JPS6084299A - ヒト神経成長因子の遺伝子組換えによる調製法 - Google Patents
ヒト神経成長因子の遺伝子組換えによる調製法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
本発明シまポリペプチドホルモン、ヒト神経成長因子(
NGF)、組換え技術を用いたその調製法、およびそれ
を含有する組成物に関する。 本発明の背景 A、神経我長因子 分子量〜130,000の多成分系蛋白質がマウスの唾
液腺から分離された。この蛋白質は特((雄マウスの唾
液腺に豊富に存在しており、通常神経成長因子(Ner
ve Growth Factor )と呼ばれている
。 この蛋白質が演じる主要な神経活性ば、感覚レセプター
(受容体)から脳へインパルスを伝える神経細胞、感覚
ニューロンの大きさおよび循環系、腺、平滑筋およびそ
の他の麗官の機能的活tl調節している自律神経系を構
成している2種の内の1つ、交感神経ニューロンの大き
さを増大させる能力を有する点にある。 マウスの唾液腺から、中B pHで抽出して得られるN
GPH78NOFとして知られており、α、βおよびβ
サブユニットと呼ばれる3つのサブユニットで構成され
ている。78 NGFの全体としての神経活性は、非共
有結合性の力で互いに結合している2個の同一の118
アミノ酸ベグチドのダイマーであるβサブユニット4よ
ってもたらされる。このザブユニットは2.5SNGF
とも呼ばれる。βサブユニットは生物活性ヲ持っていな
い、しかし、とのβサブユニットはアルギニンニステロ
ペプチダーゼである。NGFの合成ニおける初期の遺伝
子産物は、βサブユニットで開裂されるプレプロ−NG
Fポリペプチドである。このrサブユニットn、マウス
に於いて傷の治療を促進させることがわかった。 最近、第3のNGF成分(分子量〜116,000)が
マウスの唾液腺から分離され、プラスミノーゲシ活注化
剤としての性質を有することが報告された。即ち、この
成分はグラスミノーゲンをプラスミンに変換するので、
血餅の溶解に利用し得ること全示唆し7ている(欧州特
許出願7’83006562(公開番号0002139
A1)参照:発明の名称、1−神経成長因子およびその
調製法」、出願日、1978年11月22日、公開、1
979年5月30日)。 既述した様に、NGFの神経活性はβサブユニット(以
下、βNOFと言う)によってもたらされる。これは、
中枢性アドレナリン作用性ニューロンの切断された軸索
の再生性再発芽を顕著に促進し、損傷を受けた軸索の修
復に有用な性質を持っていることがわかった。 B1組換えi) N A技術 組換えI) N A技術は、一応戎熟期に達したと言え
る、分子生物学者は、各種のDNA配列に6る程度容易
に組換え、形質転換された微生物および細胞培養株中で
多量の外来性蛋白質産物を生産し得る新しいDNA体を
つくることができる。一般。 的な手技手法は、各種のDNAの平滑末端あるいは粘着
末端フラグメントにインビトロで結合させ、特定の生物
に形質転換するのに有用な強力な発現ベクターを調製し
、所望の外来性産物を効率的に合収させることである。 しかし、産物によっては、それを生産する方法は依然と
して回りくどいものであり、常に成功を予見し得る程に
は、この科学は進歩していない。事実、基礎的な実験に
基づくことなく、成功すると予想する者は、著しい実施
不能の危険をおかしてそ゛うするのである・主要な要素
、即ち複製起源、1種またはそれ以上の表現型選択特性
、発現プロモーター、外来性遺伝子の挿入および残留ベ
クターの]) N A組換えは、通常宿主細胞の外で行
なう。得られた組換え複製可能発現ベクター捷たはプラ
スミドを形質転換によって細胞に導入し、その形質転換
体を増殖させることによって多量の組換えビヒクルを得
る・暗号化されているDNA情報の転写および翻訳を支
配している部分に関して適切な位置にこの遺伝子が挿入
された場合は、この得られた発現ベクターは、挿入され
た遺伝子が暗号化しているポリペプチド配列を生産する
のに有用である、この過程は発現と呼ばれる、要すれば
宿主細胞全溶解させ、他の蛋白質から分離精製して生産
物を回収することができる。 実際には、組換えDNA技術を使って全て外来性のペプ
チドを発現させることができ(いわゆる直接発現)、る
るいはまた、ホモローガス(同種の)ポリペプチドのア
ミノ酸配列の一部と融合したヘテロローガス(異種の)
ポリペプチドを発現させると々もできる。後者の場合、
目的とする生物活性産物は、細胞外環境で開裂されるま
で、融合したホモローガス/ヘテロローガスポリペプチ
ド内で不活性化されていることがある。 同様に、遺伝および細胞生理を研究するための細胞培養
寸たは組織培養の技術も非常に進歩している。単離した
正常細胞から、続々と継代(移植)して調製した耐久セ
ルラインを保持する手技手法を使用することができる。 研究に使用するには、この様なセルライシl−J:ti
、体培地中の固形担体上に保持するか、あるいは支持栄
養物を含んでいる懸濁液中で発育させて保持する。大量
生産のためのスケールアップには機械的な問題があるた
けである。 同様に、生物工学に於いて、蛋白質の生化学は有用な、
実rよ必要な補助字間である。所望の蛋白質を生産する
細胞に、何百という他の蛋白質、細胞代謝の内性産物を
も生産する。これらの夾雑蛋白質は、所望の蛋白質から
分離しておかないと、他の化合物と同様、所望の蛋白質
による治療過程でヒトや動物に投与されると毒性を現わ
すことがある。従って、当面の特定の系に適した分離法
を計画し、所望の用途に使用できる均質な安全な生産物
を得るのに蛋白質生化学の技術が必要となってくる。蛋
白質生化学はまた、所望の生産物の同定に、そしてそれ
を特定化して、細胞が確実に、変化したり変異すること
なく、忠実にそれ全生産したことを確かめるのにも必要
である。この科学分野は更に、バイオアッセイや安定性
試験全計画したり、臨床試験やマーケティングを行なう
前にやらなけれはならないその他の手続きにも関係して
いる。 本発明の要約 本発明は、従来、抽出技術や合1戎によって、実質的に
純粋な形で単離されたことのないヒトNGFのβザブユ
ニットを提供するものである。本発明者らは、意外にも
、融合したホモローガス蛋白質(自己蛋白質)f:含ん
でいない成熟(mature)ポリペプチドの形で、β
−NGFをE、coli (大腸菌)でヘテロローガス
蛋白質(外来性蛋白質)として発現させ得ることを見い
出した(これは、外来性蛋白質として認識する細胞酵素
から保護する必要があるかも知れないものである)。本
発明音ら砿1.NOFのβザブユニットは、E、col
i中で成熟蛋白質として直接発現される最も小さな蛋白
質である七イ言じている。 本発明に係るβ−NOFは、神経障害の治療またはそれ
に関連するその他の有用な目的に使用することができる
。天然に分泌されるヒトβ−NOFと同じであり、しか
も11市乳動物由来の他の蛋白質を含んでいないので、
ヒト以外の動物由来のペプチドポルモジをヒトの病気の
治療に使う場合と違って、本発明のβ−N C,liが
治療中に免疫原性反応をひき起すということはない。更
に、組織抽出物として得たβ−N G l”に附随して
おり、それを含む組成物に望ましくない生物活性を示′
tflffl乳動物起源の他の蛋白質全実質的・疋含ん
でいないのが本発明のβ−NGFであり、これは外来性
蛋白質として得られるからである。 更に本発明は、このポリペプチドを発現し得る形で暗号
化している遺伝子配列を含んでいる複製可能なりNA発
現ベクターを提供するものである。 更にまた本発明は、この様なベクターで形質転換された
微生物株またはセルラインの様な組換え宿主細胞、およ
びそれらの培養物を提供するものである。さらに本発明
は、得られたこのポリペプチドを含有している非経口投
与用の組成物を提供するものである。 従って、本発明の目的は、他の哺乳動物蛋白質を実質的
に含んでいないヒトβ−N G Fを得ることKあり、
もう一つの目的は、天然資源から抽出によって得るこ々
ができる量より多量のヒトβ−NGFを得ることにある
・ 図面の説明 第1図はマウスNGFのβサブユニットのアミノ酸配列
、それを暗号化している遺伝子配列、およびその遺伝子
の特定の断片(セグメント)の相補DNA@を示してい
る。 第2図は、β−NGFml(NAの断片を含んでいるク
ローンのノーザンプロット分析を示してぃる。 第3図(1、マウスNGF遺伝子の部分的制限地図、お
よび本発明によって組み立てられたプラスミドのヌクレ
オチド配列とマウスNGF遺伝子のヌクレオチド配列と
のお゛およその一致を示している。 第4図は、組換えファージλhN8の物理的地図および
ヒトゲノムを囲っている領域を示している。 第5図はヒトβNOF染色体遺伝子のヌクレオチド配列
を示している。 第6図は、ヒトおよびマウスのプレグローβNOF遺伝
子のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の比較を示し
ている、 第7図は、ヒトβN OFの発現のために組み立てられ
た遺伝子を示している。 gIJ8図は、ヒトβNGFf:発現するための、E。 coli ’に形質転換するためのプラスミドph N
G Ftrp lの組み立て工程の一部を示している
。 詳細な説明 A、宿主細胞の培養およびベクター DNA配列を、それを発現することのできる他の配列に
有効に結合した場合、そのI) N A配列を発現する
こ七ができるベクターを発現ベクターと言う。常にはっ
きりと記載することはしないが、この発現ベクターは、
エビソームとして、あるいは染色体DNAの組込み部分
として、宿主生物中で複製できるものでなければならな
い。言う捷でもなく、複製能を持たないものは有効に使
用できない。結局、発現ベクターとは機能的な定義であ
り、この用語は特定の配列に用いられるだけでなく、そ
の用語には、そこに含まれる特定のDNA暗号を発現す
ることができる全ゆるDNA配列が含まれている。一般
に、組換えDNA技術で用いられる発現ベクターはグラ
スミドの形であることが多い。このプラスミドは、環状
の2本鎖DNAループであって、そのベクターの形では
、染色体に結合していないものを言う。プラスミドは、
ベクターの最も普通に用いられる形であるので、本明細
書に於いては、プラスミドとベクターを交換可能な用語
として用いる。しかし本発明に於いては、同じ機能金有
する、当技術分野で知られている、あるいは今後知られ
得る他の形の発現ベクターも含捷れると解釈すべきであ
る。 本明細書に於いて組換え宿主細胞とけ、組換えDNA技
術を用いて組み立てられたベクターで形質転換された細
胞を意味する。 本明細書に記載した方法およびベクターは、広範囲の真
核性および原核性の生物の宿主細胞に使用することがで
きる。 勿論、一般的に、本発明に有用なベクターを組み立てる
に際し、D N A配列をクローニングするのに原核生
物が好ましい。特にE、 coli K 12株294
(ATCC/l631446)が特に好ましい。 使用し得るその他の微生物株として、E、 coli
B、E、 Ca1コ、 X 1776 (ATTC/I
631537 )などのE、’ coli株が含捷れる
。これらは限定する意味で挙げたのではなく、単なる例
示に過ぎないことは言う丑でもない。 ・ 原核生物は発現にも使用することができる。上記ノ菌株
の他、E、 C01i W3110 (F−+λ−2原
栄養性、ATTC427325) 、Bacillus
5ubtilusの様な大腸菌類、Salmonel
la typhmuriu+nやSerratiama
rcesans の様な腸内細菌群および各種のシュー
ドモナス種を使用することができる。 一般に、これらの宿主に関しては、その宿主細胞と適合
し得る種由来のレプリコンおよび調節配列を含んでいる
プラスミドベクターが使用される。 このベクターはもともと、形質転換細胞に表現形質(表
現型)の選択性を付与することのできる標識化配列と共
に複製部位を持っている。例えば、E、 coli (
1’i、E、 coli種由来のpnit3.22を使
ッテ形質転換される( 1301iVarら、Gene
2 : 95(1977))。p’BR322はアシ
ビンリシおよびテトラサイクリン耐性のための遺伝子を
含んでおり、従って、これは形質転換細胞を同定するだ
めの簡単な手段となる。このpBR322プラスミドや
その他の微生物グラスミドは、その微生物がそれ自身の
蛋白質を発現するのに使用することのできるプロモータ
ーを含んでいなければならず、あるいは含む様に改良さ
れなくてはならない。 組換えDNAの組み立てに通常用いられるプロモーター
にはβ−ラクタマーゼ(ペニシリナーゼ)およびラクト
ースプロモーター系(Changら、Nature 2
75 : 615 (1978) ; Itakura
ら、 5cience 198 : 1056 (19
77) ;(3oeddelら、Nature 281
’ : 544 (1979))およびトリプトファン
(trp)プロモーター系(0oeddelら、 Nu
cleic Ac1ds &s、 8 : 4057(
1980) ; EI’0Appl Publ 400
36776)がある、これらが最も普通に用いられてい
るが、その他の微生物プロモーターも発見され、使用さ
れており、それらのヌクレオチド配列は詳8aに発表さ
れているので、当業者であれば、それらをプラスミドベ
クターに機能的に結合させることができる( 5ieb
enlistら、 Ce1120 :269(1980
))。 原核生物の他、酵母培養株の様な真核性微生物も使用す
ることができる。8accbaronyces cer
evisiaeえばプラスミドY几p 7 (Stin
chcombら、Nature2.82 : 39 (
1979) ; Kingeman fi Gene7
: I 4 1 (1979) ; Tschempe
r ら、Gene 1 0: 157(1980))が
よく用いられる。このプラスミドは、トリプトファンを
生産する能力を欠いている酵母の突然変異株、例えばA
TCC/f644076またtry P E P 4−
’ 1 (Jones、 aenetics85:12
(1977))にとって選択マーカーとなるtrp ]
遺伝子をもともと含んでいる。酵母宿主細胞ゲノムの特
徴としてのtrp l損傷が存在することは、トリプト
ファンの非存在下に発育させることによって形質転換体
を検出する有効な環境を提供することになる。 酵母ベクター中の適切な促進(promoting )
配列ニハ、3−ホスホグリセレートキナーゼ(Ilit
Zeman ら、J、Biol、Chem、255 :
2073(1980))または他の解糖酵素(Hes
sら、J。 Aav、 Enzymel(eg、7 : 149 (
1968) ;1(o 11a naら、 Bioch
emistry 1 7 : 4900 (1978)
)、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−3−ホス
フェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベー
トデカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グル
コース−6−ホスフニートイソメラーゼ、3−ホスホグ
リセレートムターゼ、ピルベートキナーゼ、ト1ノオー
スホスフエートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメ
ラーゼおよびグルコキナーゼなどのフ゛ロモーター〃(
含まれる。好適な発現グラスミドヲ組み立てるに際し、
これらの遺伝子の終了(termj、nation )
西上列もまた、発現ベクターに、発現しようとするへ上
列の3′ニ結合さ−せてmRNAのポリアゾ=ルイヒお
よび終了を提供する。発育条件によってコントロールさ
れる、もう1つの転写における有オリ性を持った他のプ
ロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ2、イソチ
トクロームC1酸性ホスフアターゼ、窒素の代謝に関与
する分解酵素、」二言己のグリセルアルデヒド−3−ホ
スフェ−トチヒドロゲナーゼ、およびマルトースおよび
ガラクトースオlJ用に関与する酵素(H’、alla
nd、前記)などのり゛ロモーター領域である。酵母に
適合するプロモーター、複製起源および終了配列を含ん
でいる全てのプラスミドベクターが適している。 微生物の他、多細胞生物由来の細胞培養も宿主として使
用することがゼきる。原則として、を椎動物および無を
椎動物のいずれの細胞培養も使用できる。しかし、を椎
動物・細胞が最も興味があり、を椎動物細胞の培養増殖
(組織培養)が最近では常套手段となって来た(Tis
sue 0ulture、 AcademicPreB
B、 KrueeおよびPatterson、 edi
tors(1973))。この様な有用な宿主細胞系の
例は、V E BDおよびH8i、a細胞、チ、ヤイユ
ーズ、7、ムスター卵巣(Ci−I O’ )細胞系、
W2B5、B f(i(、C08−7およびM ])
CK細胞系などである。この様な細胞の発現ベクターは
、通常、(要すれば)複製起源、発現しようとする遺伝
子の前に位置するプロモーター、必要なリポソーム結合
部位、RNA組み継ぎ(スプライス)部位、ポリアデニ
ル化部位、転写終了配列などを含んでいる。本明細書で
は、好ましい態様を記載したが、本発明がその様な例示
した配列に限定されるものと解釈してはならない。 哺乳動物細胞中で用いるには、発現ベクター上の調節機
能はウィルスから提供されることが多い。 例えば、通常使用されるプロモーターは、ポリオーマ、
アデノウィルス2から誘導され、シミアシウィルス40
(SV40)から導かれることが最も多い。古い、そし
て新しいSV40ウィルスのプロモーターに、共にこの
ウィルスから、SV40ウィルスの複製起源を含んでい
るフラグメントとして簡単に得られるという理由で特に
有用である( Fiersら、Nature 273
: 113 (1978))。)Iina Illlゴ
ザ(部位)からウィルスの複製起源内に存在している8
g1■サイト[至る約250bp 配列を含んでいるな
らば、それより小さいあるいは大きいSV4 Qフラグ
メントも使用することかできる。更に、所望の遺伝子配
列と正常通り結合しているプロモーターまたは調節配列
を、この様な調節配列が宿主細胞に適合する限り、使用
することができ、′またそれが好ましいことが多い。 複製起源は、5v4otたは他のウィルス(例えばポリ
オーマ、アデノ、VSV、l3PVなど)が誘導される
様に、外来性の起源を含む様にベクターを組み立てるこ
とにより、あるいは宿主細胞の染色体の複製機構により
提供′仁ることかできる。 このベクターが宿主細胞染色体に組み込まれたら、後者
は十分であることが多い。 B、使用した方法 強力な細胞壁バリアーのない細胞全宿主細胞おして使用
する場合は、Graham らの燐酸カルシウム沈澱法
(Graham およびVan der Eb、 Vi
r’ology52:546(1978))によってト
ランスフェクションを行なう。しかし、核注入−!たは
プロトプラスト融合などの、DNA全細胞に導入する他
の方法も使用することができる。 原核細胞捷たけ実質的な細胞壁構造を持った細胞を使用
する場合、好ましいトランスフェクションの方法は、C
ohenらの塩化カルシウムを用いたカルシウム処理で
ある( C0hen、 F、 N、ら、proc 。 Natl、 Acad、 Sci、(USA) 、 6
9 : 2110(1972))。 所望の暗号配列および調節配列(contro1seq
uθnc()を含んでいる好適なベクター全組み立てる
には標準的な結合技術を用いる。分離したプラスミド!
f?Llr、J:、DNAフラグメントを開裂し、修復
(ティラー)し、所望のプラスミドを形成する様に、希
望の形に再結合する。 開裂は、適当な緩衝液中、制限酵素で処理することによ
り行なう。通常、約1μyのプラスミドまたはD N
Aフラグメント、約20μlの緩衝液、約1単位の酵素
全使用する(特定の制限酵素に対する適切な緩衝液およ
び基質の量は製造業者が指定している)。37°Cで約
1時間インキュベートする。インキュベートした後、フ
ェノールおよびクロロホルムで抽出して蛋白質を除き、
水性分画からエタノールで沈澱させて核酸を回収する。 平滑末端が必要な場合は、E、 coli I) N
AポリメラーゼI(K1θnow)10単位で、15℃
で15分間処理し、フェノール−クロロホルム抽出し、
エタノール沈毅に付す。 開裂しプこフラグメントの大きさによる分離は、aoe
aae:tらの方法(Goeddel、 Dら−Nuc
leic Ac1ds′R8s、8:4057’(19
80’))VC従い、6襲ポリアクリルアミドゲルを使
って行なう。 結合(ライゲーション)には、正しく符合する様に末端
を適当に修復したほぼ等モル量の所望の我分全、DNA
Q、5μ!当たり約10単位のT4DNAリガーゼを用
いて処理する(開裂したベクターを成分として用いる場
合に、細菌性アルカリ性ホスファターゼで予め処理して
開裂したベクターの再結合を防ぐのがよい)。 ライゲーション混合物を使ってE、 coli K12
株294(ATL031446)を形質転換し、成功し
た形質転換体をアシビタリン剛性について選択する。形
質転換体からプラスミド金調製し、M8ssingらの
方法(Meesingら、Nucleic Ac1dS
&s、 9 :309(1981))またはMaxam
らの方法(Maxamら、Methocls in E
nzymology 65 : 499(1980))
に従って、制限酵素分析し、そして/または配列を決定
する・ C1好ましい実施態様 以下に、E、 C01i中でポリペプチドを発現させる
好寸しい態様について記載するが、これは本発明を例示
するものであって、本発明がこれに限定されるものと解
訳してはならない。 C91,マウスのプローβN OF−q暗号化している
CDNAクローンの分離 ヒトN OFのβサブユニツIf暗号化している遺伝子
を得るために、ハイブリダイゼーション・プローブとし
て、マウスのβNGFI暗号化しているクローンされた
cDNAを用いることにした。 c D N Aクローニング・アプローチには、合成オ
リゴヌクレオチドプライマー全使用して、第1図((示
し/也マウスのβNGFサブユニットの既知のアミノ酸
配列を利用した:雄および雌のマウスの唾液腺に存在す
るNGFレベルの違いを、同定のも91つの手段として
用いた。マウスのβNGFアミノ酸配列の3つの小さな
部分を選び、それらを暗号化している全ての可能性のあ
る配列に相捕的なオリゴヌクレオチド・プールk Cr
ea 等の方法(Nucleic Ac1ds Res
、、 8 : 2331 (1980))で合成した。 この暗号鎖および相補鎖のヌクレオチド配列を第1図に
示す。 合成オリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーション・プ
ローブとして用いて、マウスβNGFCDNAクローン
を、雄マウス唾液腺からのオリゴdT−プライム化cD
N Aバンクから分離同定する試みは失敗した。この
結果は、βN0FH雄マウスの唾液腺蛋白質の01%を
占めているが、そのmRNAは同じ様に豊富ではないこ
とを示してイル。従って、まずβNOF特異ヌクレオチ
ド配列を豊富にするために、この蛋白質のカルボキシ末
端に近接した配列を表わしているプライマー・プールを
使って、雄の唾液腺からのポIJA−含有(A + )
几NAの逆転写を特異的にプライムした。 長さ200bp以上のCDNA分子を、よく知られたプ
ラスミドpBR322にクローンした。CDNAのブラ
イミングにハイブリダイゼーション・グローブとして最
初に使った5−32p−標識NGFプライマー・プール
を使って、全部で10,000個のクローンをスクリー
ニングした結果、その内08係が、非常に厳重なノ・イ
ブリダイゼーション条件下で陽性信号を与えた。残、り
の992%の1プライム化−1されたCf)NAバンク
は、ポリAMSGRNAの調製中に溶離した痕跡量のオ
リゴd′丁によるブライミングおよび自己ブライミング
により生じたと思われる。クローニング操作の際の81
ヌクレアーゼ処理が末端プライマー配列を傷つけ、従つ
′C検出された陽性クローンが少なかったのかも知れな
い。 この最初のスクリーニングで陽性となったクローンを、
ハイブリダイゼーション・プローブとして、第1図に示
したオリゴヌクレオチドプール1より上流のDNA配列
から誘導した放射線標識化プライマー・プール2および
3を使ってスクリーニングE7た。更に雄または雌マウ
スの唾液腺のいずれかからのポリARNAから、プール
1でフリイム化した32p−cDNA4y−二重フィル
ター上のグローブさして用いた。再びpB IL 32
2中、オリゴヌクレオチド・プール2および3とノーイ
ブリッドを形成した全部で10個の雄−特異的クローン
を同定した。制限酵素分析の結果、10個は全て共通の
I(ae[IIおよびHinf I フラグメントを持
っているこ七がわかった。本発明者らがpmβN−gG
lと名付けた、最も長いDNA挿入体(〜700bp)
’を発現するプラスミドを含んでいるクローンの全配列
全決定した。このヌクレオチド配列から推定されるアミ
ノ酸配列は、N1−12−末端ブロー配列に加えて、1
つの翻訳フレーム中に期待するNGF配列を含んでいた
(第4図参照)。マウスのN G P CI) N A
配列金倉んでいる細菌クローンの組み立−〇および同定
について、以降に詳述する。 完全なNGI”mRNAの大きさを決定するために、ノ
ーザン・フ゛ロット ハイブリダイゼーションおよびプ
ライマー・エクステンショシ分析法を用いた。NGFお
よびブロペプチド配列を含んでいる長さ470bpの3
2p−標識D N Aフラグメント(Rsal −Rs
aI789 、第3図参照)1雄マウス唾液腺に特異な
長さ約1300ヌクレオチドの几NA種と雑種形成させ
た・2つの短い、2本鎖の、5′末端−標識化制限フラ
グメン1、を用いたプライマー・エクステンション実験
(第3図の説明参照)してより、βNGFm]i’Aの
5末端は、本発明者らのクローンの3末端から下流の約
370塩基を残して、pmβN−9GlcDNAフラグ
メントの5末端から上流に約230塩基の所に位置づけ
られた。欠失5配列の〜30ヌクレオチドを除く全てが
、本発明者らがpm pN−161゛7およびpm β
N −2] B 5と名付けたクローンに含まれており
、これらは、第3図に示す様に、互いに、そしてクロー
ンpmβN−901と重複している。これらは、c ]
) N A合ljl fプライムするため、制限フラグ
メントの使用についてのより詳細な以下に記載の方法で
分離する。 プライマー配列の3′末端から下流へ3′ポリA配列−
までの配列を含んでいるクローン化[7たCDNA−4
得るために、プレパラテイブ尿素アガロースゲル上で、
全ポリA雄マウス唾液腺RNA1分画することによυ、
βNGFm几NAを豊富化した。 最も大きいサイズのフラクション、βNGF1.DNA
グローブとハイブリダイズ(雑種形成)する配列を含む
フラクションを、オリゴdT−プライム化c D N
A合成およびクローニングに使用した。 3.700のクローンをスクリーニングした結果、4つ
の腸性ハイブリダイゼーショシシグナルが得うれた。本
発明者がpmβN −12E 4と名付けたクローンの
ヌクレオチド配列分析、および3暗号化および非翻訳配
列に239ヌクレオチドを添加したpmβN−8B3゜
オリゴdTプライム化であるが、本発明者らのクローン
はいずれも、第2のDNA鎖の不完全な合成または広範
なS1ヌクレアーゼ処理のために、βN OF 、m
lt N Aの全3非翻訳領域を含んでいなかった。ノ
ーザノ プロント部分・訛により、ポリA配列(1本発
明者らがクローンした配列から離れていないことがわか
った(第2図参照)。豊富化したmJ(i’7 Aから
のオリゴa Tプライム化CDNAクローンの調製につ
いて以下に詳述する。 0、2. ヒト染色体βNGF遺伝子の分離および特性
化 ’2 ト遺伝子ライブラリー(λCharon 4 A
ベクターに挿入された、15−20kbの、部分的f■
a。 Ill / Alu Iヒト胎児肝1DNAフラグメン
トからなる)を、放射活性ハイブリダイゼーション・プ
ローブとして、既述し1470bpマウスNGFクロー
ン化CDNA7ラグメント(pmβN−901Rsa
■フラグメント)を用いてスクリーニングした。全部で
27組み換えファージをプラーク純化し、Eco几■消
化によシ部分的
NGF)、組換え技術を用いたその調製法、およびそれ
を含有する組成物に関する。 本発明の背景 A、神経我長因子 分子量〜130,000の多成分系蛋白質がマウスの唾
液腺から分離された。この蛋白質は特((雄マウスの唾
液腺に豊富に存在しており、通常神経成長因子(Ner
ve Growth Factor )と呼ばれている
。 この蛋白質が演じる主要な神経活性ば、感覚レセプター
(受容体)から脳へインパルスを伝える神経細胞、感覚
ニューロンの大きさおよび循環系、腺、平滑筋およびそ
の他の麗官の機能的活tl調節している自律神経系を構
成している2種の内の1つ、交感神経ニューロンの大き
さを増大させる能力を有する点にある。 マウスの唾液腺から、中B pHで抽出して得られるN
GPH78NOFとして知られており、α、βおよびβ
サブユニットと呼ばれる3つのサブユニットで構成され
ている。78 NGFの全体としての神経活性は、非共
有結合性の力で互いに結合している2個の同一の118
アミノ酸ベグチドのダイマーであるβサブユニット4よ
ってもたらされる。このザブユニットは2.5SNGF
とも呼ばれる。βサブユニットは生物活性ヲ持っていな
い、しかし、とのβサブユニットはアルギニンニステロ
ペプチダーゼである。NGFの合成ニおける初期の遺伝
子産物は、βサブユニットで開裂されるプレプロ−NG
Fポリペプチドである。このrサブユニットn、マウス
に於いて傷の治療を促進させることがわかった。 最近、第3のNGF成分(分子量〜116,000)が
マウスの唾液腺から分離され、プラスミノーゲシ活注化
剤としての性質を有することが報告された。即ち、この
成分はグラスミノーゲンをプラスミンに変換するので、
血餅の溶解に利用し得ること全示唆し7ている(欧州特
許出願7’83006562(公開番号0002139
A1)参照:発明の名称、1−神経成長因子およびその
調製法」、出願日、1978年11月22日、公開、1
979年5月30日)。 既述した様に、NGFの神経活性はβサブユニット(以
下、βNOFと言う)によってもたらされる。これは、
中枢性アドレナリン作用性ニューロンの切断された軸索
の再生性再発芽を顕著に促進し、損傷を受けた軸索の修
復に有用な性質を持っていることがわかった。 B1組換えi) N A技術 組換えI) N A技術は、一応戎熟期に達したと言え
る、分子生物学者は、各種のDNA配列に6る程度容易
に組換え、形質転換された微生物および細胞培養株中で
多量の外来性蛋白質産物を生産し得る新しいDNA体を
つくることができる。一般。 的な手技手法は、各種のDNAの平滑末端あるいは粘着
末端フラグメントにインビトロで結合させ、特定の生物
に形質転換するのに有用な強力な発現ベクターを調製し
、所望の外来性産物を効率的に合収させることである。 しかし、産物によっては、それを生産する方法は依然と
して回りくどいものであり、常に成功を予見し得る程に
は、この科学は進歩していない。事実、基礎的な実験に
基づくことなく、成功すると予想する者は、著しい実施
不能の危険をおかしてそ゛うするのである・主要な要素
、即ち複製起源、1種またはそれ以上の表現型選択特性
、発現プロモーター、外来性遺伝子の挿入および残留ベ
クターの]) N A組換えは、通常宿主細胞の外で行
なう。得られた組換え複製可能発現ベクター捷たはプラ
スミドを形質転換によって細胞に導入し、その形質転換
体を増殖させることによって多量の組換えビヒクルを得
る・暗号化されているDNA情報の転写および翻訳を支
配している部分に関して適切な位置にこの遺伝子が挿入
された場合は、この得られた発現ベクターは、挿入され
た遺伝子が暗号化しているポリペプチド配列を生産する
のに有用である、この過程は発現と呼ばれる、要すれば
宿主細胞全溶解させ、他の蛋白質から分離精製して生産
物を回収することができる。 実際には、組換えDNA技術を使って全て外来性のペプ
チドを発現させることができ(いわゆる直接発現)、る
るいはまた、ホモローガス(同種の)ポリペプチドのア
ミノ酸配列の一部と融合したヘテロローガス(異種の)
ポリペプチドを発現させると々もできる。後者の場合、
目的とする生物活性産物は、細胞外環境で開裂されるま
で、融合したホモローガス/ヘテロローガスポリペプチ
ド内で不活性化されていることがある。 同様に、遺伝および細胞生理を研究するための細胞培養
寸たは組織培養の技術も非常に進歩している。単離した
正常細胞から、続々と継代(移植)して調製した耐久セ
ルラインを保持する手技手法を使用することができる。 研究に使用するには、この様なセルライシl−J:ti
、体培地中の固形担体上に保持するか、あるいは支持栄
養物を含んでいる懸濁液中で発育させて保持する。大量
生産のためのスケールアップには機械的な問題があるた
けである。 同様に、生物工学に於いて、蛋白質の生化学は有用な、
実rよ必要な補助字間である。所望の蛋白質を生産する
細胞に、何百という他の蛋白質、細胞代謝の内性産物を
も生産する。これらの夾雑蛋白質は、所望の蛋白質から
分離しておかないと、他の化合物と同様、所望の蛋白質
による治療過程でヒトや動物に投与されると毒性を現わ
すことがある。従って、当面の特定の系に適した分離法
を計画し、所望の用途に使用できる均質な安全な生産物
を得るのに蛋白質生化学の技術が必要となってくる。蛋
白質生化学はまた、所望の生産物の同定に、そしてそれ
を特定化して、細胞が確実に、変化したり変異すること
なく、忠実にそれ全生産したことを確かめるのにも必要
である。この科学分野は更に、バイオアッセイや安定性
試験全計画したり、臨床試験やマーケティングを行なう
前にやらなけれはならないその他の手続きにも関係して
いる。 本発明の要約 本発明は、従来、抽出技術や合1戎によって、実質的に
純粋な形で単離されたことのないヒトNGFのβザブユ
ニットを提供するものである。本発明者らは、意外にも
、融合したホモローガス蛋白質(自己蛋白質)f:含ん
でいない成熟(mature)ポリペプチドの形で、β
−NGFをE、coli (大腸菌)でヘテロローガス
蛋白質(外来性蛋白質)として発現させ得ることを見い
出した(これは、外来性蛋白質として認識する細胞酵素
から保護する必要があるかも知れないものである)。本
発明音ら砿1.NOFのβザブユニットは、E、col
i中で成熟蛋白質として直接発現される最も小さな蛋白
質である七イ言じている。 本発明に係るβ−NOFは、神経障害の治療またはそれ
に関連するその他の有用な目的に使用することができる
。天然に分泌されるヒトβ−NOFと同じであり、しか
も11市乳動物由来の他の蛋白質を含んでいないので、
ヒト以外の動物由来のペプチドポルモジをヒトの病気の
治療に使う場合と違って、本発明のβ−N C,liが
治療中に免疫原性反応をひき起すということはない。更
に、組織抽出物として得たβ−N G l”に附随して
おり、それを含む組成物に望ましくない生物活性を示′
tflffl乳動物起源の他の蛋白質全実質的・疋含ん
でいないのが本発明のβ−NGFであり、これは外来性
蛋白質として得られるからである。 更に本発明は、このポリペプチドを発現し得る形で暗号
化している遺伝子配列を含んでいる複製可能なりNA発
現ベクターを提供するものである。 更にまた本発明は、この様なベクターで形質転換された
微生物株またはセルラインの様な組換え宿主細胞、およ
びそれらの培養物を提供するものである。さらに本発明
は、得られたこのポリペプチドを含有している非経口投
与用の組成物を提供するものである。 従って、本発明の目的は、他の哺乳動物蛋白質を実質的
に含んでいないヒトβ−N G Fを得ることKあり、
もう一つの目的は、天然資源から抽出によって得るこ々
ができる量より多量のヒトβ−NGFを得ることにある
・ 図面の説明 第1図はマウスNGFのβサブユニットのアミノ酸配列
、それを暗号化している遺伝子配列、およびその遺伝子
の特定の断片(セグメント)の相補DNA@を示してい
る。 第2図は、β−NGFml(NAの断片を含んでいるク
ローンのノーザンプロット分析を示してぃる。 第3図(1、マウスNGF遺伝子の部分的制限地図、お
よび本発明によって組み立てられたプラスミドのヌクレ
オチド配列とマウスNGF遺伝子のヌクレオチド配列と
のお゛およその一致を示している。 第4図は、組換えファージλhN8の物理的地図および
ヒトゲノムを囲っている領域を示している。 第5図はヒトβNOF染色体遺伝子のヌクレオチド配列
を示している。 第6図は、ヒトおよびマウスのプレグローβNOF遺伝
子のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の比較を示し
ている、 第7図は、ヒトβN OFの発現のために組み立てられ
た遺伝子を示している。 gIJ8図は、ヒトβNGFf:発現するための、E。 coli ’に形質転換するためのプラスミドph N
G Ftrp lの組み立て工程の一部を示している
。 詳細な説明 A、宿主細胞の培養およびベクター DNA配列を、それを発現することのできる他の配列に
有効に結合した場合、そのI) N A配列を発現する
こ七ができるベクターを発現ベクターと言う。常にはっ
きりと記載することはしないが、この発現ベクターは、
エビソームとして、あるいは染色体DNAの組込み部分
として、宿主生物中で複製できるものでなければならな
い。言う捷でもなく、複製能を持たないものは有効に使
用できない。結局、発現ベクターとは機能的な定義であ
り、この用語は特定の配列に用いられるだけでなく、そ
の用語には、そこに含まれる特定のDNA暗号を発現す
ることができる全ゆるDNA配列が含まれている。一般
に、組換えDNA技術で用いられる発現ベクターはグラ
スミドの形であることが多い。このプラスミドは、環状
の2本鎖DNAループであって、そのベクターの形では
、染色体に結合していないものを言う。プラスミドは、
ベクターの最も普通に用いられる形であるので、本明細
書に於いては、プラスミドとベクターを交換可能な用語
として用いる。しかし本発明に於いては、同じ機能金有
する、当技術分野で知られている、あるいは今後知られ
得る他の形の発現ベクターも含捷れると解釈すべきであ
る。 本明細書に於いて組換え宿主細胞とけ、組換えDNA技
術を用いて組み立てられたベクターで形質転換された細
胞を意味する。 本明細書に記載した方法およびベクターは、広範囲の真
核性および原核性の生物の宿主細胞に使用することがで
きる。 勿論、一般的に、本発明に有用なベクターを組み立てる
に際し、D N A配列をクローニングするのに原核生
物が好ましい。特にE、 coli K 12株294
(ATCC/l631446)が特に好ましい。 使用し得るその他の微生物株として、E、 coli
B、E、 Ca1コ、 X 1776 (ATTC/I
631537 )などのE、’ coli株が含捷れる
。これらは限定する意味で挙げたのではなく、単なる例
示に過ぎないことは言う丑でもない。 ・ 原核生物は発現にも使用することができる。上記ノ菌株
の他、E、 C01i W3110 (F−+λ−2原
栄養性、ATTC427325) 、Bacillus
5ubtilusの様な大腸菌類、Salmonel
la typhmuriu+nやSerratiama
rcesans の様な腸内細菌群および各種のシュー
ドモナス種を使用することができる。 一般に、これらの宿主に関しては、その宿主細胞と適合
し得る種由来のレプリコンおよび調節配列を含んでいる
プラスミドベクターが使用される。 このベクターはもともと、形質転換細胞に表現形質(表
現型)の選択性を付与することのできる標識化配列と共
に複製部位を持っている。例えば、E、 coli (
1’i、E、 coli種由来のpnit3.22を使
ッテ形質転換される( 1301iVarら、Gene
2 : 95(1977))。p’BR322はアシ
ビンリシおよびテトラサイクリン耐性のための遺伝子を
含んでおり、従って、これは形質転換細胞を同定するだ
めの簡単な手段となる。このpBR322プラスミドや
その他の微生物グラスミドは、その微生物がそれ自身の
蛋白質を発現するのに使用することのできるプロモータ
ーを含んでいなければならず、あるいは含む様に改良さ
れなくてはならない。 組換えDNAの組み立てに通常用いられるプロモーター
にはβ−ラクタマーゼ(ペニシリナーゼ)およびラクト
ースプロモーター系(Changら、Nature 2
75 : 615 (1978) ; Itakura
ら、 5cience 198 : 1056 (19
77) ;(3oeddelら、Nature 281
’ : 544 (1979))およびトリプトファン
(trp)プロモーター系(0oeddelら、 Nu
cleic Ac1ds &s、 8 : 4057(
1980) ; EI’0Appl Publ 400
36776)がある、これらが最も普通に用いられてい
るが、その他の微生物プロモーターも発見され、使用さ
れており、それらのヌクレオチド配列は詳8aに発表さ
れているので、当業者であれば、それらをプラスミドベ
クターに機能的に結合させることができる( 5ieb
enlistら、 Ce1120 :269(1980
))。 原核生物の他、酵母培養株の様な真核性微生物も使用す
ることができる。8accbaronyces cer
evisiaeえばプラスミドY几p 7 (Stin
chcombら、Nature2.82 : 39 (
1979) ; Kingeman fi Gene7
: I 4 1 (1979) ; Tschempe
r ら、Gene 1 0: 157(1980))が
よく用いられる。このプラスミドは、トリプトファンを
生産する能力を欠いている酵母の突然変異株、例えばA
TCC/f644076またtry P E P 4−
’ 1 (Jones、 aenetics85:12
(1977))にとって選択マーカーとなるtrp ]
遺伝子をもともと含んでいる。酵母宿主細胞ゲノムの特
徴としてのtrp l損傷が存在することは、トリプト
ファンの非存在下に発育させることによって形質転換体
を検出する有効な環境を提供することになる。 酵母ベクター中の適切な促進(promoting )
配列ニハ、3−ホスホグリセレートキナーゼ(Ilit
Zeman ら、J、Biol、Chem、255 :
2073(1980))または他の解糖酵素(Hes
sら、J。 Aav、 Enzymel(eg、7 : 149 (
1968) ;1(o 11a naら、 Bioch
emistry 1 7 : 4900 (1978)
)、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−3−ホス
フェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベー
トデカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グル
コース−6−ホスフニートイソメラーゼ、3−ホスホグ
リセレートムターゼ、ピルベートキナーゼ、ト1ノオー
スホスフエートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメ
ラーゼおよびグルコキナーゼなどのフ゛ロモーター〃(
含まれる。好適な発現グラスミドヲ組み立てるに際し、
これらの遺伝子の終了(termj、nation )
西上列もまた、発現ベクターに、発現しようとするへ上
列の3′ニ結合さ−せてmRNAのポリアゾ=ルイヒお
よび終了を提供する。発育条件によってコントロールさ
れる、もう1つの転写における有オリ性を持った他のプ
ロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ2、イソチ
トクロームC1酸性ホスフアターゼ、窒素の代謝に関与
する分解酵素、」二言己のグリセルアルデヒド−3−ホ
スフェ−トチヒドロゲナーゼ、およびマルトースおよび
ガラクトースオlJ用に関与する酵素(H’、alla
nd、前記)などのり゛ロモーター領域である。酵母に
適合するプロモーター、複製起源および終了配列を含ん
でいる全てのプラスミドベクターが適している。 微生物の他、多細胞生物由来の細胞培養も宿主として使
用することがゼきる。原則として、を椎動物および無を
椎動物のいずれの細胞培養も使用できる。しかし、を椎
動物・細胞が最も興味があり、を椎動物細胞の培養増殖
(組織培養)が最近では常套手段となって来た(Tis
sue 0ulture、 AcademicPreB
B、 KrueeおよびPatterson、 edi
tors(1973))。この様な有用な宿主細胞系の
例は、V E BDおよびH8i、a細胞、チ、ヤイユ
ーズ、7、ムスター卵巣(Ci−I O’ )細胞系、
W2B5、B f(i(、C08−7およびM ])
CK細胞系などである。この様な細胞の発現ベクターは
、通常、(要すれば)複製起源、発現しようとする遺伝
子の前に位置するプロモーター、必要なリポソーム結合
部位、RNA組み継ぎ(スプライス)部位、ポリアデニ
ル化部位、転写終了配列などを含んでいる。本明細書で
は、好ましい態様を記載したが、本発明がその様な例示
した配列に限定されるものと解釈してはならない。 哺乳動物細胞中で用いるには、発現ベクター上の調節機
能はウィルスから提供されることが多い。 例えば、通常使用されるプロモーターは、ポリオーマ、
アデノウィルス2から誘導され、シミアシウィルス40
(SV40)から導かれることが最も多い。古い、そし
て新しいSV40ウィルスのプロモーターに、共にこの
ウィルスから、SV40ウィルスの複製起源を含んでい
るフラグメントとして簡単に得られるという理由で特に
有用である( Fiersら、Nature 273
: 113 (1978))。)Iina Illlゴ
ザ(部位)からウィルスの複製起源内に存在している8
g1■サイト[至る約250bp 配列を含んでいるな
らば、それより小さいあるいは大きいSV4 Qフラグ
メントも使用することかできる。更に、所望の遺伝子配
列と正常通り結合しているプロモーターまたは調節配列
を、この様な調節配列が宿主細胞に適合する限り、使用
することができ、′またそれが好ましいことが多い。 複製起源は、5v4otたは他のウィルス(例えばポリ
オーマ、アデノ、VSV、l3PVなど)が誘導される
様に、外来性の起源を含む様にベクターを組み立てるこ
とにより、あるいは宿主細胞の染色体の複製機構により
提供′仁ることかできる。 このベクターが宿主細胞染色体に組み込まれたら、後者
は十分であることが多い。 B、使用した方法 強力な細胞壁バリアーのない細胞全宿主細胞おして使用
する場合は、Graham らの燐酸カルシウム沈澱法
(Graham およびVan der Eb、 Vi
r’ology52:546(1978))によってト
ランスフェクションを行なう。しかし、核注入−!たは
プロトプラスト融合などの、DNA全細胞に導入する他
の方法も使用することができる。 原核細胞捷たけ実質的な細胞壁構造を持った細胞を使用
する場合、好ましいトランスフェクションの方法は、C
ohenらの塩化カルシウムを用いたカルシウム処理で
ある( C0hen、 F、 N、ら、proc 。 Natl、 Acad、 Sci、(USA) 、 6
9 : 2110(1972))。 所望の暗号配列および調節配列(contro1seq
uθnc()を含んでいる好適なベクター全組み立てる
には標準的な結合技術を用いる。分離したプラスミド!
f?Llr、J:、DNAフラグメントを開裂し、修復
(ティラー)し、所望のプラスミドを形成する様に、希
望の形に再結合する。 開裂は、適当な緩衝液中、制限酵素で処理することによ
り行なう。通常、約1μyのプラスミドまたはD N
Aフラグメント、約20μlの緩衝液、約1単位の酵素
全使用する(特定の制限酵素に対する適切な緩衝液およ
び基質の量は製造業者が指定している)。37°Cで約
1時間インキュベートする。インキュベートした後、フ
ェノールおよびクロロホルムで抽出して蛋白質を除き、
水性分画からエタノールで沈澱させて核酸を回収する。 平滑末端が必要な場合は、E、 coli I) N
AポリメラーゼI(K1θnow)10単位で、15℃
で15分間処理し、フェノール−クロロホルム抽出し、
エタノール沈毅に付す。 開裂しプこフラグメントの大きさによる分離は、aoe
aae:tらの方法(Goeddel、 Dら−Nuc
leic Ac1ds′R8s、8:4057’(19
80’))VC従い、6襲ポリアクリルアミドゲルを使
って行なう。 結合(ライゲーション)には、正しく符合する様に末端
を適当に修復したほぼ等モル量の所望の我分全、DNA
Q、5μ!当たり約10単位のT4DNAリガーゼを用
いて処理する(開裂したベクターを成分として用いる場
合に、細菌性アルカリ性ホスファターゼで予め処理して
開裂したベクターの再結合を防ぐのがよい)。 ライゲーション混合物を使ってE、 coli K12
株294(ATL031446)を形質転換し、成功し
た形質転換体をアシビタリン剛性について選択する。形
質転換体からプラスミド金調製し、M8ssingらの
方法(Meesingら、Nucleic Ac1dS
&s、 9 :309(1981))またはMaxam
らの方法(Maxamら、Methocls in E
nzymology 65 : 499(1980))
に従って、制限酵素分析し、そして/または配列を決定
する・ C1好ましい実施態様 以下に、E、 C01i中でポリペプチドを発現させる
好寸しい態様について記載するが、これは本発明を例示
するものであって、本発明がこれに限定されるものと解
訳してはならない。 C91,マウスのプローβN OF−q暗号化している
CDNAクローンの分離 ヒトN OFのβサブユニツIf暗号化している遺伝子
を得るために、ハイブリダイゼーション・プローブとし
て、マウスのβNGFI暗号化しているクローンされた
cDNAを用いることにした。 c D N Aクローニング・アプローチには、合成オ
リゴヌクレオチドプライマー全使用して、第1図((示
し/也マウスのβNGFサブユニットの既知のアミノ酸
配列を利用した:雄および雌のマウスの唾液腺に存在す
るNGFレベルの違いを、同定のも91つの手段として
用いた。マウスのβNGFアミノ酸配列の3つの小さな
部分を選び、それらを暗号化している全ての可能性のあ
る配列に相捕的なオリゴヌクレオチド・プールk Cr
ea 等の方法(Nucleic Ac1ds Res
、、 8 : 2331 (1980))で合成した。 この暗号鎖および相補鎖のヌクレオチド配列を第1図に
示す。 合成オリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーション・プ
ローブとして用いて、マウスβNGFCDNAクローン
を、雄マウス唾液腺からのオリゴdT−プライム化cD
N Aバンクから分離同定する試みは失敗した。この
結果は、βN0FH雄マウスの唾液腺蛋白質の01%を
占めているが、そのmRNAは同じ様に豊富ではないこ
とを示してイル。従って、まずβNOF特異ヌクレオチ
ド配列を豊富にするために、この蛋白質のカルボキシ末
端に近接した配列を表わしているプライマー・プールを
使って、雄の唾液腺からのポIJA−含有(A + )
几NAの逆転写を特異的にプライムした。 長さ200bp以上のCDNA分子を、よく知られたプ
ラスミドpBR322にクローンした。CDNAのブラ
イミングにハイブリダイゼーション・グローブとして最
初に使った5−32p−標識NGFプライマー・プール
を使って、全部で10,000個のクローンをスクリー
ニングした結果、その内08係が、非常に厳重なノ・イ
ブリダイゼーション条件下で陽性信号を与えた。残、り
の992%の1プライム化−1されたCf)NAバンク
は、ポリAMSGRNAの調製中に溶離した痕跡量のオ
リゴd′丁によるブライミングおよび自己ブライミング
により生じたと思われる。クローニング操作の際の81
ヌクレアーゼ処理が末端プライマー配列を傷つけ、従つ
′C検出された陽性クローンが少なかったのかも知れな
い。 この最初のスクリーニングで陽性となったクローンを、
ハイブリダイゼーション・プローブとして、第1図に示
したオリゴヌクレオチドプール1より上流のDNA配列
から誘導した放射線標識化プライマー・プール2および
3を使ってスクリーニングE7た。更に雄または雌マウ
スの唾液腺のいずれかからのポリARNAから、プール
1でフリイム化した32p−cDNA4y−二重フィル
ター上のグローブさして用いた。再びpB IL 32
2中、オリゴヌクレオチド・プール2および3とノーイ
ブリッドを形成した全部で10個の雄−特異的クローン
を同定した。制限酵素分析の結果、10個は全て共通の
I(ae[IIおよびHinf I フラグメントを持
っているこ七がわかった。本発明者らがpmβN−gG
lと名付けた、最も長いDNA挿入体(〜700bp)
’を発現するプラスミドを含んでいるクローンの全配列
全決定した。このヌクレオチド配列から推定されるアミ
ノ酸配列は、N1−12−末端ブロー配列に加えて、1
つの翻訳フレーム中に期待するNGF配列を含んでいた
(第4図参照)。マウスのN G P CI) N A
配列金倉んでいる細菌クローンの組み立−〇および同定
について、以降に詳述する。 完全なNGI”mRNAの大きさを決定するために、ノ
ーザン・フ゛ロット ハイブリダイゼーションおよびプ
ライマー・エクステンショシ分析法を用いた。NGFお
よびブロペプチド配列を含んでいる長さ470bpの3
2p−標識D N Aフラグメント(Rsal −Rs
aI789 、第3図参照)1雄マウス唾液腺に特異な
長さ約1300ヌクレオチドの几NA種と雑種形成させ
た・2つの短い、2本鎖の、5′末端−標識化制限フラ
グメン1、を用いたプライマー・エクステンション実験
(第3図の説明参照)してより、βNGFm]i’Aの
5末端は、本発明者らのクローンの3末端から下流の約
370塩基を残して、pmβN−9GlcDNAフラグ
メントの5末端から上流に約230塩基の所に位置づけ
られた。欠失5配列の〜30ヌクレオチドを除く全てが
、本発明者らがpm pN−161゛7およびpm β
N −2] B 5と名付けたクローンに含まれており
、これらは、第3図に示す様に、互いに、そしてクロー
ンpmβN−901と重複している。これらは、c ]
) N A合ljl fプライムするため、制限フラグ
メントの使用についてのより詳細な以下に記載の方法で
分離する。 プライマー配列の3′末端から下流へ3′ポリA配列−
までの配列を含んでいるクローン化[7たCDNA−4
得るために、プレパラテイブ尿素アガロースゲル上で、
全ポリA雄マウス唾液腺RNA1分画することによυ、
βNGFm几NAを豊富化した。 最も大きいサイズのフラクション、βNGF1.DNA
グローブとハイブリダイズ(雑種形成)する配列を含む
フラクションを、オリゴdT−プライム化c D N
A合成およびクローニングに使用した。 3.700のクローンをスクリーニングした結果、4つ
の腸性ハイブリダイゼーショシシグナルが得うれた。本
発明者がpmβN −12E 4と名付けたクローンの
ヌクレオチド配列分析、および3暗号化および非翻訳配
列に239ヌクレオチドを添加したpmβN−8B3゜
オリゴdTプライム化であるが、本発明者らのクローン
はいずれも、第2のDNA鎖の不完全な合成または広範
なS1ヌクレアーゼ処理のために、βN OF 、m
lt N Aの全3非翻訳領域を含んでいなかった。ノ
ーザノ プロント部分・訛により、ポリA配列(1本発
明者らがクローンした配列から離れていないことがわか
った(第2図参照)。豊富化したmJ(i’7 Aから
のオリゴa Tプライム化CDNAクローンの調製につ
いて以下に詳述する。 0、2. ヒト染色体βNGF遺伝子の分離および特性
化 ’2 ト遺伝子ライブラリー(λCharon 4 A
ベクターに挿入された、15−20kbの、部分的f■
a。 Ill / Alu Iヒト胎児肝1DNAフラグメン
トからなる)を、放射活性ハイブリダイゼーション・プ
ローブとして、既述し1470bpマウスNGFクロー
ン化CDNA7ラグメント(pmβN−901Rsa
■フラグメント)を用いてスクリーニングした。全部で
27組み換えファージをプラーク純化し、Eco几■消
化によシ部分的
【・ζ@性化した=27個のファージは
6つの異なるタイプの制限パターンを示した。各バター
シ種は、制限フラグメ/トヲ共有しており、従って同じ
ゲノム領域を重複していると思われる。γhβN8と名
づけたファージの特性を、物理的マツピングによびヌク
レオチド配列決定により調べた。第4図ケよ、ファージ
・マツピング、配列決定およびゲノム・サザーン・ブロ
ノテーlング実験によって得た、クローンrhβN8の
物理的地図身よびヒトゲノム中のその配列を画している
領域を示している。サブクローノした、重複しているE
co 4 IおよびHind IIIフラグメントから
誘導された12,000bpのヌクレオチド配列の部分
を第5図に示す。 C03,マウスβN G F c D N Aとヒトβ
NGF遺伝子の配列の比較 マウスQβN G F c D N A配列り、成熟β
N0F=、−暗号化する可能性を持った解説わく全含有
しており、予想されたアミノ酸配列は、マウスβNOF
の既知の配列に相当している( Angeletti等
、Biochemistry、 I 2 : 90 (
1973)および12: l 00 (1973) )
o意外にも、このc D NA配列は・マウスβNGF
の報告されている配列の末端に結合した、C−末端、ア
ルギニン−グリシンジペプチド延長部を予測している〇
ヒトβNOF遺伝子は、成熟マウスβNOFアミノ酸配
列と約90%が相同(ホモローガス)なアミノ酸配列を
予測している領域を含んでおり、従ってこれは、ヒトβ
NOFの遺伝子のための遺伝子でなければならない。ヒ
トβNGF蛋白質もまた、C−末端ジペプチド延長部を
持っている・ヒトとマウスのβNGF配列を並べると(
第6図)、成熟マウス蛋白質の既知の配列からかなりの
遠くの上流まで広範な相同性が延びていることがわかる
。22,000ダルトシの生合吠ブローβNG」゛グリ
カーサー(前、駆体)の存在が証明されており (13
ergerおよび5hooter、 Proc、 Na
t、Acad。 Sci、(USA)、74:3647.(1977))
、これは成熟蛋白質からヌクレオチド位置419および
420(第6図参照)の潜在的なアルギニン−アルギニ
ン開裂部位にまで延びているかもしれない。このヌクレ
オチド配列で予測される前駆体は、既に以前に検出され
たものより長い:後述する様に、全プレプロ−β−NG
F配列は分子量27,000と予測され、ブロー配列は
25,000ダルトンと予」すされ、特異なアルギニン
残基対が存在することケ考えると、21,500および
18,000ダルトンのプロセッシング中間体が細胞内
に存在する。 C14,開始メチオニンコドンおよび信号配列の位置づ
け 蛋白質合成開始コドンであると指定するための候補とし
て3つのメチオニン残基が挙げられる(第6図のアミノ
酸−187、−121および−119)。しかし、いく
つかの要因から、本発明者らの配列の一121アミノ酸
が実際の開始コドンとして使われていることを強く暗示
している。βNOFは分泌された蛋白質であるので、開
始コドンの後には、このポリペプチドを小胞体の内腔へ
と共同翻訳転移させる信号配列が続いていると考えられ
る。アミノ酸−121から−104に、優れた信号配列
の候補である。これらの18個のアミノ酸は正しい長さ
であり、−続きの6個の完全に疎水性のアミノ酸(al
a−phe−1eu−ile−gly−va’l)を含
んでいる。信号ペプチダーゼによる開裂は、小さいアミ
ノ酸であるala−104と、−103位のglu残基
の間で起り得る゛。プレーアルファ・ラクトアルブミン
の場合、信号ペプチダーゼハ同一のgln −ala配
列(後)を開裂させ、同一のN−末端g1u残基金残す
ことが知られている。−187位のmet残基に続く一
連のアミノ酸は、極性および荷電アミノ酸を高率で含ん
でおり、これまで報告されている信号配列のいずれにも
一部ていない。 従って、−121のメチオニンがヒトおよびマウスのグ
レブロ−βNOFの翻訳開始に使われる可能性が最も高
く、この場合27,000ダルトンのプレブロホルモン
が生成する。もし信号ペプチドプロセッシングが残基−
104で起ったら、25゜000 ダルトンのプローβ
N G Fが生1収するでろろう。 C,5,’ l(、coli中でのヒトβNGFの直接
発現スhβN8からのEcolLIフラグメシトをpB
It322でサブクローンした。本発明者らがphβ
N8−89と命名したサブクローンプラスミドは、ヒト
βN G li’サブユニットを暗号化している配列の
大部分を含んでいる2kbヒトDNA挿入体を含有して
いた。配列決定の結果、10個のN1]2−末端アミノ
酸だけがこの配列から除かれていることがわかった。β
N G I!’暗号配列をE、co’liで発現させる
ための本発明者らの方法(は、phβN5−B9のβN
OF暗号部分から最も大きい可能なフラグメント金切り
取り、次いで欠失コドンを満たし、その配列の5′およ
び3末端を、E、 C01i発現プラスミドに挿入する
のに適する様に修飾することでめった。使用した発現系
は、米国特許出願第307゜473号(1981年10
月1日出願)に記載されているTrpプロモーター系で
あり、これH,M。 Mateucci の配列変換と共に、各種の遺伝子に
ついて以前から用いられて来たものである。 プラスミドphβN8− B 9 f: Eco RI
$−ヨヒI(gIAIで消化し、〜300bpフラグ
メントヲ消化混合物から分離した。このフラグメントを
第7図に示す。2工程の消化により生じる粘着末端も示
しである。発現のためのヒトβN G F配列の5′末
端を組み立てるために、10個の欠失アミノ繍のための
コドン、開始メチオニンコドン(ATG)、およびリポ
ソーム結合サイトの一部でらり、制限エンドヌクレアー
ゼXba Iの開裂サイトを含んでいる、該ATGに先
行するヌクレオチド押金付加した。この目的の為VC4
つのオリゴヌクレオチドを化学的に合成した。これら金
オリゴヌクレオチドI−IVとして第7図に示す。 βN (3F暗号領域の3′末端は以下の如く修正した
:第7図に示した1個のH,gI A I部位(吸熱ヒ
トβN G ]”の1111位 Val )と112位
(Leu)のアミノ酸)から下流の両DNA鎖のヌクレ
オチド配列を、Argl18およびSal l粘着末端
に続く終止コトリ(TAG)を含む様に化学的に合1視
した。これらのオリゴヌクレオチド灯第7図のフラグメ
ントVおよび■である。 合成オリゴヌクレオチド1−VlをT4ポリヌクレオチ
ドキナーゼおよびr−32p−A、TPで放射活性標識
し、その放射活性オリゴヌクレオチドを、T 4 DN
A IJ カーセ緩衝液中、〜300bphβN(3
FDNAフラグメントと混合した。10単位ty) i
’ 4 ]) N A リガーセラ用い、12”0f1
2時間ライゲーション(結合)した。この混合物をフエ
、ノール抽出し、D N A’l’70%エタノール中
で沈殿させた。沈殿を乾燥し、制限エンドヌクレアーゼ
緩衝液に溶解い酵素Xba (および5−aIIを添加
し、2時間消化した。 DNA混合物のプレパラティプゲル電気泳動おある二重
体(ダブレット)が〜37 C1bpに存在することが
わかった。溶離したDNAフラグメントを、Xba I
および5aIIで消化した後細菌性アルカリホスファタ
ーゼで処理したpH−GJ:I 207−1 七命名さ
れたfI G II −’rrp発現ブラユミ83.結
合させた(T4DNAリガーゼ)。このアルカリホスフ
ァターゼ処1rqH1I−I G HフラグメントがT
rp発現ベクターに再挿入されるのを防ぐ為に行なった
。 このライゲージヨシ混合物を使ってE、coli K1
2/294f:形質転換した。寒天平板上、アンピシリ
ン耐性でテトラサイクリシ感受性のコロニーを選択した
:200のコロニーを、放射活性の300bp +gc
o 13. I / Hgi A Iプローブとのハイ
ブリダイゼーシヨンにより、ヒトβNOF配列の存在(
てついてスクリーニングした。12個の陽性コロニーを
、ウェスタン・プロット上、ウサギの抗マウスβNOF
抗体を使って、その細胞抽出物中に免疫反応性βNOF
分子が存在するがどうかについて分析した。1個を除く
全てのクローンが、陰性の対照抽出物と比較して、期待
される分子量の陽性信号を示した。これらのクローンの
1個のDNA配列を分析した結果、本発明者らによって
PhβNOF trp Iと命名された、ヒトβN G
F 2発現した最終的なプラスミドが、当初に計画し
た構造を持っていることが証明された。 プラスミドl)hβN8−B9の’!’coltlお工
び馬IA1による消化からグラスミドPhβNGF t
rp 1の組み立てに至る一連の操作を第8図に示した
。 プラスミドPLIOH,207−11−、i’、上記出
願番号第307.473号に記載されているプラスミド
P 1.(G l−1207’c BamHIで消化し
、次イテECoIt■テ部分消化することにより得られ
た。trpプロモータf含んでいる最も大きいフラグメ
ントを分離した。p 13 r 322から最も大きイ
ECORI −Bam H■フラグメント’を分+=t
L、この2つのフラグメントを結合させ、E、 co
li Kl 2/ 194の形質転換ニ使用した。アン
ピシリンおよびテトラサイクリシの両者に耐性のめるク
ローンがPf(GH207−1を含んでいた、 c、5. mNGFcDNA配列を含んでいる細菌クロ
ーンの組b・立ておよび同定 各(14塩基の)8つのプライマーのプール2種を化学
的1(合成した。各プライマーは、アミノ酸93−96
および97の1部のための潜在高m几NA配列と相補的
である1、ポ+) (A、 ) 4LN Aで特異的V
Cc D N Aの合成をプライムするのに16オリゴ
ヌクレオチドの混合物音用いた。10ミリモル(mモル
)のKO150μl中、8プライマーの各プール200
ピコモル(pモル)(1μり(総計440pモル、2μ
y)を、ポリ(A+) It N A4Q1t9と、9
0°C168°C142゛Cおよび37°Cで4分間づ
つインキュベートすることにより、アニーリングした。 32p−標識cD N A、 f、、50 m M、
l□リス(pH8,3)、10mMMgC12、I O
m M D’l’T、50 m M KClの反応(系
)100μ6中で合If L fc。 この反応系はアニーリングした混合物の他ニ、500μ
Mc7)aATP、’I’TP、、IGTP、100I
t Mの、ICTP、20μC1の〔γ−32p)dC
T” (2000Ci/mモル、Amersham )
、0.5単位/μlのIL N ASinおよび90単
位の逆転写酵素を含んでいた。最初の鎖の合1ii 3
7°Cで60分間であった。反応系を3分間煮沸し、1
分間氷でクエンチジグし、マイクロフユージ中で回転さ
せた。 上澄を同容軟のdd l−120で希釈し、Kleno
w Fo11J5単11Jえ、12°Cで18時間、d
ecDNA全合1戎した。フェノール/クロロホルム抽
出し、エタノール沈殿を行なった後、標品を150ti
e中の81ヌクレア一ゼ10単位を用いて37°Cで1
時間消化した。フェノール/クロロホルム抽出およびエ
タノール沈殿の後、5%ポリアクリルアミドゲル上の電
気泳動に、r、9cDNAを分画した・2つのサイズ範
囲のcDNA−1電気溶離した。長さ〜550bp(J
:)Hl 32ngm回収され、長さ200〜550b
p(下) u182 ngm回収された。 全5−2 Q ngmの各フラクションの3′−末端を
、末端ヌクレオチドル・トランスフェラーゼを用いて2
O−40d(C)残基で延長させた。このd (c)−
尾部形17M、 c D N A f、同様にPet1
部位でa (Q)残基音用いて延長させたpBR322
(150ngm )とアニーリングした。アニーリング
は50tAの100m M NaC1、10mMトリス
(pl+ 7.5 )、250mMEDTA中で行なっ
た。混合物t 70 ’Oに加熱し・徐々VC37°C
に冷却しく16時間)、次いで4°Cに冷却した(6時
間)。アニーリング混合物の半分を使ってE、coli
K−12株294全形質転換した。各サイズフラクシ
ョシ(上と下)からの500コロニーをフィルター・ハ
イブリダイゼーシヨンによりスクリーニングした。32
p−標識グローブは16プライマーの混合物(全II1
g)から、公表されている方法により、ポリヌクレオチ
ドキナーゼ(P−L Biochmicals)および
20071C]の〔、−32p〕ATP(50ooc1
/mモル、Amersham )を用いた燐酸化によV
調製した。10゜000個のクローンを含んでいるフィ
ルターを、プライマー・ハイブリダイゼーシヨン・ミッ
クス(100mM)リスpH7,5,0,9M NaC
1,6m M EDTA、l X Dennardt’
s溶液、100 tt M rA、TP、1′m M
Na1i2PO,−Naピロホス7.1lr−−−)、
05%NQnidet P −40,0,1’ my
/me酵母RN A (SigmaR−67’50 )
)中、〜l X 108cpmの32p(識プローブ
と、室温で18時間ハイブリッド形成させた。フィルタ
ーを、42℃で6 X ssc中で30分間(3回)洗
浄し、強化スクリーン(])upont)を用いて一7
0°Cで16時間、X線フィルムに感光させた。約0.
7−0.9%(上370.下460)のコロニーを選択
し、もとのプライミング部位に対して5である2つの追
加の合1戎グライマーによる2回目のスクリーニングに
かけた。アミノ酸74−74のための全ての潜在的mR
NA配列に相補的な】2量体を各4プライマーの2プー
ルに合成した。各々8個の14量体2プール(アミノ酸
52−58および56の一部のための潜在的mRNA配
列に相補的)′f:同様にして合1戎した。第1回のス
クリーニングで選択した「上」および「下」のコロニー
から、3セツトの同一のフィルター’を作成した。4つ
の合成オリゴヌクレオチドから、既述した様にして32
p−標識グローブを作成した。プライマー・ハイブリダ
イゼーシヨン・ミックス中、フィルターto、5 X
10’ cpmとハイブリッド形戎させ、洗浄し、X線
フィルムに感光させた。5オリゴヌクレオチド全てとハ
イブリッド形ffl’を行なった9つの陽性群(下から
3つ、上から6つ)がみつかった。ミニスクリーン手法
でプラスミドI) N A i分離し、最も大きい挿入
体を持ったクローンを制限分析により決定した。p、m
pN−9G1と名付けたプラスミドの塩基配列を、翫x
am −Oi’1.bert法によって完全に決定した
。このcDNA挿入体は、14塩基のプライマー配列(
第1図、プール1)および全量716bpを含んでいた
。 0.7 βN OFメツセージに富むmI(NAから調
製されたオリゴdT−プライム化C1)NAクローン 0.025Mのクエン酸ナトリウム(pH3,8)中の
2%アガロースおよび6M尿素からなる変性アガロース
ゲルにより、電気泳動によって200/1gのポリf’
A)RNAi分画した。リボンームバン(帯)は、垂直
のスライスをエチジウムブロマイドで染色することによ
り肉眼観察し得る様にした。 ゲルk 0.5 cmのスライスに切断し、70”Oで
融解し、フェノールで2回、クロロホルムで1回、強力
に抽出した。2回のエタノール沈殿の後、そのペレット
f、(daH2030lieに溶解した。各フラクショ
ン(4M酢酸7ノモ=ウム5μ1(pH7,0)中)1
1’lNt乾燥ニトロセルロースフイルターにスポット
し、厳重な条件下でドツト・ハイブリダイゼーションに
、j:クスクリーニングした。Klenow Po1.
1反応系中、プライマーとして牛胸腺DNAフラグメン
トを用いて既知の方法により、32p〜標識プロ一ブf
fipmβN −g G1挿入体から調製した。このフ
ィルターを、50 m M NaPO4(pH?、’
0 )、5×Dennart’s溶液、5. x 5e
c150tt9/4の超音波処理したニシン***DNA
11ool1MのrATP、I m M NaH2PO
4−ナトリウムピロボスフェート、および50%ポルム
アミド中、42°Cで18時間、〜lO’cpmとハイ
ブリッド形成させた。このフィルターtO,2Xssc
−Q、1%SDS中、42′cで20分間洗浄しく3回
)、フィルムに感光させた。ハイブリダイゼーションの
結果、NGFメツセージはフラクション11および12
にあることがわかった。フラクション11お工び12の
それぞれ10d’r用い、標準的な方法でオリゴdT−
プライム化c D N A f調製した。5%ポリアク
リルアミドゲル上の電気泳動の後、ゲルスライスから6
00 bpより長いcDNAを溶離した。フラクション
11から約4 Or+gmのc D N A 、および
フラクション12からの20 ngm ff:d (C
:)−尾部形成し、d (G) −尾部形成したpBR
322とアニーリングした。フラクション11から約3
300クローン、フラクション12からの1500クロ
ーンヲ、pmβN−901からの32p−標識内部Hp
aIIフラグメント(216bp)を使って、厳重な条
件下のフィルターハイブリダイゼーションにより、コロ
ニーとしてスクリーニングした。フィルターを42°C
で18時間・50 X ] 06cp’mとハイブリッ
ド形成させ、洗浄し、既述した様にX線フィルムに感光
させた。 フラクション12からの5つのクローンがこのフ゛ロー
プについて陽性であった。制限分析により、それらは同
胞であることがわかった。pmβN−121’:4 f
、1、Maxam −G11berL法によυ完全に塩
基配列決定した。フラクション11からの2つのクロー
ンが陽1牛であった。最大のpmβN−3B3の塩基配
列をMaxam−Gi、1bert法により完全に決定
した。 C,8医薬組成物 本発明に係るヒトのβ−N Q li’は、このβ−N
G l” 全適当な担体と混合して、既知の方法で、有
用な医薬Mi成物に製剤化することができる。好適な担
体、および他のヒトの蛋白質、例えばヒトの血清アルブ
ミン金倉んでいてもよい製剤の調製法は、例えばJLe
mingtonのPhazmacentjcal 8C
’3.9nCeB(1す、W0Ma7−tjnVcよる
)IC記載されCいる。この様な医薬組1我物eゴ、本
発明の蛋白質の有効量を適当な量の担体と共に含んでお
り、患者に非経口投与することができる。 このヒトβ〜N G F i、r、神経障害またはその
他の、この物質が治療効果を発揮し得る疾患にかかつて
いる患者に非経口投与することができる。投与量および
投与割合に、例えばマウスの唾液腺から得られる同様の
製剤の臨床実験に現在使用されているもの七同じである
。 以上の記載は本発明の好ましい態様を述べたものでhv
、本発明がこれに限定されると解釈してはならない。
6つの異なるタイプの制限パターンを示した。各バター
シ種は、制限フラグメ/トヲ共有しており、従って同じ
ゲノム領域を重複していると思われる。γhβN8と名
づけたファージの特性を、物理的マツピングによびヌク
レオチド配列決定により調べた。第4図ケよ、ファージ
・マツピング、配列決定およびゲノム・サザーン・ブロ
ノテーlング実験によって得た、クローンrhβN8の
物理的地図身よびヒトゲノム中のその配列を画している
領域を示している。サブクローノした、重複しているE
co 4 IおよびHind IIIフラグメントから
誘導された12,000bpのヌクレオチド配列の部分
を第5図に示す。 C03,マウスβN G F c D N Aとヒトβ
NGF遺伝子の配列の比較 マウスQβN G F c D N A配列り、成熟β
N0F=、−暗号化する可能性を持った解説わく全含有
しており、予想されたアミノ酸配列は、マウスβNOF
の既知の配列に相当している( Angeletti等
、Biochemistry、 I 2 : 90 (
1973)および12: l 00 (1973) )
o意外にも、このc D NA配列は・マウスβNGF
の報告されている配列の末端に結合した、C−末端、ア
ルギニン−グリシンジペプチド延長部を予測している〇
ヒトβNOF遺伝子は、成熟マウスβNOFアミノ酸配
列と約90%が相同(ホモローガス)なアミノ酸配列を
予測している領域を含んでおり、従ってこれは、ヒトβ
NOFの遺伝子のための遺伝子でなければならない。ヒ
トβNGF蛋白質もまた、C−末端ジペプチド延長部を
持っている・ヒトとマウスのβNGF配列を並べると(
第6図)、成熟マウス蛋白質の既知の配列からかなりの
遠くの上流まで広範な相同性が延びていることがわかる
。22,000ダルトシの生合吠ブローβNG」゛グリ
カーサー(前、駆体)の存在が証明されており (13
ergerおよび5hooter、 Proc、 Na
t、Acad。 Sci、(USA)、74:3647.(1977))
、これは成熟蛋白質からヌクレオチド位置419および
420(第6図参照)の潜在的なアルギニン−アルギニ
ン開裂部位にまで延びているかもしれない。このヌクレ
オチド配列で予測される前駆体は、既に以前に検出され
たものより長い:後述する様に、全プレプロ−β−NG
F配列は分子量27,000と予測され、ブロー配列は
25,000ダルトンと予」すされ、特異なアルギニン
残基対が存在することケ考えると、21,500および
18,000ダルトンのプロセッシング中間体が細胞内
に存在する。 C14,開始メチオニンコドンおよび信号配列の位置づ
け 蛋白質合成開始コドンであると指定するための候補とし
て3つのメチオニン残基が挙げられる(第6図のアミノ
酸−187、−121および−119)。しかし、いく
つかの要因から、本発明者らの配列の一121アミノ酸
が実際の開始コドンとして使われていることを強く暗示
している。βNOFは分泌された蛋白質であるので、開
始コドンの後には、このポリペプチドを小胞体の内腔へ
と共同翻訳転移させる信号配列が続いていると考えられ
る。アミノ酸−121から−104に、優れた信号配列
の候補である。これらの18個のアミノ酸は正しい長さ
であり、−続きの6個の完全に疎水性のアミノ酸(al
a−phe−1eu−ile−gly−va’l)を含
んでいる。信号ペプチダーゼによる開裂は、小さいアミ
ノ酸であるala−104と、−103位のglu残基
の間で起り得る゛。プレーアルファ・ラクトアルブミン
の場合、信号ペプチダーゼハ同一のgln −ala配
列(後)を開裂させ、同一のN−末端g1u残基金残す
ことが知られている。−187位のmet残基に続く一
連のアミノ酸は、極性および荷電アミノ酸を高率で含ん
でおり、これまで報告されている信号配列のいずれにも
一部ていない。 従って、−121のメチオニンがヒトおよびマウスのグ
レブロ−βNOFの翻訳開始に使われる可能性が最も高
く、この場合27,000ダルトンのプレブロホルモン
が生成する。もし信号ペプチドプロセッシングが残基−
104で起ったら、25゜000 ダルトンのプローβ
N G Fが生1収するでろろう。 C,5,’ l(、coli中でのヒトβNGFの直接
発現スhβN8からのEcolLIフラグメシトをpB
It322でサブクローンした。本発明者らがphβ
N8−89と命名したサブクローンプラスミドは、ヒト
βN G li’サブユニットを暗号化している配列の
大部分を含んでいる2kbヒトDNA挿入体を含有して
いた。配列決定の結果、10個のN1]2−末端アミノ
酸だけがこの配列から除かれていることがわかった。β
N G I!’暗号配列をE、co’liで発現させる
ための本発明者らの方法(は、phβN5−B9のβN
OF暗号部分から最も大きい可能なフラグメント金切り
取り、次いで欠失コドンを満たし、その配列の5′およ
び3末端を、E、 C01i発現プラスミドに挿入する
のに適する様に修飾することでめった。使用した発現系
は、米国特許出願第307゜473号(1981年10
月1日出願)に記載されているTrpプロモーター系で
あり、これH,M。 Mateucci の配列変換と共に、各種の遺伝子に
ついて以前から用いられて来たものである。 プラスミドphβN8− B 9 f: Eco RI
$−ヨヒI(gIAIで消化し、〜300bpフラグ
メントヲ消化混合物から分離した。このフラグメントを
第7図に示す。2工程の消化により生じる粘着末端も示
しである。発現のためのヒトβN G F配列の5′末
端を組み立てるために、10個の欠失アミノ繍のための
コドン、開始メチオニンコドン(ATG)、およびリポ
ソーム結合サイトの一部でらり、制限エンドヌクレアー
ゼXba Iの開裂サイトを含んでいる、該ATGに先
行するヌクレオチド押金付加した。この目的の為VC4
つのオリゴヌクレオチドを化学的に合成した。これら金
オリゴヌクレオチドI−IVとして第7図に示す。 βN (3F暗号領域の3′末端は以下の如く修正した
:第7図に示した1個のH,gI A I部位(吸熱ヒ
トβN G ]”の1111位 Val )と112位
(Leu)のアミノ酸)から下流の両DNA鎖のヌクレ
オチド配列を、Argl18およびSal l粘着末端
に続く終止コトリ(TAG)を含む様に化学的に合1視
した。これらのオリゴヌクレオチド灯第7図のフラグメ
ントVおよび■である。 合成オリゴヌクレオチド1−VlをT4ポリヌクレオチ
ドキナーゼおよびr−32p−A、TPで放射活性標識
し、その放射活性オリゴヌクレオチドを、T 4 DN
A IJ カーセ緩衝液中、〜300bphβN(3
FDNAフラグメントと混合した。10単位ty) i
’ 4 ]) N A リガーセラ用い、12”0f1
2時間ライゲーション(結合)した。この混合物をフエ
、ノール抽出し、D N A’l’70%エタノール中
で沈殿させた。沈殿を乾燥し、制限エンドヌクレアーゼ
緩衝液に溶解い酵素Xba (および5−aIIを添加
し、2時間消化した。 DNA混合物のプレパラティプゲル電気泳動おある二重
体(ダブレット)が〜37 C1bpに存在することが
わかった。溶離したDNAフラグメントを、Xba I
および5aIIで消化した後細菌性アルカリホスファタ
ーゼで処理したpH−GJ:I 207−1 七命名さ
れたfI G II −’rrp発現ブラユミ83.結
合させた(T4DNAリガーゼ)。このアルカリホスフ
ァターゼ処1rqH1I−I G HフラグメントがT
rp発現ベクターに再挿入されるのを防ぐ為に行なった
。 このライゲージヨシ混合物を使ってE、coli K1
2/294f:形質転換した。寒天平板上、アンピシリ
ン耐性でテトラサイクリシ感受性のコロニーを選択した
:200のコロニーを、放射活性の300bp +gc
o 13. I / Hgi A Iプローブとのハイ
ブリダイゼーシヨンにより、ヒトβNOF配列の存在(
てついてスクリーニングした。12個の陽性コロニーを
、ウェスタン・プロット上、ウサギの抗マウスβNOF
抗体を使って、その細胞抽出物中に免疫反応性βNOF
分子が存在するがどうかについて分析した。1個を除く
全てのクローンが、陰性の対照抽出物と比較して、期待
される分子量の陽性信号を示した。これらのクローンの
1個のDNA配列を分析した結果、本発明者らによって
PhβNOF trp Iと命名された、ヒトβN G
F 2発現した最終的なプラスミドが、当初に計画し
た構造を持っていることが証明された。 プラスミドl)hβN8−B9の’!’coltlお工
び馬IA1による消化からグラスミドPhβNGF t
rp 1の組み立てに至る一連の操作を第8図に示した
。 プラスミドPLIOH,207−11−、i’、上記出
願番号第307.473号に記載されているプラスミド
P 1.(G l−1207’c BamHIで消化し
、次イテECoIt■テ部分消化することにより得られ
た。trpプロモータf含んでいる最も大きいフラグメ
ントを分離した。p 13 r 322から最も大きイ
ECORI −Bam H■フラグメント’を分+=t
L、この2つのフラグメントを結合させ、E、 co
li Kl 2/ 194の形質転換ニ使用した。アン
ピシリンおよびテトラサイクリシの両者に耐性のめるク
ローンがPf(GH207−1を含んでいた、 c、5. mNGFcDNA配列を含んでいる細菌クロ
ーンの組b・立ておよび同定 各(14塩基の)8つのプライマーのプール2種を化学
的1(合成した。各プライマーは、アミノ酸93−96
および97の1部のための潜在高m几NA配列と相補的
である1、ポ+) (A、 ) 4LN Aで特異的V
Cc D N Aの合成をプライムするのに16オリゴ
ヌクレオチドの混合物音用いた。10ミリモル(mモル
)のKO150μl中、8プライマーの各プール200
ピコモル(pモル)(1μり(総計440pモル、2μ
y)を、ポリ(A+) It N A4Q1t9と、9
0°C168°C142゛Cおよび37°Cで4分間づ
つインキュベートすることにより、アニーリングした。 32p−標識cD N A、 f、、50 m M、
l□リス(pH8,3)、10mMMgC12、I O
m M D’l’T、50 m M KClの反応(系
)100μ6中で合If L fc。 この反応系はアニーリングした混合物の他ニ、500μ
Mc7)aATP、’I’TP、、IGTP、100I
t Mの、ICTP、20μC1の〔γ−32p)dC
T” (2000Ci/mモル、Amersham )
、0.5単位/μlのIL N ASinおよび90単
位の逆転写酵素を含んでいた。最初の鎖の合1ii 3
7°Cで60分間であった。反応系を3分間煮沸し、1
分間氷でクエンチジグし、マイクロフユージ中で回転さ
せた。 上澄を同容軟のdd l−120で希釈し、Kleno
w Fo11J5単11Jえ、12°Cで18時間、d
ecDNA全合1戎した。フェノール/クロロホルム抽
出し、エタノール沈殿を行なった後、標品を150ti
e中の81ヌクレア一ゼ10単位を用いて37°Cで1
時間消化した。フェノール/クロロホルム抽出およびエ
タノール沈殿の後、5%ポリアクリルアミドゲル上の電
気泳動に、r、9cDNAを分画した・2つのサイズ範
囲のcDNA−1電気溶離した。長さ〜550bp(J
:)Hl 32ngm回収され、長さ200〜550b
p(下) u182 ngm回収された。 全5−2 Q ngmの各フラクションの3′−末端を
、末端ヌクレオチドル・トランスフェラーゼを用いて2
O−40d(C)残基で延長させた。このd (c)−
尾部形17M、 c D N A f、同様にPet1
部位でa (Q)残基音用いて延長させたpBR322
(150ngm )とアニーリングした。アニーリング
は50tAの100m M NaC1、10mMトリス
(pl+ 7.5 )、250mMEDTA中で行なっ
た。混合物t 70 ’Oに加熱し・徐々VC37°C
に冷却しく16時間)、次いで4°Cに冷却した(6時
間)。アニーリング混合物の半分を使ってE、coli
K−12株294全形質転換した。各サイズフラクシ
ョシ(上と下)からの500コロニーをフィルター・ハ
イブリダイゼーシヨンによりスクリーニングした。32
p−標識グローブは16プライマーの混合物(全II1
g)から、公表されている方法により、ポリヌクレオチ
ドキナーゼ(P−L Biochmicals)および
20071C]の〔、−32p〕ATP(50ooc1
/mモル、Amersham )を用いた燐酸化によV
調製した。10゜000個のクローンを含んでいるフィ
ルターを、プライマー・ハイブリダイゼーシヨン・ミッ
クス(100mM)リスpH7,5,0,9M NaC
1,6m M EDTA、l X Dennardt’
s溶液、100 tt M rA、TP、1′m M
Na1i2PO,−Naピロホス7.1lr−−−)、
05%NQnidet P −40,0,1’ my
/me酵母RN A (SigmaR−67’50 )
)中、〜l X 108cpmの32p(識プローブ
と、室温で18時間ハイブリッド形成させた。フィルタ
ーを、42℃で6 X ssc中で30分間(3回)洗
浄し、強化スクリーン(])upont)を用いて一7
0°Cで16時間、X線フィルムに感光させた。約0.
7−0.9%(上370.下460)のコロニーを選択
し、もとのプライミング部位に対して5である2つの追
加の合1戎グライマーによる2回目のスクリーニングに
かけた。アミノ酸74−74のための全ての潜在的mR
NA配列に相補的な】2量体を各4プライマーの2プー
ルに合成した。各々8個の14量体2プール(アミノ酸
52−58および56の一部のための潜在的mRNA配
列に相補的)′f:同様にして合1戎した。第1回のス
クリーニングで選択した「上」および「下」のコロニー
から、3セツトの同一のフィルター’を作成した。4つ
の合成オリゴヌクレオチドから、既述した様にして32
p−標識グローブを作成した。プライマー・ハイブリダ
イゼーシヨン・ミックス中、フィルターto、5 X
10’ cpmとハイブリッド形戎させ、洗浄し、X線
フィルムに感光させた。5オリゴヌクレオチド全てとハ
イブリッド形ffl’を行なった9つの陽性群(下から
3つ、上から6つ)がみつかった。ミニスクリーン手法
でプラスミドI) N A i分離し、最も大きい挿入
体を持ったクローンを制限分析により決定した。p、m
pN−9G1と名付けたプラスミドの塩基配列を、翫x
am −Oi’1.bert法によって完全に決定した
。このcDNA挿入体は、14塩基のプライマー配列(
第1図、プール1)および全量716bpを含んでいた
。 0.7 βN OFメツセージに富むmI(NAから調
製されたオリゴdT−プライム化C1)NAクローン 0.025Mのクエン酸ナトリウム(pH3,8)中の
2%アガロースおよび6M尿素からなる変性アガロース
ゲルにより、電気泳動によって200/1gのポリf’
A)RNAi分画した。リボンームバン(帯)は、垂直
のスライスをエチジウムブロマイドで染色することによ
り肉眼観察し得る様にした。 ゲルk 0.5 cmのスライスに切断し、70”Oで
融解し、フェノールで2回、クロロホルムで1回、強力
に抽出した。2回のエタノール沈殿の後、そのペレット
f、(daH2030lieに溶解した。各フラクショ
ン(4M酢酸7ノモ=ウム5μ1(pH7,0)中)1
1’lNt乾燥ニトロセルロースフイルターにスポット
し、厳重な条件下でドツト・ハイブリダイゼーションに
、j:クスクリーニングした。Klenow Po1.
1反応系中、プライマーとして牛胸腺DNAフラグメン
トを用いて既知の方法により、32p〜標識プロ一ブf
fipmβN −g G1挿入体から調製した。このフ
ィルターを、50 m M NaPO4(pH?、’
0 )、5×Dennart’s溶液、5. x 5e
c150tt9/4の超音波処理したニシン***DNA
11ool1MのrATP、I m M NaH2PO
4−ナトリウムピロボスフェート、および50%ポルム
アミド中、42°Cで18時間、〜lO’cpmとハイ
ブリッド形成させた。このフィルターtO,2Xssc
−Q、1%SDS中、42′cで20分間洗浄しく3回
)、フィルムに感光させた。ハイブリダイゼーションの
結果、NGFメツセージはフラクション11および12
にあることがわかった。フラクション11お工び12の
それぞれ10d’r用い、標準的な方法でオリゴdT−
プライム化c D N A f調製した。5%ポリアク
リルアミドゲル上の電気泳動の後、ゲルスライスから6
00 bpより長いcDNAを溶離した。フラクション
11から約4 Or+gmのc D N A 、および
フラクション12からの20 ngm ff:d (C
:)−尾部形成し、d (G) −尾部形成したpBR
322とアニーリングした。フラクション11から約3
300クローン、フラクション12からの1500クロ
ーンヲ、pmβN−901からの32p−標識内部Hp
aIIフラグメント(216bp)を使って、厳重な条
件下のフィルターハイブリダイゼーションにより、コロ
ニーとしてスクリーニングした。フィルターを42°C
で18時間・50 X ] 06cp’mとハイブリッ
ド形成させ、洗浄し、既述した様にX線フィルムに感光
させた。 フラクション12からの5つのクローンがこのフ゛ロー
プについて陽性であった。制限分析により、それらは同
胞であることがわかった。pmβN−121’:4 f
、1、Maxam −G11berL法によυ完全に塩
基配列決定した。フラクション11からの2つのクロー
ンが陽1牛であった。最大のpmβN−3B3の塩基配
列をMaxam−Gi、1bert法により完全に決定
した。 C,8医薬組成物 本発明に係るヒトのβ−N Q li’は、このβ−N
G l” 全適当な担体と混合して、既知の方法で、有
用な医薬Mi成物に製剤化することができる。好適な担
体、および他のヒトの蛋白質、例えばヒトの血清アルブ
ミン金倉んでいてもよい製剤の調製法は、例えばJLe
mingtonのPhazmacentjcal 8C
’3.9nCeB(1す、W0Ma7−tjnVcよる
)IC記載されCいる。この様な医薬組1我物eゴ、本
発明の蛋白質の有効量を適当な量の担体と共に含んでお
り、患者に非経口投与することができる。 このヒトβ〜N G F i、r、神経障害またはその
他の、この物質が治療効果を発揮し得る疾患にかかつて
いる患者に非経口投与することができる。投与量および
投与割合に、例えばマウスの唾液腺から得られる同様の
製剤の臨床実験に現在使用されているもの七同じである
。 以上の記載は本発明の好ましい態様を述べたものでhv
、本発明がこれに限定されると解釈してはならない。
第1図はマウスNGFのβザブユニットのアミノ酸配列
、それを暗号化している遺伝子配列、およびその遺伝子
の特定の断片の相補DNA鎖を示す模式図、第2図はβ
−N G F mit N A断片を含んでいるクロー
ンのノーザシ・プロット分析の結果を示すグラフ、第3
図はマウスNOF遺伝子の部分的制限地図、および本発
明のプラスミドのヌクレオチド配列とマウスNGF遺伝
子のヌクレオチド配列との対比を示す模式図、第4図は
組換えファージλhN8の物理的地図、第5図はヒトβ
NOF染色1本遺伝子のヌクレオチド配列を示す模式図
、第6図はヒトおよびマウスのプレブローβNOF遺伝
子のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の比較を示す
模式図、第7図はヒトβN OFの発現のために組み立
てられた遺伝子を示す模式図、第8図はヒトβNGF全
発現するための、E、coli全形質転換するためのプ
ラスミドph NGF trp 1の組み立て工程の1
部を示す工程図である。 特許出願人 ジエネンテク、インコーポレイテッド代
理 人弁即士 青白 葆 外1名 図面のi−、、、jl、(内容に変更なし)〜、1−1 cc cccc 0 cc cccc 0 CCCCC[: c cc c c0 CCC A CA A A A A CAA AAGT TT
AGTT TT c cc cc cc 0 A A A CA CA G ATA 00 TT TT T cc cc c c CCC T TAGT T T T T cccc ccc 手続補正書(方式) 1.事件の表示 昭和5≦〕年特許願第 412 (15号2、発明の名
称 ヒト神経成長因子の遺伝子紺換えによる調製法3、補正
をする者 事件との関係 特許出願人 (ijili アメリカ合衆国カリ7オルニア9408
f+、刃ウス・サン・7ランシスコ、ポイント・サン
・ブルーノ・ブールバード460番 名称 ジェネンテク、インフーボレイテソド4、代理人
、それを暗号化している遺伝子配列、およびその遺伝子
の特定の断片の相補DNA鎖を示す模式図、第2図はβ
−N G F mit N A断片を含んでいるクロー
ンのノーザシ・プロット分析の結果を示すグラフ、第3
図はマウスNOF遺伝子の部分的制限地図、および本発
明のプラスミドのヌクレオチド配列とマウスNGF遺伝
子のヌクレオチド配列との対比を示す模式図、第4図は
組換えファージλhN8の物理的地図、第5図はヒトβ
NOF染色1本遺伝子のヌクレオチド配列を示す模式図
、第6図はヒトおよびマウスのプレブローβNOF遺伝
子のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の比較を示す
模式図、第7図はヒトβN OFの発現のために組み立
てられた遺伝子を示す模式図、第8図はヒトβNGF全
発現するための、E、coli全形質転換するためのプ
ラスミドph NGF trp 1の組み立て工程の1
部を示す工程図である。 特許出願人 ジエネンテク、インコーポレイテッド代
理 人弁即士 青白 葆 外1名 図面のi−、、、jl、(内容に変更なし)〜、1−1 cc cccc 0 cc cccc 0 CCCCC[: c cc c c0 CCC A CA A A A A CAA AAGT TT
AGTT TT c cc cc cc 0 A A A CA CA G ATA 00 TT TT T cc cc c c CCC T TAGT T T T T cccc ccc 手続補正書(方式) 1.事件の表示 昭和5≦〕年特許願第 412 (15号2、発明の名
称 ヒト神経成長因子の遺伝子紺換えによる調製法3、補正
をする者 事件との関係 特許出願人 (ijili アメリカ合衆国カリ7オルニア9408
f+、刃ウス・サン・7ランシスコ、ポイント・サン
・ブルーノ・ブールバード460番 名称 ジェネンテク、インフーボレイテソド4、代理人
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1ヒト起源の夾雑蛋白質を実質的に含んでいないヒトβ
NGF。 2、組換え宿主細胞によって生産される第1項に記載の
βNOF。 3微生物細胞によって生産される第2項に記載のβNO
F。 4、組換え宿主細胞中でヒトβNGFf:暗号化してい
るDNA配列を発現させることができるDNA配列と有
効に連結された該βNOF暗号化])NA配列。 5形質転換組換え宿主細胞中で第4項に記載のDN’A
配列を発現することができる複製可能な発現ベクター。 6、第5項に記載の発現ベクターで形質転換された組換
え宿主細胞。 7、 E、coli株である第6項に記載の組換え宿主
細胞。 8プラスミドphβNGFtrpl。 9第8項に記載のプラスミドで形質転換された組換え宿
主細胞。 10、 E、 coli株である第9項に記載の組換え
宿主細胞・ 11、治療に有効な量の、第1項〜第3項のいづれかに
記載のβNGFi薬学的に許容し得る担体と共に含有し
てなる医薬組成物。 12非経口投与に適した第11項に記載の組数物。 13、損傷を受けた神経の治療に用いる第11項または
第12項に記載の組成物。 14第5項に記載の発現ベクターで組換え宿主細胞を形
質転換し、この細胞を培養し、発現されたβNOFを分
離することからなるβNGFの調製法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US47196283A | 1983-03-03 | 1983-03-03 | |
US471962 | 1990-01-29 |
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Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP4185044A Division JP2740417B2 (ja) | 1983-03-03 | 1992-07-13 | ヒト神経成長因子の遺伝子組換えによる調製法 |
JP4346109A Division JPH067169A (ja) | 1983-03-03 | 1992-12-25 | ヒト神経成長因子の遺伝子組換えによる調製法 |
JP4346116A Division JP2898494B2 (ja) | 1983-03-03 | 1992-12-25 | ヒト神経成長因子の遺伝子組換えによる調製法 |
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Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6084299A true JPS6084299A (ja) | 1985-05-13 |
JPH0536031B2 JPH0536031B2 (ja) | 1993-05-28 |
Family
ID=23873671
Family Applications (4)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP59041205A Granted JPS6084299A (ja) | 1983-03-03 | 1984-03-02 | ヒト神経成長因子の遺伝子組換えによる調製法 |
JP4185044A Expired - Lifetime JP2740417B2 (ja) | 1983-03-03 | 1992-07-13 | ヒト神経成長因子の遺伝子組換えによる調製法 |
JP4346116A Expired - Lifetime JP2898494B2 (ja) | 1983-03-03 | 1992-12-25 | ヒト神経成長因子の遺伝子組換えによる調製法 |
JP4346109A Pending JPH067169A (ja) | 1983-03-03 | 1992-12-25 | ヒト神経成長因子の遺伝子組換えによる調製法 |
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Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP4185044A Expired - Lifetime JP2740417B2 (ja) | 1983-03-03 | 1992-07-13 | ヒト神経成長因子の遺伝子組換えによる調製法 |
JP4346116A Expired - Lifetime JP2898494B2 (ja) | 1983-03-03 | 1992-12-25 | ヒト神経成長因子の遺伝子組換えによる調製法 |
JP4346109A Pending JPH067169A (ja) | 1983-03-03 | 1992-12-25 | ヒト神経成長因子の遺伝子組換えによる調製法 |
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JP (4) | JPS6084299A (ja) |
KR (1) | KR840008026A (ja) |
AT (1) | ATE45382T1 (ja) |
AU (1) | AU574350B2 (ja) |
CA (1) | CA1220736A (ja) |
DE (1) | DE3479321D1 (ja) |
DK (1) | DK161152C (ja) |
ES (1) | ES8600783A1 (ja) |
IE (1) | IE57013B1 (ja) |
NZ (1) | NZ207337A (ja) |
ZA (1) | ZA841597B (ja) |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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