記載したが、本発明がその様な例示
した配列に限定されるものと解釈してはならない。 哺乳動物細胞中で用いるには、発現ベクター上の調節機
能はウィルスから提供されることが多い。 例えば、通常使用されるプロモーターは、ポリオーマ、
アデノウィルス２から誘導され、シミアシウィルス４０
（ＳＶ４０）から導かれることが最も多い。古い、そし
て新しいＳＶ４０ウィルスのプロモーターに、共にこの
ウィルスから、ＳＶ４０ウィルスの複製起源を含んでい
るフラグメントとして簡単に得られるという理由で特に
有用である（　Ｆｉｅｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ　２７３　
：　１１３　（１９７８））。）Ｉｉｎａ　Ｉｌｌｌゴ
ザ（部位）からウィルスの複製起源内に存在している８
ｇ１■サイト［至る約２５０ｂｐ　配列を含んでいるな
らば、それより小さいあるいは大きいＳＶ４　Ｑフラグ
メントも使用することかできる。更に、所望の遺伝子配
列と正常通り結合しているプロモーターまたは調節配列
を、この様な調節配列が宿主細胞に適合する限り、使用
することができ、′またそれが好ましいことが多い。 複製起源は、５ｖ４ｏｔたは他のウィルス（例えばポリ
オーマ、アデノ、ＶＳＶ、ｌ３ＰＶなど）が誘導される
様に、外来性の起源を含む様にベクターを組み立てるこ
とにより、あるいは宿主細胞の染色体の複製機構により
提供′仁ることかできる。 このベクターが宿主細胞染色体に組み込まれたら、後者
は十分であることが多い。 Ｂ、使用した方法 強力な細胞壁バリアーのない細胞全宿主細胞おして使用
する場合は、Ｇｒａｈａｍ　らの燐酸カルシウム沈澱法
（Ｇｒａｈａｍ　およびＶａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ、　Ｖｉ
ｒ’ｏｌｏｇｙ５２：５４６（１９７８））によってト
ランスフェクションを行なう。しかし、核注入−！たは
プロトプラスト融合などの、ＤＮＡ全細胞に導入する他
の方法も使用することができる。 原核細胞捷たけ実質的な細胞壁構造を持った細胞を使用
する場合、好ましいトランスフェクションの方法は、Ｃ
ｏｈｅｎらの塩化カルシウムを用いたカルシウム処理で
ある（　Ｃ０ｈｅｎ、　Ｆ、　Ｎ、ら、ｐｒｏｃ　。 Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）　、　６
９　：　２１１０（１９７２））。 所望の暗号配列および調節配列（ｃｏｎｔｒｏ１ｓｅｑ
ｕθｎｃ（）を含んでいる好適なベクター全組み立てる
には標準的な結合技術を用いる。分離したプラスミド！
ｆ？Ｌｌｒ、Ｊ：、ＤＮＡフラグメントを開裂し、修復
（ティラー）し、所望のプラスミドを形成する様に、希
望の形に再結合する。 開裂は、適当な緩衝液中、制限酵素で処理することによ
り行なう。通常、約１μｙのプラスミドまたはＤ　Ｎ　
Ａフラグメント、約２０μｌの緩衝液、約１単位の酵素
全使用する（特定の制限酵素に対する適切な緩衝液およ
び基質の量は製造業者が指定している）。３７°Ｃで約
１時間インキュベートする。インキュベートした後、フ
ェノールおよびクロロホルムで抽出して蛋白質を除き、
水性分画からエタノールで沈澱させて核酸を回収する。 平滑末端が必要な場合は、Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｉ）　Ｎ　
ＡポリメラーゼＩ（Ｋ１θｎｏｗ）１０単位で、１５℃
で１５分間処理し、フェノール−クロロホルム抽出し、
エタノール沈毅に付す。 開裂しプこフラグメントの大きさによる分離は、ａｏｅ
ａａｅ：ｔらの方法（Ｇｏｅｄｄｅｌ、　Ｄら−Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ′Ｒ８ｓ、８：４０５７’（１９
８０’））ＶＣ従い、６襲ポリアクリルアミドゲルを使
って行なう。 結合（ライゲーション）には、正しく符合する様に末端
を適当に修復したほぼ等モル量の所望の我分全、ＤＮＡ
Ｑ、５μ！当たり約１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを用
いて処理する（開裂したベクターを成分として用いる場
合に、細菌性アルカリ性ホスファターゼで予め処理して
開裂したベクターの再結合を防ぐのがよい）。 ライゲーション混合物を使ってＥ、　ｃｏｌｉ　Ｋ１２
株２９４（ＡＴＬ０３１４４６）を形質転換し、成功し
た形質転換体をアシビタリン剛性について選択する。形
質転換体からプラスミド金調製し、Ｍ８ｓｓｉｎｇらの
方法（Ｍｅｅｓｉｎｇら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄＳ
＆ｓ、　９　：３０９（１９８１））またはＭａｘａｍ
らの方法（Ｍａｘａｍら、Ｍｅｔｈｏｃｌｓ　ｉｎ　Ｅ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　６５　：　４９９（１９８０））
に従って、制限酵素分析し、そして／または配列を決定
する・ Ｃ１好ましい実施態様 以下に、Ｅ、　Ｃ０１ｉ中でポリペプチドを発現させる
好寸しい態様について記載するが、これは本発明を例示
するものであって、本発明がこれに限定されるものと解
訳してはならない。 Ｃ９１，マウスのプローβＮ　ＯＦ−ｑ暗号化している
ＣＤＮＡクローンの分離 ヒトＮ　ＯＦのβサブユニツＩｆ暗号化している遺伝子
を得るために、ハイブリダイゼーション・プローブとし
て、マウスのβＮＧＦＩ暗号化しているクローンされた
ｃＤＮＡを用いることにした。 ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａクローニング・アプローチには、合成オ
リゴヌクレオチドプライマー全使用して、第１図（（示
し／也マウスのβＮＧＦサブユニットの既知のアミノ酸
配列を利用した：雄および雌のマウスの唾液腺に存在す
るＮＧＦレベルの違いを、同定のも９１つの手段として
用いた。マウスのβＮＧＦアミノ酸配列の３つの小さな
部分を選び、それらを暗号化している全ての可能性のあ
る配列に相捕的なオリゴヌクレオチド・プールｋ　Ｃｒ
ｅａ　等の方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ
、、　８　：　２３３１　（１９８０））で合成した。 この暗号鎖および相補鎖のヌクレオチド配列を第１図に
示す。 合成オリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーション・プ
ローブとして用いて、マウスβＮＧＦＣＤＮＡクローン
を、雄マウス唾液腺からのオリゴｄＴ−プライム化ｃＤ
　Ｎ　Ａバンクから分離同定する試みは失敗した。この
結果は、βＮ０ＦＨ雄マウスの唾液腺蛋白質の０１％を
占めているが、そのｍＲＮＡは同じ様に豊富ではないこ
とを示してイル。従って、まずβＮＯＦ特異ヌクレオチ
ド配列を豊富にするために、この蛋白質のカルボキシ末
端に近接した配列を表わしているプライマー・プールを
使って、雄の唾液腺からのポＩＪＡ−含有（Ａ　＋　）
几ＮＡの逆転写を特異的にプライムした。 長さ２００ｂｐ以上のＣＤＮＡ分子を、よく知られたプ
ラスミドｐＢＲ３２２にクローンした。ＣＤＮＡのブラ
イミングにハイブリダイゼーション・グローブとして最
初に使った５−３２ｐ−標識ＮＧＦプライマー・プール
を使って、全部で１０，０００個のクローンをスクリー
ニングした結果、その内０８係が、非常に厳重なノ・イ
ブリダイゼーション条件下で陽性信号を与えた。残、り
の９９２％の１プライム化−１されたＣｆ）ＮＡバンク
は、ポリＡＭＳＧＲＮＡの調製中に溶離した痕跡量のオ
リゴｄ′丁によるブライミングおよび自己ブライミング
により生じたと思われる。クローニング操作の際の８１
ヌクレアーゼ処理が末端プライマー配列を傷つけ、従つ
′Ｃ検出された陽性クローンが少なかったのかも知れな
い。 この最初のスクリーニングで陽性となったクローンを、
ハイブリダイゼーション・プローブとして、第１図に示
したオリゴヌクレオチドプール１より上流のＤＮＡ配列
から誘導した放射線標識化プライマー・プール２および
３を使ってスクリーニングＥ７た。更に雄または雌マウ
スの唾液腺のいずれかからのポリＡＲＮＡから、プール
１でフリイム化した３２ｐ−ｃＤＮＡ４ｙ−二重フィル
ター上のグローブさして用いた。再びｐＢ　ＩＬ　３２
２中、オリゴヌクレオチド・プール２および３とノーイ
ブリッドを形成した全部で１０個の雄−特異的クローン
を同定した。制限酵素分析の結果、１０個は全て共通の
Ｉ（ａｅ［ＩＩおよびＨｉｎｆ　Ｉ　フラグメントを持
っているこ七がわかった。本発明者らがｐｍβＮ−ｇＧ
ｌと名付けた、最も長いＤＮＡ挿入体（〜７００ｂｐ）
’を発現するプラスミドを含んでいるクローンの全配列
全決定した。このヌクレオチド配列から推定されるアミ
ノ酸配列は、Ｎ１−１２−末端ブロー配列に加えて、１
つの翻訳フレーム中に期待するＮＧＦ配列を含んでいた
（第４図参照）。マウスのＮ　Ｇ　Ｐ　ＣＩ）　Ｎ　Ａ
配列金倉んでいる細菌クローンの組み立−〇および同定
について、以降に詳述する。 完全なＮＧＩ”ｍＲＮＡの大きさを決定するために、ノ
ーザン・フ゛ロット　ハイブリダイゼーションおよびプ
ライマー・エクステンショシ分析法を用いた。ＮＧＦお
よびブロペプチド配列を含んでいる長さ４７０ｂｐの３
２ｐ−標識Ｄ　Ｎ　Ａフラグメント（Ｒｓａｌ　−Ｒｓ
ａＩ７８９　、第３図参照）１雄マウス唾液腺に特異な
長さ約１３００ヌクレオチドの几ＮＡ種と雑種形成させ
た・２つの短い、２本鎖の、５′末端−標識化制限フラ
グメン１、を用いたプライマー・エクステンション実験
（第３図の説明参照）してより、βＮＧＦｍ］ｉ’Ａの
５末端は、本発明者らのクローンの３末端から下流の約
３７０塩基を残して、ｐｍβＮ−９ＧｌｃＤＮＡフラグ
メントの５末端から上流に約２３０塩基の所に位置づけ
られた。欠失５配列の〜３０ヌクレオチドを除く全てが
、本発明者らがｐｍ　ｐＮ−１６１゛７およびｐｍ　β
Ｎ　−２］　Ｂ　５と名付けたクローンに含まれており
、これらは、第３図に示す様に、互いに、そしてクロー
ンｐｍβＮ−９０１と重複している。これらは、ｃ　］
）　Ｎ　Ａ合ｌｊｌ　ｆプライムするため、制限フラグ
メントの使用についてのより詳細な以下に記載の方法で
分離する。 プライマー配列の３′末端から下流へ３′ポリＡ配列−
までの配列を含んでいるクローン化［７たＣＤＮＡ−４
得るために、プレパラテイブ尿素アガロースゲル上で、
全ポリＡ雄マウス唾液腺ＲＮＡ１分画することによυ、
βＮＧＦｍ几ＮＡを豊富化した。 最も大きいサイズのフラクション、βＮＧＦ１．ＤＮＡ
グローブとハイブリダイズ（雑種形成）する配列を含む
フラクションを、オリゴｄＴ−プライム化ｃ　Ｄ　Ｎ　
Ａ合成およびクローニングに使用した。 ３．７００のクローンをスクリーニングした結果、４つ
の腸性ハイブリダイゼーショシシグナルが得うれた。本
発明者がｐｍβＮ　−１２Ｅ　４と名付けたクローンの
ヌクレオチド配列分析、および３暗号化および非翻訳配
列に２３９ヌクレオチドを添加したｐｍβＮ−８Ｂ３゜
オリゴｄＴプライム化であるが、本発明者らのクローン
はいずれも、第２のＤＮＡ鎖の不完全な合成または広範
なＳ１ヌクレアーゼ処理のために、βＮ　ＯＦ　、ｍ　
ｌｔ　Ｎ　Ａの全３非翻訳領域を含んでいなかった。ノ
ーザノ　プロント部分・訛により、ポリＡ配列（１本発
明者らがクローンした配列から離れていないことがわか
った（第２図参照）。豊富化したｍＪ（ｉ’７　Ａから
のオリゴａ　Ｔプライム化ＣＤＮＡクローンの調製につ
いて以下に詳述する。 ０、２．　ヒト染色体βＮＧＦ遺伝子の分離および特性
化 ’２　ト遺伝子ライブラリー（λＣｈａｒｏｎ　４　Ａ
ベクターに挿入された、１５−２０ｋｂの、部分的ｆ■
ａ。 Ｉｌｌ　／　Ａｌｕ　Ｉヒト胎児肝１ＤＮＡフラグメン
トからなる）を、放射活性ハイブリダイゼーション・プ
ローブとして、既述し１４７０ｂｐマウスＮＧＦクロー
ン化ＣＤＮＡ７ラグメント（ｐｍβＮ−９０１Ｒｓａ　
■フラグメント）を用いてスクリーニングした。全部で
２７組み換えファージをプラーク純化し、Ｅｃｏ几■消
化によシ部分的

【・ζ＠性化した＝２７個のファージは
６つの異なるタイプの制限パターンを示した。各バター
シ種は、制限フラグメ／トヲ共有しており、従って同じ
ゲノム領域を重複していると思われる。γｈβＮ８と名
づけたファージの特性を、物理的マツピングによびヌク
レオチド配列決定により調べた。第４図ケよ、ファージ
・マツピング、配列決定およびゲノム・サザーン・ブロ
ノテーｌング実験によって得た、クローンｒｈβＮ８の
物理的地図身よびヒトゲノム中のその配列を画している
領域を示している。サブクローノした、重複しているＥ
ｃｏ　４　ＩおよびＨｉｎｄ　ＩＩＩフラグメントから
誘導された１２，０００ｂｐのヌクレオチド配列の部分
を第５図に示す。 Ｃ０３，マウスβＮ　Ｇ　Ｆ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａとヒトβ
ＮＧＦ遺伝子の配列の比較 マウスＱβＮ　Ｇ　Ｆ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ配列り、成熟β
Ｎ０Ｆ＝、−暗号化する可能性を持った解説わく全含有
しており、予想されたアミノ酸配列は、マウスβＮＯＦ
の既知の配列に相当している（　Ａｎｇｅｌｅｔｔｉ等
、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　Ｉ　２　：　９０　（
１９７３）および１２：　ｌ　００　（１９７３）　）
ｏ意外にも、このｃ　Ｄ　ＮＡ配列は・マウスβＮＧＦ
の報告されている配列の末端に結合した、Ｃ−末端、ア
ルギニン−グリシンジペプチド延長部を予測している〇
ヒトβＮＯＦ遺伝子は、成熟マウスβＮＯＦアミノ酸配
列と約９０％が相同（ホモローガス）なアミノ酸配列を
予測している領域を含んでおり、従ってこれは、ヒトβ
ＮＯＦの遺伝子のための遺伝子でなければならない。ヒ
トβＮＧＦ蛋白質もまた、Ｃ−末端ジペプチド延長部を
持っている・ヒトとマウスのβＮＧＦ配列を並べると（
第６図）、成熟マウス蛋白質の既知の配列からかなりの
遠くの上流まで広範な相同性が延びていることがわかる
。２２，０００ダルトシの生合吠ブローβＮＧ」゛グリ
カーサー（前、駆体）の存在が証明されており　（１３
ｅｒｇｅｒおよび５ｈｏｏｔｅｒ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ
ｔ、Ａｃａｄ。 Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）、７４：３６４７．（１９７７））
、これは成熟蛋白質からヌクレオチド位置４１９および
４２０（第６図参照）の潜在的なアルギニン−アルギニ
ン開裂部位にまで延びているかもしれない。このヌクレ
オチド配列で予測される前駆体は、既に以前に検出され
たものより長い：後述する様に、全プレプロ−β−ＮＧ
Ｆ配列は分子量２７，０００と予測され、ブロー配列は
２５，０００ダルトンと予」すされ、特異なアルギニン
残基対が存在することケ考えると、２１，５００および
１８，０００ダルトンのプロセッシング中間体が細胞内
に存在する。 Ｃ１４，開始メチオニンコドンおよび信号配列の位置づ
け 蛋白質合成開始コドンであると指定するための候補とし
て３つのメチオニン残基が挙げられる（第６図のアミノ
酸−１８７、−１２１および−１１９）。しかし、いく
つかの要因から、本発明者らの配列の一１２１アミノ酸
が実際の開始コドンとして使われていることを強く暗示
している。βＮＯＦは分泌された蛋白質であるので、開
始コドンの後には、このポリペプチドを小胞体の内腔へ
と共同翻訳転移させる信号配列が続いていると考えられ
る。アミノ酸−１２１から−１０４に、優れた信号配列
の候補である。これらの１８個のアミノ酸は正しい長さ
であり、−続きの６個の完全に疎水性のアミノ酸（ａｌ
ａ−ｐｈｅ−１ｅｕ−ｉｌｅ−ｇｌｙ−ｖａ’ｌ）を含
んでいる。信号ペプチダーゼによる開裂は、小さいアミ
ノ酸であるａｌａ−１０４と、−１０３位のｇｌｕ残基
の間で起り得る゛。プレーアルファ・ラクトアルブミン
の場合、信号ペプチダーゼハ同一のｇｌｎ　−ａｌａ配
列（後）を開裂させ、同一のＮ−末端ｇ１ｕ残基金残す
ことが知られている。−１８７位のｍｅｔ残基に続く一
連のアミノ酸は、極性および荷電アミノ酸を高率で含ん
でおり、これまで報告されている信号配列のいずれにも
一部ていない。 従って、−１２１のメチオニンがヒトおよびマウスのグ
レブロ−βＮＯＦの翻訳開始に使われる可能性が最も高
く、この場合２７，０００ダルトンのプレブロホルモン
が生成する。もし信号ペプチドプロセッシングが残基−
１０４で起ったら、２５゜０００　ダルトンのプローβ
Ｎ　Ｇ　Ｆが生１収するでろろう。 Ｃ，５，’　ｌ（、ｃｏｌｉ中でのヒトβＮＧＦの直接
発現スｈβＮ８からのＥｃｏｌＬＩフラグメシトをｐＢ
　Ｉｔ３２２でサブクローンした。本発明者らがｐｈβ
Ｎ８−８９と命名したサブクローンプラスミドは、ヒト
βＮ　Ｇ　ｌｉ’サブユニットを暗号化している配列の
大部分を含んでいる２ｋｂヒトＤＮＡ挿入体を含有して
いた。配列決定の結果、１０個のＮ１］２−末端アミノ
酸だけがこの配列から除かれていることがわかった。β
Ｎ　Ｇ　Ｉ！’暗号配列をＥ、ｃｏ’ｌｉで発現させる
ための本発明者らの方法（は、ｐｈβＮ５−Ｂ９のβＮ
ＯＦ暗号部分から最も大きい可能なフラグメント金切り
取り、次いで欠失コドンを満たし、その配列の５′およ
び３末端を、Ｅ、　Ｃ０１ｉ発現プラスミドに挿入する
のに適する様に修飾することでめった。使用した発現系
は、米国特許出願第３０７゜４７３号（１９８１年１０
月１日出願）に記載されているＴｒｐプロモーター系で
あり、これＨ，Ｍ。 Ｍａｔｅｕｃｃｉ　の配列変換と共に、各種の遺伝子に
ついて以前から用いられて来たものである。 プラスミドｐｈβＮ８−　Ｂ　９　ｆ：　Ｅｃｏ　ＲＩ
　＄−ヨヒＩ（ｇＩＡＩで消化し、〜３００ｂｐフラグ
メントヲ消化混合物から分離した。このフラグメントを
第７図に示す。２工程の消化により生じる粘着末端も示
しである。発現のためのヒトβＮ　Ｇ　Ｆ配列の５′末
端を組み立てるために、１０個の欠失アミノ繍のための
コドン、開始メチオニンコドン（ＡＴＧ）、およびリポ
ソーム結合サイトの一部でらり、制限エンドヌクレアー
ゼＸｂａ　Ｉの開裂サイトを含んでいる、該ＡＴＧに先
行するヌクレオチド押金付加した。この目的の為ＶＣ４
つのオリゴヌクレオチドを化学的に合成した。これら金
オリゴヌクレオチドＩ−ＩＶとして第７図に示す。 βＮ　（３Ｆ暗号領域の３′末端は以下の如く修正した
：第７図に示した１個のＨ，ｇＩ　Ａ　Ｉ部位（吸熱ヒ
トβＮ　Ｇ　］”の１１１１位　Ｖａｌ　）と１１２位
（Ｌｅｕ）のアミノ酸）から下流の両ＤＮＡ鎖のヌクレ
オチド配列を、Ａｒｇｌ１８およびＳａｌ　ｌ粘着末端
に続く終止コトリ（ＴＡＧ）を含む様に化学的に合１視
した。これらのオリゴヌクレオチド灯第７図のフラグメ
ントＶおよび■である。 合成オリゴヌクレオチド１−ＶｌをＴ４ポリヌクレオチ
ドキナーゼおよびｒ−３２ｐ−Ａ、ＴＰで放射活性標識
し、その放射活性オリゴヌクレオチドを、Ｔ　４　ＤＮ
　Ａ　ＩＪ　カーセ緩衝液中、〜３００ｂｐｈβＮ（３
ＦＤＮＡフラグメントと混合した。１０単位ｔｙ）　ｉ
’　４　］）　Ｎ　Ａ　リガーセラ用い、１２”０ｆ１
２時間ライゲーション（結合）した。この混合物をフエ
、ノール抽出し、Ｄ　Ｎ　Ａ’ｌ’７０％エタノール中
で沈殿させた。沈殿を乾燥し、制限エンドヌクレアーゼ
緩衝液に溶解い酵素Ｘｂａ　（および５−ａＩＩを添加
し、２時間消化した。 ＤＮＡ混合物のプレパラティプゲル電気泳動おある二重
体（ダブレット）が〜３７　Ｃ１ｂｐに存在することが
わかった。溶離したＤＮＡフラグメントを、Ｘｂａ　Ｉ
および５ａＩＩで消化した後細菌性アルカリホスファタ
ーゼで処理したｐＨ−ＧＪ：Ｉ　２０７−１　七命名さ
れたｆＩ　Ｇ　ＩＩ　−’ｒｒｐ発現ブラユミ８３．結
合させた（Ｔ４ＤＮＡリガーゼ）。このアルカリホスフ
ァターゼ処１ｒｑＨ１Ｉ−Ｉ　Ｇ　ＨフラグメントがＴ
ｒｐ発現ベクターに再挿入されるのを防ぐ為に行なった
。 このライゲージヨシ混合物を使ってＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ１
２／２９４ｆ：形質転換した。寒天平板上、アンピシリ
ン耐性でテトラサイクリシ感受性のコロニーを選択した
：２００のコロニーを、放射活性の３００ｂｐ　＋ｇｃ
ｏ　１３．　Ｉ　／　Ｈｇｉ　Ａ　Ｉプローブとのハイ
ブリダイゼーシヨンにより、ヒトβＮＯＦ配列の存在（
てついてスクリーニングした。１２個の陽性コロニーを
、ウェスタン・プロット上、ウサギの抗マウスβＮＯＦ
抗体を使って、その細胞抽出物中に免疫反応性βＮＯＦ
分子が存在するがどうかについて分析した。１個を除く
全てのクローンが、陰性の対照抽出物と比較して、期待
される分子量の陽性信号を示した。これらのクローンの
１個のＤＮＡ配列を分析した結果、本発明者らによって
ＰｈβＮＯＦ　ｔｒｐ　Ｉと命名された、ヒトβＮ　Ｇ
　Ｆ　２発現した最終的なプラスミドが、当初に計画し
た構造を持っていることが証明された。 プラスミドｌ）ｈβＮ８−Ｂ９の’！’ｃｏｌｔｌお工
び馬ＩＡ１による消化からグラスミドＰｈβＮＧＦ　ｔ
ｒｐ　１の組み立てに至る一連の操作を第８図に示した
。 プラスミドＰＬＩＯＨ，２０７−１１−、ｉ’、上記出
願番号第３０７．４７３号に記載されているプラスミド
Ｐ　１．（Ｇ　ｌ−１２０７’ｃ　ＢａｍＨＩで消化し
、次イテＥＣｏＩｔ■テ部分消化することにより得られ
た。ｔｒｐプロモータｆ含んでいる最も大きいフラグメ
ントを分離した。ｐ　１３　ｒ　３２２から最も大きイ
ＥＣＯＲＩ　−Ｂａｍ　Ｈ■フラグメント’を分＋＝ｔ
　Ｌ、この２つのフラグメントを結合させ、Ｅ、　ｃｏ
ｌｉ　Ｋｌ　２／　１９４の形質転換ニ使用した。アン
ピシリンおよびテトラサイクリシの両者に耐性のめるク
ローンがＰｆ（ＧＨ２０７−１を含んでいた、 ｃ、５．　ｍＮＧＦｃＤＮＡ配列を含んでいる細菌クロ
ーンの組ｂ・立ておよび同定 各（１４塩基の）８つのプライマーのプール２種を化学
的１（合成した。各プライマーは、アミノ酸９３−９６
および９７の１部のための潜在高ｍ几ＮＡ配列と相補的
である１、ポ＋）　（Ａ、　）　４ＬＮ　Ａで特異的Ｖ
Ｃｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの合成をプライムするのに１６オリゴ
ヌクレオチドの混合物音用いた。１０ミリモル（ｍモル
）のＫＯ１５０μｌ中、８プライマーの各プール２００
ピコモル（ｐモル）（１μり（総計４４０ｐモル、２μ
ｙ）を、ポリ（Ａ＋）　Ｉｔ　Ｎ　Ａ４Ｑ１ｔ９と、９
０°Ｃ１６８°Ｃ１４２゛Ｃおよび３７°Ｃで４分間づ
つインキュベートすることにより、アニーリングした。 ３２ｐ−標識ｃＤ　Ｎ　Ａ、　ｆ、、５０　ｍ　Ｍ、　
ｌ□リス（ｐＨ８，３）、１０ｍＭＭｇＣ１２、Ｉ　Ｏ
ｍ　Ｍ　Ｄ’ｌ’Ｔ、５０　ｍ　Ｍ　ＫＣｌの反応（系
）１００μ６中で合Ｉｆ　Ｌ　ｆｃ。 この反応系はアニーリングした混合物の他ニ、５００μ
Ｍｃ７）ａＡＴＰ、’Ｉ’ＴＰ、、ＩＧＴＰ、１００Ｉ
ｔ　Ｍの、ＩＣＴＰ、２０μＣ１の〔γ−３２ｐ）ｄＣ
Ｔ”　（２０００Ｃｉ／ｍモル、Ａｍｅｒｓｈａｍ　）
、０．５単位／μｌのＩＬ　Ｎ　ＡＳｉｎおよび９０単
位の逆転写酵素を含んでいた。最初の鎖の合１ｉｉ　３
７°Ｃで６０分間であった。反応系を３分間煮沸し、１
分間氷でクエンチジグし、マイクロフユージ中で回転さ
せた。 上澄を同容軟のｄｄ　ｌ−１２０で希釈し、Ｋｌｅｎｏ
ｗ　Ｆｏ１１Ｊ５単１１Ｊえ、１２°Ｃで１８時間、ｄ
ｅｃＤＮＡ全合１戎した。フェノール／クロロホルム抽
出し、エタノール沈殿を行なった後、標品を１５０ｔｉ
ｅ中の８１ヌクレア一ゼ１０単位を用いて３７°Ｃで１
時間消化した。フェノール／クロロホルム抽出およびエ
タノール沈殿の後、５％ポリアクリルアミドゲル上の電
気泳動に、ｒ、９ｃＤＮＡを分画した・２つのサイズ範
囲のｃＤＮＡ−１電気溶離した。長さ〜５５０ｂｐ（Ｊ
：）Ｈｌ　３２ｎｇｍ回収され、長さ２００〜５５０ｂ
ｐ（下）　ｕ１８２　ｎｇｍ回収された。 全５−２　Ｑ　ｎｇｍの各フラクションの３′−末端を
、末端ヌクレオチドル・トランスフェラーゼを用いて２
Ｏ−４０ｄ（Ｃ）残基で延長させた。このｄ　（ｃ）−
尾部形１７Ｍ、　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　ｆ、同様にＰｅｔ１
部位でａ　（Ｑ）残基音用いて延長させたｐＢＲ３２２
（１５０ｎｇｍ　）とアニーリングした。アニーリング
は５０ｔＡの１００ｍ　Ｍ　ＮａＣ１、１０ｍＭトリス
（ｐｌ＋　７．５　）、２５０ｍＭＥＤＴＡ中で行なっ
た。混合物ｔ　７０　’Ｏに加熱し・徐々ＶＣ３７°Ｃ
に冷却しく１６時間）、次いで４°Ｃに冷却した（６時
間）。アニーリング混合物の半分を使ってＥ、ｃｏｌｉ
　Ｋ−１２株２９４全形質転換した。各サイズフラクシ
ョシ（上と下）からの５００コロニーをフィルター・ハ
イブリダイゼーシヨンによりスクリーニングした。３２
ｐ−標識グローブは１６プライマーの混合物（全ＩＩ１
ｇ）から、公表されている方法により、ポリヌクレオチ
ドキナーゼ（Ｐ−Ｌ　Ｂｉｏｃｈｍｉｃａｌｓ）および
２００７１Ｃ］の〔、−３２ｐ〕ＡＴＰ（５０ｏｏｃ１
／ｍモル、Ａｍｅｒｓｈａｍ　）を用いた燐酸化によＶ
調製した。１０゜０００個のクローンを含んでいるフィ
ルターを、プライマー・ハイブリダイゼーシヨン・ミッ
クス（１００ｍＭ）リスｐＨ７，５，０，９Ｍ　ＮａＣ
１，６ｍ　Ｍ　ＥＤＴＡ、ｌ　Ｘ　Ｄｅｎｎａｒｄｔ’
ｓ溶液、１００　ｔｔ　Ｍ　ｒＡ、ＴＰ、１′ｍ　Ｍ　
Ｎａ１ｉ２ＰＯ，−Ｎａピロホス７．１ｌｒ−−−）、
０５％ＮＱｎｉｄｅｔ　Ｐ　−４０，０，１’　ｍｙ　
／ｍｅ酵母ＲＮ　Ａ　（ＳｉｇｍａＲ−６７’５０　）
　）中、〜ｌ　Ｘ　１０８ｃｐｍの３２ｐ（識プローブ
と、室温で１８時間ハイブリッド形成させた。フィルタ
ーを、４２℃で６　Ｘ　ｓｓｃ中で３０分間（３回）洗
浄し、強化スクリーン（］）ｕｐｏｎｔ）を用いて一７
０°Ｃで１６時間、Ｘ線フィルムに感光させた。約０．
７−０．９％（上３７０．下４６０）のコロニーを選択
し、もとのプライミング部位に対して５である２つの追
加の合１戎グライマーによる２回目のスクリーニングに
かけた。アミノ酸７４−７４のための全ての潜在的ｍＲ
ＮＡ配列に相補的な】２量体を各４プライマーの２プー
ルに合成した。各々８個の１４量体２プール（アミノ酸
５２−５８および５６の一部のための潜在的ｍＲＮＡ配
列に相補的）′ｆ：同様にして合１戎した。第１回のス
クリーニングで選択した「上」および「下」のコロニー
から、３セツトの同一のフィルター’を作成した。４つ
の合成オリゴヌクレオチドから、既述した様にして３２
ｐ−標識グローブを作成した。プライマー・ハイブリダ
イゼーシヨン・ミックス中、フィルターｔｏ、５　Ｘ　
１０’　ｃｐｍとハイブリッド形戎させ、洗浄し、Ｘ線
フィルムに感光させた。５オリゴヌクレオチド全てとハ
イブリッド形ｆｆｌ’を行なった９つの陽性群（下から
３つ、上から６つ）がみつかった。ミニスクリーン手法
でプラスミドＩ）　Ｎ　Ａ　ｉ分離し、最も大きい挿入
体を持ったクローンを制限分析により決定した。ｐ、ｍ
ｐＮ−９Ｇ１と名付けたプラスミドの塩基配列を、翫ｘ
ａｍ　−Ｏｉ’１．ｂｅｒｔ法によって完全に決定した
。このｃＤＮＡ挿入体は、１４塩基のプライマー配列（
第１図、プール１）および全量７１６ｂｐを含んでいた
。 ０．７　βＮ　ＯＦメツセージに富むｍＩ（ＮＡから調
製されたオリゴｄＴ−プライム化Ｃ１）ＮＡクローン ０．０２５Ｍのクエン酸ナトリウム（ｐＨ３，８）中の
２％アガロースおよび６Ｍ尿素からなる変性アガロース
ゲルにより、電気泳動によって２００／１ｇのポリｆ’
Ａ）ＲＮＡｉ分画した。リボンームバン（帯）は、垂直
のスライスをエチジウムブロマイドで染色することによ
り肉眼観察し得る様にした。 ゲルｋ　０．５　ｃｍのスライスに切断し、７０”Ｏで
融解し、フェノールで２回、クロロホルムで１回、強力
に抽出した。２回のエタノール沈殿の後、そのペレット
ｆ、（ｄａＨ２０３０ｌｉｅに溶解した。各フラクショ
ン（４Ｍ酢酸７ノモ＝ウム５μ１（ｐＨ７，０）中）１
１’ｌＮｔ乾燥ニトロセルロースフイルターにスポット
し、厳重な条件下でドツト・ハイブリダイゼーションに
、ｊ：クスクリーニングした。Ｋｌｅｎｏｗ　Ｐｏ１．
１反応系中、プライマーとして牛胸腺ＤＮＡフラグメン
トを用いて既知の方法により、３２ｐ〜標識プロ一ブｆ
ｆｉｐｍβＮ　−ｇ　Ｇ１挿入体から調製した。このフ
ィルターを、５０　ｍ　Ｍ　ＮａＰＯ４（ｐＨ？、’　
０　）、５×Ｄｅｎｎａｒｔ’ｓ溶液、５．　ｘ　５ｅ
ｃ１５０ｔｔ９／４の超音波処理したニシン***ＤＮＡ
１１ｏｏｌ１ＭのｒＡＴＰ、Ｉ　ｍ　Ｍ　ＮａＨ２ＰＯ
４−ナトリウムピロボスフェート、および５０％ポルム
アミド中、４２°Ｃで１８時間、〜ｌＯ’ｃｐｍとハイ
ブリッド形成させた。このフィルターｔＯ，２Ｘｓｓｃ
−Ｑ、１％ＳＤＳ中、４２′ｃで２０分間洗浄しく３回
）、フィルムに感光させた。ハイブリダイゼーションの
結果、ＮＧＦメツセージはフラクション１１および１２
にあることがわかった。フラクション１１お工び１２の
それぞれ１０ｄ’ｒ用い、標準的な方法でオリゴｄＴ−
プライム化ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　ｆ調製した。５％ポリアク
リルアミドゲル上の電気泳動の後、ゲルスライスから６
００　ｂｐより長いｃＤＮＡを溶離した。フラクション
１１から約４　Ｏｒ＋ｇｍのｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　、および
フラクション１２からの２０　ｎｇｍ　ｆｆ：ｄ　（Ｃ
：）−尾部形成し、ｄ　（Ｇ）　−尾部形成したｐＢＲ
３２２とアニーリングした。フラクション１１から約３
３００クローン、フラクション１２からの１５００クロ
ーンヲ、ｐｍβＮ−９０１からの３２ｐ−標識内部Ｈｐ
ａＩＩフラグメント（２１６ｂｐ）を使って、厳重な条
件下のフィルターハイブリダイゼーションにより、コロ
ニーとしてスクリーニングした。フィルターを４２°Ｃ
で１８時間・５０　Ｘ　］　０６ｃｐ’ｍとハイブリッ
ド形成させ、洗浄し、既述した様にＸ線フィルムに感光
させた。 フラクション１２からの５つのクローンがこのフ゛ロー
プについて陽性であった。制限分析により、それらは同
胞であることがわかった。ｐｍβＮ−１２１’：４　ｆ
、１、Ｍａｘａｍ　−Ｇ１１ｂｅｒＬ法によυ完全に塩
基配列決定した。フラクション１１からの２つのクロー
ンが陽１牛であった。最大のｐｍβＮ−３Ｂ３の塩基配
列をＭａｘａｍ−Ｇｉ、１ｂｅｒｔ法により完全に決定
した。 Ｃ，８医薬組成物 本発明に係るヒトのβ−Ｎ　Ｑ　ｌｉ’は、このβ−Ｎ
Ｇ　ｌ”　全適当な担体と混合して、既知の方法で、有
用な医薬Ｍｉ成物に製剤化することができる。好適な担
体、および他のヒトの蛋白質、例えばヒトの血清アルブ
ミン金倉んでいてもよい製剤の調製法は、例えばＪＬｅ
ｍｉｎｇｔｏｎのＰｈａｚｍａｃｅｎｔｊｃａｌ　８Ｃ
’３．９ｎＣｅＢ（１す、Ｗ０Ｍａ７−ｔｊｎＶｃよる
）ＩＣ記載されＣいる。この様な医薬組１我物ｅゴ、本
発明の蛋白質の有効量を適当な量の担体と共に含んでお
り、患者に非経口投与することができる。 このヒトβ〜Ｎ　Ｇ　Ｆ　ｉ、ｒ、神経障害またはその
他の、この物質が治療効果を発揮し得る疾患にかかつて
いる患者に非経口投与することができる。投与量および
投与割合に、例えばマウスの唾液腺から得られる同様の
製剤の臨床実験に現在使用されているもの七同じである
。 以上の記載は本発明の好ましい態様を述べたものでｈｖ
、本発明がこれに限定されると解釈してはならない。

【図面の簡単な説明】

第１図はマウスＮＧＦのβザブユニットのアミノ酸配列
、それを暗号化している遺伝子配列、およびその遺伝子
の特定の断片の相補ＤＮＡ鎖を示す模式図、第２図はβ
−Ｎ　Ｇ　Ｆ　ｍｉｔ　Ｎ　Ａ断片を含んでいるクロー
ンのノーザシ・プロット分析の結果を示すグラフ、第３
図はマウスＮＯＦ遺伝子の部分的制限地図、および本発
明のプラスミドのヌクレオチド配列とマウスＮＧＦ遺伝
子のヌクレオチド配列との対比を示す模式図、第４図は
組換えファージλｈＮ８の物理的地図、第５図はヒトβ
ＮＯＦ染色１本遺伝子のヌクレオチド配列を示す模式図
、第６図はヒトおよびマウスのプレブローβＮＯＦ遺伝
子のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の比較を示す
模式図、第７図はヒトβＮ　ＯＦの発現のために組み立
てられた遺伝子を示す模式図、第８図はヒトβＮＧＦ全
発現するための、Ｅ、ｃｏｌｉ全形質転換するためのプ
ラスミドｐｈ　ＮＧＦ　ｔｒｐ　１の組み立て工程の１
部を示す工程図である。 特許出願人　ジエネンテク、インコーポレイテッド代　
理　人弁即士　青白　葆　外１名 図面のｉ−、、、ｊｌ、（内容に変更なし）〜、１−１ ｃｃ　ｃｃｃｃ ０ ｃｃ　ｃｃｃｃ ０ ＣＣＣＣＣ［： ｃ　ｃｃ　ｃ ｃ０ ＣＣＣ Ａ　ＣＡ　Ａ　Ａ　Ａ　Ａ　ＣＡＡ　ＡＡＧＴ　ＴＴ　
ＡＧＴＴ　ＴＴ ｃ　ｃｃ　ｃｃ　ｃｃ ０ Ａ　Ａ　Ａ　ＣＡ　ＣＡ　Ｇ　ＡＴＡ ００ ＴＴ　ＴＴ　Ｔ ｃｃ　ｃｃ　ｃ ｃ　ＣＣＣ Ｔ　ＴＡＧＴ　Ｔ　Ｔ　Ｔ　Ｔ ｃｃｃｃ　ｃｃｃ 手続補正書（方式） １．事件の表示 昭和５≦〕年特許願第　４１２　（１５号２、発明の名
称 ヒト神経成長因子の遺伝子紺換えによる調製法３、補正
をする者 事件との関係　特許出願人 （ｉｊｉｌｉ　アメリカ合衆国カリ７オルニア９４０８
　ｆ＋、刃ウス・サン・７ランシスコ、ポイント・サン
・ブルーノ・ブールバード４６０番 名称　ジェネンテク、インフーボレイテソド４、代理人

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ヒト起源の夾雑蛋白質を実質的に含んでいないヒトβ
   ＮＧＦ。 ２、組換え宿主細胞によって生産される第１項に記載の
   βＮＯＦ。 ３微生物細胞によって生産される第２項に記載のβＮＯ
   Ｆ。 ４、組換え宿主細胞中でヒトβＮＧＦｆ：暗号化してい
   るＤＮＡ配列を発現させることができるＤＮＡ配列と有
   効に連結された該βＮＯＦ暗号化］）ＮＡ配列。 ５形質転換組換え宿主細胞中で第４項に記載のＤＮ’Ａ
   配列を発現することができる複製可能な発現ベクター。 ６、第５項に記載の発現ベクターで形質転換された組換
   え宿主細胞。 ７、　Ｅ、ｃｏｌｉ株である第６項に記載の組換え宿主
   細胞。 ８プラスミドｐｈβＮＧＦｔｒｐｌ。 ９第８項に記載のプラスミドで形質転換された組換え宿
   主細胞。 １０、　Ｅ、　ｃｏｌｉ株である第９項に記載の組換え
   宿主細胞・ １１、治療に有効な量の、第１項〜第３項のいづれかに
   記載のβＮＧＦｉ薬学的に許容し得る担体と共に含有し
   てなる医薬組成物。 １２非経口投与に適した第１１項に記載の組数物。 １３、損傷を受けた神経の治療に用いる第１１項または
   第１２項に記載の組成物。 １４第５項に記載の発現ベクターで組換え宿主細胞を形
   質転換し、この細胞を培養し、発現されたβＮＯＦを分
   離することからなるβＮＧＦの調製法。